Giải trình tự gen vi khuẩn thuộc chi neisseria trong mô đúc nến bằng giải trình tự sanger

-ãc ô4 ugc V Hl B GIO DC V O TẠO BỘYTÉ TRƯỜNG DẠI HỌC V HÀ NỘI NGUYỀN THỊ NGỌC ÁNH GIÃI TRÌNH TựGEN VI KHUÂN THUỘC CHI NEISSERIA TRONG MƠ DÚC NÊN BÀNG GIÃI TRÌNH Tự SANGER Ngành đào tạo: kỷ thuật xét nghiệm V học Mã ngành: 7720601 KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP cư NHẤN Y KHOA Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Trần Vân Khánh TS.Nguyẽn Hoàng Việt H NI 2023 -ãc ô4 ugc V Hl LI CM ƠN Trước hốt, với tất ca lòng kinh trọng biết ơn, cm xin gưi lời cam ơn đền PGS.TS.Trần Vân Khánh vã TS Nguyền Hồng Việt, thầy cị đà trực tiếp hường dần em hoàn thiện khỏa luận Em xin cám ơn thầy, cô tận tinh hướng dẫn truyền dạt cho cm kiến thức bố ích lọo diêu kiện tốt de cm cị thê hồn thiện khóa luận tot nghiệp Nhờ có hướng dần dạy bao cua thảy nên de tài nghiên cứu cua cm mõi có thè hồn thiện tốt dẹp Với tình cam sâu sắc vã chân thảnh nhất, cho phép cm dược gưi lời cam on den Ban Giám hiệu Phòng Đào tạo Đại Học Khoa Kỳ thuật Y học Bệnh học phản tư trường Dại học Y llã Nội Em xin gứi lời cám ơn den GS.TS.BS Tạ Thành Vân giám đốc Trung Tàm Nghiên cứu Gcn- Protcin trường Dại học Y Hả Nội, dà cho em có hội dược thực hãnh trcn trung tàm giúp em làm quen với mòi trường nghiên cửu khoa học vã trang thiết bị máy móc đại Em xin gửi lời cam ơn den TS Phạm Lê Anh Tuấn dà tạo điều kiện hỗ trợ em trinh hoàn thành de tài Em xin dược gưi lời cam em tới tất cà thầy cô anh chị cán nhân viên Trung Tâm Nghiên Cứu Gen- Protein dà tận tinh giúp đờ quan tâm động viên đê em có thê hỗn thiện khóa luận Em xin gưi lời cam ơn tới gia dinh vả bạn bẽn giúp dừ đồng hành ung hộ em suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Đại Học Y Hà Nội dê hỗn thiện khóa luận Hà Nội tháng 05 nám 2023 Sinh viên Nguyền Thị Ngọc Ánh -ãc ô4 ugc V Hl CNG HềA X HI CH NGHỈA việt nam Độc lập - Tự - Hạnh phúc CAM ĐOAN Kính gửi: Phịng Qn lý đào tạo Dại học - Trường Dại học Y Hà Nội Hội đồng chấm thi khóa luận tốt nghiệp Em tên Nguyen Thị Ngọc Ảnh sinh viên tô 28 lớp Y4XN chuyên ngành Cử nhàn Xét nghiệm y học khỏa 2019 2023 trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan: Đây cóng trinh nghiên cứu cùa em hướng dần giúp dờ TS Nguyền Hoảng Việt vã PGS.TS Trần Vân Khánh Các sổ liệu vả thông tin nghiên cứu lâ chinh xác trung thực, khách quan em tự thực thu thp Sinh viờn Nguyn Th Ngc nh -ãc ô4 ugc V Hl MỤC LỤC ĐẠT VÁN ĐÈ CHƯƠNG I: TÒNG QUAN 1.1 Vi khuân Neisseria Gonorrhoeae 1.1.1 Cấu trúc 1.1.2 Sức đề kháng 1.1.3 Khu nũng gây bệnh che bệnh sinh 1.1.4 Dưòng lây truyền biện pháp phòng ngừa 10 1.1.5 Phương pháp phát Neisseria Gonorrhoeac 12 1.1.6 Dịch te 13 1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tứ 15 1.2.1 Mô (lúc nến 15 1.2.2 Tách chiết DNA từ mô vùi paraffin 19 1.2.3 Phăn ứng Polymerase Chain Reaction 20 1.2.4 Giãi trinh tự gen kỹ thuật giãi trinh tự Sanger 23 CHƯƠNG 2: DÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư .28 2.1 Dổi tượng nghiên cứu 28 2.2 Thòi gian địa diem nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.3.2 Cờ mẩu nghiên cứu 28 2.3.3 Sơ dồ nghiên cứu 29 2.3.4 Dụng cụ, thiết bị hóa chất nghiên cứu 29 -•c «4 ugc V Hl 2.3.5 Quy trinh nghiên cứu 31 2.4 Xữ li số liệu 38 2.5 Dạo (lức nghiên cứu 38 CHƯƠNG 3: KÉT QUÁ NGHIÊN cưu 39 3.1 Kết tách DNA Kit QlAamp DNA FFPE Tissue 39 3.2 Kết quã điện (li sân phẩm PCR 41 3.3 Ket giãi trình tự gen Sanger 42 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 4.1 ưu nhược điếm cùa mẫu mô (lúc nến 46 4.2 Kết tách chiết DNA từ mô FFPE 47 4.3 Lựa chọn cập mồi khuếch (lại vùng 16s rRNA 48 4.4 Kết qua PCR phát Neisseria Gonorrhoeae 51 4.5 Kết quã giãi trinh tự Sanger 52 4.6 Tinh hình nghiên cứu ứ Việt Nam thể giói 55 KÉT LUẬN 59 TÀI LIÊU THAM KHÁO -ãc ô4 ugc V Hl DANH MC CH VIẾT TÁT N.Gononhoeae :Neisseria Gonorrhoeae PCR : Polymerase chain reaction FFPE :Fonnalin Fixed Paraffin Embedded (Mó đúc nến vùi pararffin) Tin Temperature melting ( Nhiệt độ nông chay cùa mồi) CDC : Centers for Disease Control and Prevention (Trung tàm kiêm sốt phịng ngừa dịch bệnh) dNTP : Deoxynucleotide dclNTP : Dideoxynucleotide -ãc ô4 ugc V Hl DANH -MC BÁNG Báng 1.1 Bang thống kê số ca mắc lậu nước ta lừ năm 2012-2016 Báng 2.1 Thành phần phán ứng PCR Báng 2.2 Mồi I6S rRNA lựa chọn Bâng 23 Chu trình nhiệt phan ứng PCR Bang 2.4 Thành phần phan ứng giãi trinh tự Sanger Báng 2.5 Chu kỳ nhiệt phan ứng giãi trình lự Sanger Báng 3.1 Kết qua quang trcn máy Nanodrop 2000c vi 17 mu nghicn cu -ãc ô4 ugc V Hl DANH MỤC HÌNH ANH Hình 1.1 Vi khn Neisseria gonorrhosas Hình 1.2 Sinh bệnh học cùa vi khuân Neisseria Gonorrhoeas khơng biến chung theo Morse Hình 1.3 Các giai đoạn cúa phan ứng chuỗi polymerase (PCR) Hình 1.4 Cấu trúc phàn tú dNTP vã ddNTP Hình 1.5 Ilinh minh họa giái trinh tự gcn trẽn gcl Hình 1.6 Minh họa giai trinh tự Sanger máy tự dộng Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.2 Minh họa diện di sân phẩm PCR gel agarose Hình 3.1 Minh họa kết qua đo nồng độc ĐNA máy Nanodrop 2000c cùa mẫu DNA bệnh nhân HyC 01 sau tách chiết Hình 3.2 kết diện di sân phàm PCR phát lậu cầu Hình 3.3 Kết qua giai trinh tự Sanger «4 ugc V Hl TĨM TÁT KHĨA LUẬN Vi khn chi Neisseria dóng vai trị quan trọng cản nguycn gày bệnh lây nhiễm qua dường tinh dục Trong lồi thuộc chi có hai lồi lồi gảy bệnh nguy hiềm lã Neisseria Gonorrhoeae Neisseria Xíemgilidis Vi khuẩn Neisseria Gonorrhoeae (N.Gonorrhoeae) vi khuẩn nguy hiêm không chi gây bệnh tụi dường sinh dục mả cỏn gây bệnh co quan khác mat miệng, họng Theo thõng kê cua tô chức Y tê Thè giới (WHO) cho thấy vào năm 2020 uớc tinh cỏ khoang 82.4 triệu trường hợp mắc bệnh lậu xảy toàn cầu Tại Hoa Kỳ, vào năm 2020, tồng cộng 677.769 trường hợp mẩc lậu cẩu dà dưực báo cáo cho CDC, vã bệnh lây nhiem qua dường tinh dục phô biến thứ hai o Hoa Kỳ Việt Nam linh hình nhiễm vi khuẩn Neisseria Gonorrhoeae diễn phức tạp với tỹ lệ chung N.gonorrìioeae kháng kháng sinh ngày gia táng dần đến nhiêu khơ khản diều trị Các mầu bệnh phẳm mị tươi khơng báo quan dược lâu khơng có ý nghĩa cho cãc nghiên cứu sau Mô đúc nến mẫu mô dược bao quan paraffin, giúp bao quan bệnh phàm ca VC hình thái lần cấu trúc thời gian dài với chi phí bao quan thấp Mơ đúc nen nguồn vật liệu cô giá trị phát đột biến định danh vi khuân, vi rút Chính vi nghiên cửu dược thực với mục tiêu: xác định dược có mật cùa vi khuân chi Neisseria mẫu mỏ đúc nến vả giai trinh tự gen mầu dương linh kỳ thuật giai trinh lự Sanger Nghiên cứu dược thực với 17 màu mô đúc dam bao yêu cầu lựa chọn mẫu bệnh phàm Kct qua thu 03 mẫu xãc định có xuắi trinh tự khuếch dại phũ hợp (dương tinh) kỹ thuật PCR Tiến hành giãi trinh tự gcn mầu ngầu nhiên dương tinh thu dược trinh tự tương dồng với gen cùa hụ vi khuân Neisseria so sánh với gcn chuân ngủn hàng Gcn «4 ugc V Hl 52 phẩm phụ cịn có the DNA dirt gày lạo thành Formalin gian cố định bệnh phàm có thê oxy hóa thành axil formic, điều kiện axil mạnh purin giai phóng khiến DNA bị phân húy phân manh Thời gian cổ định, loại chai cố dinh, thành phan cua chat co định (nong dộ formalin, plỉ vả nồng độ muồi), loại mõ nhiệt độ củng góp phần lãm phân huy DNA Đày nhược diem cùa mẫu mò dúc nến tiến hãnh nghiên cứu mầu bệnh phàm 4.5 Ket giãi trinh tự Sanger Hiện giái trinh lự Sanger dà dược tiến hành máy giái trinh tự gcn tự động giúp phát hay định danh vi khuắn dễ dâng với độ chinh xác cao Chinh vi nghiên cứu chúng tơi dà lựa chọn phương pháp giái trình lự gen đê định danh vi khuân Neissei ta Gũnotrhơeae Đánh giá chai lưựng kết quà giái trình tự mầu HyC 14 cho thấy hĩnh anh dinh nucleotide rò ràng, tin hiệu thấp, dụt tiêu chuẩn đe so sánh, phân tích, định danh vi khuân Tuy nhiên kết qua giãi trinh tự cho thấy so vùng có tin hiệu nhiều, chu yếu lã đoạn trinh tự ngan hai dâu cua cùa san phẩm DNA dược tách chiết từ mỏ dúc nen nên khó tránh khơi việc cịn lẫn tạp chất carbohydrat, lipid, hóa chất cịn sót lại sau lách chiết, yếu tố dần đen hĩnh anh nhiều cho kct quà giai trinh tự Horn nửa, trình cố định băng fomalin dàn đến hĩnh thành liên kết chéo DNA - protein, khó dê loại bị hồn tồn q trình tách chiết Ngồi formalin bị oxy hóa thành axit formic gày tương khư purin DNA đứt gày DNA Gác yếu tố có thỏ nguyên nhãn dần đen hình ánh giãi trình lự cịn xuất tín hiệu nhiều Jl Mầu HyC 14 giai trinh tự có nồng độ DNA tách chiết 75.1ng/pl (trong khoáng khuyến cáo), độ tinh A260/280 lã 2.04 (trong khoang cho phép), luy nhiên ty sỗ A260/230 li nm ngoi khoang gii hn -ãc ^H ô4 ugc V Hl 53 San phâm PCR có the lần số tạp chất sán phàm không đặc hiệu, tiến hãnh diện di xuất băng mở nho Điều cô thê nguycn nhân anh hưởng đến chắt lượng giai trình tự mầu HyC 14 cùa chúng tịi Qua phân tích kết qua giai trinh tự xác định vật chất di truyền cua mầu HyC 14 có lý lệ tương dong cao (96%) với trình tự gcn cua chung Neisseria suflava vi khuân thuộc chi Neisseria ngân hàng Gen Chửng to dà phát dược vi khuẩn chi Neisseria từ mảu mó đúc nến (vùi paraffin) cùa 17 mầu nghiên cửu Chi Neisseria chứa 34 loài (cập nhật ngây 02 tháng 11 năm 2022) song cầu Gram ám vả nhiêu lồi cộng sinh vơ hại trẽn niêm mạc cua người dộng Tuy nhiên chi bao gồm hai mầm bệnh quan trọng gây bệnh người Neisseria Ganorrhoeae Neisseria Meningitidis ’2 Neisseria subflava dược tim thấy đường hô hấp vi khuân dược coi không gây bệnh, nhiên so trưởng hợp Neisseria subflava có thê lác nhân gây viêm màng sau phẫu thuật ỈJ Theo nghiên cửu cua Masatoshi Tanaka phân tích dột biền gen liên quan dển tinh trạng kháng thuốc sỗ chung Neisseria gonorrhoeae thành phố Fukuoka Nhật Ban dà chi ràng Neisseria sitbflava có thê đóng vai trô quan trọng xuất cua chung Neisseria Gonorrhoeae kháng penicillin cephalosporin qua trung gian nhiêm sẳc thê bang cách trao dôi gen theo chiêu ngang cùa gcn mà hóa vị tri đích cho penicillin cephalosporin.51 Mặc dù nghiên cửu chưa phát dược chinh xác lồi Neisseria Gonoirhơeae mẫu mị đúc nến dà phát vi khuân thuộc chi Neisseria mầu nghiên cứu Đè giái thích cho kết nhận thấy rang: ^H «4 ugc V Hl 54 Cạp mồi lựa chọn chưa thực tồi ưu de khuếch đại vi khuẩn Neisseria Gonoirhoeae từ mỏ dũc Như dã phân lích trên, vùng I6S cùa vi khuẩn bao gồm vùng bao tồn giống vi khuân loài vã cãc vùng siêu bicn dôi dê phàn biệt giừa vi khn lồi Có thê trinh tự moi lựa chọn dược thiết kế vảo vùng báo tồn cua nhỏm vi khuân Neisseria, vi nên chưa thực đặc hiệu với N.gonoirhoeae Him nừa tinh phố biền cua gen 16S rRNA nen dược thiết kể có phạm vi rộng, cỏ thê khuếch dại ca vi khuẩn khác có mật thành phần bị nhiêm Tý lệ nhiêm Nessena subjlava dtrờng hô hấp khu vực hầu họng tương dối thấp, nhiên không loại trừ trường hợp bệnh nhân dồng nhiễm hai loại vi khuân Neisseria Gonoirhoeae Neisseria Subflava Trong khuôn khố khóa luận tốt nghiệp với cờ mầu nho (17 mầu nghiên cứu) nên kct qua chưa mang ý nghĩa thông kè, chưa kháng định chúng vi khuân Neisseria gonorrhoeae hay gặp mó dúc Vi nghiên cứu cần dược mớ rộng cờ mầu dê có thê dưa kết qua trinh tự tốt lum xác định dược chung N.gonoirhoeae hay gập mầu mô vùi paraffin Như quy trinh giái trinh tự gen vi khn từ mơ đúc nến dà dược hồn thành, bao gồm bước: ('huân bị mầu mò đúc nến (vùi paraffin): Tách chiết DNA từ mẫu mỏ dúc nén bang Kit QlAamp DNA FFPE Tissue: Kiêm tra ĐNA sau tách chiết; Khuểch dại vi khuân lậu cầu bang kỳ thuật PCR; Giai trinh tự gen ngẫu nhiên mầu dương tinh với ket qua PCR bang giai trinh lự Sanger, phân tích so sánh kết qua .^H «4 ugc V Hl 55 Ngày phương pháp giai trinh tự gen hộ (NGS) với nhiêu ưu diêm cho phẽp giải trình tự đồng thời với so lượng lớn DNA đích lằn chạy, trư diem chi phí tinh song song, NGS vần chưa thê thay the hoàn toàn giái trinh tự Sanger So sánh với NGS có thê thay, NGS giai trinh tự hàng triệu DNA lúc cung cấp dừ liệu lớn cần nhiều thời gian đè xử li nhiên dộ dải dọc thường ngắn (35 "00 bp) NGS chi có hiệu qua chi phi với trường hợp có số lượng mục tiêu lớn (> 20 mục tiêu) Giai trinh tự Sanger cho phép giai trinh tự cảc đoạn trinh tự lớn (900 1000 bp) việc cho phcp giái trinh tự đoạn DNA phan ứng giúp tiết kiệm thời gian chi phí dổi với trường hợp sổ lượng mục tiêu (1 20 mục tiêu) Trong nghiên cứu cua với mục liêu giãi trinh tự gcn vi khuân N.Ganorrhoeae từ mảu có kết qua PCR dương tính, kích thước doạn khuếch đại 694 bp với số lượng gen mục tiêu it kích thước lớn việc lựa chọn giai trinh lự Sanger phũ hợp với mục đích nghiên cứu 4.6 Tình hình nghiên cứu Việt Nam giỏi Tại Việt Nam Tại Việt Nam theo nghiên cứu cua Phan Quốc Hưng ve khao sát thực trạng viêm niệu đạo cấp ỡ nam giới Neisseria GonoiTỈtoeae số yếu tổ liên quan dợn vị Nam học bệnh viện Bạch Mai lừ tháng nảm 2020 đen tháng năm 2021 kết qua nghiên cứu cho thầy tý lộ nức N.Gononhoeae từ bệnh phẩm dịch dịch dục lã 38.3% tống số 120 mầu nghiên cứu.' Theo nghiên cửu cua Nguyền Hoa Lan VC tinh hĩnh kháng kháng sinh chung vi khuân N.Gonoirhoeae dã phàn lập viện Da liều Trung ương nãm 2017 với 1788 bệnh nhân, nghiên cửu tiến hãnh bệnh phẩm dịch sinh dục cho kết qua có 140 bệnh nhân dương tinh với NGonanhoeae trẽn tơng sổ mẫu nghiên cửu, lương ứng với 7.83% ỉ6 Két ^H «4 ugc V Hl 56 qua có khác biệt so với nghiên cứu cua Trần Hai tỳ lệ nhiễm mức độ kháng kháng sinh cua N.Gownhoeae bệnh nhân cỏ triệu chứng tiết dịch niệu đạo âm dạo vào năm 2019 kct qua cùa nghiên cứu cho biết tông so 50X2 bênh nhãn tham gia nghiên cửu có 923 trường hợp (18.16%) dương tính vói V Gonorrhoeae Theo nghicn cứu cua Paul c Adamson Lè Minh Giang cộng vê lý lệ nhiễm, phàn bo môi lương quan nhiễm Chlamydia trachomatis V Gononhoeae nhỏm nam quan hộ tinh dục dong giới Hà Nội từ tháng nám 2017 den tháng năm 2019 Nghiên cứu dược thực với bệnh phàm mẫu lấy từ niệu đạo trực tràng hẩu họng, nước tiêu cobas PCR, cho kết qua tỳ lệ dương linh với N.Gonorrhoea? lả 11.6% trường hợp nhiễm trùng hầu họng có den 70.5% trưởng hợp N.Gononhoeae) Trên giới Trên giới, nghiên cứu dưa cãc kel qua khác VC tý lộ dương linh với vi khuân N.Gononhoeae đỗi với dạng bệnh phâm khác Theo nghiên cứu Kazufumi Nakashima cộng nghiên cứu so sánh ty lệ nhiễm HPV N.Gonorrhoeae Chlamydia trachonatis Mycoplasma spp hầu họng nước liêu dối tương nam giới có quan hệ tinh dục tuồi lừ 16 70 (trung binh: 34.4) Nhật Ban Nghiên cứu sư dụng PCR với cập moi dặc hiệu dê phát N.gononhoeae Ket qua cho thấy tý lộ nhiễm lậu cầu phố biền I1OT1 họng miệng, với tý lệ dương tinh 15.6% ty lệ dương tinh với lậu cầu nước tiêu lã 9.1%38 Theo nghiên cứu báo cáo cùa BS Ho WG Feng cộng đánh giã kha phát Neisseria Gononhoeae kỹ thuật PCR tử mẫu tăm «4 ugc V Hl 57 bỏng chửa dịch sinh dục cho kết qua dương tinh với 34/52 mầu nghicn cứu Từ sau nghiên cứu dã dưa kết luận PCR cỏ thê lả cỏng cụ giúp chân đoán vi khuẩn Neisseria Gonorrhoeae)Kếl thu dược ỡ nghiên cứu cua Seada Ali cộng bệnh viện Gambella Ethiopia từ tháng đến tháng năm 2015 Neisseria Gononhoeae láy nhiễm qua dường linh dục yếu to kháng thuốc trẽn dôi tượng nghi ngờ mac bệnh lây truyền qua dưỡng linh dục cho thây tý lệ nhiễm N.Goiiorrhoeae lã 11.3% Nghiên cứu dược tiến hành mẫu bệnh phẩm lã dịch sinh dục tiến hành nuôi cấy mói trưởng Thayer- martin dọc két qua sau 24 - 4811.39 Giai trinh tự toàn bộ gen cho phép diều tra dịch tễ học lây truyền mẩm bệnh với độ chinh xác cao ủng dụng cua doi với Neisseria Gonoirhoeae phức lạp ty lệ tái lô hợp cao Giải trinh lự loàn bộ gen dã dược sư dụng để diều tra dợt bùng phái bệnh lậu kháng kháng sinh Theo nghiên cứu cua Dilrini De Silva PhD giai trinh tự toàn bộ gcn dê xác định lây truyền N.gonorrhoeae Anh, tiến hành đối lượng đen khám sức khỏe tinh dục nhiều dịa diem vương quốc Anh Kct thu dược 1407 (98%) số 1437 dòng phát đà dược phân lập Trong 578 dịng (41%) phân lập dược giai trinh tự lấy bệnh phàm lừ niệu đạo, 518 dịng (37%) lừ trục tràng, 239 dơng (17%) từ hầu họng 68 dòng (5%) từ cổ tữ cung I địng (