Thiết kế và thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ bộ gen Canine Parvovirus tại Việt Nam

MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Khả ứng dụng đề tài CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Nơi thực 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 2.3.2 Các hóa chất sử dụng 10 2.4 Phương pháp nghiên cứu 10 2.4.1 Thu thập trình tự mẫu 10 2.4.2 Sắp gióng cột trình tự 10 2.4.3 Thiết kế mồi 11 2.4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi sau thiết kế 11 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC 16 3.1 Thu trình tự mẫu 16 3.2 Kết thiết kế mồi 17 3.3 Ket kiểm tra PCR chuẩn hóa độ đặc hiệu mồi 21 3.3.1 Kết kiểm tra khả bắt cặp mồi phản ứng PCR 21 3.3.2 Ket chuẩn hóa quy trình độ đặc hiệu mồi 23 3.3.3 Kết kiểm tra vũng overlap 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC • CHỮ VIẾT TẤT CPV Canine parvovirus PCR Polymrase Chain Reaction FPV Feline panleukopenia virus MEV Mink enteritis virus RPV Racoon parvovirus DNA Deoxyribonucleotide ssDNA Chuỗi DNA sợi đơn (single strain DNA) NS1 Phi cấu trúc (Non structural 1) NS2 Phi cấu trúc (Non structural 2) RCR Rolling Circle Replication TFRC Transferrin receptor ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay KN Kháng nguyên (antigen) KT Kháng the (antibody) dNTP Deoxy nucleoside triphosphat TAE Tris Acetate Elution Tm Nhiệt độ nóng chảy (Melting temperature) NCBI National Center for Biotechnology Information BLAST Basic Local Alignment Search Tool DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Vị trí bắt cặp mồi 20 Hình 3.2 Ket kiểm tra độ khuếch đại mồi 23 Hình 3.3 Ket chuẩn hóa nồng độ mồi 25 Hình 3.4 Ket chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp mồi 27 Hình 3.5 Ket độ đặc hiệu mồi 30 Hình 3.6 Ket giải trình tự tốt 31 Hình 3.7 Kết BLAST trình tự NCBI .31 Hình 3.8 Vùng overlap giũa cặp mồi 32 DANH MỤC BẢNG BIỂU • Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sử dụng Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng .9 Bảng 2.3 Danh mục hóa chất sử dụng 10 Bảng 2.4 Các thành phần cho phản ứng PCR 12 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng 13 Bảng 2.6 Các thành phần phản ứng PCR với nồng độ mồi 30 pmol 14 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng 15 Bảng 3.1 Các trình tự full genome Canine parvovirus 16 Bảng 3.2 Các cặp mồi thiết kế 19 Bảng 3.3 Các thông số mồi 21 Bảng 3.4 Các mồi thay 22 Bảng 3.5 Kích thước sản phẩm PCR 22 Bảng 3.6 Nhiệt độ nóng chảy mồi 27 Bảng 3.7 Nồng độ mồi nhiệt độ bắt cặp thích họp cho mồi 29 CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Theo nghiên cứu, chó lồi người hóa sớm lồi động vật Chúng lồi vật thơng minh, trung thành gắn liền với hoạt động xã hội người trông nhà, làm thú cảnh, trở thành người bạn thân thiết gia đình, v.v Từ đó, nhu cầu việc ni chó chăm sóc chó ngày xem trọng tăng cao, bên cạnh việc xuất dịch bệnh lây truyền chó giới quan tâm Bệnh chó đa dạng, kể đến bệnh dại, bệnh ngồi da, bệnh hơ hấp, v.v Trong đó, bệnh đường tiêu hóa bệnh phổ biến giống chó lưu hành nay, khơng chữa trị kịp thời dẫn đến tử vong Đặc biệt bệnh tiêu chảy cấp tính Canine parvovirus (CPV) gây CPV lồi virus gây bệnh chủ yếu chó, chúng dễ lây lan từ chó sang chó qua đường trực tiếp lẫn gián tiếp Chó dễ mắc bệnh CPV gây loại chó trưởng thành có sức đề kháng yếu Khi mắc bệnh, chó có trạng thái lờ đờ, nơn máu tiêu máu Tình trạng bệnh thường tiến triển nhanh khiến nhiều chó lẫn chó chưa tiêm chủng vaccine tử vong nhanh Hiện nay, vaccine phương pháp hữu hiệu việc phịng bệnh CPV gây chó Dần đến nghiên cứu việc giải trình tự full genome CPV ngày nhiều cần thiết để tìm loại vaccine thích họp cho việc điều trị Nhưng nghiên cứu cịn nhiều sai sót mồi chưa thích họp cho giải trình tự chủng khác vị trí địa lý khác Các mồi sử dụng chưa đảm bảo tính đặc hiệu độ xác cao dẫn đến sai sót trong trình giải trình tự full genome Từ lý trên, đề xuất đề tài “Thiết kế thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ gen Canine parvovirus Việt Nam” 1.2 Mục tiêu đề tài Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ gen Canine parvovirus 1.3 Khả ứng dụng đề tài Tiếp tục thực nghiên cứu việc thiết kế đoạn mồi F1 R4 phục vụ cho việc giải trình tự đầy đủ gen Canine parvovirus CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Noi thực Đe tài thực phịng thí nghiệm Vi sinh vật, Khoa Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực đề tài từ tháng 6/2020 - 9/2020 2.2 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế mồi PCR phục vụ nhu cầu giải trình tự gần đầy đủ gen CPV Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế chủng CPVs phân lập Việt Nam 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sử dụng STT Tên thiết bị Tủ lạnh Tủ mát Tủ sấy Máy ly tâm lạnh Máy PCR Cân Lị vi sóng Tủ -80 °C STT 10 11 12 13 14 15 16 Tên thiết bị Máy điện di Máy soi gel Máy vortex Máy spindown Máy lắc ủ nhiệt Máy soi Máy hấp Máy ảnh Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng STT Tên dụng cụ Găng tay Khâu trang Pipet ỏng hút loại Đầu tip Giấy bạc Cuộn bọc thực phẩm STT 10 11 12 13 14 Tên dụng cụ Bình xịt cồn Đèn cồn Khay đựng tip, eppendorf Đá khô Tube, eppendorf loại Dao, kéo Quẹt lửa 2.3.2 Các hóa chất sử dụng Bảng 2.3 Danh mục hóa chất sử dụng STT Tên hóa chât Nước cất Phosphate Buffered Saline Deion Water (DW) Cồn 70 Cồn 96 6X Gelred loading dye buffer STT 10 11 12 Tên hóa chât MyTaq Mix Agarose TAE 50X Primer Hyper Ladder 10 kbp TopPURE®Genomic Extraction kit 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thu thập trình tự mẫu Sử dụng nguồn sở liệu National Center for Biotechnology Information (NCBI) để thu nhận gen đầy đủ Canine parvovirus Các từ khóa tìm kiếm sử dụng “Canine parvovirus, complete genome” Các trình tự sau thu nhận lưu định dạng file FASTA 2.4.2 Sắp gióng cột trình tự Sau thu nhận trình tự, ta sử dụng phần mềm CLUSTAL X 2.1 BioEdit 7.2 để so sánh điểm tương đồng vùng trình tự Bước 1: khởi động phần mềm CLUSTAL X 2.1 Bước 2: nhấn File/Load sequences, chọn file Fasta trình tự full genome tìm Bước 3: chọn Alignment/Do complete alignment, chờ 15 đến 20 phút để thu kết so sánh vùng trình tự Bước 4: kết trực tiếp dẫn qua phần mềm BioEdit 7.2 Từ đó, ta xác định vùng bảo tồn trình tự bắt đầu thiết kế mồi 10 2.4.3 Thiết kế mồi Sau xác định vùng bảo tồn, ta sử dụng phần mềm Primer-BLAST để thực việc thiết kế mồi chọn cặp mồi thích hợp Bước 1: truy cập vào phần mềm Primer-BLAST theo đường dẫn https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi Bước 2: chọn vùng trình tự kích thước sản phẩm mong muốn để tạo đoạn mồi thích họp Bước 3: chọn thơng số kỹ thuật để tạo đoạn mồi khuếch đại vùng trình tự mong muốn Chọn kích thước sản phẩm PCR (PCR product) nằm khoảng từ 100 - 1500 bp Nhiệt độ nóng chảy nằm từ khoảng 50 - 65 °C Khoảng cách nhiệt độ nóng chảy hai mồi khơng vượt q °C Bước 4: nhấn Get Primers để bắt đầu việc thiết kế mồi chọn đoạn mồi thích họp với điều kiện đặt Sau thiết kế, ta gửi thơng số trình tự cặp mồi cho công ty Phù Sa PHUSA Bio-Chemistry Co.,Ltd (Website: http://www.phưsabiochem.com/vi/.html) thực việc tổng họp tạo mồi 2.4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi sau thiết kế Sử dụng mẫu định danh Canine parvovirus thu nhận từ phòng khám Thú y Thành phố Hồ Chí Minh nhóm nghiên cứu Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy chó DNA tách chiết theo TopPURE®Genomic Extraction kit cho virus sản xuất công ty TNHH Giải pháp y sinh ABT: Bước 1: huyền phù mẫu 200 pL PBS Thêm 20 pL Proteinase K Bước 2: thêm 200 pL CL buffer, vortex ủ khoảng 10 phút 60 °C 11 phát CPV nhóm nghiên cứu bao gồm mẫu: 21, 24, 25, 30, 31 để kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi DNA mẫu tách chiết tiến hành PCR với cặp mồi theo thứ tự Fl/Rl, F2/R2, F3/R3, F4/R4 với thứ tự mẫu xếp theo 21, 24, 25, 30, 31 Việc cặp moi F1/R1 F4/R4 khơng cho kết sản phẩm, vùng trình tự tưong đồng khơng thích họp với chủng CPVs phân lập Việt Nam (Phụ lục 2) Vì thế, chúng tơi thay mồi Fl, R4 mồi NSFext 4823R (Bảng 3.4, Hình 3.2) Bảng 3.4 Các mồi thay Mồi Vị trí Mồi thay Vị trí thay Trích dẫn Parvo F1 (+), - 30 NSFext (+), 206 - 227 Parvo R4 (-), 5.016-4.996 4823R (-), 4.823 -4.800 Tiến hành PCR lại với DNA mẫu tách chiết với cặp mồi theo thứ tự NSFext/Rl, F2/R2, F3/R3, F4/4823R Kích thước sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,2% (Hình 3.2, Bảng 3.5) Kết sản phẩm PCR đối chứng với thang chuẩn kích thước 10 kbp Bảng 3.5 Kích thước sản phẩm PCR Các cặp mồi Độ dài sản phẩm (bp) NSFext/Rl 1.024 Parvo F2/R2 1.427 Parvo F3/R3 1.358 Parvo F4/4823R 1.193 22 NSFext - R1 M 21 24 25 30 31 M 24 21 25 24 25 30 31 F4 - 4823R F3-R3 M r 21 F2-R2 L— 30 31 Hình 3.2 Kết kiểm tra độ khuếch đại mồi Kết sản phẩm điện di cặp mồi theo thứ tự NSFext/Rl, F2/R2, F3/R3, F4/4823R 1.024 bp, 1.427 bp, 1.358 bp, 1.193 bp Band điện di lên với kích thước lý thuyết dự đốn (Bảng 3.5), chứng tỏ độ đặc hiệu cặp moi F3/R3 F2/R2 thiết kế thành công mặc dũ band lên mờ xuất hiện tưọng smear Đối với cặp mồi NSFext/Rl F4/4823R cho lên kết sản phẩm PCR, điều chứng tỏ đoạn mồi RI F4 thiết kế cho kết tốt, thích họp cho việc thực PCR phục vụ giải trình tự CPV Tuy nhiên, đoạn mồi NSFext 4823R thuộc nghiên cứu Ruben Pérez công bố vào năm 2014 4, vậy, đề tài cịn hạn chế chưa thể thiết kế đầy đủ mồi giải trình tự full genome CPV 3.3.2 Kết chuẩn hóa quy trình độ đặc hiệu mồi Mục đích thí nghiệm để chuẩn hóa nồng độ mồi nhiệt độ bắt cặp mồi để từ quy trình thích họp cho cặp mồi thiết kế 23 Sau xác định độ khuếch đại mồi, tiếp tục lấy DNA mẫu CPV để thực PCR chuẩn hóa nồng độ mồi nhiệt độ bắt cặp mồi 3.3.2 í Kết chuẩn hóa nồng độ mồi Chuẩn hóa nồng độ mồi tương tự với PCR kiểm tra độ khuếch đại, chọn mẫu CPV để thực xác định nồng độ primer thích họp Thực pha lỗng nồng độ mồi có từ số liệu nhà sản xuất 100 pmol/pL xuống thành 10 pmol/pL Thay đổi nồng độ 30 pmol, 20 pmol, 15 pmol, 10 pmol, pmol tương đương với liều lượng thể tích pL, pl, 1,5 pL, pl, 0,5 pL xếp mẫu theo thứ tự nồng độ liệt kê Tiêu chuẩn để lựa chọn kết điện di xem tốt phải thỏa mãn điều kiện band lên sáng, rõ không bị smear việc xuất vệt kéo dài band điện di cho sản phẩm phụ không mong muốn kết giải trình tự xuất trình tự khơng thể xác định, gây nhiễu q trình giải trình tự Kết sản phẩm PCR hiển thị Hình 3.3 chuẩn với thang 10 kbp Ket cho thấy thay đổi nồng độ mồi cặp mồi cho kết điện di lên band với kích thước lý thuyết dự đoán (Bảng 3.5) Đối với cặp mồi NSFext/Rl, nồng độ 30 pmol cho band lên to, sáng nhiên có tượng smear rõ rệt, cịn nồng độ 20 pmol cho band có độ dày to, bị smear kéo vệt gel điện di, nồng độ 15 pmol cho band lên sáng nhất, kích thước band vừa phải nhiên xuất hiện tượng smear đầu Ở hai nồng độ 10 pmol pmol cho kết điện di band lên rõ, sáng, độ dày band vừa Ket thu nhận nồng độ thích hợp cho cặp mồi NSFext/Rl từ - 10 pmol, thích hợp sử dụng nồng độ pmol tiết kiệm lượng mồi sử dụng đảm bảo kết sản phẩm tốt để thực việc giải trình tự 24 Ở cặp mồi F2/R2, nồng độ 30 pmol cho lên band điện di dày, to, tượng bị smear lớn, không đáp ứng điều kiện đánh giá band lên kết tốt Nồng độ 20 pmol cho kết band điện di sáng, rõ, hoi dày tượng smear Tại nồng độ 15 pmol, band điện di cho kết to, rõ, sản phẩm lớn, smear hai đầu, khơng thích hợp cho việc giải trình tự Hai nồng độ lại 10 pmol pmol cho kết tốt, độ sáng vừa phải, rõ, nhiên band điện di nồng độ 10 pmol cịn tượng smear, vậy, nồng độ pmol nồng độ thích họp sử dụng cho cặp moi F2/R2 NSFext-R1 M 30 20 15 F2-R2 10 M (pmol) 30 20 F3 - R3 M 30 20 15 15 10 (pmol) F4 — 4823R 10 (pmol) M 30 20 15 10 (pmol) Hình 3.3 Kết chuẩn hóa nồng độ mồi Các kết cặp moi F3/R3 nồng độ khác nhận thấy khác biệt nồng độ Độ sáng kích thước band điện di giảm dần từ 30 pmol pmol Nồng độ pmol cho kết band vừa phải, độ sáng rõ, không bị smear hai đầu, đánh giá so cho kết tốt, thích họp việc giải trình tự Với nồng độ từ 30 pmol, 20 pmol, 15 pmol cho kết kích thước band dày, độ sáng 25 mạnh, tượng smear hai đầu lớn Ở nồng độ 10 pmol, band điện di cho kết tot, band lên sáng, rõ có tượng smear, khơng thích hợp phục vụ cho việc làm chuẩn quy trình cho nồng độ mồi để thực việc giải trình tự Ở cặp mồi F4/4823R, độ sáng kích thước band giảm dần theo thứ tự nồng độ từ 30 pmol, 20 pmol, 15 pmol, 10 pmol pmol Nồng độ 30 pmol cho kết sáng kích thước band lớn nhất, vệt smear xuất lớn Tại hai nồng độ 20 pmol 15 pmol cho kết band giảm dần độ sáng kích thước band, tượng smear xuất hai nồng độ, từ đánh giá hai nồng độ khơng thích hợp cho việc chuẩn quy trình cho nồng độ mồi Đối với hai nồng độ 10 pmol pmol cho kết band tốt, độ sáng kích thước band rõ vừa phải, khơng có tượng smear hai đầu Vì vậy, chúng tơi lựa chọn nồng độ pmol nồng độ chuẩn cho cặp mồi F4/4823R giảm thiểu nồng độ mồi sử dụng đảm bảo kết kết sản phẩm PCR đạt chất lượng tốt Tóm lại, kết khảo sát nồng độ cặp mồi thiết kế, lựa chọn nồng độ cho cặp mồi pmol nồng độ chuẩn cho cặp mồi 3.3.2.2 Kết chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp mồi Sau chuẩn hóa quy trình lựa chọn nồng độ mồi thích hợp, tiếp tục thực cải thiện nhiệt độ bắt cặp cho cặp mồi kết điện di tốt Lấy mẫu CPV sử dụng để chuẩn hóa nồng độ mồi thực cho cơng việc chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp Nồng độ mồi sử dụng phản ứng nồng độ chuẩn hóa cặp mồi Khảo sát nhiệt độ bắt cắp dựa vào thông số Tm thấp cặp mồi nhà sản xuất thiết kế mồi (Bảng 3.6), thực theo nguyên tắc (Tm - 5) ± Chọn nhiệt độ bắt cặp cặp mồi là: cặp mồi NSFext/Rl thực với nhiệt độ 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, ba cặp mồi khác F2/R2, F3/R3, F4/4823R 53 °C, 54 °C, 55 °C, 56 °C, 57 °C Kết điện di cho kết giống với kết điện di kiểm tra khả bắt cặp mồi phản ứng PCR (Hình 3.4) 26 Bảng 3.6 Nhiệt độ nóng chảy mơi Tên mồi Nhiệt độ nóng chảy (°C) NSFext 62,1 Parvo RI 62,5 Parvo F2 58,4 Parvo R2 60,5 Parvo F3 60,5 Parvo R3 62,1 Parvo F4 60,5 4823R 65,2 F2-R2 NSFext - R1 M 53 54 56 55 57 (°C) (bp) (bp) 2000 1500 2000 1500 1024 (bp) 1000 800 600 400 200 1427 (bp) 1000 800 600 400 F4 - 4823R F3-R3 M 53 54 55 56 M 57 (°C) 53 54 55 56 57 (°C) Hình 3.4 Kết chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp mồi Cặp mồi NSFext/Rl cho kết band điện di nhiệt độ bắt cặp từ 55 °C đến 59 °C lên màu band sáng, rõ, to Đặc biệt, band điện di nhiệt độ 58 °C cho kết 27 sáng band mảnh, khơng có tương smear Từ kết trên, cho thấy nhiệt độ bắt cặp cặp mồi NSFext/Rl thích họp từ 55 đến 59 °C, tối ưu nhiệt độ 58 °C cho kết PCR đạt chất lượng tốt thích hợp cho việc giải trình tự chủng CPVs Đối với cặp moi F2/R2, band điện di cho kết nhiệt độ 54 °C, 55 °C, 56 °C, nhiệt độ lại 53 °C 57 °C cho kết âm tính Nhận định nhiệt độ 53 °C có nhiệt độ q thấp, khơng làm biến tính cặp mồi dẫn đến tượng khơng cho kết quả, nhiệt độ 57 °C nhiệt độ q cao, ảnh hưởng đến cặp mồi, khơng thích họp cho việc bắt mồi Còn nhiệt độ 54 °C, 55 °C, 56 °C cho kết điện di, nhiên nhiệt độ 55 °C 56 °C có tượng smear nên nhiệt dộ thích họp cho cặp mồi F2/R2 nhiệt độ 54 °C Ở cặp moi F3/R3, theo kết đạt nhiệt độ bắt cặp từ 53 °C, 54 °C, 55 °C, 56 °C, 57 °C cho kết dương tính, khơng xuất tình trạng smear Tuy nhiên, nhiệt độ 53 °C band điện di cho kết mờ, khó quan sát, cịn trường hợp nhiệt độ 56 °C 57 °C cho kích thước band to, sáng Tại hai nhiệt độ 54 55 °C cho kết kích thước band vừa phải, độ sáng rõ ràng, không bị smear Ket luận nhiệt độ bắt cặp phù họp cho cặp moi F3/R3 từ 54 °C đến 57 °C, lựa chọn nhiệt độ tối ưu nhiệt độ 54 °C Cặp mồi cuối F4/4823R cho kết dương tính nhiệt độ từ 55 đến 57 °C kết âm tính 53 54 °C Từ kết thu được, nhận định nhiệt độ 53 54 °C nhiệt độ bắt cặp thích họp cho cặp mồi Cịn ba nhiệt độ 55 °C, 56 °C 57 °C nhiệt độ phù họp Tuy nhiên, nhiệt độ 55 °C kích thước band to, cịn hai nhiệt độ 56 57 °C cho kết vừa phải, độ sáng trung bình, rõ Ket luận nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi F4/4823R 56 57 °C, lựa chọn 57 °C nhiệt độ bắt cặp tối ưu Tóm lại, sau chuẩn hóa quy trình nhiệt độ bắt cặp cặp mồi, kết thu nhiệt độ tối ưu cặp mồi là: 55 đến 59 °C cho cặp mồi NSFext/Rl, tối ưu 58 °C Với cặp mồi F2/R2 từ nhiệt độ 54 đến 56 °C, thích họp 54 °C Cịn cặp mồi F3/R3 54 đến 57 °C, tốt 54 °C Và cặp mồi F4/4823R chọn nhiệt độ từ 55 đến 57 °C, tối ưu 57 °C 28 3.3.2.3 Ket kiểm tra độ đặc hiệu sau chuẩn quy trình Mục đích thí nghiệm kiểm tra lại nồng độ mồi nhiệt độ mồi lựa chọn sản phẩm PCR tốt dựa mẫu CPVs phân lập Việt Nam Thực quy trình PCR tưcmg tự với quy trình kiểm tra độ đặc hiệu mồi Nồng độ mồi nhiệt độ mồi lựa chọn theo kết thử nghiệm để phù hợp cho cặp mồi trình bày Bảng 3.7 Ket sản phẩm PCR lên với kích thước dự đốn lý thuyết (Bảng 3.5) Kích thước sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,2% (Hình 3.5) Bảng 3.7 Nồng độ mồi nhiệt độ bắt cặp thích họp cho mồi Cặp mồi Nồng độ mồi Nhiệt độ mồi Kích thước sản phẩm (bp) NSFext/Rl pmol 58 °C 1024 F2/R2 pmol 54 °C 1427 F3/R3 pmol 54 °C 1358 F4/4823R pmol 57 °C 1193 29 NSFext - R1 M 21 24 25 F2-R2 30 31 F4 - 4823R F3-R3 M 21 24 25 30 M 31 21 24 25 30 31 Hình 3.5 Ket độ đặc hiệu mồi Từ kết Hình 3.5, cho thấy mẫu cho kết điện di tốt, sáng, rõ khơng bị smear, thích họp cho việc giải trình tự gần đầy đủ gen CPV phân lập Việt Nam Nhận định nồng độ nhu nhiệt độ bắt cặp mồi cặp mồi lựa chọn phù họp cho kết tốt 3.3.3 Kết kiểm tra vùng overlap Mục đích thí nghiệm quan sát vũng overlap cặp mồi để xác định độ thân thiện mồi thiết kế Sau chuẩn hóa quy trình đặc hiệu cho mồi, sử dụng trình tự giải full genome nhóm nghiên cứu CPV sử dụng mồi thiết kế Nhận định chất lượng kết giải trình tự từ cơng ty First Base, file giải trình tự nàm tín hiệu huỳnh quang (Hình 3.6) 30 □ BioEdit Sequence Alignment Editor File Edit view Zoom Horizontal Scale Accesory Application RNA Window X Help Hình 3.6 Ket giải trình tự tốt Trình tự thơ sau giải trình tự đuợc hiệu chỉnh chương trình BioEdit 7.2.6.1 Các trình tự loại bỏ hai đầu chứa nucleotide mơ hồ có tín hiệu bị nhiễu Trình tự có peak tín hiệu đều, khơng bị chồng lắp lên trình tự đủ chất lượng để sử dụng cho phân tích (Hình 3.6) Hai trình tự giải theo hai chiều forward reverse consensus thành trình tư chương trình SeqMan 6.0 Descriptions Graphic Summary Alignments Taxonomy Download * Sequences producing significant alignments Q select all 20Ớ sequences se/ecced Manage Columns v Gen Bank Max Total Show 100 V [ o Distance (rẹẹ Qf rf-suHs Graphics Query Per Score Score E Cover value 8353 8353 100% 00 99 78% 8342 8342 100% 00 99 74% MH476583 8336 8336 100% 00 99 71% MH476584 8331 8331 100% 00 99 69% MT010564 8331 8331 100% 00 99 69% MH476592 8331 8331 100% 00 99 69% MH476587 8331 8331 100% 00 99 69% 8325 8325 100% 00 99 67% MN519258 Ị 8320 8320 100% 00 99 65% MN832850 8320 8320 100% 00 99 65% MF805796 Idem Accession MG013488 MH476581.1 Hình 3.7 Kết BLAST trình tự NCBI Trình tự sau hiệu chỉnh BLAST NCBI để tìm kiếm vùng trình tự tương đồng (Hình 3.7) Ket cho thấy trình tự BLAST có độ tương đồng cao với chủng CPV-SH1516 (MG013488) đạt tới 99,78%, chứng tỏ mồi thiết kế cho kết giải trình tự tốt, phù hợp với điều kiện mục tiêu đặt 31 Khi đánh giá chât lượng môi tự thiêt kê, tiêp tục thực kiêm tra vùng overlap cặp mồi để xác định độ thân thiện primer Các trình tự kiểm tra phần mềm Seqman Kết mô tả Hình 3.8 ' SeqMỉn File Edit Sequence Contig Project Net Search Help Sequence Contig Project Net Search Help 5equ*n