Bài viết trình bày phân lập được chủng C. glabrata RN4 trong một sản phẩm gạo nếp cẩm lên men. Chủng RN4 có hình thái tế bào trên cả môi trường thạch và dưới kính hiển vi điều rất giống với loài nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.00046 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN Candida glabrata RN4 TỪ GẠO NẾP CẨM LÊN MEN Trần Văn Tuấn1,*, Vũ Xuân Tạo2 Tóm tắt: Nấm men Candida glabrata thường liên hệ với khả gây bệnh hội người Tuy nhiên, số chủng lồi lại có khả sinh ethanol chịu điều kiện sinh trưởng khắc nghiệt trình lên men Với khả lên men sinh ethanol chịu nồng độ ethanol cao mà C glabrata vơ tình sử dụng bị nhiễm vào sản phẩm lên men trình sản xuất Trong nghiên cứu này, phân lập chủng C glabrata RN4 sản phẩm gạo nếp cẩm lên men Chủng RN4 có hình thái tế bào mơi trường thạch kính hiển vi giống với loài nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae Chủng RN4 có đặc tính kết lắng bám dính bề mặt giống với số chủng nấm men S cerevisae nghiên cứu Đặc biệt, chủng có khả lên men hình thành khí CO2 chịu nồng độ ethanol môi trường nuôi cấy lên đến 7% Việc phân lập chủng nấm men C glabrata sản phẩm lên men cho thấy cần phải có kiểm sốt chặt chẽ chất lượng gạo nếp cẩm lên men theo hình thức thủ cơng để tránh nhiễm nấm men gây bệnh hội ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dùng Từ khóa: Candida glabrata, Saccharomyces cerevisiae, gạo nếp cẩm lên men MỞ ĐẦU Sau Candida albicans, Candida glabrata nguyên nhân thường gặp liên quan đến bệnh da, miệng đường sinh dục người Nấm men C glabrata gây nhiễm trùng hệ thống, viêm da viêm đường sinh dục người bị suy giảm miễn dịch (Pfaller & Diekema, 2004) Tương tự với nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae, C glabrata có khả bám dính để dễ dàng tiếp cận xâm nhập vào thể vật chủ Khả bám dính yếu tố cần thiết tương tác tế bào tạo khối đa bào (Brückner & Mưsch, 2011) Nhờ có khả sinh lượng lớn ethanol trình lên men mà C glabrata nghiên cứu để dùng sản xuất ethanol sinh học (Watanabe et al., 2010) Tuy nhiên lồi nấm men có nguy ảnh hưởng đến sức khỏe người, nên C glabrata nghiên cứu sử dụng cho mục đích cơng nghiệp Nấm men S cerevisiae thường sử dụng sản xuất thực phẩm lên men đồ uống có cồn (Walker & Stewart, 2016) Ở sở sản xuất nhỏ lẻ, việc kiểm soát chất lượng men giống dùng sản xuất hạn chế Men giống (dạng bột 1Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ *Email: tuantran@vnu.edu.vn 2Trung BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 370 dạng bánh men) thường bổ sung vào nguyên liệu lần sản xuất Nếu chủng giống không kiểm soát mặt phân loại mà dựa vào hiệu lên men khó để đánh giá mức độ an toàn Ngoài trình lên men theo sản xuất thủ cơng xuất tạp nhiễm nấm men gây bệnh hội C glabrata Trong nghiên cứu này, phân lập chủng C glabrata RN4 sản phẩm gạo nếp cẩm lên men bán chợ Hà Nội Chủng RN4 có hình thái số đặc tính tương đồng với nấm men rượu S cerevisiae khả lên men, đặc tính kết lắng tế bào bám dính bề mặt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Mẫu gạo nếp cẩm lên men theo phương pháp thủ công mua chợ Hà Nội dùng cho phân lập nấm men tổng số Chủng S cerevisiae BY4741 khơng có khả kết lắng khơng bám dính mua từ EUROSCARF (www.euroscarf.de) Chủng BY4741[FLO8] chủng chuyển gen FLO8 để kích hoạt khả kết lắng bám dính nấm men rượu Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phân lập quan sát hình thái Mẫu gạo nếp cẩm lên men tiến hành pha loãng nồng độ khác nhau, sau cấy trải mơi trường YPD (1% cao nấm men, 1% pepton, 2% dextrose, 2% agar, pH 6,5) Đĩa mơi trường sau ủ nhiệt độ 30 ºC 24 Các khuẩn lạc nấm men xuất tinh sạch, khiết Hình dạng tế bào quan sát kính hiển vi quang học Đánh giá khả bám dính Chủng RN4 chủng đối chứng BY4741 BY4741[FLO8] cấy vạch đĩa môi trường YPD Sau 24 nuôi 37 oC, tiến hành bổ sung 5-7 ml nước cất lên bề mặt đĩa lắc nhẹ khuẩn lạc nấm chủng đối chứng âm BY4741 trôi hết đổ bỏ phần dịch lỏng Khả bám dính bề mặt chủng RN4 so sánh với chủng đối chứng dương BY4741[FLO8] Đánh giá khả kết lắng Cấy vài khuẩn lạc nấm men vào ống fancol 10 ml có chứa ml mơi trường YPD dạng dịch Ống nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, 37 ºC Hai chủng BY4741[FLO8] BY4741 sử dụng làm đối chứng Sau 18 giờ, ống dịch nuôi dựng đứng cố định 1-2 phút Các chủng có khả kết lắng nhanh chóng tạo lớp sinh khối lắng đáy ống fancol Đánh giá khả lên men sinh CO2 chịu ethanol PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 371 Chủng RN4 chủng đối chứng nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae BY4741 nuôi cấy ống nghiệm có chứa ống Durham 10 ml dịch mơi trường Hansen (5% glucose; 1% pepton; 0,3% KH2PO4; 0,2% MgSO4.7H2O; 1,5% agar; pH 6) Các ống nghiệm bọc kín nuôi nhiệt độ 30 ºC Các mẫu quan sát khả sinh khí sau 15-20 ni cấy Khả chịu cồn xác định cách nhỏ 10 µL dịch tế bào nấm men RN4 chủng đối chứng BY4743 lên bề mặt môi trường YPD bổ sung ethanol để đạt nồng độ ethanol tương ứng 5%, 7% 9% Các đĩa ủ tủ ổn nhiệt 30 oC 24 để nấm men phát triển Định danh chủng RN4 giải trình tự vùng ITS rDNA DNA hệ gen chủng RN4 tách chiết theo quy trình nhóm nghiên cứu cơng bố (Tran et al., 2017) Vùng ITS rDNA khuếch đại từ DNA hệ gen PCR sử dụng cặp mồi đa đặc hiệu cho phổ rộng lồi nấm gồm: mồi xi ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) mồi ngược ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATAT GC) (White et al., 1990) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,7% tinh kit tinh hãng Promega (Mỹ) Mẫu DNA tinh giải trình tự Cơng ty 1st BASE (Singapore) trình tự ITS phân tích so sánh với sở liệu GenBank Cây phát sinh chủng loại xây dựng phần mềm MEGA6 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập đặc điểm hình thái chủng RN4 Từ mẫu gạo nếp cẩm lên men, phân lập khiết chủng nấm men RN4 Sau 24 nuôi cấy môi trường YPD, khuẩn lạc chủng RN4 có màu trắng, bóng đặc trưng nấm men Quan sát kính hiển vi, tế bào chủng RN4 có dạng hình oval, sinh trưởng nảy chồi So sánh đặc điểm hình thái chủng RN4 với chủng nấm men chuẩn S cerevisiae BY4741 nhận thấy chúng có khuẩn lạc trịn, màu trắng đục, bề mặt lồi bóng, hình thái tế bào kính hiển vi chúng giống (Hình 1) Nếu dựa vào hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào, khó phân biệt hai chủng Hình Hình thái khuẩn lạc chủng nấm men RN4 S cerevisiae BY4741 môi trường YPD hình thái tế bào kính hiển vi 3.2 Định danh chủng RN4 giải trình tự vùng ITS rDNA So với gen 18S rRNA 28S rRNA rDNA, vùng ITS nối gen 18S rRNA 28S rRNA (gồm ITS1; 5,8S rRNA; ITS2) nấm có mức độ biến đổi cao 372 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM lồi gần gũi Do vùng trình tự sử dụng phổ biến nghiên cứu phân loại nấm (Curran et al., 1994, White et al., 1998) DNA hệ gen chủng nấm RN4 tách chiết dùng để khuếch đại vùng ITS PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 Điện di sản phẩm PCR gel agarose cho băng DNA với kích thước khoảng 760 bp (Hình 2a) Kết so sánh trình tự ITS thu với liệu GenBank cho thấy chủng RN4 thuộc loài Candida glabrata với độ tương đồng trình tự ITS 99,9% (Hình 2b) Hình Định danh chủng RN4 dựa trình tự vùng ITS rDNA (a) Sản phẩm PCR vùng ITS gel agarose 0,7%, (b) Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự ITS rDNA 3.3 Khả bám dính kết lắng của chủng RN4 Khả bám dính tạo thành cụm tế bào bám dính bề mặt điều kiện tiên cho phương thức sinh trưởng, khả hấp thụ dinh dưỡng thích ứng với yếu tố khắc nghiệt môi trường nồng độ ethanol cao, dinh dưỡng cạn kiệt (Brückner & Mösch, 2011) Đối với chủng nấm men gây bệnh, khả bám dính bề mặt giúp chúng bám xâm nhập vào tế bào chủ để lây nhiễm Chủng RN4 chủng đối chứng BY4741 BY4741[FLO8] kiểm tra khả kết lắng bám dính Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng RN4 có khả kết lắng giống với chủng đối chứng BY4741[FLO8] Dựa lượng sinh khối kết lắng cho thấy chủng RN4 có khả sinh trưởng kết lắng mạnh (Hình 3a) Sau rửa trôi nước, tế bào chủng RN4 không bị rửa trôi so với đối chứng âm chủng BY4741 tương đồng với chủng đối chứng dương BY4741[FLO8] Thậm chí chủng RN4 cịn thể đặc tính bám dính bề mặt mạnh chủng đối chứng dương BY4741[FLO8] (Hình 3b) Ở nấm men rượu S cerevisiae, khả bám dính kết lắng định nhóm gen thuộc họ FLO mã hóa protein gồm Flo1, Flo5, Flo9, Flo10 Flo11 Sự biểu protein Flo kiểm sốt protein điều hịa Flo8 mã hóa gen FLO8 Trên thực tế, nhiều chủng nấm men rượu tự nhiên khơng có khả bám dính kết lắng gen FLO8 bị đột biến dẫn đến bất hoạt (Fichtner et al., 2007) Khả bám dính hai loài nấm men quan trọng chi Candida C albicans C glabrata kiểm sốt gen điều hịa FLO8 (Cao et al., 2006; Mundy & PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 373 Cormack, 2009) Ở loài C glabrata, protein Flo8 điều hòa biểu gen thuộc họ EPA mã hóa protein gắn bề mặt Khả bám dính giúp nấm men dễ dàng xâm nhập lẫy nhiễm tế bào vật chủ (Mundy & Cormack, 2009) Hình Khả kết lắng bám dính chủng RN4 so với nấm men rượu S cerevisiae (a) Khả kết lắng (b) Khả bám dính 3.4 Khả sinh khí CO2 chịu ethanol chủng RN4 Khả lên men chủng RN4 xác định gián tiếp qua hình thành khí CO2 tích tụ ống Durham Sau 15-20 nuôi cấy, ống nghiệm với chủng RN4 chủng đối chứng nấm men S cerevisiae BY4741 sinh khí CO2 Khả sinh CO2 chủng RN4 chí cịn mạnh so với chủng BY4741 (Hình 4a) Thử nghiệm ni mơi trường YPD có bổ sung nồng độ ethanol khác cho thấy chủng RN4 có khả chịu nồng độ cồn cao, lên đến 7% (Hình 4b) Nấm men S cerevisiae có khả lên men rượu an tồn sức khỏe người Do đó, chúng sử dụng nhiều sản xuất rượu vang, bia số sản phẩm lên men khác (Legras et al., 2007) Việc chịu nồng độ cồn cao khiến C grabrata dễ dàng thích ứng sinh trưởng tốt điều kiện lên men rượu Gạo nếp cẩm lên men ăn bán rộng rãi chợ truyền thống nước ta Tuy nhiên, việc phân lập chủng C glabrata RN4 có khả lên men sinh CO2 chịu hàm lượng cao ethanol từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men cho thấy nguy gây hại sức khỏe người tiêu dùng vơ tình sử dụng chủng RN4 lên men chủng bị nhiễm vào sản phẩm trình sản xuất Trên giới, số chủng thuộc loài C glabrata nghiên cứu ứng dụng lên men sản xuất ethanol từ nguyên liệu phế thải nông nghiệp (Watanabe et al., 2010) Tuy nhiên, việc nghiên cứu sử dụng loài C glabrata kể phục vụ cho sản xuất ethanol công nghiệp cần cân nhắc kiểm soát chặt chẽ 374 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình Khả sinh khí CO2 chịu ethanol chủng RN4 so với chủng nấm men rượu S cerevisiae BY4741 (a) Khả sinh khí CO2, (b) Khả chịu ethanol KẾT LUẬN Đã phân lập chủng nấm men RN4 từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men có đặc điểm hình thái giống với lồi nấm men rượu S cerevisiae Chủng RN4 phân loại thuộc loài C glabrata dựa trình tự vùng ITS rDNA Chủng RN4 có khả lên men sinh khí CO2, chịu nồng độ ethanol cao, có đặc tính bám dính kết lắng Tuy nhiên, C glabrata loài nấm men gây bệnh hội người, nên chủng RN4 không phép sử dụng sản xuất thực phẩm Lời cảm ơn: Để hoàn thành nghiên cứu này, tác giả xin cảm ơn CN Đào Thị Bích Ngọc hỗ trợ kỹ thuật cho số thí nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Brückner S., Mösch H.-U., 2011 Choosing the right lifestyle: adhesion and development in Saccharomyces cerevisiae FEMS Microbiology Reviews, 36(1): 25-58 Cao F., Lane S., Raniga P P., Lu Y., Zhou Z., Ramon K., Chen J., Liu H., 2016 The Flo8 transcription factor is essential for hyphal development and virulence in Candida albicans Molecular Biology of the Cells, 17(1): 295-307 Curran J., Driver F., Ballard J W O., Milner R J., 1994 Phylogeny of Metarhizium: analysis of ribosomal DNA sequence data Mycological Research, 98(5): 547-552 Fichtner L., Schulze F., Braus G H., 2007 Differential Flo8p‐dependent regulation of FLO1 and FLO11 for cell–cell and cell–substrate adherence of S cerevisiae S288c Molecular Microbiology, 66(5): 1276-1289 Legras J L., Merdinoglu D., Cornuet J M., Karst F., 2007 Bread, beer and wine: Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history Molecular Ecology, 16(10): 2091-2102 Mundy R D., Cormack B., 2009 Expression of Candida glabrata adhesins after exposure to chemical preservatives The Journal of Infectious Diseases 199(12):1891-1898 PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 375 Pfaller M., Diekema D., 2004 Twelve years of fluconazole in clinical practice: global trends in species distribution and fluconazole susceptibility of bloodstream isolates of Candida Clinical Microbiology and Infection, 10(s1): 11-23 Tran V T., Do T B X., Nguyen T K., Vu X T., Dao B N., Nguyen H H., 2017 A simple, efficient and universal method for the extraction of genomic DNA from bacteria, yeasts, molds and microalgae suitable for PCR-based applications Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 59(4): 66-74 Walker G M., Stewart G G., 2016 Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages Beverages 2, 30; doi:10.3390/beverages2040030 Watanabe I., Nakamura T., Shima J., 2010 Strategy for simultaneous saccharification and fermentation using a respiratory-deficient mutant of Candida glabrata for bioethanol production Journal of Bioscience and Bioengineering, 110(2): 176-179 White T J., Bruns T D., Lee S B., Taylor J W., 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 18(1): 315 BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF Candida glabrata RN4 ISOLATED FROM A FERMENTED GLUTINOUS RICE PRODUCT Tran Van Tuan1,*, Vu Xuan Tao2 Abstract: The yeast Candida glabrata is often associated with the ability to cause opportunistic disease in humans However, some strains of this species have a high ethanol production capacity and can endure the harsh growing conditions of fermentation There have been previous studies on the ability to use C glabrata for industrial bioethanol production With the ability to ferment and a tolerance toward high concentration of ethanol, C glabrata may unknowingly contaminate the glutinous rice fermention process In this study, we isolated a budding yeast colony from a fermented glutinous rice product and identified it as C glabrata RN4 The strain RN4 has similar morphological characteristics and cell shape to the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae when grown on an agar plate and under microscopy RN4 possesses the features of flocculation (cell-cell adhesion) and agar surface adhesion, which are similar to some well-known strains of S cerevisae RN4 has the ability to ferment via production of CO2 This strain can grow at especially high concentrations of ethanol (up to 7%) The successful isolation of a strain of C glabrata from a traditional fermented product indicates that it is necessary to have strict control on the quality of hand-made fermented glutinous rice products in order to avoid contamination of harmful yeasts that can cause opportunistic diseases Keywords: Candida glabrata, Saccharomyces cerevisiae, fermented glutinous rice 1University of Science, Vietnam National University, Hanoi of Experimental Biology, National Center for Technological Progress *Email: tuantran@vnu.edu.vn 2Center ... phân lập chủng nấm men RN4 từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men có đặc điểm hình thái giống với loài nấm men rượu S cerevisiae Chủng RN4 phân loại thuộc lồi C glabrata dựa trình tự vùng ITS rDNA Chủng. .. ITS phân tích so sánh với sở liệu GenBank Cây phát sinh chủng loại xây dựng phần mềm MEGA6 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập đặc điểm hình thái chủng RN4 Từ mẫu gạo nếp cẩm lên men, phân lập. .. trình lên men theo sản xuất thủ cơng xuất tạp nhiễm nấm men gây bệnh hội C glabrata Trong nghiên cứu này, phân lập chủng C glabrata RN4 sản phẩm gạo nếp cẩm lên men bán chợ Hà Nội Chủng RN4 có