KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀI XÂY DỤNG PROBE ĐẺ KHAI THÁC VÀ CHỌN GEN MÃ HÓA XYLAN 1 4 BETA XYLOSIDASE TỪ DỮ LIỆU GIẢI TRÌNH TỤ DNA METAGENOME Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực hiện.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀI: XÂY DỤNG PROBE ĐẺ KHAI THÁC VÀ CHỌN GEN MÃ HÓA XYLAN 1-4 BETA XYLOSIDASE TỪ DỮ LIỆU GIẢI TRÌNH TỤ DNA METAGENOME Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Lứp :TS.Nguyễn Thị Trung :VŨ Trường Đức :1302-K20 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀI: XÂY DỤNG PROBE ĐẾ KHAI THÁC VÀ CHỌN GEN MÃ HÓA XYLAN 1-4 BETA XYLOSIDASE TÙ DỮ LIỆU GIẢI TRÌNH TỤ DNA METAGENOME Giáo viên hướng dẫn :TS Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực :Vũ Trường Đức Lóp :13.02-K20 Hà Nội-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC DANH MỰC CÁC CHỪ VIÉT TẮT I DANH MỤC CÁC BẢNG II DANH MỤC CÁC HÌNH III LỜI MỞ ĐÀU PHẦN 1: TÓNGQUAN Khái quát xylan -4 beta xylosidase 1.1 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Hoạt tính cùa xylan -4 beta xylosidase 1.1.4 Cấu trúc xylan -4 beta xylosidasc .4 1.2 1.1.4.1 Cấu trúc bậc I cúa xylan 1-4 beta xylosidase 1.1.4.2 Cấu trúc bậc II xylan I -4 beta xylosidase 1.1.4.3 Cấu trúc bậc xylan 1-4 beta xylosidasc 1.1.4.4 Cấu trúc bậc IV xylan -4 beta xylosidase Khái quát enzyme hoạt hóa carbohydrate (CAZy) 1.2.1 Khái niệm enzyme hoạt hóa carbohydrate (CAZy) 1.2.2 Lịch sứ phát triến enzyme hoạt hóa carbohydrate 1.3 Khai thác sở dừ liệu gen 1.3.1 Khai thác dừ liệu từ Ngân hàng Gcn quốc tế .9 1.3.1.1 Khái niệm sở liệu gcn 1.3.1.2 Phương pháp tìm kiếm thông tin gen Vũ Trường Đức - 1302.K20 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 1.3.1.3 1.3.2 1.4 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Một số phần mềm hỗ trợ tìm kiếm thông tin gen Sử dụng Probe 10 1.3.2.1 Khái niệm Probe 10 1.3.2.2 Cấu trúc probe 11 1.3.2.3 Phương pháp xây dựng probe 11 Cơ sở liệu DNA mctagcnomc vi sinh ruột mối 12 PHÀN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 2.1 cứu 13 Vật liệu nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Xác định họ GH có chứa enzyme xylan 1-4 beta xylosidasc theo CAZy 13 2.2.2 Tìm kiếm trình tự axit amin enzyme xylan -4 beta xylosidasc xác định đặc tính 14 2.2.3 Xác định mức độ tương đồng trình tự ClustalW - PBIL 15 2.2.4 Xây dựng probe giá trị tham chiếu 16 2.2.5 Khai thác trình tự mã hóa xylan 1-4 beta xylosidase từ dừ liệu DNA mctagcnomc vi sinh vật ruột mối 17 PHÀN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Các họ GH có chứa enzyme xylan -4 beta xylosidase theo CAZy 18 Vũ Trường Đức - 1302.K20 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 3.1.1 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Số lượng họ GH có chứa enzyme xylan -4 beta xylosidase theo CAZy 18 3.1.2 Cấu trúc đặc trưng cùa số họ GH có chứa enzyme xylan -4 beta xylosidase theo CAZy 19 3.2 Trình tự axit amin enzyme xylan 1-4 beta xylosidasc xác định đặc tính 20 3.3 Mức độ tương đồng cúa trinh tự axit amin 26 3.4 Xây dựng probe giá trị tham chiếu 27 3.5 Khai thác trình tự mã hóa cho enzyme xylan -4 beta xylosidase probe từ dừ liệu DNA metagenome vi sinh vật ruột mối 29 3.6 Kháo sát cấu trúc bậc cùa trình tự axit amin enzym xylan 1- beta xylosidase khai thác probe 32 PHÀN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Vũ Trường Đức - 1302.K20 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các họ GH chứa enzyme xylan 1-4 beta xylosidasc theo 18 CAZy Bảng 3.2 Tổng hợp liệu nghiên cứu chi tiết xylan -4 20 beta xylosidasc Bảng 3.4 So sánh tương đồng probe với trinh ựr thuộc 28 GH43 Bảng 3.5.1 So sánh số lượng trình tự khai thác bàng probe với dự 29 đoán cùa BGI Bảng 3.5.2 So sánh số lượng trình tự khai thác probe với dự 31 đoán BGI Bảng 3.6 Ước đoán cấu trúc bậc ba cùa trình tự bàng Swiss Prot Vũ Trường Đức - 1302.K20 II 33 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc bậc cùa enzyme P-xylosidase tách từ Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 có khối lượng 73 kDa Hình 1.2 Cấu trúc bậc cùa beta-l,4-xylanases from Chaetomium thermophilum Hình 1.3 Cấu trúc bậc enzyme P-xylosidasc tách từ Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 Hình 3.3 Kết so sánh tương đồng trình tự axit amin 26 xylan 1-4 beta xylosidasc thuộc họ GH43 Hình 3.4 Trình tự probe cho enzyme xylan 1-4 beta xylosidase thuộc 27 họ GH43 Hình 3.5 Kết dự đốn tương đồng đặc hiệu trình tự gốc 32 hoạt động cùa trình tự lựa chọn probe GH43 Hình 3.6 Cấu trúc bậc ba cúa xylan beta xylosidase khuôn (template) 2exk.l.A (A), lyrz.l.A (B), lyi7.1.A (C), 3c7g.l.A(D) họ 37 GH43 tương đồng với trình tự khai thác bang probe sử dụng Swiss prot Vũ Trường Đức - 1302.K20 III Khóa luận tốt nghiệp KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI LỜI MỎ ĐẦU Mối Coptotermes gestroi thuộc mối bậc thấp họ Rhinotermitidae phố biến Việt Nam số quốc gia giới Có 16 họ GH vi sinh vật cộng sinh ruột sau bao gồm: GH2, 3, 5, 7, 10, 11, 16, 20, 26, 30, 42, 45, 47, 53, 77, 92 ứng dụng kỹ thuật mctagcnomics theo hướng phân tích liệu thu từ việc giãi tồn trình tự metagenome, Do đồng tác giả khai thác 125.431 khung đọc mở (ORF) với tổng chiều dài lên tới 78.271.365 bp hệ vi khuẩn sống tự ruột mối, ước đốn gồm nhiều trình tự mã hóa cho enzyme xylan -4 beta xylosidase hay gọi tắt enzyme beta xylosidase Phương pháp dự đoán gen từ liệu khổng lồ DNA metagenome vi sinh vật ruột mối bước đầu sử dụng phần mềm tin sinh học, thường dựa số liệu trình tự tương đồng với lồi công bố ngân hàng gen Việc lựa chọn trình tự gen mong muốn thực bàng nhiều phần mềm dự đoán cấu trúc chức cùa protein Đầu tiên việc sử dụng công cụ BLASTP để xác định chức cách so sánh độ tương đồng mức độ bao phú cúa trinh tự ước đoán chức ban đầu từ DNA metagenome, với trình tự có ngân hàng gen cùa NCBI Ket BLASTP giúp cho việc ước đốn nhiều thơng số enzyme vị trí víing bảo tồn, họ enzyme, nguồn vi sinh vật chứa enzyme, Trước đưa vào thực nghiệm, gen tiếp tục sử dụng phần mềm dự đoán tính chất chịu kiềm/axit, chịu nhiệt, enzyme Mặc dù liệu trình tự axit amin/nucleotit cùa NCBI vơ lớn, có nhiều trình tự nuclcotit mã hóa cho enzyme xylan -4 beta xylosidasc chưa nghiên cứu tính chất, mà chi dựa so sánh tương đong trình tự có sẵn NCBI Do số liệu dự đoán BLAST phần mềm khác sử dụng dừ liệu cúa NCBI chưa nghiên cứu chi tiết trớ nên tin cậy Vũ Trường Đức - 1302.K20 Khóa luận tốt nghiệp KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI đưa vào thực nghiệm Đây khó khăn việc lựa chọn gcn từ số liệu DNA metagenome cúa ruột mối chi sử dụng công cụ Do việc tìm kiếm phương pháp đe có the khai thác, lựa chọn gen mã hóa xylan 1-4 beta xylosidase từ dừ liệu thực nghiệm hiệu cần thiết ❖ Mục tiêu nghiên cứu Đưa phương pháp để xây dựng probe cho enzyme xylan 1-4 beta xylosidase Vũ Trường Đức - 1302.K20 Khóa luận tốt nghiệp KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI PHẦN I: TÓNGQUAN 1.1 Khái quát xylan 1-4 beta xylosidase 1.1.1 Định nghĩa Xylan 1,4-bcta-xylosidasc (EC 3.2.1.37, xylobiasc, bcta-xylosidasc, exo-1,4-beta-xylosidase, beta-D-xylopyranosidase, exo-l,4-xylosidase, exo- 1,4- beta-D-xylosidase, 1,4-beta-D-xylan xylohydrolase) enzyme xúc tác cho phán ứng hóa học Thúy phân (l-> 4) -beta-D-xylan, để loại bỏ dư lượng D-xylose tiếp từ-giảm không trạm cuối enzym thủy phân xylulose 1.1.2 Phân loại Xylan 1,4-beta-xylosidase thuộc nhóm enzyme glycoside hydrolase (EC 3.2.1.x) Đây nhóm enzyme lớn, có thủy phân liên kết glycoside cacbonhydrat thành phần khác Dựa chất đặc hiệu, chế phản úng trình tự amino axit, đến có 135 họ glycoside hydrolase phân loại 14 gồm họ enzyme tương đồng thống kê Xylan 1,4-beta-xylosidase, từ nguồn tìm thấy nay, xếp vào họ glycoside hydrolase 1, 3, 30, 39, 43, 51, 52, 54, 116 120 Tuy nhiên, vần nhiều loại xylosidases chưa phân loại rõ, bới chúng khơng có đặc tính rõ ràng mang đặc tính nhiều họ Xylan 1,4-beta-xylosidase ỡ họ GH 1, 39, 52, 116, 120 có nguồn gốc vi khuẩn, họ GH 51,54 có nguồn gốc nấm Các họ cịn lại chứa P-xylosidasc có nguồn gốc hồn hợp Vũ Trường Đức - 1302.K20 Khóa luận tốt nghiệp KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI FEJrNSFnraFQii-.GLmYraWALQ’.TYEC-.UGRrJLSTCEXLl^QrLZKI-inRKZrYTYlinTiRE-TYnSYSniQJEiiEF.ZiyTR ’JSXSDinRGGG ~ỈTTGÃfV3Mữ^ì-DrSGERL5i2ĩKyFRĩEETĨE— FỄE?Ã73:FrEhTQ,3À3L7ĩfilũEỈỈSĨHỳ.TY2£-EL3RĨZn37C(JỉlÀF3Q?LẰEK-ZII?i£7ZY7YII7r7RKE-ĨYĩĩ3Y3E)QKEỈỈKEZE7?Z£3iE13DCE ,IR'GGG FiTGAiTGMQCQ-DTSGERZiETfERYEEZDE ~?k;.7Z?jZ'E::;;?jg:7."^e:-ai; 7:2E-ZLG:z:z7ZZciFZ::,:zF-T_F •:;2E:EF2:22T7G}G - 2-ÀT/22?jt;^2-2:^2722 F7ỈEnC73fRn7^3À^VXnXĨCĨSSnĩXQ:ĩOT-EK5ĩClEDCaELV7DQfflRSREI77PDCIEmiR7ĨVií^ĩ-ĨĨRĨ5’f3F3GM5WI21r7TFESyKL5DDnE3Rl - ìĩĩGÃỈY3ĨCR-K3GỈK!ỉĩẳ:FDYFLYKEL -FRJi^:3Fnirj,3.‘31irfiX3^SYCr.TYEE”GQ3RIZE7'5ZJiK7r3»ri£E2fZr7?E5AE37ifLR7I!72RL-7YRY3Y3F2