Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn thuộc chi bacillus

LỜI CẢM ƠN Đề tài “Phân lập xác định đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus” nội dung em chọn nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp sau thời gian năm học trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Trong q trình đó, em nghiên cứu hồn thiện khóa luận nhờ có giúp đỡ nhiều từ nhà trƣờng thầy cô Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập Viện Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Viện Công Nghệ Sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam nhiệt tình việc truyền đạt vốn kiến thức quý báu giúp đỡ em nhiều thời gian học tập trƣờng Em xin chân thành cảm ơn cô Ths Nguyễn Thị Thu Hằng trực tiếp bảo hƣớng dẫn em suốt trình nghiên cứu giúp em hồn thành khóa luận Mặc dù khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý báu quý thầy cô bạn học lớp giúp khóa luận hồn thiện Lời sau cùng, em xin kính chúc q thầy Viện Công Nghệ Sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam sức khỏe, niềm tin, vững bƣớc dìu dắt chúng em trƣởng thành n 1t n n m Sinh viên thực Bùi Thu Huyền i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii D NH MỤC BẢNG iv D NH MỤC H NH v DANH MỤC VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus 1.2 Sơ lƣợc vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1 Lịch sử phát 1.2.2 Đặc điểm phân loại phân bố tự nhiên 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.2.4 Ứng dụng Bacillus subtilis 1.2.5 Tình hình nghiên cứu Bacillus subtilis 1.3 Sơ lƣợc vi khuẩn Bacillus licheniformis 1.3.1 Đặc điểm sinh học phân bố tự nhiên 1.3.2 Ứng dụng Bacillus licheniformis PHẦN II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 10 2.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.3 Nguyên liệu 10 2.3.1 Nguồn vi sinh vật 10 2.3.2 Hóa chất 10 2.3.3 Thiết bị sử dụng 10 2.3.4 Môi trƣờng nghiên cứu 11 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 12 2.4.1 Phƣơng pháp phân lập làm vi sinh vật [2] 12 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn [2] 12 ii 2.4.3 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào vi khuẩn [2] 14 2.4.4 Xác định khả sinh trƣởng phát triển vi khuẩn mơi trƣờng kỵ khí [2] 16 2.4.5 Xác định khả đồng hóa nguồn carbon [34] 17 2.4.6 Xác định khả chịu NaCl [34] 17 2.4.7 Xác định khả chịu nhiệt [34] 17 2.4.8 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 18 2.5 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 18 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Phân lập sàng lọc sơ chủng Bacillus 19 3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào vi khuẩn 22 3.3 Xác định khả sinh trƣởng phát triển vi khuẩn môi trƣờng kỵ khí 25 3.4 Xác định khả đồng hóa nguồn carbon 26 3.5 Xác định khả chịu NaCl 28 3.6 Xác định khả chịu nhiệt 29 3.7 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 30 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 4.1 Kết luận 31 4.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii D NH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Công thức môi trƣờng LB 11 Bảng 2.2: Công thức môi trƣờng xác định khả đồng hóa nguồn carbon 11 Bảng 2.3: Cơng thức mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme 12 Bảng 3.1 Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 19 Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn phân lập 22 Bảng 3.3 Hoạt tính protease chủng vi khuẩn phân lập 23 Bảng 3.4 Hoạt tính amylase chủng vi khuẩnđã phân lập 23 Bảng 3.5: Khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng kỵ khí chủng vi khuẩn phân lập 25 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn carbon 26 Bảng 3.7 Khả chịu muối chủng vi khuẩn 28 Bảng 3.8 Khả phát triển nhiệt độ khác 29 Bảng 3.9: Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 iv D NH MỤC H NH Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 1.2 Vi khuẩn Bacillus licheniformis Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 20 Hình 3.2 Hình dạng chủng vi khuẩn qua quan sát dƣới kính hiển vi 20 Hình 3.3 Hoạt tính catalase chủng vi khuẩn LB2 LB5 21 Hình 3.4 Hoạt tính cellulase chủng LB2, LB4 LB5 22 Hình 3.5 Hoạt tính protease chủng LB2, LB4 LB5 23 Hình 3.6 Hoạt tính amylase chủng LB2, LB4 24 Hình 3.6 Khả sinh trƣởng phát triển điều kiện kỵ khí chủng LB5 25 Hình 3.7 Khả lên men số loại đƣờng sinh acid làm đổi màu môi trƣờng nuôi cấy chủng LB5 27 Hình 3.8 Hoạt tính kháng Bacillus cereus LB4 30 v D NH MỤC VIẾT TẮT CMC : Carboxylmethyl cellulose CTV : Cộng Tác Viên LB : Luria Bertani VK : Vi Khuẩn VSV : Vi Sinh Vật vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chủng vi khuẩn Bacillus phân bố rộng tự nhiên, chúng tham gia tích cực vào phân hủy vật chất hữu nhờ khả sinh nhiều loại enzyme ngoại bào Đa số enzyme enzyme thủy phân phân tử hữu lớn nên vi khuẩn có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác nhƣ: công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công nghệ thực phẩm, công nghệ dƣợc phẩm, công nghệ thuộc da, công nghệ dệt, xử lý nƣớc thải Sự đa dạng loài sinh thái Bacillus nên ứng dụng chúng bao trùm nhiều lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men đại, mỹ phẩm, xử lý môi trƣờng ô nhiễm, sinh học phân tử y-dƣợc học Các chủng Bacillus đƣợc sử dụng việc tạo vacxin vi khuẩn Bacillus subtilis nguồn enzyme cơng nghiệp nhƣ protease amylase Các loại men tiêu hóa, chế phẩm phịng bệnh, chế phẩm cho ăn chăn nuôi đƣợc sản xuất với nguồn nguyên liệu chủng vi khuẩn Bacillus Tuy nhiên, chi Bacillus có nhiều lồi vi khuẩn (500 lồi đƣợc tìm thấy) mà lồi lại có đặc điểm sinh học ứng dụng khác Vì nên em làm đề tài “Phân lập xác định đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus” PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus Phân loại khoa học (Theo phân loại Bergey năm 1974): Giới (regnum): Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (ordo): Bacillales Họ (familia): Bacillaceae Chi (genus): Bacillus Tế bào Bacillus hình que, thẳng gần thẳng, kích thƣớc 0,3 - 2,2 x 1,2 - µm Tế bào Bacillus thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn vuông Bacillus vi khuẩn gram dƣơng, hầu hết dƣơng tính catalase Có khả di động nhờ lơng roi Mỗi tế bào Bacillus hình thành nội bào tử có hình oval hình trụ Bào tử có khả chịu nhiệt, acid Sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản tiếp xúc khơng khí [30] Các lồi thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử giữ nguyên hình que mang bào tử, số trƣờng hợp phình to lên chút Tùy theo lồi Bacillus, bào tử nằm giữa, gần cuối, cuối Đặc điểm phân bố: Nhờ khả sinh bào tử nên Bacillus tồn thời gian dài dƣới điều kiện khác Chúng phổ biến tự nhiên nên phân lập từ nhiều nguồn khác nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, chủ yếu đất nơi mà chúng đóng vai trị quan trọng chu kỳ carbon nito [30] Hầu hết loài thuộc chi Bacillus sinh vật hóa dị dƣỡng, thu lƣợng nhờ oxi hóa hợp chất hữu nhƣ đƣờng, amino acid, acid hữu cơ, Phần lớn loài thuộc chi Bacillus vi khuẩn hiếu khí kị khí tùy tiện, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 30-45oC, số chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu lên tới 65oC, ƣa lạnh (5oC-25oC) Các loài thuộc chi Bacillus sinh trƣởng khoảng pH rộng từ 2-11 Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ muối rộng nên Bacillus tồn điều kiện bất lợi thời gian dài [5] Trong phịng thí nghiệm, dƣới điều kiện sinh trƣởng tối ƣu, Bacillus có thời gian hệ 25 phút [5] 1.2 Sơ lƣợc vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis đƣợc phát lần vào năm 1835 Christion Erenberg tên loài vi khuẩn lúc “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn “Bacteridium” Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy lồi trực khuẩn có đầu vng đặt tên Bacillus subtilis [1,5] Năm 1941, Bacillus subtilis đƣợc phát phân ngựa tổ chức y học Nazi Đức Lúc đầu, chúng đƣợc dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Năm 1949 – 1957, Henry cộng tách đƣợc chủng khiết Bacillus subtilis Gần đây, Bacillus subtilis đƣợc nghiên cứu, sử dụng rộng rãi giới Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” đời Bacillus subtilis đƣợc sử dụng ngày phổ biến đƣợc xem nhƣ sinh vật phòng trị bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy….[5] Ngày nay, Bacillus subtilis đƣợc nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm ứng dụng hiệu chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trƣờng….[1] 1.2.2 Đặc điểm phân loại phân bố tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Chúng phân bố hầu hết môi trƣờng tự nhiên, phần lớn cƣ trú đất rơm rạ, cỏ khô nên đƣợc gọi “trực khuẩn cỏ khô”, thông thƣờng đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dƣỡng vùng sa mạc, đất hoang diện chúng Ngồi ra, chúng cịn có mặt nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng, chao… Bacillus subtilis đóng vai trị đáng kể mặt có lợi nhƣ mặt gây hại trình biến đổi sinh học [8,10] Bacillus subtilis có khả dùng hợp chất vô làm nguồn carbon số loài khác nhƣ Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần hợp chất hữu vitamin amino acid cho sinh trƣởng Đặc biệt loài nhƣ Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng khơng phát triển môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn thông thƣờng nhƣ: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB) [5,12] Năm 1993, giáo sƣ Richard Losik cộng thuộc Đại học Havard Boston (Mỹ) Jose Gonzalez-Pastor Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia Madrid (Tây Ban Nha) cơng bố đƣợc lồi Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại Chúng dùng cách nhƣ phƣơng pháp đơn giản để thoát khỏi trƣờng hợp có đời sống giới hạn nhƣ dinh dƣỡng môi trƣờng cạn kiệt Một cách đơn giản cá thể khỏe mạnh tiêu diệt cá thể xung quanh khác loài lẫn loài, để thu lấy chất dinh dƣỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến mơi trƣờng thuận lợi Ngồi ra, để tránh ảnh hƣởng môi trƣờng khắc nghiệt, chúng thƣờng tạo bào tử, nhƣng cách tiêu hao nhiều lƣợng [12] 1.2.3 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt màu tím Gram (+), kích thƣớc 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, đơn lẻ thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả di động, có - 12 lơng, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ nằm lệch tâm tế bào, kích thƣớc từ 0,8 - 1,8µm [30] Bào tử phát triển cách nảy mầm nứt bào tử, không kháng acid, có khả chịu nhiệt (ở 100ºC 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng Bào tử sống vài năm đến vài chục năm 3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào vi khuẩn Enzyme ngoại bào enzyme đƣợc vi sinh vật sinh tổng hợp sau tiết ngồi tế bào tham gia trình thủy phân chất hữu bên ngồi mơi trƣờng xung quanh Các hợp chất làm nguồn dinh dƣỡng vi sinh vật lấy từ môi trƣờng bên ngồi khơng thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có enzyme để xúc tác phản ứng dị hóa hợp chất cao phân tử thành hợp chất có hợp chất có phân tử lƣợng thấp qua màng tế bào chủng Bacillus ký hiệu LB1, LB2, LB3, LB4 LB5 đƣợc tiến hành khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào Kết đƣợc trình bày Bảng 3.2 phần hình ảnh nghiên cứu trình bày hình 3.4, 3.5 3.6 Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn phân lập Cơ chất CMC 1% 48 Đƣờng kính vịng phân giải, D-d (cm) LB1 LB2 LB3 LB4 LB5 2,08 ±0,02 2,81±0,02 1,73±0,02 3,70±0,02 3,65±0,02 Hình 3.4 Hoạt tính cellulase chủng LB2, LB4 LB5 Hoạt tính cellulase LB2, LB4 LB5 mạnh, đƣờng kính vịng phân giải lớn 2,5cm Hoạt tính cellulase LB1 mạnh, đƣờng kính vịng phân giải lớn 2,0cm LB3 có hoạt tính cellulase trung bình, đƣờng kính vịng phân giải lớn 1,5cm LB4 LB5 có đƣờng kính vịng phân giải lớn (3,72cm 3,67cm) nên có hoạt tính cellulase mạnh chủng cịn lại 22 Bảng 3.3 Hoạt tính protease chủng vi khuẩn phân lập Cơ chất Casein 1% 48 Đƣờng kính vịng phân giải, D-d (cm) LB1 LB2 LB3 LB4 LB5 1,32±0,01 2,15±0,01 1,51±0,01 2,15±0,01 3,47±0,01 Hình 3.5 Hoạt tính protease chủng LB2, LB4 LB5 Hoạt tính protease LB5 mạnh, đƣờng kính vịng phân giải lớn 2,5cm Hoạt tính protease LB2 LB4 mạnh, đƣờng kính vịng phân giải lớn 2,0cm LB3 có hoạt tính protease trung bình, đƣờng kính vịng phân giải lớn 1,5cm LB5 có đƣờng kính vịng phân giải lớn (3,48cm) nên có hoạt tính protease mạnh chủng cịn lại Bảng 3.4 Hoạt tính amylase chủng vi khuẩn phân lập Cơ chất Tinh bột 1% 48 Đƣờng kính vịng phân giải, D-d (cm) LB1 LB2 LB3 LB4 LB5 1,21±0,02 2,74±0,01 1,83±0,01 2,72±0,01 3,90±0,02 23 Hình 3.6 Hoạt tính amylase chủng LB2, LB4 Hoạt tính amylase chủng LB2, LB4 LB5 mạnh, đƣờng kính vịng phân giải lớn 2,5cm LB3 có hoạt tính amylase trung bình, đƣờng kính vịng phân giải lớn 1,5cm LB5 có đƣờng kính vịng phân giải lớn (3,92cm) nên có hoạt tính amylase mạnh chủng lại Kết từ bảng 3.2, 3.3 3.4 hình 3.4, 3.5 3.6 cho thấy: Cả chủng vi khuẩn phân lập sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease cellulase) Cellulase LB4 có hoạt tính mạnh vịng phân giải LB4 lớn đạt 3,72cm Tiếp theo vòng phân giải LB5 đạt 3,67cm, LB2 đạt 2,83cm, LB1 đạt 2,1cm Cellulase LB3 có hoạt tính trung bình vịng phân giải LB4 nhỏ đạt 1,75cm Protease LB5 có hoạt tính mạnh vịng phân giải LB5 lớn đạt 3,48cm Tiếp theo vòng phân giải LB4 LB2 2,16cm Protease LB1 LB3 có hoạt tính trung bình vịng phân giải LB1 LB3 nhỏ, tƣơng ứng đạt 1,33cm 1,52cm Amylase LB5 có hoạt tính mạnh vịng phân giải LB5 lớn đạt 3,92cm Tiếp theo vòng phân giải LB2 đạt 2,75cm LB4 đạt 2,73cm Amyase LB1 LB3 có hoạt tính trung bình vịng phân giải LB1 LB3 nhỏ, tƣơng ứng đạt 1,23cm 1,84cm Từ lấy chủng có hoạt tính enzyme mạnh LB2, LB4 LB5 để tiếp tục làm thực nghiệm xác định đặc điểm sinh học 24 3.3 Xác định khả sinh trƣởng phát triển vi khuẩn môi trƣờng kỵ khí Trong lồi vi khuẩn thuộc chi Bacillus có lồi Bacillus licheniformis có khả sinh trƣởng phát triển điều kiện kỵ khí giúp chúng tồn đƣợc môi trƣờng thiếu oxi Bacillus licheniformis lồi vi khuẩn hiếu khí khơng bắt buộc cịn lồi khác thuộc chi Bacillus hiếu khí Vì chúng đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực Ví dụ xử lý đáy ao nuôi thủy sản, bể xử lý nƣớc thải kỵ khí, hầm tự hoại Kết đƣợc thể qua bảng 3.5 hình 3.6 Bảng 3.5: Khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng kỵ khí chủng vi khuẩn phân lập Chủng Khả sinh trƣởng điều kiện kỵ khí LB2 - LB4 - LB5 + Ghi chú: + : kỵ khí - : khơng kỵ khí Hình 3.6 Khả sinh trưởng phát triển điều kiện kỵ khí chủng LB5 25 Từ kết bảng 3.5 hình 3.6 thấy chủng LB5 phát triển đƣợc mơi trƣờng kỵ khí Vậy chủng LB2 LB4 vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Bacillus cịn chủng LB5 có khả lồi Bacillus licheniformis, lồi vi khuẩn chi Bacillus hiếu khí khơng bắt buộc 3.4 Xác định khả đồng hóa nguồn carbon Nguồn carbon nguồn vật chất cung cấp C cho trình sinh trƣởng vi sinh vật Hầu hết nguồn C trình phản ứng sinh hóa cịn sinh lƣợng cần thiết cho hoạt động sống vi sinh vật Đƣờng nói chung nguồn carbon nguồn lƣợng tốt cho vi sinh vật Tùy loại đƣờng mà vi sinh vật có khả sử dụng khác lực đồng hóa nguồn C loài khác Khả đồng hóa nguồn carbon chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thể bảng 3.6 phần hình ảnh nghiên cứu thể hình 3.7 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn carbon Nguồn cacbon bổ sung Ký hiệu chủng vi khuẩn vào môi trƣờng nuôi cấy LB2 LB4 LB5 Glucose + + + Lactose - - + Glycerol + + + Maltose + + + Xylose - - - Sucrose + + + Fructose + + + Mannitol + + + Ghi chú: + : có khả n n s n trưởng, chuyển hóa nguồn carbon sinh acid - : khơng có khả n n s n trưởng, khơng chuyển hóa nguồn carbon v k ôn s n ac d nên k ôn đổ m u mơ trường 26 Hình 3.7 Khả lên men số loại đường sinh acid làm đổi màu môi trường nuôi cấy chủng LB5 Từ bảng 3.6 cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả dùng nhiều nguồn C khác làm chất dinh dƣỡng: Cả chủng đồng hóa nguồn carbon sinh acid (mơi trƣờng chuyển từ tím sang vàng) có sinh khí (có bọt trắng bề mặt) LB5 đồng hóa đƣợc nguồn cacbon: Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose, Mannitol khơng có khả đồng hóa Xylose LB2 LB4 đồng hóa đƣợc nguồn cacbon: Glucose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose, Mannitol khơng có khả đồng hóa Lactose Xylose Tuy nhiên, LB2 LB4 khơng có khả đồng hóa Lactose Xylose nên nghi ngờ lồi Bacillus subtilis LB5 lồi Bacillus lichenìformis (tham khảo kết từ tài liệu số 24 32) Tạm coi LB2 LB4 vi khuẩn Bacillus subtilis LB5 vi khuẩn Bacillus licheniformis 27 3.5 Xác định khả chịu NaCl Hầu hết chủng Bacillus ƣa mặn, nên mục đích thí nghiệm nhằm xác định khả chịu mặn VK có thích hợp với điều kiện xử lý ao nuôi nhiễm mặn hay không Kết thu đƣợc trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Khả chịu muối chủng vi khuẩn Ký hiệu chủng vi Chỉ số OD600nm đo đƣợc nuôi cấy môi khuẩn trƣờng bổ sung NaCl với nồng độ 1,5% 2% 3% 5% LB2 2,060±0,02 1,651±0,01 1,590±0,02 1,442±0,01 LB4 2,068±0,01 1,592±0,01 1,563±0,02 1,475±0,02 LB5 2,118±0,01 1,660±0,01 1,583±0,01 1,467±0,01 Kết từ bảng 3.7 cho thấy chủng vi khuẩn có khả sống mơi trƣờng có nồng độ muối cao: Ở nồng độ muối thấp 1,5% sinh khối chủng vi khuẩn lớn Nồng độ muối 2% sinh khối vi khuẩn có giảm nhiều so với sinh khối nồng độ 1,5% Sinh khối vi khuẩn nồng độ 3% 5% giảm nhƣng độ chênh lệch so với sinh khối 2% nhỏ Ở nồng độ muối 1,5% chủng sinh trƣởng tốt, OD600nm LB2, LB4 LB5 tƣơng ứng đạt 2,060; 2,069 2,119 Ở nồng độ muối 2%, OD600nm LB2, LB4 LB5 tƣơng ứng đạt 1,652; 1,593 1,661, có giảm rõ rệt Ở nồng độ muối 3%, OD600nm LB2, LB4 LB5 tƣơng ứng đạt 1,592; 1,565 1,584 Ở nồng độ muối 5%, OD600nm LB2, LB4 LB5 tƣơng ứng đạt 1,443; 1,477 1,468 nồng độ muối sau giảm nhẹ so với nồng độ 2%, nhƣng so với 1,5% có giảm mạnh Tuy nhiên số OD cho thấy vi khuẩn phát triển tạo sinh khối đƣợc nồng độ NaCl 5% Vậy chủng vi khuẩn LB2, LB4 LB5 thích nghi đƣợc mơi trƣờng muối có nồng độ cao lên đến 5% 28 3.6 Xác định khả chịu nhiệt Nhiệt độ yếu tố mơi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới sinh trƣởng phát triển chủng trình nuôi cấy nhƣ thực tiễn Ở điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm, chủng ni cấy thƣờng có giá trị nhiệt độ xác định thích hợp cho q trình sinh trƣởng phát triển Do vậy, tiến hành khảo sát khả chịu nhiệt chúng nhiệt độ khác Kết thu đƣợc trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả phát triển nhiệt độ khác Ký hiệu chủng Khả phát triển vi khuẩn nhiệt độ khác vi khuẩn 400C 450C 500C 600C LB2 +++ +++ +++ ++ LB4 +++ +++ +++ ++ LB5 +++ +++ +++ ++ Ghi chú: +++: có khả n n s n trưởng phát triển mạnh ++: có khả n n s n trưởng phát triển trung bình +: có khả n n s n trưởng phát triển Kết từ bảng 3.8 cho thấy chủng phát triển đƣợc khoảng nhiệt độ 40-500C Khi nhiệt độ dần tăng cao mật độ vi khuẩn dần Ở 400C nhiệt độ tối ƣu nên vi khuẩn sinh trƣởng phát triển tạo số lƣợng lớn Ở 450C 500C số lƣợng vi khuẩn có giảm dần Ở 600C chủng sinh trƣởng yếu hơn, số lƣợng vi khuẩn so với số lƣợng vi khuẩn mọc nhiệt độ trƣớc Vậy nên chủng vi khuẩn LB2, LB4 LB5 vi khuẩn ƣa ấm, có khả chịu nhiệt độ 600C Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu cho chủng vi khuẩn khoảng 37-450C 29 3.7 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Từ chủng Bacillus phân lập đƣợc, tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt tính đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn kiểm định gồm E coli, Salmonella, Bacillus cereus, Shigella Kết thu đƣợc thể bảng 3.9, phần kết hình 3.8 Bảng 3.9: Khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn tuyển chọn Hoạt tính kháng khuẩn chủng STT VSV kiểm định Bacillus D-d (mm) LB2 LB4 LB5 E.Coli - - - Shigella + + + B cereus + + - Samonella - - - Ghi chú: +: có khả n n k n v s n vật kiểm định -: khơng có khả n n k n vi sinh vật kiểm định Hình 3.8 Hoạt tính kháng Bacillus cereus LB4 Kết từ bảng 3.9 hình 3.9 cho thấy: chủng khơng kháng E.coli Samonella LB5 có khả kháng Shigella không kháng Bacillus cereus LB2 LB4 có khả kháng Bacillus cereus Shigella 30 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ mẫu đất thu thập ruộng rau màu Quảng Ninh phân lập đƣợc chủng vi khuẩn ký hiệu LB1, LB2, LB3, LB4 LB5 có khả thuộc chi Bacillus với đặc điểm: trực khuẩn gram dƣơng, có khả sinh nội bào tử bào tử có khả chịu nhiệt độ 800C 20 phút, dƣơng tính catalase Đã xác định đƣợc khả sinh loại enzyme ngoại bào (amylase, protease cellulase) chủng vi khuẩn phân lập Từ tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính loại enzyme ngoại bào cao nhất: cellulase LB4 có hoạt tính mạnh (vịng phân giải 3,72cm), protease LB5 có hoạt tính mạnh (vịng phân giải 3,48cm), amylase LB5 có hoạt tính mạnh (vịng phân giải 3,92cm) Đã xác định đƣợc khả đồng hóa nguồn carbon chủng LB2, LB4 LB5 Với nguồn carbon: Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose, Mannitol Xylose: LB5 khơng có khả đồng hóa Xylose, LB2 LB4 khơng có khả đồng hóa Lactose Xylose Đã xác định đƣợc khả sinh trƣởng phát triển điều kiện kỵ khí chủng LB2, LB4 LB5 Trong đó: LB2 LB4 khơng có khả sinh trƣởng điều kiện kỵ khí thuộc loại vi khuẩn hiếu khí LB5 có khả sinh trƣởng điều kiện kỵ khí loại vi khuẩn kỵ khí tùy tiện chi Bacillus (Bacillus licheniformis) Đã xác định đƣợc khả chịu NaCl chủng LB2, LB4 LB5: chủng có khả sinh trƣởng đƣợc mơi trƣờng có nồng độ NaCl cao 5% Đã xác định đƣợc khả chịu nhiệt chủng LB2, LB4 LB5: chủng có khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng nuôi cấy nhiệt độ 600C 31 Đã xác định đƣợc khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng LB2, LB4 LB5 Trong đó: chủng khơng kháng E.coli Samonella LB5 có khả kháng Shigella không kháng Bacillus cereus LB2 LB4 có khả kháng Bacillus cereus Shigella 4.2 Kiến nghị Để tăng tính xác ứng dụng đề tài em xin đề nghị số nội dung sau: Lặp lại thí nghiệm để tăng tính xác Thực thí nghiệm để định danh xác chủng Bacillus 32 TÀI LIỆU TH M KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Đức Duy Anh (2005), Phân lập khảo sát số đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis LVTN, Khoa Công Nghệ Sinh Học Trườn Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phƣơng pháp nghiên cứu VSV học, NXB hoa học v kĩ T uật, Hà N i Trần Liên Hà, Đặng Ngọc Sâm (2006), Phân lập tuyển chọn Bacillus để xử lí nƣớc hồ bị nhiễm, H i nghị Khoa học lần thứ 20 - Kỷ niệm n m thành lập trường Đại học Bách khoa Hà N i: 55 Nguyễn Thị Hoàng Hải (2009), Nghiên cứu thu nhận enzyme α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trườn Đại học Sư p ạm TP Hồ Chí Minh Lý Kim Hữu (2005), Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic LVTN, K oa C n uô T ú Y Trườn Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Đức Lƣơng (2004), Công nghệ enzyme, XB Đại học quốc gia Hà N i Nguyễn Quỳnh Nam (2006), Phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis phân heo thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy heo LVTN Khoa Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Đỗ Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả sinh tổng hợp protease số chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trườn đại học Sư p ạm TP Hồ Chí Minh Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic Tìm hiểu mơi trƣờng ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm LVTN K oa C n uô T ú Y Trườn Đại Học Nông Lâm Tp.HCM 10 Lƣơng Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà N i: 112-152 11 Nguyễn Văn Phúc Phan Thị Phƣơng Trang (2014), Phân lập định danh xác định đặc tính có lợi chủng Bacillus spp từ ao nuôi tôm tỉnh Bến Tre Tạp chí khoa học Đ SP TP CM 64: 94-102 12 Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn (2009), Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nƣớc thải, Tạp chí Khoa học Đại học quốc gia Hà N i, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 25: 101 13 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thi Xô (2004), Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố lên khả sinh protease Bacillus subtilis Tạp c í ơn ng ệp v P t tr ển nơn t ơn 12: 1667-1668 14 Đỗ Thị Bích Thuỷ, Nguyễn Trần Phƣơng Thảo, Đinh Thị Thu Thanh (2008), Ảnh hƣởng số yếu tố lên khả tổng hợp α-amylase ngoại bào từ Bacillus subtilis, Kỷ yếu H i nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hố sinh sinh học phân tử phục vụ nơng, sinh, y học công nghệ thực phẩm, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà N i 15 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vƣờn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Trườn Đại học Sư p ạm TP Hồ Chí Minh 16 Vũ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới 17 Võ Thị Thứ, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng, La Thị Nga, Lê Thị Thu Hiền, Phạm Thị Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn Trƣờng Sơn, Đào Thị Thanh Xuân (2005), Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nƣớc ni thuỷ sản Tuyển tập h i thảo tồn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thuỷ sản:815 18 Nguyễn Ngọc Thanh Xuân (2006), Phân lập vi khuẩn Bacillus sbtilis từ đất khảo sát khả sử dụng chủng phân lập đƣợc xử lý nhiễm aflatoxin nguyên liệu bắp LVTN K oa C n uô T ú Y Đại Học Nông Lâm Tp.HCM 19 Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trƣờng nƣớc ni thủy sản, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trườn Đại học Sư p ạm Hà N i 20 Lê Hải Yến Nguyễn Đức Hiền (2016), Khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tỉnh đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học đại học Cần Thơ Nông nghiệp 2: 26-32 II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 21 Chambert, R., Treboul, G & Dedonder (1974) “Kinetic studies of levansucrase of Bacillus subtilis” Eur J Biochem 41: 285–300 22 Chambert, R & Petit-Glatron, M.F (1991) “Polymerase and hydrolase activities of Bacillus subtilis levansucrase can be separately modulated by sitedirected mutagenesis” Biochem J 279: 35–41 23 Francesco Santini, Valentino Borghetti, Guido Amalfitano and Alessandro Mazzucco (1995), “Bacillus licheniformis Prosthetic Aortic Valve Endocarditis”, Journal of Clinical Microbiology 33 (11): 3070–3073, 24 Petit-Glatron, M.F., Grajcar, L., Munz, A & Chambert (1993) “The contribution of the cell wall to a transmembrane calcium gradient could play a key role in Bacillus subtilis protein secretion” Mol Microbiol 9: 1097–1106 25 Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, Rainey, F.A., Schleifer, K.-H & Whitman, W.B ( 2009) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (3), Springer-Verlag, New York, NY 26 Janczura, E., H R Perkins, and H J Rogers (1960) “Teichuronic acid: a mucopolysaccharide present in wall preparations from vegetative cells of Bacillus subtilis” Biochem J 80:82-93 27 Rogers, H J., M McConnell, and I D J Burdett (1970) “The isolation and characterization of mutants of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis with disturbed morphology and cell division” J Gen Microbiol 61:155-171 III TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 28 https://static1.squarespace.com/static/54c7f25fe4b0447c7f8aed4b/t/550 4c972e4b06ae7c7462e69/IDFlowcharts.pdf 29 http://anabio.com.vn/vi/cac-ung-dung-thuc-te-cua-bacillus-subtilis-motloai-vi-khuan-quan-trong-trong-khoa-hoc-y-te-va-doi-song-con-nguoi/ 30 http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan-bacillussutilis/ 31 https://sites.google.com/site/menvisinhthuysangiasucgiacam/mendondo ng/men-bacillus-licheniformis 32 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC228642/pdf/333070.pdf 33 https://pdfs.semanticscholar.org/77fa/52754c7ae8c148a2ef4375a5a305f 9e289e1.pdf 34 https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=3563 ... đất xác định đƣợc đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu, phân lập số chủng vi khuẩn Bacillus từ đất - Xác định số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập. .. acid chủng vi khuẩn + Xác định khả chịu muối khả chịu nhiệt chủng vi khuẩn + Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 2.3 Nguyên liệu 2.3.1 Nguồn vi sinh vật Vi khuẩn Bacillus phân lập. .. liệu chủng vi khuẩn Bacillus Tuy nhiên, chi Bacillus có nhiều lồi vi khuẩn (500 lồi đƣợc tìm thấy) mà lồi lại có đặc điểm sinh học ứng dụng khác Vì nên em làm đề tài ? ?Phân lập xác định đặc điểm sinh