Nghiên cứu biến đổi di truyền ở một bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh bằng phương pháp giải trình tự vùng gen mã hóa

Trang 1

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC BIOTECHNOLOGY rer ae MỞ, Š KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐÈ TÀI:

NGHIEN CUU BIEN DOI DI TRUYEN

O MOT BENH NHAN MAC DI TAT TIM BAM SINH BANG PHUONG PHAP GIAI TRINH TU VUNG GEN MA

HOA

Trang 2

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH MỤC LỤC Phan I: TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Bệnh tim bẩm sinh 1.1.1 Khái niệm về tim bẩm sinh

1.1.2 Nguyên nhân gây ra bénh tim bam sinh

1.1.3 Các dạng dị tật tim bẩm sinh và triệu chứng lâm sàng của bệnh

tim bam sinh:

1.1.4 Chuẩn đốn bệnh tim bam sinh:

1.1.5 Ảnh hưởng của bệnh tim bẩm sinh với bệnh nhân:

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về lĩnh vực liên quan đến đề tài:

1.2 Các gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh:

PHAN II: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 3

2.3.6.3 Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR được thực hiện trên máy GeneAmp PCR System 9700 thơng qua 3 giai đoạn (Hình

2.3.7 Phương pháp tỉnh sạch sản PCR

PHAN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu thập mẫu máu 3.2 Xác định nồng độ tỉnh sạch DNA 3.4 Tach chiết DNA tổng si 3.5, Kết quả xác định và chú giải biến thể

3.6 Kết quả sàng lọc biến thẻ liên quan dén bénh tim bam sinh

PHAN IV: KET LUAN 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DE CUONG TOT NGHIEP DAI HOC

Trang 4

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TÁT Aa Amino acid Bp Base pairs DNA Axit deoxyribonucleic PCR Phản ứng chuỗi polymerase

PDB Ngan hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank)

TAE Tris - Acid acetic - EDTA

NST Nhiễm sắc thê

Kb Kilo base paris (1kb = 1000 bp)

EtBr Ethidium Bromide

dNTP Deoxynucleotid triphosphat EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EMBL, Ngân hàng dữ liệu Châu Âu

(European Molecular Bioinformatic Laboratory)

TBS Tim bam sinh

Trang 5

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Tỷ lệ mắc bệnh TBS từ năm 1945 đến năm 2009 10

theo phân loại khuyết tật

Hình 2: Phân bố bệnh tim bẩm sinh trên tồn cầu về số 10

lượng sinh trên một triệu dân số

Hình 3: Vị trí gen LRP2 trên NST số 2 l3 Hình 4: Quy trình phân tích và sàng lọc đột biến 20 Hình 5: Chu trình nhiệt đã được tối ưu hĩa 30 Hình 6: Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel 1% 35 Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch dai gen LRP2 37 Hình 8: Phân bố kích thước thư viện DNA 4I

Hình 9: Đột biến trên gen ở vị trí c.428-10_428-8dellTTT 42

Trang 6

DANH MỤC BANG

Bảng 1: Các thành phần phản ứng của quá trình PCR 30

Bảng 2: Kết quả đo nồng độ DNA và độ tỉnh sạch 35 Báng 3: Thơng tin chất lượng đọc trình tự 37

Bảng 4: Kết quá giĩng hàng dữ liệu bệnh nhân với hệ gen 38

tham chiếu

Bảng 5: Kết quả xác định và sàng lọc biến thể 39

Trang 7

MỞ ĐÀU

Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là một tình trạng bắt thường về cấu trúc và chức năng của tìm Vấn đề cĩ từ khi trẻ mới được sinh ra và cịn được

gọi là bệnh tim bằm sinh hay dj tat tim bam sinh (Congenital Heart

Defects CHDs) Trên thực tế, nhiều trường hợp bệnh tim bẩm sinh khiến

trẻ vừa sinh ra đời đã tử vong ngay lập tức Trái tìm của em bé bắt đầu

phát triển từ khi thụ thai và được hình thành hồn tồn sau 8 tuần mang

thai Các dị tật tìm bẩm sinh thường xảy ra trong 8 tuần đầu tiên Bệnh

tim bam sinh xảy ra khi tìm hoặc các mạch máu gần tim khơng phát triển

bình thường trước khi sinh Các vấn đề về tìm bẩm sinh cĩ thể ở các dạng từ đơn giản đến phức tạp Một số khiếm khuyết ở tìm cĩ thể được bác sĩ theo dõi và xử trí bằng thuốc Một số trường hợp khác sẽ được yêu

cầu phẫu thuật, đơi khi ngay sau vài giờ đầu sau khi sinh Một số em bé

cĩ thể mắc một số vấn đề về tim đơn giản Những khiếm khuyết này cĩ

thể tự phục hồi khi em bé lớn lên Tuy nhiên một vài trường hợp sẽ cĩ những khiếm khuyết cần được theo dõi và điều trị suốt đời

Dị tật tìm bam sinh là các bệnh liên quan đến cấu trúc của tim và

buồng tim Xảy ra khi cấu trúc của tìm khác thường hoặc buồng tim cĩ dị

tật

Dị tật tìm bẩm sinh cĩ thể liên quan đến bất kỳ phần nào của tim bao gồm buơng tim, van tim, vách tim, các động mạch và tĩnh mạch của

tim Chúng đều làm ảnh hưởng đến dịng chảy bình thường của máu qua tìm, khiến cơ thể trẻ khơng nhận đủ lượng oxy cần thiết [1] Chính vì vậy

chuẩn đốn sớm bệnh tim bẩm sinh rất cần thiết

Chẩn đốn muộn bệnh sẽ làm chậm sự bắt đầu của các phương pháp điều trị đặc hiệu dẫn đến những hậu quả đáng tiếc, đe dọa đến cuộc sống

bao gồm tình trạng lâm sàng nặng hơn gây tâm lý nặng nề cho bệnh nhân

và gia đình, thậm chí tử vong trong trường hợp bệnh tiến triển Trong

Trang 8

trường hợp bệnh được di truyền, các anh chị em khác trong gia đình cũng

cĩ nguy cơ bị ảnh hưởng cao Đối với những gia đình này, việc khơng cĩ

một chẩn đốn cụ thể và tiếp cận với tư vấn di truyền, làm tăng nguy cơ

về việc cĩ một đứa trẻ khác bị bệnh được sinh ra

Giải trình tự gen thế hệ mới (giải trình tự vùng gen mã hĩa — whole exome sequencing, hoặc tồn bộ bộ gen của con người ~ whole genome

sequencing) [2] cĩ thể được sử dụng đề nghiên cứu các gen bệnh theo di

truyền Mendel Giải trình tự gen thế hệ mới đã được xem như là một

cơng cụ hữu hiệu cho phát hiện các gen bệnh mới, đặc biệt giải trình tự vùng mã hĩa cĩ thể sẽ trở thành cơng cụ phổ biến nhất được sử dụng để

xác định gen bệnh theo di truyền Mendel cho những năm tới Hàng chục

nghìn biến thể gen cĩ thể được xác định trong vùng gen mã hĩa trong

nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, chuyền hĩa

Mục đích của đề tài: Đề tài tiến hành giải trình tự tồn bộ vùng

gen mã hĩa (WES) ở một số bệnh nhỉ mắc dị tật tìm bẩm sinh để tìm hiểu

rõ nguyên nhân di truyền của bệnh, từ đĩ cĩ phương pháp chân đốn, điều trị và tư vấn di truyền thích hợp cho bệnh nhân và gia đình

Nội dung đề tài:

« _ Thu thập mẫu máu của bệnh nhỉ mắc tim bẩm sinh

« Giải trình tự vùng gen mã hĩa của 01 bệnh nhân nhỉ mắc bệnh dị

Trang 9

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Phan I: TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Bénh tim bam sinh

1.1.1 Khái niệm về tìm bẩm sinh

Bénh tim bam sinh (TBS) là dị tật bẩm sinh phổ biến nhất ở người và

là nguyên nhân gây tử vong hang dau 6 trẻ sơ sinh Các dị tật tìm bam sinh thường xảy ra trong 8 tuần đầu tiên khi tìm hoặc các mạch máu gần

tim khơng phát triển bình thường trước khi sinh Với tỷ lệ mắc bệnh thay

đổi từ 0,8 - 2% ở trẻ sơ sinh dự đốn tỷ lệ mắc TBS lên đến 4% ở tất cả trẻ sơ sinh, bệnh tìm bẩm sinh gây ra tỷ lệ thai chết lưu lớn hơn nhiều

[3:4] Ngồi ra, các dị tật nhẹ chưa được chẩn đốn của tim thường xuất

hiện muộn hơn ở tuổi trưởng thành hoặc khơng được chẩn đốn suốt đời Trong trường hợp này, người ta dự đốn tỷ lệ mắc TBS lên đến 4% ở tắt

cả trẻ sơ sinh

Phần lớn bệnh TBS được cho là do đột biến gen Điều này được

quan sát ban đầu về sự di truyền trong các gia đình Một bằng chứng

khác đến từ các hội chứng bẩm sinh do sự mắt đoạn của các vùng nhiễm sắc thể sẽ dẫn đến TBS cùng với một số biểu hiện khác Trong vài thập

kỷ qua, cùng với sự ra đời của giải trình tự gen và các kỹ thuật khác, người ta cĩ thể xác định được nguyên nhân di truyền của bệnh TBS

Trong các trường hợp hội chứng, mặc dù cĩ thể xác định được sự mat đoạn nhiễm sắc thẻ gây ra bệnh, nhưng trong nhiều trường hợp, gen chịu

trách nhiệm về kiểu hình tìm vẫn chưa được xác định

ấu trúc và

Bénh tim bam sinh (TBS) là một tình trạng bất thường về

chức năng của tim Vấn đề cĩ từ khi trẻ mới được sinh ra và cịn được

gọi la di tật tìm bẩm sinh Trên thực tế, đã cĩ nhiều trường hợp bệnh tim

bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh ra đời đã tử vong ngay lập tức

Trang 10

Các vấn dé vé tim bam sinh cĩ thể ở các dạng từ đơn giản đến phức

tạp Một số khiếm khuyết ở tim cĩ thể được bác sĩ theo dõi và xử trí bằng thuốc Một số trường hợp khác sẽ được yêu cầu phẫu thuật, đơi khi ngay sau vài giờ đầu sau khi sinh Một em bé cĩ thể mắc một số vấn đề

về tim đơn giản và sẽ tự hồi phục khi lớn lên Tuy nhiên, một vài trường

hợp sẽ cĩ những khiếm khuyết cần được điều trị suốt đời

Các dấu hiệu bệnh tùy thuộc vào kiểu cụ thể của dị tật cĩ thể nguy hiểm tính mạng Các triệu chứng thường thấy gồm thở nhanh, tím tái,

khĩ lên cân, và cảm thầy mệt mỏi [5] Các triệu chứng của bệnh tim bâm

sinh ở trẻ sơ sinh và trẻ em cĩ thể bao gồm:

® Da, mĩng tay và mơi cĩ màu hơi xanh (các bác sĩ gọi đây là chứng

xanh tím, một tình trạng do máu thiếu oxy)

e Thở nhanh và bú kém © Tang can kém

Bệnh này khơng gây ra đau ngực Đa số các vấn đề tim bẩm sinh

khơng xảy ra đồng thời với các bệnh khác Các biến chúng cĩ thể xảy ra

do dj tat tim gồm cĩ suy tìm

1.1.2 Nguyên nhân gây ra bệnh tim bam sinh

Nguyên nhân của một bắt thường tim bẩm sinh thường khơng rõ [6] Một số trường hợp cĩ thể là do nhiễm trùng trong giai đoạn mang thai

như nhiễm Rubella, việc sử dụng một số loại dược phẩm hay các chất

như rượu hay thuốc lá, bố mẹ cĩ quan hệ cận huyết, hay tình trạng dinh

Trang 11

Marfan Các bệnh tim bảm sinh được chia thành hai nhĩm chính: các

bệnh tim bẩm sinh tím và các bệnh tìm bẩm sinh khơng tím, dựa vào việc bệnh nhỉ cĩ khả năng chuyển màu tím tái hay khơng Các bất thường cĩ thể ở thành trong của tim, các van tỉm, hay các mạch máu lớn dẫn máu

đến và đi khỏi tim

+ Di truyền trên nhiễm sắc thể thường mang gen trội với các hội chứng

đa dị tật: Bénh tim bam sinh 1a dj tật chính như hội chứng Noonan (bệnh di truyền cĩ liên quan tới tim), hội chứng Marfan (hội chứng di truyền ảnh hưởng đến mơ liên kết)

+ Di truyền trên nhiễm sắc thể thường mang gen lặn: hội chứng Jervell

(quá trình kéo dài, đột tử), hội chứng Ellis Van Creveld (tim chỉ cĩ 1 nhĩ

kèm các dị tật khác) Di truyền theo thể ẩn cĩ liên quan đến nhiễm sắc

thể giới tính: thường bị ở trẻ trai như hội chứng Hunter (dị tật ở nhiều

van tìm và động mạch vành), loạn dưỡng cơ Duchenne

+ Đã cĩ nhiều tổn thương tim bam sinh do bắt thường cấu trúc đi truyền

, mất đoạn hay thêm đoạn DNA Các

21, 13 và 18, chiếm khoảng 5 - 8 %

được phát hiện, cĩ thể là đảo đoạ bất thường hay gặp nhất tại NST

trường hợp TBS, trong đĩ đột biến cấu trúc NST 21 là phổ biến nhất Ngồi ra cũng đã phát hiện ra tổn thương tại một số NST khác, bao gồm

đột biến cấu trúc nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (22q11, Hội chứng

DiGeorge), nhanh dai NST số 1 (1q21), nhánh ngắn NST sé 8 (8p23) © Cac nguyén nhan tt méi trường gây bệnh tìm bẩm sinh

+ Các tác nhân vật lý như các loại tỉa phĩng xạ, tia gama, tia quang tuyén

X Nhiễm độc các loại hĩa chất, độc chất, các thuốc kháng động kinh, thuốc an thần Nhiễm trùng virus đặc biệt là Rubella trong 3 tháng đầu cĩ

thai Các bệnh của mẹ mắc khi đang mang thai: đái tháo đường, bệnh

Trang 12

Lupus ban do (a bệnh tự sinh ra kháng thể chống lại chính bản thân

mình) Đặc biệt nguy hiểm là mẹ bị nhiễm virus cúm trong ba tháng đầu mang thai 1.1.3 Các dạng dị tật tìm bẩm sinh và triệu chứng lâm sàng của bệnh tim bẩm sinh: Hầu hết các vấn đề về tim bam sinh là các vấn đề về cấu trúc như lỗ và van bị rị rỉ [7] Cụ thể như:

©_ Các khuyết tật van tim: Một cĩ thể quá hẹp hoặc đĩng hồn tồn

Điều đĩ làm cho máu khĩ đi qua Đơi khi, nĩ khơng thể vượt qua

được Trong các trường hợp khác, van cĩ thẻ khơng đĩng đúng

cách, do đĩ máu bị rị rỉ ngược lại

buồng tim bên trái và bên phải cĩ thể khiến máu bị trộn lẫn

œ_ Các vấn đề với co tim: Những vấn đề này cĩ thẻ dẫn đến suy tim,

cĩ nghĩa là hoạt động bơm máu của tim khơng hiệu quả như bình

thường

Kết nối khơng tốt giữa các mạch máu: Ở trẻ sơ sinh, điều này cĩ

thể khiến máu đi đến phổi và các bộ phận khác của cơ thể hoặc

ngược lại diễn ra khơng bình thường Những khiếm khuyết này cĩ

thể làm mắt oxy trong máu và dẫn đến suy các cơ quan 1.1.4 Chuẩn đốn bệnh tim bam sinh:

Bệnh tìm bẩm sinh cĩ thể chuẩn đốn trước (giai đoạn mang thai)

hoặc sau khi sinh

- Chan đốn khi mang thai:

Trang 13

Ban dau cĩ thể nghỉ ngờ bệnh tim bẩm sinh khi siêu âm định kỳ cho

em bé trong bụng mẹ Siêu âm chuyên khoa, được gọi là siêu âm tim thai,

sau đĩ sẽ được tiến hành vào khoảng tuần thứ 18 đến 22 của thai kỳ để chan đốn xác định Điều này cũng cĩ thể được thực hiện nếu cĩ tiền sử

gia đình mắc bệnh tim bẩm sinh hoặc nơi cĩ nguy cơ cao Siêu âm tim là

một loại siêu âm quét, trong đĩ sĩng âm tần số cao được sử dụng để tạo

ra hình ảnh của tim Tuy nhiên, khơng phải lúc nào cũng cĩ thẻ phát hiện

các di tật tìm, đặc biệt là các di tật nhẹ bằng siêu âm tim thai

- Chẵn đốn sau khi sinh:

Đơi khi cĩ thể chân đốn trẻ mắc bénh tim bam sinh ngay sau khi

sinh nếu cĩ một số dấu hiệu hoặc triệu chứng đặc trưng của bệnh tim bam sinh, chang hạn như da cĩ màu xanh (tím tái)

Tuy nhiên, một số khiếm khuyết khơng gây ra bắt kỳ triệu chứng

đáng chú ý nào trong vài tháng hoặc thậm chí vài năm 1.1.5 Ảnh hưởng của bệnh tim bẩm sinh với bệnh nhân:

- Theo WHO tỷ lệ mắc bệnh khoảng 0,5~0,8 % và khơng cĩ khác

biệt về giới tính, chủng tộc

- Bệnh tim bẩm sinh chiếm đến 90% tổng số các bệnh tim mạch ở

trẻ Tần xuất mắc bệnh tim bam sinh ở trẻ sơ sinh khoảng từ 0,7 — 0,8%,

nam nữ mắc ngang nhau, khơng cĩ sự khác nhau giữa các chủng tộc, địa

lý cũng như điều kiện kinh tế xã hội Bệnh tim bẩm sinh ở trẻ sơ sinh là

những bắt thường của tìm xuất hiện ngay từ khi đứa trẻ mới sinh ra Bất

kỳ một cơ quan nào trong cơ thể cũng cĩ nguy cơ bị dị dạng hay bất thường về cấu trúc nhưng những bắt thường về cấu trúc tìm mạch là

những bắt thường đáng chú ý nhất Hiệu ứng bệnh lý của nĩ cĩ thê nhân

bản theo cắp số cộng và đơi khi cĩ thể khiến trẻ tử vong ngay lập tức mà

khơng thể cứu chữa được

Trang 14

Bệnh tim bam sinh ở trẻ sơ sinh cĩ thể khiến trẻ tử vong sau sinh trong thời gian rất ngắn hoặc làm cho chất lượng cuộc sống của trẻ sau

này bị giảm sút nghiêm trọng, cha mẹ khĩ chăm sĩc bé

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về lĩnh vực liên quan đến đề tài:

~ Tình hình nghiên cứu trong nước:

Ảnh hưởng của bệnh tìm bẩm sinh ~ 1% tổng số trẻ sinh sống trong

dân số nĩi chung Các bệnh tim bẩm sinh phức tạp liên quan đến nhiều dị

tật hơn, bao gồm động mạch chủ phổi và động mạch vành dị thường Trong vài thập kỷ qua, việc chẩn đốn và điều trị các bệnh tim bẩm sinh

đã được cải thiện rất nhiều [9]

Theo tổ chức y tế thế giới, cứ 1.000 trẻ em ra đời, thì 8 trẻ trong số

đĩ mắc bệnh TBS [1] Tại Việt Nam, mỗi năm cĩ thêm 20.000 trường

hợp mang căn bệnh này, chỉ cĩ 1/10 số đĩ được can thiệp phẫu thuật Trẻ

bj TBS dé roi vào tình trạng suy tim nặng, đi chứng khơng phục hồi ảnh hưởng tới tình trạng tồn thân

Các bệnh tìm bẩm sinh rất đa dạng, cĩ thể chia thành hai nhĩm lớn là nhĩm đi kèm và khơng đi kèm với các hội chứng di truyền khác

Nhĩm đi kèm với các hội chứng di truyền khác bao gồm các hội chứng:

Hội chứng Down, Hội chứng Edward, Hội chứng Patau, Hội chứng Holt- Oram, Hội chứng Noonan, Hội chứng Ellis-van Creveld, Hội chứng Costello, Hội chứng Leopard, Hội chứng Alagille, Hội chứng Tumer, Hội chứng Williams-Beuren, Hội chứng Anderson, Hội chứng Cat-Eye, Hội chứng Marfan, Hội chứng Char, Hội chứng Charge Nhĩm khơng

đi kèm với các hội chứng di truyền khác được xác định do đột biến gen

đơn gây ra

Các dạng bệnh tim bam sinh phổ biến bao gồm: thơng liên nhĩ, thơng liên thắt, van động mạch chủ hai lá, hẹp eo động mạch chủ, bất

Trang 15

thường van hai lá, hai đường ra tâm thất phải, hội chứng Eisenmenger, hội chứng thiểu sản thất trái, hội chứng WolffFParkinson-White, hội

chứng Brugada, hội chứng QT dài, bất thường hồi lưu tĩnh mạch phổi, ống động mạch tồn lưu, cịn lỗ bầu dục, thiểu sản phơi, thiểu sản phổi với

khuyết tật thơng liên thất, hẹp van động mạch phổi, thiểu sản phổi với

vách ngăn thất nguyên vẹn, tứ chứng Fallot, chuyển vị các động mạch

lớn, thiểu sản van ba lá, thân chung động mạch, vịng mạch máu, khiếm khuyết thơng liên thất

Các dị tật tìm bẩm sinh thường gặp nhất và là nguyên nhân gây tử

vong hàng đầu trong số các dị tật bẩm sinh ở trẻ Ngày nay với những

tiến bộ trong chẩn đốn và điều trị đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của

những trường hợp tim bầm sinh phức tạp

~ Tình hình nghiên cứu trên thế giới:

Thống kê năm 2015 cho thấy cĩ 48,9 triệu người mắc bệnh tính

trên tồn thế giới Nĩ tác động lên 4 đến 75 người trên mỗi 1.000 trẻ sinh

ra với khoảng từ 6 đến 19 trên 1.000 trẻ cĩ dị tật mức độ từ vừa đến nặng

[7:8] Bệnh tìm bẩm sinh là nguyên nhân hàng đầu của các ca tử vong

liên quan dị tật bẩm sinh Trong năm 2015 nĩ dẫn đến 303.300 cái chết,

giảm so với 366.000 ca tử vong vào năm 1990

Trang 16

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH 3s 30 2 28 2 3 bê 5 & — — ie 5 Sus —n POA H —e Eu Ệ _ 5 os N — PSP EEE EP EE EL LEP PELE EE EE A Hinh 1: Tỷ lệ mắc bệnh TBS từ năm 1945 đến năm 2009 theo phân loại khuyết tật

Hình 2: Phân bố bệnh tìm bẩm sinh trên tồn cầu về số lượng sinh

trên một triệu dân

Trang 17

1.2 Các gen liên quan đến bệnh tim bam sinh:

Bệnh tìm bam sinh cĩ thể là kết quả của biểu hiện sai lệch của các

gen tham gia vào quá trình phát triển tìm Các đột biến trong một loạt các

yếu tố phiên mã, các phân tử tín hiệu phát triển và các phân tử làm thay

đổi chất nhiễm sắc gây ra ít nhất 20% bệnh tật, nhưng nguyên nhân của

hầu hết bệnh TBS vẫn khơng giải thích được

Sự phát triên của tim là một quá trình phức tạp địi hỏi sự tương tác

chính xác của các phân tử tín hiệu, yếu tố phiên mã, đồng yếu tố và protein cấu trúc Cả hai yếu tố di truyền và khơng di truyền đều liên quan

đến bệnh tim bẩm sinh [10]

Tỷ lệ mắc TBS là khoảng 4-6 /1000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ thực sự cĩ thể

là 40/1000 nếu bao gồm van động mạch chủ hai lá [11,12] Mặc dù cĩ những tiến bộ trong chẩn đốn và can thiệp, hiểu biết của chúng ta về nguyên nhân và cơ chế của TBS vẫn cịn hạn chế Trong hai thập kỷ qua,

phân tích liên kết và sảng lọc gen ứng viên đã giúp xác định nguyên nhân

di truyền trong một số trường hợp TBS

Các gen quy định trình tự phát triển phức tạp mới chỉ được làm sáng

tỏ một phần Một số gen cĩ liên quan đến các khuyết tật cụ thể Một số gen cĩ liên quan đến các biểu hiện của tim Đột biến của một protein cơ

tìm, chuỗi nặng d-myosin (MYH6) cĩ liên quan đến khuyết tật vách liên nhĩ [13] Một số protein tương tác với AZYH/6 cũng cĩ liên quan đến các khuyết tật về tim

Yéu tố phiên mã G4742 tạo thành một phức hợp với 78X5 tương tác

với MYHĩ Một yêu tố khác, gen homeobox (phát triển), NKX2-5 cũng

tương tác với M4YHõ Các đột biến của tắt cả các protein này cĩ liên quan

đến cả khuyết tật thơng liên nhĩ va tâm thất; Ngồi ra, KX2-5 cĩ liên

Trang 18

quan đến các khiếm khuyết trong dẫn truyền điện của tim và 7BX5 liên

quan đến hội chứng Holt-Oram bao gồm các khiếm khuyết về dẫn truyền điện và các bất thường của chỉ trên Các đồng yếu tố báo hiệu Wnt BCL9, BCL9L và PYGO cĩ thể là một phần của con đường phân tử này, vì khi

gen của chúng bị đột biến, điều này gây ra các kiểu hình tương tự như

các đặc điểm cĩ trong hội chứng Holt-Oram [14] Một gen T-box khác,

TBXI, cĩ liên quan đến hội chứng DiGeorge, loại bỏ phỏ biến nhất cĩ các triệu chứng bao gồm các khuyết tật của đường dẫn tim bao gồm tứ

chứng Fallot [15]

~_ Hiện nay, các gen liên quan đến bệnh tim bam sinh đã được nghiên

cứu, cụ thể như các gen NOS3; CELA1; NKX2.5; NOTCHI; TBX1;

GAT44 Sau khi sàng lọc đột biến trên trình tự gen của trẻ mắc, chúng, tơi đã tìm thấy gen LRP? được xác định liên quan đến hội chứng Donnai

Barrow và là một yếu tố nguy cơ gây xơ vữa động mạch và các bệnh liên

quan, chẳng hạn như bệnh tim mạch vành và đột quy 1.3 Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân: «Thơng liên nhĩ Hở hàm ếch Teo than

Hội chứng Donnai Barrow

Dị tat tim bam sinh

1.4 Gen gây bệnh:

1.4.1 Giới thiệu chung về gen /RP2:

~ LRP2 Protein được mã hĩa bởi gen này liên quan đến lipoprotein mật độ thấp 2 (RP2) hoặc megalin, là một thụ thể nội bào đa phối tử được

biểu hiện ở nhiều mơ khác nhau nhưng chủ yếu ở các biểu mơ hấp thụ

Trang 19

như thận Glycoprotein này cĩ một miền ngoại bào đầu tận cing amin

lớn, một miền xuyên màng đơn, và một đuơi tế bào chất cĩ đầu tận cùng carboxy ngắn Các miền liên kết phối tử ngoại bào liên kết các đại phân

tử đa dạng bao gồm albumin, apolipoprotein B và E, và lipoprotein lipase Protein LRP2 rat quan trong di véi sy tai hap thu của nhiều phối

tir, bao gdm lipoprotein, sterol, protein liên két vitamin va hormone Protein này cũng cĩ một vai trị trong tín hiệu tế bảo; các phối tử ngoại bào bao gồm hor mon tuyến cận giáp và nhím siêu âm morphogen trong

khi phối tử tế bào bao gồm các protein giàn giáo MAP kinase và các protein tương tác JNK Sự tái tạo của thụ thể màng này được điều chỉnh

bởi quá trình phosphoryl hĩa miền tế bào chất của nĩ Các đột biến trong

gen này gây ra hội chứng Donnai-Barrow (DBS) và hội chứng thận yếu (FOAR)

1.4.2 Cau trie gen LRP2:

- LRP2 nim trén nhiễm sắc thể số 2 (2q31,1) [Hình 3] Cụ thé gen

LRP2 kéo dài 235.489 bp và nằm từ nucleotide 169.127.109 đến nucleotide 169.362.597 trên nhiễm sắc thể số 2

Hình 3: Vị trí gen LRP2 trên NST số 2

~ Lipoprotein (a) là một biến thể lipoprotein mật độ thấp cĩ chứa một

protein gọi là apolipoprotein (a) Các nghiên cứu về di truyền và dịch tễ

học đã xác định lipoprotein (a) là một yếu tố nguy cơ gây xơ vữa động

Trang 20

mạch và các bệnh liên quan, chẳng hạn như bệnh tim mạch vành và đột quy [16;17;18]

Lipoprotein (a) [Lp (a)] bao gồm LDL và apolipoprotein cụ thể (a),

được liên kết cộng hĩa trị với apoB cĩ trong vỏ ngồi của hạt Nồng độ Lp

(a) trong huyết tương cĩ tính di truyền cao và chủ yếu được kiểm sốt bởi gen LP⁄4 nằm trên nhiễm sắc thể 6q 26-27 Các protein Apo (a) khác nhau

về kích thước do sự đa hình về kích thước [KIV-2 VNTR], do một số lần

lặp lại kringle IV thay đồi trong gen L4 Sự thay đơi kích thước này ở cấp

độ gen cũng được biểu hiện trên cấp độ protein, dẫn đến các protein apo (a)

cĩ 10 đến hơn 50 kringle IV lặp lại, mỗi biến đổi kringle IV bao gồm 114 axit amin [19;20] Các kích thước apo (a) biến đổi này được gọi là "apo (a)

isoforms "'

Nhiều nghiên cứu xác nhận mối tương quan chặt chẽ giữa tăng Lp (a)

và bệnh tim đã dẫn đến sự đồng thuận rằng Lp (a) là một yếu tố dự báo độc

lập quan trọng của bệnh tim mạch [16] Các nghiên cứu trên động vật đã

chỉ ra rằng Lp (a) cĩ thể gĩp phần trực tiếp vào tổn thương xơ vữa động mach bằng cách tăng kích thước mảng bám, viêm nhiễm, khơng ơn định và tăng trưởng tế bảo cơ trơn [21] Dữ liệu di truyền cũng ủng hộ lý thuyết rằng Lp (a) gây ra bệnh tim mạch[ 18]

1.5 Hội chứng Donnai - Barrow:

Hội chứng Donnai — Barrow là một rối loạn đi truyền được Dian

Donnai va Margaret Barrow mé ta lan dau tién vao nim 1993 [22] Nĩ cĩ

lién quan dén LRP2 [23] Đây là một rối loạn di truyền ảnh hưởng đến

nhiều bộ phận của cơ thể

Rối loạn này được đặc trưng bởi các đặc điểm bất thường trên khuơn

mặt, bao gồm đơi mắt mở to, nổi bật với các gĩc bên ngồi hướng xuống

dưới; mũi củ cải ngắn với sống mũi tẹt; tai bị xoay về phía sau

Trang 21

Những người mắc hội chứng Donnai — Barrow bi mat thính lực nghiêm

trọng do các bắt thường của tai trong (mát thính giác thần kinh giác quan) Ngồi ra, họ thường gặp các vấn đề về thị lực, bao gồm cận thị cực độ (cận

thị cao), bong trĩc hoặc suy giảm mơ nhạy cảm với ánh sáng ở phía sau của

mắt (võng mạc) và mắt thị lực dần dần Một số cĩ một khoảng trồng hoặc

phân chia ở phần cĩ màu của mắt (u mống mắt) [24;25]

Ở hầu hết những người mắc hội chứng Donnai - Barrow, mơ nối nửa

trái và phải của não (thẻ tích) kém phát triển hoặc khơng cĩ Những người

bị ảnh hưởng cũng cĩ thể cĩ những bắt thường về cấu trúc khác của não

Nhìn chung, họ bị thiểu năng trí tuệ từ nhẹ đến trung bình và chậm phát

triển

Những người bị hội chứng Donnai - Barrow cũng cĩ thé cĩ một lỗ

trên cơ ngăn cách bụng với khoang ngực (cơ hồnh), được gọi là thốt vị cơ hồnh Dị tật bẩm sinh nghiêm trọng tiềm ân này cho phép da dày và ruột đi chuyên vào lồng ngực và cĩ thể chèn ép tim và phổi đang phát triển

Một lỗ hở trên thành bụng cho phép các cơ quan trong 6 bụng nhơ ra qua rốn cũng cĩ thê xảy ra ở những người bị ảnh hưởng Đơi khi những người mắc hội chứng Donnai — Barrow cĩ bất thường về ruột, tìm hoặc các cơ quan khác và chứng vẹo cột sống - Nguyên nhân:

Các đột biến trong gen //&P2 gây ra hội chứng Donnai - Barrow Gen

LRP2 cung cấp hướng dẫn để tạo ra một protein gọi là megalin, cĩ chức

năng như một thụ thể Các protein thụ thể cĩ các vị trí cụ thể mà một số

protein khác, được gọi là phối tử, khớp với nhau như chìa khĩa vào ổ khĩa Củng nhau, các phối tử và các thụ thể của chúng kích hoạt các tín hiệu ảnh

hưởng đến sự phát triển và chức năng của tế bào Megalin cĩ nhiều phối tử tham gia vào các quá trình khác nhau của cơ thể, bao gồm sự hấp thụ

Trang 22

vitamin A và D, chức năng miễn dịch, phản ứng với căng thẳng và vận

chuyền chất béo trong máu

Megalin được nhúng trong màng tế bào lĩt bề mặt và khoang của cơ thể (tế bào biểu mơ) Receptor giúp di chuyển các phối tử của nĩ từ bề mặt

tế bảo vào trong tế bào (endocytosis) Nĩ hoạt động trong sự phát triển và chức năng của nhiều bộ phận của cơ thể, bao gồm não và tủy sơng (hệ thần

kinh trung ương), mắt, tai, phổi, ruột, hệ thơng sinh sản và các ống nhỏ

trong thận, nơi hình thành nước tiểu (ống thận)

Các đột biến gen LRP2 gây ra hội chứng Donnai-Barrow được cho là dẫn đến thiếu protein megalin chức năng Việc thiếu megalin chức năng trong ống thận làm cho các phối tử khác nhau của megalin được bài tiết qua

nước tiểu chứ khơng được hấp thu trở lại vào máu Các đặc điểm của hội chứng Domnai — Barrow cĩ thể là do megalin khơng cĩ khả năng giúp hấp thụ các phối tử này, gián đoạn các đường truyền tín hiệu sinh hĩa hoặc các

tác động khác của protein megalin khơng cĩ chức năng Tuy nhiên, người

ta vẫn chưa rõ những bất thường này dẫn đến các dấu hiệu và triệu chứng

cụ thể của rối loạn như thế nào

Một tình trạng trước đây được phân loại là một rối loạn riêng biệt

được gọi là hội chứng facio-oculo-acoustico-thận (FOAR) cũng đã được phát hiện là do dot bién LRP2 gay ra Hội chứng FOAR hiện được coi là rối loạn tương tự như hội chứng Donnai ~ Barrow

1.6 Cơng nghệ giải mã hĩa tồn bộ hệ gen biểu hiện (WES):

Giải trình tự vùng gen exome (Whole exome sequencing - WES) là một ứng dụng của cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) để xác định các biến thể trên tất cả các vùng mã hĩa trong hệ gen Việc phát hiện các biến dị di truyền giúp phát hiện các biến dị

gây ra bệnh di truyền đã biết, từ đĩ tiến hành sàng lọc ung thư/bệnh di truyền sớm hoặc theo dõi đáp ứng điều trị; cung cấp các biến dị cho nghiên

Trang 23

cứu, đánh giá đa dạng quần thể bằng cách xác định tần số alen WES ngày

càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu bệnh hiểm nghèo, khĩ chuẩn

đốn, khơng phát hiện rõ nguyên nhân như ung thư, tìm mạch, thần

kinh [26]

Ưu điểm của việc giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là phương pháp tiếp cận hợp lý đối với những vùng gen quan tâm hay những vùng exome

chứa gen đột biến, ví dụ exome chỉ chiếm 2% trong hệ gen người nhưng biến đổi trong đĩ lại gây nên 85% các căn bệnh đã biết [27] Do vậy, việc

nghiên cứu lâm sàng các bệnh di truyền hiện nay dựa trên kết quả giải trình

tu WES đã được sử dụng rất phổ biến

Trang 24

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH PHẢN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân và các thành viên trong gia đình bệnh nhân mắc bệnh

tim bẩm sinh tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện E Tắt cả các đối tượng

tham gia nghiên cứu đều được cung cấp đầy đủ thơng tin Mục tiêu nghiên cứu và tham gia nghiên cứu tự nguyện theo đúng quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của tổ chức trong nước và trên thế giới

Tất cả các thơng tin liên quan đến bệnh nhân và nghiên cứu đều được

bảo mật

Nghiên cứu này được sự đồng ý từ gia đình bệnh nhân và đã được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Viện Nghiên cứu hệ

gen thơng qua

2.2 Vật liệu và hĩa chất 2.2.1 Vật liệu

'Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của bệnh nhân tim bẩm sinh và gia đỉnh người bệnh ở Việt Nam được cung cấp bởi Khoa tim mạch - Bệnh viện E

2.2.2 Hĩa chất

Các hĩa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

« Bộ Kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA purification Minikit của hãng Thermo (Mỹ) và QIAamp DNA của hãng QIAGEN dùng

để tách DNA tổng số

« Bộ Kit giải trinh ty WES cua hang Illumina

Trang 25

2.243

Bộ KIT GeneJET Extraction của hãng Thermo (Mỹ) dùng để tỉnh

sạch PCR

Nhĩm hĩa chất dùng cho phan img PCR: Taq DNA polymerase, buffer, dNTP, mdi đặc hiệu

Nhĩm hĩa chất dung cho dién di gel agarose: Gel agarose, dém

TAE 1X, dye, ethydium bromide

'Và một số hĩa chất khác như: nước cắt 1 lần, ethanol, Thiết bị Các thiết bị nghiên cứu bao gồm: Tủ lạnh -20°C Vestfrot (Đan Mạch) May li tâm BioFuge fresco (Đức) Lị vi sĩng Sharp (Nhật Bản) Cân điện tử Precisa ( Thụy Sĩ)

Máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ) Máy chụp Gel BioRad (Đức)

Máy điện đi BioNeer (Nhật Bản) Pipette Gilson (Pháp)

Bề ơn nhiệt Memmert (Han Quốc)

Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan) Máy đo quang phổ (Đức)

Ong đầu cơn hãng Thermo

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu bao gồm các bước chính: thu thập mẫu máu,

tách chiết DNA, giải trình tự tồn bộ vùng gen mã hĩa, phân tích số liệu

nhằm tìm ra đột biến liên quan đến bệnh, sàng lọc và kiểm chứng lại đột

biến gây bệnh theo hình 4

Trang 26

Khĩa luận tốt nghiệp Thu thập mẫu máu b4 Tách chiết DNA b4 Giải trình tự tồn bộ vùng mã hĩa b4 Phân tích số liệu 4 Sang lọc biến thể h4

Wee ey ceuenecactes sacoac TM

Kiểm chứng đột biến trên bệnh nhân và gia đình Khoa CNSH

Hình 4: Quy trình phân tích và sàng lọc đột biến

~ Thu thập mẫu máu:

Mẫu máu của bệnh nhân và các thành viên trong gia đình bao gồm

bố, mẹ và anh, chị, em bệnh nhân được cung cấp bởi Khoa Tim mạch -

Bệnh viện E Hà Nội, sau khi được sự đồng ý của bố mẹ bệnh nhân Mỗi đối tượng tham gia nghiên cứu được thu thập 2 ml máu tĩnh mạch, chống

đơng EDTA 1,5 mg/ml Tắt cả mẫu máu sau đĩ được bảo quản ở nhiệt độ

-20°C

Trang 27

- Tach chiét DNA và giải trình tự tồn bộ vùng mã hĩa của một

số bệnh nhân mắc đị tật tìm bẩm sinh:

Mẫu máu của các bệnh nhân và thành viên trong gia đình được tách

chiết bằng bộ kit QIAamp DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản

phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

và đo quang phơ để xác định nồng độ và độ tỉnh sạch 2.3.1 Phương pháp tách DNA tổng số

DNA tổng số được chiết xuất từ các mẫu máu tồn phần bằng bộ

kit QlAamp DNA Blood Mini Kit-QIAGEN Phương pháp này bao gồm

các bước sau:

«Bước l: Dùng pipet lấy 20 ul QLAGEN Protease (hoặc proteinase K) vào đáy của ống ly tâm 1,5 ml

©_ Bước 2 Cho 200 ul mẫu máu tồn phần vào ống ly tâm

«_ Bước 3: Thêm 200 l Buffer AL vào mẫu Trộn đều trong 15 giây

« Bước 6: Thêm 200 ul ethanol (96-100%) vao mau va tron trong 15

giây Sau khi trộn, ly tâm nhanh để loại bỏ các giọt bên trong nắp

œ_ Bước 7: Cân thận chuyển hỗn hợp từ bước 6 lên cột QIAamp Mini (trong ống thu 2 ml) Day nắp và ly tâm ở tốc độ 6000 x g (8000 vịng / phúU) trong 1 phút Đặt cột vào một ống 2 ml sạch và loại bỏ dch

ô_ Bc Đ: Cn thn mở cột và thêm 500 yl Buffer AW1 Day nap va ly tâm ở tốc độ 6000 x g (8.000 vịng / phút) trong 1 phút

« Bước 10: Cẩn thận mở cột và thêm 500 ul Buffer AW2 Day nap

và ly tâm ở tốc độ tối đa (14.000 vịng / phút) trong 3 phút

Trang 28

« Bước 12: Đặt cột vào một ống ly tâm 1,5 ml sạch và loại bỏ hồn tồn dịch lọc Cẩn thận mở cột và thêm 200 pl Buffer AE hoặc nước cắt Ù ở nhiệt độ phịng (15-25°C) trong 1 phút, và sau đĩ ly tâm ở 6.000 x g(8.000 vịng / phúU trong 1 phút

Sau khi cĩ mẫu DNA, mẫu DNA sẽ được điện di trên gel agarose 19 Mẫu được nhuộm Ethidium bromide trong 3 đến 5 phút và rửa bằng nước

cất trong 2 đến 3 phút Cuối cùng quan sát bản gel dưới tia UV

Sau đĩ, sản phẩm DNA tổng số được đo quang phổ đề xác định

nơng độ và độ tỉnh sạch

2.3.2 Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA tổng số

Kiểm tra nồng độ DNA là một bước khơng thể thiếu trong quá trình

tách chiết DNA vì số lượng và chất lượng DNA cĩ thể ảnh hưởng đến

chất lượng PCR Biết được nồng độ DNA sẽ dễ dàng tính tốn được số

lượng cần thiết Enzyme Tag polymerase dùng để nhân đúng số lượng

DNA mong muốn và cĩ kết quả chính xác cao Phương pháp dùng trong nghiên cứu này là đo quang phổ DNA Nguyên tắc của phương pháp nay dựa vào sự hấp phụ ánh sáng khác nhau của các bazo nito của phân tử DNA mach kép và mạch đơn đề xác định hàm lượng DNA trong dung dịch Phân tử DNA hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sĩng 260 nm Giá trị mật độ quang ở bước sĩng 260 nm của các mẫu cho phép xác định

nồng d6 nucleic acid trong dung dich

Đơn vị Azøm tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dich

DNA sợi đơi Nong độ DNA trong mẫu được tính theo cơng thức sau:

Coa (ng/ml)= A26onm X 50 x Độ pha lỗng

Trang 29

Để kiểm tra độ tỉnh sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở

280 nm (Assom„) Ở bước sĩng này, các protein cĩ mức hấp thụ cao nhất Ngồi ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sĩng 260nm như các

nucleic acid và do đĩ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid được coi là sạch (khơng tạp nhiễm protein)

khi tỷ số: Azsò Azsoam nằm trong khoảng 1,8-2

Các bước đo OD:

* Chuan bj miu DNA đo OD: Hịa 10 ml dich DNA cần đo vào 90 ml nước khử ion vơ trùng (pha lỗng 10 lần)

© Đo đối chứng: Lấy 100 ml nước khử ion vơ trùng vào cuvet, đo ở bước sĩng 260 nm, 280 nm © Do mau: Lấy 100 ml mẫu DNA đã chuẩn bị ở trên vào cuvet, đo ở bước sĩng 260 nm, 280 nm «Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sĩng 260 nm, 280 nm 2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose Nguyên lý:

Điện di là kỹ thuật tách các phân tử dựa trên điện tích, kích

thước và hình dạng của chúng trên gel Trong phương pháp điện di trên gel, các phân tử DNA cĩ điện tích âm, được kéo qua một lớp gel

mỏng nhờ một dịng điện từ phía cực dương trong buồng điện di

Thơng thường, gel cĩ chứa một phần đường của thạch tỉnh

khiết gọi là agarose, chất này ngồi việc làm gel đồng nhất hơn nĩ cịn

hoạt động như một rây phân tử, làm tách biệt các đoạn dựa trên kích

thước của chúng khi trong điện trường

Trang 30

Các đoạn DNA cảng nhỏ sẽ chuyển động càng nhanh và càng xa so với các đoạn lớn Để xác định kích thước của một đoạn DNA, người ta so sánh với các đoạn DNA tiêu chuẩn (Marker)

Nơng độ gel agarose được sử dụng khác nhau mà tùy thuộc

vào thí nghiệm cần nghiên cứu, thường nằm trong vùng khoảng 0,8

— 1,5%

Để hiện hình các băng DNA trên bảng gel, người ta thường sử

dụng thuốc nhuộm Ethydium bromide (EtBr) Chất này liên kết với DNA bằng cách xen vào giữa và kế sát cặp bazo (liên kết nhuộm)

Khi chiếu UV vào bản gel, các liên kết nhuộm sẽ hấp thụ và phát

huỳnh quang, cĩ thể nhận thấy bằng mắt thường hoặc chụp ảnh

Quy trình:

- Chuan bj gel agarose:

* Can 0,8 g agarose cho vào100 ml dung dịch đệm TAE IX * Dun hén hgp trén 1 vi song cho dén khi dung dich trong suốt, © Dé nguội xuống khoảng 50°C rồi đồ dung dịch agarose vio ăn lược khay điện di cĩ c

e Để khoảng 30 phút gel đơng đặc hồn tồn, gỡ lược ra và

đặt bản gel vào bề mặt điện di Đỗ đệm TAE 1X vào bề mặt

dung dịch ngập cách mặt gel 1-2 mm

- Tramau DNA:

(Chat này vừa cĩ tác dụng tạo màu để quan sát, vừa cĩ tác dụng giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trước khi

chạy điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong bản gel

- Chay dign di:

Trang 31

«Tiến hành điện đi mẫu DNA với thang DNA chuẩn ở hiệu điện

thế 100 V trong 30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực

dương Quan sát sự đi chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào dừng điện di

- Nhu6m ban gel điện đi bằng EtBr:

«Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuơn và ngâm vào dung dịch EtBr nơng độ 2 wI/ml trong thời gian 5-10 phút Sau

đĩ lấy bản gel ra tráng qua nước khoảng 3-5 phút rồi quan

sát chụp ảnh dưới ánh sáng tỉa tử ngoại của máy soi chụp

gel (Bio — Rad)

2.3.4 Phương pháp giải trình tự vùng gen mã hĩa Các bước thực hiện như sau:

~ Bước ]: Phân tích dữ liệu giải trình tự đẻ xác định biến đổi di truyền ~ Bước 2: Tạo thư viện bằng SureSelect All Exon V6

DNA tổng số sau khi được phân mảnh, lai và tỉnh sạch bằng SureSeleet All Exon Võ để gắn được tắt

sản xuất IIlumia

các exome đã biết theo hướng dẫn của nhà

- Bước 3: Giải trình tự thế hệ mới IIlumina

Thư viện lai exome sau khi được xử lý, được tiến hành giải trình tự trên

máy giải trình tự thế hệ mới IIlumina

DNA tổng số sẽ được cắt, lai và tỉnh sạch bằng SureSelect All Exon

V6 đề tạo thư viện exome theo hướng dẫn của nhà sản xuất IIlumina Thư

viện exome sau khi được xử lý, được tiến hành giải trình tự trên máy giải

trình tự thế hệ mới Illumina theo hướng dẫn của nhà sản xuất IIlumina

Kiểm định chất lượng đọc ban đầu bằng phần mềm FastQC Bước này đặc

biệt quan trọng vì nĩ đảm bảo cho các bước phân tích tiếp theo

~ Xác định và chú giải biến thể:

Trang 32

Sau khi giải trình tự trên máy IIlumina, chất lượng đọc được kiểm tra

bằng phần mềm FastQC Dữ liệu trình tự được sắp xếp và so sánh với trình tự gen người (hg19) bằng phần mềm BWA 0.7.10 (Li and Durbin, 2009)

[31] Cơng cụ Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) được sử dụng để xử lý dữ liệu sau khi giĩng hàng Các biến thể được phát hiện bằng phần

mém Genome Analysis Toolkit v3.4 (McKenna et al., 2010) [28] Anh

hưởng của biến thể được xác định bằng các phần mềm SnpEff v4.1

(Cingolani et al., 2012) [29] Đây là cơng cụ chú thích và dự báo ảnh

hưởng của các biến thể gen (như thay đổi axit amin) Dữ liệu đầu vào của

cơng cụ này là các biến thể được dự đốn (SNPs, chèn, xĩa và MNP), là kết quả của giải trình tự, và cĩ định dạng VCF (Variant Call Format)

Trong dữ liệu đầu ra, SnpEff sẽ phân tích các biến đầu vào đề chú giải và

tính tốn các tác động mà các biến thê cĩ thể tạo ra SnpEff đưa ra các kết

quả như sau: Kiểu gen và các điểm bị ảnh hưởng bởi biến thể; vị trí của các

biến thể; ảnh hưởng của biến thẻ đến quá trình tổng hợp protein; so sánh

với các dữ liệu khác đề tìm các biến thể đã biết

- Sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh tim kèm dị tật khác:

Sau khi phân tích, các biến thể được sàng lọc theo các tiêu chí sau:

+ Biến thê xảy ra trên các gen đã được cơng bố là liên quan đến bệnh dị tật

tim bam sinh

* Biến thể cĩ tần suất alen MAF < 1% Tần suất alen của biến thể được

tham khảo dựa trên bộ cơ sở dữ liệu 1000 hệ gen người (1000 Genomes Project)

* Lọc các biến thể dự đốn là cĩ ảnh hưởng đến chức năng của protein

+ Những đột biến được báo cáo là lành tính trên cơ sở dữ liệu ClinVar bị loại bỏ

iém chứng các đột biến trên bệnh nhân và thành viên gia đình:

Trang 33

Các đột biến tiềm năng gây bệnh tìm được được kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên cả bệnh nhân và gia đình nhằm xây dựng phả hệ và nghiên cứu cơ chế di truyền của bệnh

2.3.5 Thiết kế mỗi nhân đoạn gen chứa các đột biến cần kiểm nghiệm Cặp mơi khuếch đại gen được thiết kế dựa trên trình tự gen #P2 cĩ

mã số là ENSG00000081479 từ cơ sở dữ liệu Ensembl Cặp mỗi phù hợp cần đạt các tiêu chí sau:

5 Bám một cách chính xác vào DNA mẫu;

+ _ Chiều dài cặp mỗi phù hợp, thường từ 18-30 nucleotide;

*_ Ti lệ %GC phù hợp, thường từ 50-60%;

+ _ Tránh hình thành dạng xoắn cặp tĩc, cặp mơi tránh bắt cặp với nhau;

+ _ Nhiệt độ nĩng chảy của mỗi Tm nhỏ hơn nhiệt độ của Taq

polymerase, thường nằm trong khoảng 50-60°C

Trong nghiên cứu này, cặp mỗi khuếch đại gen được thiết kế bằng cơng

cụ Primer - BLAST

LRP2 14 F 5'-AGGGAGCATACTTCTTTTGTGTATC-3' LRP2 14 R 5`-CTGAGGAGTCCCTGCAATCA-3"

Kích thước đoạn gen được khuếch đại bằng cặp mơi trên là 240 bp

Gen LRP2 cĩ nucleotide thay đổi: c.428-10 428-8del[TTT

Mỗi sử dụng: Mỗi xuơi: 5'-AGGGAGCATACTTCTTTTGTGTATC-3' Mỗi ngược: 5'-CTGAGGAGTCCCTGCAATCA-3'

2.3.6 Kỹ thuật PCR

2.3.6.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction, được dịch là

“Phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “Phản ứng khuếch đại gen” Phương

Trang 34

pháp PCR được nhà kha học người Mỹ Kary Mullis cùng cộng sự phát minh, nam 1985 [30]

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà khơng cần sử dụng các sinh

vat séng nhu E coli hay nam men PCR dugc sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện

các bệnh di truyền [32], nhận dạng, chuẩn đốn những bệnh nhiễm trùng,

tách địng gen và xác định huyết thống [33]

Đây là phương pháp z viro được sử dụng các cặp mơi đề tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase Nguyên tắc PCR dựa trên cơ sở tính chất

biến tính và hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA Trên cơ sở

trình tự của đoạn DNA khuơn (DNA khuơn, DNA đích - target

sequence), doan mỗi (primer), các nucleotid tự do (đNTP) và Enzyme DNA Polymerase cĩ thể tổng hợp được đoạn DNA giới hạn bởi các đoạn

mỗi Lặp lại nhiều lần các chu kỳ nhân gen, trong một khoảng thời gian ngắn số lượng DNA tạo thành tăng theo cấp số nhân [34] PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu ky (cycle) kế tiếp nhau

Quy trình PCR cĩ khoảng 20-35 chu kỳ liên tiếp, mỗi chu kỳ bao gồm

3 giai đoạn:

các đoạn dài gồm nhiều nucleiotid giống nhau Do vậy

đặc điểm DNA khuơn đề lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp Giai đoạn này kéo đài 1-2 phút

Trang 35

Chargaff Giai đoạn này khoảng 30-60 giây

Điều kiện hoạt động của Enzyme DNA polymerase Enzyme DNA

polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào

cuối đoạn mơi, các mỗi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch

khuơn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA Thơng thường, với thời gian 1 phút, tổ

hợp được những đoạn DNA kích thước dưới 2 kb Để phản ứng PCR thành cơng cần cĩ các thành phần sau:

e Mỗi đặc hiệu 2 loại xuơi ngược: mỗi mỗi dài khoảng 15 - 30 nucleotid, các nucleotid ở 2 đầu khơng tự bắt cặp với nhau

« dNTP bốn loại

enzyme Rnase và Dnase * Enzyme Tag polymerase

Tổng thể tích cho một phản ứng PCR từ khoảng 20 - 50 pl 2.3.6.2 Nhân đoạn gen LP2 bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen được tiến hành với thành

phan được trình bày như bang 1:

Trang 36

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Bảng 1: Các thành phần phản ứng của quá trình PCR Thành phần phản Nồng độ Thể tích (wl) ứng Nước đã khử nuclease 18,5 ul Buffer 10X 2,0 ul dNTP 10 mM/ ul 1,0 ul Mỗi xuơi 10 mM ul 1,0 pl Mỗi ngược 10 mM/ ul 1,0 pl

Tag polymerase 1U/pl 1,0 pl

Trang 37

2.3.6.3 Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR được thực hiện trên máy

GeneAmp PCR System 9700 thơng qua 3 giai đoạn (Hình 5):

~ Giai đoạn 1: biến tính, tháo xoắn DNA ở 95°C trong 3 phút

- Giai đoạn 2: khuếch đại DNA qua 3 bước: biến tính DNA ở 95°C trong 1 phút, sau đĩ gắn mỗi ở 60,5°C trong 1 phút và kéo dài chuỗi ở 72°C trong

1 phút Lặp lại các bước theo thứ tự này 30 lần

- Giai đoạn 3: tổng hợp chuỗi DNA mới ở 72°C trong 8 phút, sau đĩ mẫu được bảo quản ở 4°C

Tổng thời gian thực hiện phản ứng PCR là khoảng hơn 2h Sau khi

kết thúc quá trình PCR, sản phẩm PCR được điện di kiểm tra kết quả

2.3.7 Phương pháp tỉnh sạch sản PCR Nguyên lý:

Dựa trên việc liên kết cĩ chọn lọc của lớp mảng silica với DNA sợi đơi trong mơi trường cĩ bố sung các dung dịch muối thích hợp Hỗn hợp sản phẩm PCR cùng với dung dịch đệm Binding được cho lên cột Các

phân tử DNA sợi đơi sẽ liên kết với màng silica ở trong cột Các tạp chất

sẽ được loại bỏ qua quá trình rửa Sau khi tỉnh sạch, hịa tan DNA trong

dung dịch nồng độ muối thấp hoặc nước [35] Sản phẩm DNA phù hợp

cho giải trình tự DNA huỳnh quang tự động, phản ứng enzyme giới hạn và nhân dịng

Kết thúc PCR, sản phẩm thu được cĩ lẫn những tạp chất như mơi,

đệm PCR, các nucleotide, cịn dư và đơi khi cịn chứa các sản phẩm

phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình giải trình tự gen Do vậy, cần

tiến hành tỉnh sạch sản phẩm PCR trước khi giải trình tự gen Tại Viện Nghiên cứu hệ gen, chúng tơi sử dụng bộ Kit GeneJET Gel Extraction

của hãng Thermo đề tỉnh sạch sản phẩm sau PCR

Quá trình tỉnh sạch theo các bước sau:

Trang 38

«Bước l: điện di sản phẩm PCR trong 30 phút, hiện hình dưới tỉa

UV, dùng dao cắt băng DNA mong muốn cho vào ống eppendorf

1,5 ml Cn cdc bang gel agarose trong ống Lưu ý: cân ống trước và sau khi cho băng vào ống

Binding - Buffer cho méi 100mg agarose gel

«Bước 3: Ủ ống trong bể ổn nhiệt ở 50 - 60°C cho đến khi gel tan

hồn tồn

sạch của hãng GeneJET và để trong vịng 2 phút ở nhiệt độ phịng Sau 2 phút, ly tâm 10.000 vịng trong 1 phút đến khi lượng dung dịch trong cột xuống đáy ống (nếu lượng dung dịch nhiều cần chia thành nhiều lần hút, mỗi lần 800 gl rồi ly tâm cho đến khi hết

lượng dung dịch trong ống) Sau li tâm loại bỏ hết phần địch ở đáy

ống, thu cột

« Bước 5: bd sung 10 pl Binding Buffer vào cột, tiếp tục li tâm

10.000 vịng trong 1 phút Loại bỏ hết dịch đáy ống, thu cột

« Bước 6: bổ sung 700 ul Wash Buffer cho vào cột Lỉ tâm trong 1 phút, loại bỏ hết phần dịch đáy ống, thu cột

« Bước 7: Ly tâm cột thêm 1 phút để lượng Wash Buffer hồn tồn

trơi qua cột, tránh làm ảnh hưởng đến chất lượng DNA Loại bỏ

dịch đáy ống, thu cột

nhiệt độ phịng rồi ly tâm 10.000 vịng trong 1 phút để tỉnh sạch hồn tồn đoạn DNA mong muốn Sau ly tâm, thu phần dịch dưới

đáy ống eppendorf, bỏ cột

Trang 39

« Bước 9: DNA sau khi được tỉnh sạch cần được bảo quản ở -20°C,

dùng 3 - 5 wl mau đi điện di kiểm tra, chạy điện di bằng gel agarose 0,8 % trong 30 phút, sau đĩ nhuộm bằng EtBr trước khi chụp ảnh dưới tia UV trên máy Bio Rad Sản phẩm PCR tỉnh sạch sẽ được dùng để giải trình tự vùng gen mã hĩa

Trang 40

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH PHAN II: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu thập mẫu máu

Hồ sơ và mẫu máu bệnh nhân được cung cấp bởi đề tài Nghiên cứu khoa học cơ bản của Viện Nghiên cứu hệ gen Đối tượng được lựa chọn

là mẫu máu của bệnh nhân mắc bệnh tim bẩm sinh Mẫu máu sau khi thu

thập được chúng tơi bảo quản ở nhiệt độ -20°C

3.2 Xác định nồng độ tỉnh sạch DNA

Sau khi tiến hành điện di kiểm tra, mẫu DNA tổng số được đo OD ở

bước sĩng 260 nm và 280 nm để xác định nồng độ DNA và kiểm tra độ

tỉnh sạch Các nucleotide hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sĩng 260 nm Giá trị mật độ quang ở bước sĩng 260 nm (A260 nm) của các

mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu theo cơng thức đã

nêu ở phần phương pháp:

CDNA(ng/ tl) = A260 nm x 50 x độ pha lỗng

Để kiểm tra độ tỉnh sạch của dung dịch, chúng tơi đã đo thêm giá trị mật độ quang ở bước sĩng 280 nm (A280 nm) A280nm là bước sĩng ở đĩ các protein cĩ mức hấp thụ cao nhất Một dung dịch DNA đực xem là

sạch khi tỷ số A260 nm/A280 nm DNA nằm trong khoảng 1,8 - 2 Tuy nhiên, trong một số trường hợp tỷ lệ này cĩ thể thấp hon 1,8 một chút,

vào khoảng 1,5 — 1,7 thì DNA tổng số vẫn hồn tồn đủ tiêu chuẩn để

làm khuơn cho phản ứng PCR

Trong nghiên cứu này, giá trị A260nm/A280nm và nồng độ DNA

được thề hiện như sau:

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	7,46 MB