VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 0O0 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dê tài Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội GIẢI TRÌNH TỤ GEN ADN TY THÊ VÙNG CYTOCHROME B ỦNG DỤNG TRONG GIÁM DỊNH PHÂN BIỆT ADN TY.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - 0O0 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dê tài: Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội GIẢI TRÌNH TỤ GEN ADN TY THÊ VÙNG CYTOCHROME B - ỦNG DỤNG TRONG GIÁM DỊNH PHÂN BIỆT ADN TY THÉ NGĨ VÀ MỘT SĨ DỘNG VẬT Giáo viên hướng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo Sinh viên thực : Nguyễn Thị Yên Lóp : K20.13 - 02 HÀ NỘI - 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MO HA NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC - 0O0 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: GIẢI TRÌNH TỤ GEN ADN TY THÊ VÙNG CYTOCHROME B - ỦNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÂN BIỆT ADN TY THÉ NGI VÀ MỘT SĨ ĐỘNG VẬT Giáo viên hưóng dẫn : ThS Hà Hữu Hảo Sinh viên thực : Nguyễn Thị Yên Lớp : K20.13 - 02 HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đào Thị Hồng Vân đã tận tình giúp đỡ giúp em thực tập Viện Pháp y quốc gia Và với tất lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến: Các thầy cô giáo trường Viện đại học Mờ Hà Nội giúp em có kiến thức trình học tập trường ThS Hà Hĩru Hâo - Trường khoa Y - Sinh học, Viện Pháp y quốc gia tận tình hướng dẫn, giảng dạy tạo điều kiện cho em tham gia lớp học đào tạo chuyên môn giám định ADN cúa TS.Nguyễn Đức Nhự - Viện trưởng Viện Pháp y quốc gia, Khóa đào tạo phân tích ADN ty chun gia Phịng thí nghiệm nhận dạng ADN người thuộc quân đội Hoa Kỳ giảng dạy Trong trình thực tập, làm việc thực luận văn, em nhận iTiii' viền V lên Đại nọc MO laNọị " giúp đỡ chi bào cán Viện Pháp y quốc gia tạo điều kiện cho em có thời gian học tập, giúp em tiếp cận với kỹ thuật phịng nghiên cứu đổ hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, Ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Yên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TÙ VIẾT TẤT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐÈ PHẦN I TÓNG QUAN 1.1 1.2 Tông quan ADN giám định ADN 1.1.1 ADN cấu trúc cúa ADN 1.1.2 Giám định ADN Ty ADN ty thể 1.2.1 1.2.2 1.3 1.4 Ty ADN tyTtỉỉẳi: Y.iệii V.iện.Đại.iiọ£ Mó:.I.IÀ.N.Ội ❖ Vai trò việc nghiên cứu ADN ty ❖ Cơ sở khoa học di truyền ADN ty thể ❖ Cấu trúc ADN ty thể 10 Cytochrome B 11 Tình hình nghiên cứu gen Cytb ngồi nước 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu gen Cytb nước ngồi 13 1.4.2 Tinh hình nghiên cứu gen Cytb Việt Nam 14 PHÀN II VẠT LIỆU VÀ PHU ONG PHÁP NGHIÊN CÚC 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Hóa chất thiết bị sứ dụng 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách chiết ADN 16 2.2.2 Điện di ADN tống số 19 2.2.3 Phản ứng PCR 20 2.2.5 Giái trình tự ADN 22 2.2.6 Xử lý thống kê số liệu 24 PHÀN III KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số .25 3.2 Kết quà khuếch đại ADN ty thể vùng Cytb 26 3.3 Kết giải trình tự gen Cytb mẫu nghiên cứu 28 3.4 Kết so sánh ADN ty thề vùng Cytb người số động vật 29 3.4.1 Kết so sánh trình tự gen Cytb mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảo Genbank 29 3.4.2 Kết quà so sánh trình tự gen Cytb người số động vật 44 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị Thtrviệi-i-V-iện-Đại-họe-MỚ-Hả-Nội 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT ADN Axit deoxyribonucleic D-Loop Displacement loop EDTA Ethylenedianinetetraacetic acid HV1 Hypervariable (Vùng siêu biến 1) HV2 Hypervariable (Vùng siêu biền 2) HV3 Hypervariable (Vùng siêu biến 3) mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thế) PCR Polymerase chain reaction ( Phàn ứng chuỗi trùng hợp) Rcrs Revised Cambridge Reference Sequence ĩ (Trinh tò thám khảo 'cửá Cambridge đẩ chinh sửa) Bp Cytb Base pair (Cặp base) Cytochrome B DANH MỤC HÌNH Hình : cấu trúc chung gen điến hình Hình 2:MƠ hình ty thể Hình 3: cấu trúc hệ gen ty thể Hình 4: Sơ đồ phă hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể 10 Hình 5: Vị trí gen Cytb ADN ty thể 116| 11 Hình 6: Chương trình thiết lập phần mềm giải trình tự 24 Hình 7: Điện di ADN tổng số gel agarose 0.8% 25 Hình 8: Điện di sàn phẩm PCR vùng Cytochrome B gcl polyacrylamide27 Hình 9: Kct giải trình tự mẫu L2CB theo hướng dần cùa hãng ABI (Mỹ)28 Hình 10: Ket quà giải trình tự mẫu L2CB 29 Hình 11: So sánh trình tự nucleotide thu từ mẫu cùa người với trình tự tham khảo Genbank 34 Hình 12: So sánh trình tự nucleotide thu từ mầu bị với trình tự tham khảo GĨtaịêụ Vien Dai.JA2.C Mớ Hà Nôi 38 Hình 13: So sánh trình tự nucleotid thu từ mẫu chó với trình tự tham khảo Genbank 40 Hình 14: So sánh trình tự nucleotid thu từ mẫu lợn với trình tự tham kháo Genbank 43 Hình 15: So sánh trình tự nucleotid từ bị, chó, lợn nghiên cứu với trình tự nucleotid người (Homo sapiens JN034136.1) 53 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Trình tự cặp mồi dùng khuếch đại vùng Cytb 20 Bảng 2: Thành phần PCR 20 Bàng 3: Chu trình nhiệt thực dùng cho máy PCR 21 (Eppendorf-Đức) 21 Báng 4: Thành phần hóa chất điện di 21 Bảng 5: Thực PCR với BigDye Terminator kít [12]: .23 Bảng 6: Chu trình nhiệt PCR: 23 Bảng 7: Tinh sán phẩm PCR sử dụng BigDye Xterminator purification kit [10]: 23 Bảng Ti lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu nghiên cứu với trình tự lồi tương ứng Genbank 43 Bảng 9: Ti lệ phần trăm trình tự đa hình mầu người với bị, chó, lợn 54 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội ĐẶT VẤN ĐÈ Trong vòng 20 năm trở lại đây, sinh học phân tử công nghệ gen phát triền mạnh mê đem lại thành tựu vĩ đại cho khoa học công nghệ cuối kĩ 20 đầu ki 21, việc giải trình tự hồn chinh gen người Từ sinh học phân tử trở thành công cụ đắc lực cho nhiều lĩnh vực khoa học khác như: kháo cổ học, nhân chủng học, di truyền y học đặc biệt giám định vụ án hình Ngày nay, phương pháp giám định gen sử dụng rộng rãi nhiều quốc gia khác nhau, đưa chứng đáng tin cậy cho việc phá án, giúp đem lại cơng cho xã hội Có hai phương pháp giám định gen phân tích ADN nhân tế bào phân tích ADN ty Phân tích gen nhân tế bào phương pháp có nhiều ưu điểm bên cạnh có nhiều hạn chế đòi hỏi phải thu đươc ADN nhân nguyên ỵẹn^của mầu phân tích Tuỵ^nỊýên, trường hợp mẫu phân tích bị phân húy khơng thè thu ADN nhân tê bào phương pháp áp dụng phân tích ADN ty thẻ Với đặc trưng bật cùa ADN ty the như: di truyền theo dịng mẹ, có kích thước tương đối nhỏ nên ben vững thời gian dài có the lên tới hàng nghìn năm, so lượng lớn tế bào cấu trúc ADN mạch vòng, bão vệ bời cấu trúc đặc biệt keratin tóc, hydroxyapatite xương Vì vậy, phân tích ADN ty trờ thành công cụ thiếu khoa học y học khoa học điều tra Trong công tác giám định pháp y, phân tích dấu vet sinh học khơng rõ nguồn gốc, việc quan trọng cần tiến hành phải xác định mẫu vật có nguồn gốc từ người hay từ động vật khác Đôi việc xác định nguồn gốc lồi cùa mầu phân tích số trường hợp đóng vai trị định đen khã kết luận vụ việc (như tai nạn giao thông liên quan đến động vật, tai nạn bị động vật công ) Tuy nhiên, mẫu bị cháy, đặc điểm hình thái đặc trưng, dập nát, bị phân húy đổ lâu điều kiện không thuận lợi (chẳng hạn mẫu xương lâu nãm bị phân hủy chôn điều kiện ngập nước, bị phân hủy tính axit cùa đất, vi khuấn, ánh sáng, nhiệt độ ) nhiệm vụ nhiều không thê thực bang phương pháp nhận biết thơng thường Vì để nhận biết trường hợp việc có phương pháp nhận biết nguồn gốc loài mẫu giám định cách hiệu quà cẩn thiết Vì tơi thực đề tài: “Giải trình tự gen ADN ty vùng Cytochrome B - ứng dụng giám định phân biệt ADN ty thể người số động vật” Với mục tiêu chính: - Hồn thiện kỹ thuật khuếch đại ADN ty vùng Cytochrome B - Phân tích đặc điếm đa dạng di truyền ADN ty thể vùng Cytochrome B cùa cặc mẫu pghien^cdu từ ứng dụng trọng phân biệt ADN người sô động vật B2CB_17 T.c A.AA A A c c TG.TA T TGC G C C A A.A B3CB_17 T.C A.AA A A.C C TG.TA T TGC G C C A A.A B4CB17 T.C A.GA A A.C C TG.TA T TGC G C C A A.A B5CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B6CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B7CB_17 T.C A.GA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B8CB_17 T.C A.AA A A.C C TG.TA T TGC G C C A A.A B9CB17 T.C A.GA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A B10CB_17 T.C A.AA A A C C TG.TA T TGC G C C A A.A ChlCB_17 T.G A.AG.C A T G A.G TGC T C C T TA.G Ch2CB 17 T.G .A.AG.C .A .T G .A.G TGC T .c .c T TA.G Ch3CB_17 T.G A.AG.C A T G A.G TGC T .c .c T TA.G Ch4CB_17 T.G A.AG.C A T G A.G TGC T C C T TA.G Ch5CB 17 T.G A.AG.C A T G A.G TGC T C C T TA.G L1CB-17 T A.AA A T C G.TA.A TG C A G.T T .A L2CB17 T A.AA A T C G.TA.A TG C A G.T T A L3CB_17 Thujiiện V iện Đại Jiq.c.tM.o: Nệi* g.t t A L4CB_17 T A.AA A T -C G.TA.A TG C A G.T T A L5CB 17 T A.AA A T C G.TA.A TG C A G.T T A 90 CYTB Homo sapiens Bl 100 110 N2CB16 N3CB 16 81 81 N5CB16 N6CB_16 N7CB-16 N8CB 16 81 N9CB_16 81 130 140 150 160 CGCCAATGGCGCCTCAATATTCTTTATCTGCCTCTTCCTACACATCGGGCGAGGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACT N1CB_16 N4CB_16 120 N10CB 16 45 N11CB 16 81 N12CB16 81 A N13CB_16 81 N14CB_16 81 N15CB_16 81 A B1CB17 81 A .c .A .T G .T T.A.ATA.G .G.A .A T G .T.ACACT.TTC B2CB_17 81 A ,c .A T G T T.A.ATA.G G.A A T G T.ACACT.TTC B3CB_17 81 -A .c .A ,T G .T T.A.ATA.G .G.A .A T G -T.ACACT.TTC B4CB_17 81 A .c .A .T G T T.A.ATA.G G.A A T T G, T ACACT TTC B5CB_17 81 A .c .A .T G T T.A.ATA.G .G.A .A T G T ACACT TTC B6CB_17 81 A .c .A .T G T T.A ATA.G .G A .A T G .T.ACACT.TTC B7CB_17 81 A ,c .A .T G T T A ATA G B8CB-17 81 A .c .A ,T G .T T.A.ATA.G -G.A .A T G -T.ACACT.TTC G A A T T G T.ACACT.TTC B9CB 17 81 A .c -A .T G .T T.A.ATA.G .G.A .A T T .G .T.ACACT.TTC C10CB_17 81 A .c .A .T G T T A ATA G G A A T G T ACACT TTC ChlCB_17 81 A T C A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch2CB_17 Thư .viậneViện Đại hoc .Md.Ilà Nội C.A.C.A.T.A Ch3CB_17 81 A .T C A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch4CB 17 81 A T .c A TG.A A C.A.G.A.T.A Ch5CB_17 81 A .T C A TG.A A C.A.G.A.T.A L1CB_17 81 T A c A.,A c G T A A c G A c c C.A.A.A.T.C L2CB-17 81 T .A .c .A .A .c G T A .A.c .G.A .c c C.A.A.A.T.C L3CB_17 81 T .A .c, A .A .c G T A A.C .G.A C c C.A.A.A.T.C L4CB-17 81 T .A .c A .A .c- -G T A .A.c .G.A .c c C.A.A.A.T.C L5CB-17 81 T .A .c .A .A .c .G T A .A.c .G.A .c c C.A.A.A.T.C 170 180 190 200 210 220 230 240 I I I I I I I I I I I I I I I I CYTB Homo sapiens 161 CAGAAACCTGAAACATCGGCATTATCCTCCTGCTTGCAACTATAGCAACAGCCTTCATAGGCTATGTCCTCCCGTGAGGC N1CB-16 161 N2CB 16 161 N3CB_16 161 N4CB16 161 46 N5CB_16 161 N6CB_16 161 N7CB 16 161 N8CB_16 161 N9CB_16 161 N10CB16 161 c N11CB_16 161 G N12CB 16 161 N13CB_16 161 N14CB_16 161 N15CB 16 161 B1CB_17 161 T A T T AG.A T CA .GTA c A .T A C A .A A B2CB 17 161 T A T ,T .AG.A T CA .GTA c A .T A A .A A B3CB.17 161 T A T .T .AG.A T CA GTA c A .T A .c A .A A B4CB_17 161 T A T AG.A T CA GTA c A A .c A .A A B5CB17 161 T A T .T .AG.A T CA GTA c A .T A .c A .A A 1.1 Thư*viện ,Viện Đại hạG»M.á J làiNội .c A .A A B6CB 17 B7CB_17 161 T A T AG.A T CA .GTA c A A C A .A A B8CB 17 161 T A T -T .AG.A T CA .GTA c A .T A .c A .A A B9CB-17 161 T A T AG.A T CA .GTA c A A C A .A A B10CB_17 161 T A T .T .AG A T CA GTA c A T A C A .A A ChlCB_17 161 T A T .A .G.A .AT.AT.C c c A G A .A .A A Ch2CB_17 161 T A T A Ch3CB 17 161 T A T A G.A AT.AT.C c c A G A .A .A A Ch4CB_17 161 T A T A G.A AT.AT.C c c A G A A A A Ch5CB_17 161 T A T .A L1CB17 161 T A T .AG.AG .A .AT .A.CGT c G .c A G.A .AT AT.C c c A G A .A .A A G.A AT.AT.C c c A G A .A .A A L2CB_17 161 T A T .AG AG .A .AT .A.CGT c G .c A L3CB_17 161 T A T .AG AG .A AT A.CGT c G C A L4CB 17 161 T A T .AG.AG .A .AT .A.CGT c G .c A L5CB—16 161 T A T .AG AG .A .AT A.CGT c G C A 47 250 260 270 280 290 300 310 320 CYTB Homo sapiens 241 CAAATATCATTCTGAGGGGCCACAGTAATTACAAACTTACTATCCGCCATCCCATACATTGGGACAGACCTAGTTCAATG N1CB_16 241 N2CB_16 241 N3CB 16 241 N4CB_16 241 T N5CB_16 241 N6CB_16 241 N7CB_16 241 N8CB.16 241 N9CB_16 241 N10CB_16 241 N11CB_16 241 N12CB_16 241 N13CB-16 241 N14CB_16 241 Thư .viện Viện Đại học Mo: Hà Nội T 48 Ch5CB 17 241 T A A T C T TC.T C T T T C A T T AG L1CB_17 241 A .T .G .c .c TC A .T T T C A C AG L2CB 17 241 A T.,G c.-C TC A .T T T C A c.-AG L3CB—17 241 A, T .G c L4CB_17 241 A .T .G .c .c TC A .T T T C A C AG L5CB.17 241 A T G c c TC A .T T T C A C AG 330 340 c TC A, T T T C A C AG 3S0 360 370 380 390 400 I I I I I I I I I I I I I I I I CYTB Homo sapiens 321 AATCTGAGGAGGCTACTCAGTAGACAGTCCCACCCTCACACGATTCTTTACCTTTCACTTCATCTTGCCCTTCATTATTG N1CB_16 321 N2CB_16 321 A N3CB_16 321 N4CB_16 321 N5CB16 321 N6CB_16 321 N7CB-16 321 A N8CB 16 321 N9CB_16 321 N10CB-16 321 A Thư viện Viện Đại học .Mờ Hà Nội N11CB-16 321 N12CB 16 321 A N13CB.16 321 N14CB_16 321 N15CB-16 321 A B1CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T c .T T .c.T A .T .c .CA B2CB-17 321 C A.T AAG.A T C CG T c T B3CB 17 321 C A.T AAG.A T C CG.T .c .T .1 .C.T.-A .T .c.-CA B4CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG.T c T T c.T A T c CA B5CB-17 321 C A.T AAG.A T C CG T c T T c T A T C CA B6CB 17 321 C A.T AAG.A T C CG.T c .T .T .c.T A .T .c .CA B7CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG T c T T c T A T c CA B8CB17 321 C A.T AAG.A T C CG.T c -T .T c-T A T c CA 49 T c T A T c CA B9CB 17 321 .C A.T AAG.A T C CG.T C T C.T A T c CA B10CB_17 321 C A.T AAG.A T C CG T C T T c T A T c CA ChlCB 17 321 G c .-T G AAG.A A G.A C T C.C T C C Ch2CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T c c Ch3CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A.C T C.C T C C Ch04_17 321 G C T G AAG.A A G.A C T C.C T C C Ch5CB_17 321 G C T G AAG.A A G.A.C T C.C T C C L1CBJL7 321 G .-TT.,c.-C .AAG.A CG T C A C A L2CB_17 321 G .TĨ .c .c .AAG.A CG T C A c L3CB_17 321 G TT c C AAG.A CG T C A C A L4CB_17 321 G -TT c c AAG.A CG T C A C A L5CB_17 321 G TT c c AAG.A CG T C A c 410 420 430 440 450 460 470 A A 480 I I I I I I I I I I I I I I I I CYTB Homo sapions 401 CAGCCCTAGCAACACTCCACCTCCTATTCTTGCACGAAACGGGATCAAACAACCCCCTAGGAATCACCTCCCATTCCGAT N1CB._16 401 G N2CB-16 401 Thư .viện Viện Đại hạc Mỏ: Hà Nội G N3CB_16 401 N4CB.16 401 G N5CB_16 401 G 401 G N6CB_16 N7CB16 N8CB_16 401 401 G N9CB-16 401 G A N10CB 16 401 G G A G N11CB_16 401 N12CB 16 401 G N13CB_16 401 G N14CB_16 401 G N15CB 16 401 G B1CB_17 401 T .AA.T .C.T.G A c.c A C C AAC TT B2CB_17 401 T -AA.T C.T.G A c.c A C C AAC TT AG.CGTA .c 50 AG.CGTA C B3CB_17 401 T .AA.T .C.T.G A c.c A .c .c AAC TT .AG.CGTA .c B4CB_17 401 T AA.T C.T.G AT c.c A C C T AAC T AG.CGTA ,c B5CB 17 401 T -AA.T .C.T.G A c.c A ,c .c .AAC TT .AG.CGTA .c B6CB_17 401 T .AA.T .C.T.G A c.c A .c .c AAC TT .AG.CGTA ,c B7CB_17 401 T AA.T C.T.G AT c.c A C C T AAC T AG.CGTA .c B8CB_17 401 T AA.T C.T.G A c.c A C C AAC TT .AG.CGTA .c B9CB_17 401 T AA.T C.T.G AT c.c A C C T .AAC T B10CB 17 401 T -AA.T .C.T.G A c.c A ,c .c .AAC TT .AG.CGTA .c ChlCB_17 401 T T.G.A TC A c c TTC A AG.c A c Ch2CB_17 401 T T.G.A TC.A c c TTC A AG.C A .c Ch3CB 17 401 T T.G.A TC.A c c TTC A .AG.C .A .c Ch04_17 401 T T.G.A TC.A c c TTC A AG.C A c Ch5CB_17 401 T .T.G.A TC.A c c TTC A .AG.C .A ,c L1CB 17 401 c c -G.CG.A .T c c c TACC T.A .AG CATA .c L2CB_17 401 c c G.CG.A ,T c c c TACC T.A .AG.CATA .c L3CB17 401 c c -G.CG.A .T c c c TACC T.A .AG CATA .c AG.CGTA .c 401 'ĩhiicVÌệa.yiện Đại học MơcHà Nrậi T.A .AG.CATA C L4CB17 L5CB_17 401 c c G.CG.A .T c c c TACC T.A .AG.CATA ,c 490 500 510 520 530 540 550 560 CYTB Homo sapiens 481 AAAATCACCTTCCACCCTTACTACACAATCAAAGACGCCCTCGGCTTACTTCTCTTCCTTCTCTCCTTAATGACATTAAC N1CB.16 481 N2CB_16 481 N3CBJL6 481 N4CB 16 N5CB_16 481 H6CB16 481 N7CB_16 481 N8CB-16 481 c N9CB 16 481 N10CB_16 481 A N11CB16 481 51 N12CB 16 481 N13CB_16 481 N14CB 16 481 N15CB_16 481 B1CB_17 481 C.A c T C T G AT.T.A .GGCC .CT.AC.AA AG.TC ACT.C - GT B2CB 17 481 C.A c T .c .T .G .AT.T.A .GGCC .CT.AC.AA .AG.TC ACT.C .GT B3CB_1 481 .C.A c T c T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC ACT.C GT B4CB-17 481 .C.A c T ,c .T G .AT.T.A GGCC CT.AC.AA .AG.TC .ACT.C .GT B5CB_17 481 C.A c T c T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA B6CB_17 481 C.A c T c T G AT.T.A GGCC CT.AC.AA AG.TC B7CB_17 481 C.A c T .c .T -G .AT.T.A .GGCC .CT.AC.AA AG.TC ACT.C .GT B8CB_17 481 C.A B9CB-17 481 C.A c T .c -T .G .AT.T.A .GGCC .CT.AC.AA .AG.TC ACT.C -GT B10CB 17 481 C.A c T .c ,T G .AT.T.A .GGCC .CT.AC.AA AG.TC ACT.C .GT ChlCB_17 481 TC.A T G TAT A AGCCT A .c A c AAT.c AT .c GT c T c T G AT T A GGCC AG.TC ACT.c GT CT AC AA AG.TC ACT.c .GT ACT.c GT T G .TAT .A .AGCCT.A ,C.A .c .AAT.C .AT .c GT Ch2CB_17 481 TC.A Ch3CB_17 481 Thit.viện Viện ĐạihọÊ MoUià Mộic AAT.C AT c GT Ch04_17 481 TC.A T G TAT A AGCCT A c A .c AAT.c AT c GT Ch5CB 17 481 TC.A T G .TAT .A .AGCCT.A ,C.A .c .AAT.C -AT .c -GT L1CB_17 481 TC.A .T A T .T ATT .A GGCCT AT TA AA A AAT.C C.A.TCC.TGT L2CB_17 481 TC.A T A T T ATT A .GGCCT AT TA AA A AAT c c A TCC TGT L3CB-17 481 TC.A .T A T .T ATT .A .GGCCT.AT.TA.AA.A .AAT.C .C.A.TCC.TGT L4CB_17 481 TC.A T A T T ATT A GGCCT AT TA AA A AAT.C .C.A.TCC.TGT L5CB17 481 TC.A T A T -T ATT .A .GGCCT.AT.TA.AA.A .AAT.C -C.A.TCC.TGT 570 580 590 600 I I I I I I I I CYTB Homo sapiens 561 ACTATTCTCACCAGACCTCCTAGGCGACCCAGACAATTATACCC N1CB_16 561 N2CB-16 561 N3CB 16 561 N4CB_16 561 T N5CB16 561 52 N6CB 16 561 N7CB_16 561 N8CB 16 561 N9CB_16 561 N10CB_16 561 N11CB 16 561 N12CB-16 561 c N13CB_16 561 N14CB_16 561 N15CB_16 561 B1CB_17 561 G C c A T C C B2CB_17 561 G C c A T C C B3CB-17 561 G C c A T ,c .c B4CB.17 561 G C c A T C C B5CB_17 561 G C c A T C C B6CB.17 561 G C c A T C C B7CB17 561 B8CB_17 561 G C c A T C C B9CB 17 561 G .c c A T.-C.-C B10CB_17 561 G C c A T C C ThưoVÌện.ViệrkĐạikạCtMỞ Hà Nội ChlCB_17 561 TT T T AT A T C C Ch2CB 17 561 TT T T AT A T C C Ch3CB_17 561 TT T T AT A T C C ChO4_17 561 TT T T AT .A T.-C ,c Ch5CB_17 561 TT .T T AT A T C C L1CB_17 561 A A C C L2CB 17 561 A A C C L3CB-17 561 A .A .c .c L4CB_17 561 A A C C L5CB.17 561 A A C C Hình 15: So sánh trình tự nucleotid từ bị, chó, 1ỌT1 nghiên cứu vói trình tự nucleotid người (Homo sapiens JN034136.1) 53 Ghi : dịng trình tự nucleotide chuấn lồi người lưu Genbank Các dịng kí hiệu từ trình tự gen Cytb 15 mẫu cùa người, 10 mầu bị, chó, mẫu lợn nghiên cứu Dấu (.) biếu thị giống nucleotide; sai khác nucleotide so với trình tự chn kí hiệu băng chữ ký hiệu nucleotide dó Tì lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu người với bị, chó, lợn đạt kết sau : Mầu Mầu so sánh ri lệ phần trăm trình tự nucleotid đa hình (%) Bị 29,14% Chó 24,17% Lợn 25,17% Người Bảng 9: Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình mẫu người vói bị, chó, lựn Trong lồi đa hình khơng cao (0,49% - 2,15% bâng 8), so , TỊỊựviẹn ViJnmTnpc lylalla’N0i™,, ‘ sánh lồi với cho thâỹ tỷ lệ đa hình rât cao (24% - 30% bâng 9) Sau so sánh trình tự người với bị, chó, lợn kết cho thấy tỷ lệ phần trăm trình tự đa hình 29,14%; 24,17% 25,17% Các tỉ lệ nằm khoảng từ 5,97% đến 34,83%, hoàn toàn tương ứng với nghiên cứu Hsing-Mei Hsieh [17] cộng lồi khác có ti lệ phần trăm trình tự đa hình từ 5,97% đến 34,83% Qua bàng cho thấy tý lệ đa hình gen Cytb loài lớn, đù độ tin cậy đế dùng gen Cytb làm chi thị phân biệt loài với 54 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua nghiên cứu trình tự gen Cytb người số động vật đến kết luận sau: Đã hoàn thiện kỹ thuật khuếch đại giài trình tự ADN gen Cytb genome ty người, bị, chó lợn Đã phân tích trình tự ADN vùng Cytb nhàm kết luận trường họp giám định ADN phân biệt người số động vật Kiến nghị Qua nghiên cứu tôi: Tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu lớn đế thu số lượng trình tự gen Cytb đa hình đầy đù Tiếp tục thực nghiện cứu vùng gen-.Cv//? nhiều lồi động vật khác đê có liệu phân biệt người động vật đú 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO A - Tiếng Việt I Nguyền Anh, Nguyễn Duy Huy, Đồ Văn Thu, Nguyễn Bích Nga, Lê Thanh Hịa (2007) Nghiên cứu xác định trình tự gen mã hóa Cytochrome B cùa hệ gen ty the đánh giá mối quan hệ di truyền cùa số lồi cá song (Epinephelus Spp) ni vùng biến Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(2): 171 -178, 2007 Nguyền Mạnh Hà, Vũ Thị Hương Giang (2013) nghiên cứu khả sinh trưởng đa hình gen Cytochrome B gà Bị gà Mía phục vụ cho cơng tác báo tồn giống Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 107(07): 11, 2013 Nguyễn Minh Tâm, Nguyễn Thị Phương Trang, Nguyễn Xuân Đặng (2008) Trình tự Cytochrome Sao la (Pseudoryx Nghctinhcnsis) Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(2): 161 - 167, 2008 HỒ Huỳnh' Thụy, Dương 2Q02j Sinh họẹ phân ựr\I^ià xuất bàn Giáo dục Nguyễn Như Hiền 2014 Giáo trình sinh học tế bào Nhà xuất bàn Giáo dục Việt Nam Quy trình giám định ADN Thông tư số 47/2013 ngày 31/12/2013 Bộ Y tế ban hành Quy trình giám định pháp y B - Tiếng Anh H Afonso Costa et al (2010) Species identification from genetic materialwith cytochrome b Imprensa da Universidade de Coimbra; International Academy of LegalMcdicine Anderson, s„ Bankier, A T„ Barrell, B G., de Bruijn, M H L., Coulson, A R„ Drouin, J., Eperon, I c., Nierlich, D p Roe, B A., Sanger, F„ Schreier, p H„ Smith, A J H„ Staden, R„ and Young, I G (1981), “ Sequence and organization of the human mitochondrial genome ”, Nature 290: 457-465 56 Anderson, et al 1981 “Sequence and Organization of the Human Mitochondrial Genome.” Nature 290 (5806): 457-65 10 Andrews, el al 1999 “Rcanalysis and Revision of the Cambridge Reference Sequence for Human Mitochondrial DNA.” Nature Genetics 23 (2): 147 doi: 10.1038/13779 1 Applied Biosystems 2007 BigDye XTerminatior Purification Kit 12 Applied Biosystems 2010 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 13 Bellagamba F., Valfre F„ Panseri s., & Moretti V M., (2003) Polymerase chain reaction-based analysis to detect terrestrial animal protein in fish meal Journal of Food Protection 66(4): 682 - 685 11 14 L Cainé., G Lima., L Pontes., D Abrantes., M Pereira., M.F Pinheiro (2006) Species identification by cytochrome h gene: Casework samples International Congress Series Volume 1288, Pages 145 - 147 15 Holland MM., Fisher DL„ Mitchell LG Rodriquez wc., Canik JJ., Merril CR, Weedn'VW* ^99^)1 :MitòẻhỒkdriừl; 'Ế)NA salience analysis of human skeletal remains: identification of remains from the Vietnam War J Forensic Sci 38(3):542 - 53 16 Hsieh HM, Chiang HL., Tsai LC„ Lai SY., Huang NE., Linacre A., Lee JC (2001) Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals Forensic Sci Int: 122( ):7-18 17 Irwin D.M., Kocher T.D., Wilson A.C., 1991 Evolution of the cytochrome b gene of mammals Journal of Molecular Evolution 32: 128-44 18 Kocher T D., Thomas w K., Meyer A., Edwards s V., Paabo s., Villablanca F X., et al., 1989 Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing of conserved primers Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America 86: 6196-200 57 19 Lee, et al 2012 “Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.” Journal of Visualized Experiments: JoVE, no 62 doi: 10.3791/3923 20 Malgorzata N., Ewa s Beata (2010) Use of Cytochrome b Polymorphism for Species Identification of BiologicalMaterial Derived from Cattle, Sheep, Goats, Roe Deer and Red Deer Folia biologica (Krakow), vol 58, No 1-2 21 Matsuda H., Seo Y., Kakizaki E., Kozawa s., Muraoka E., Yukawa N (2005) Identification of DNA of human origin based on amplification of human-specific mitochondrial cytochrome b region Forensic Sci Ini 2005 Sep 10; 152(2-3): 109-14 22 Matsunaga T„ Chikuni K„ Tanabe R., Muroya s„ Shibata K., Yamad J., Shinmura Y„ (1999) A quick and simple method for the identification of meat species cowproduct by PGR assa^ Meat Scieqce^ 51: 143-148 23 Maede, D (2006) A strategy for molecular species detection in meat and meat products by PCR-RFLP and DNA sequencing using mitochondrial and chromosomal genetic sequences European Food Research and Technology 224(2): 209-217 24 Nakaki s., Hino D., Miyoshi M., Nakayama H., Moriyoshi H., Morikawa T„ Itohara K (2007) Study of animal species (human, dog and cat) identification using a multiplex single-base primer extension reaction in the cytochrome b gene Forensic Sci Int.;173(2-3):97-102 25 w Parson., K Pegoraro., H Nicderstatter., M Foger., M Steinlechner (2000) Species identification by means of the cytochrome b gene International Journal of Legal Medicine, Volume 114, Issue 1, pp 23-28 58 26 Pascoal A., Prado M., Calo p., Cepeda A., & Barros-Velazquez J., (2005) Detection of bovine DNA in raw and heat-processed foodstuffs, commercial foods and specific risk materials by a novel specific polymerase chain reaction method European Food Research and Technology 220(3-4): 444-450 27 Promega, Corp 1996 GenePrintTM STR Systems Technical Manual (Silver Stain Detection) 28 Promega 2010 “Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol.” 29 Raju Panday., Dinesh K Jha., Nirajan Thapa., Basant R Pokharel and Nanda K Aryal (2014) Forensic Identification Wildlife Parts and their Product and Individualization Using DNA Barcoding The Open Forensic Science Journal 7, 6-13 30 Rob Ogdenp Nj