Khếch đại gen vi khuẩn ureaplama urealyticum trong mẫu mô đúc nén sử dụng kỹ thuật pcr

-ãc ô4 ugc V Hl B GIO DC V DO TẠO BỌ Y TÉ TRƯỜNG DẠI HỌC V HÀ NỘI NGUYẺN THỊ TRANG KHUẾCH DẠI GEN VI KHƯẢN UREAPLASMA UREALYTICUM TRONG MÂU MÔ ĐỨC NÉN sử DỤNG KỶ THUẬT PCR Ngành tạo : Kỹ thuật xét nghiệm y học Mà ngành : 7720601 KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP CƯ NHÀN Y KHOA KHÓA 2019 2023 Người hưởng dẫn khoa học: TS NGUYấN HONG VIT H Ni 2023 -ãc ô4 ugc V Hl LỜI CÁM ox Lời em xin bây to lòng biết ơn sâu sẳc tới TS Nguyền Hoàng Việt người thầy đà diu dắt hướng dần em thực dề tài nghiên cứu Trong suốt thời gian thực khóa luận tót nghiệp Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protcin Trường Đại học Y Hà Nội cm dà học hoi dưực thêm nhiều điều tử thầy Cam ơn thảy dà tận tình chi bao truyền dạt cho em kiến thức, kinh nghiệm vô quý giá tạo điều kiện tốt cho cm đế hồn thành khóa luận tốt nghiệp cua minh Em xin gưi lời biết ơn đến GS.TS Tạ Thành Văn, Giám dốc Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein Trưởng Đại học Y Hã Nội: PGS.TS.BS Trần Vân Khánh Phó Giám dốc Trung tâm Nghiên củu Gen-Protein Trương Bộ mòn Bệnh học phân tư Trường Dại học Y Hà Nội đà tạo diều kiện cho em có cư hội dược thực khóa luận trung tâm Em xin cam ơn TS Phạm Lẽ Anh Tuấn, em cám ơn thầy dã động viên tạo diều kiện cho cm cỏ hội học hoi thêm nhiều kỳ thuật thời gian Em xin cám ơn anh chị Trung tâm Nghiên cửu Gen - Protein dà ln giúp đỡ chi bao đê em có thê hỗn thiện khỏa luận cua minh Cuối cũng, em xin gưi lời cam ơn tới gia đinh đà quan tâm dộng viên em cam ơn tất cá bạn tham gia thực khóa luận Lab dà ln bên cạnh lắng nghe chia se với em nhùng lúc thực dề tài khó khăn nhắt Hà Nội tháng 05 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Tliị Trang -ãc ^H ô4 ugc V Hl CNG HềA X HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự (lo - Hạnh phúc LỊI CAM ĐOAN Kinh gíri: Phịng Qn lý hào tạo Đại học - Trường hại học Y Hà Nội Hội đồng chẩm khóa luận tốt nghiệp Em xin cam đoan đày còng trinh nghiên cini cua em với giúp đừ cua TS Nguyền Hoàng Mệt Bụ môn Bênh học phân tử, Trường Đại hục Y Hà Nội Tắt cá sỗ liệu nghiên cim khóa luận lã trung thục, khách quan chưa còng bố cõng trinh khác Hà Nội tháng 05 nẫm 2023 Người viết khóa lun Nguyn Th Trang -ãc ô4 ugc V Hl MC LỤC DẬT VÁN DÈ CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN 1.1 ưreaplasma urealytỉcum Tính chất sinh vật hỏa học 1.1.1 1.1.2 Bộ gen 1.1.3 Khả lây nhiễm 1.1.4 Dịch tễ học cua u.ureaỉyticum 1.2 Kỳ thuật mô đúc nến thông thường 1.2.1 Các quy trinh kỹ thuật cỗ định, chuyên đúc cát đán manh bệnh phâm 10 1.2.2 ơng dụng mô đúc sinh học phân tư 13 1.3 Ưng (lụng kỹ thuật sinh 11 ọc phân tứ để phát vi khuẩn u.urealytỉcum 13 7.3.7 Realtime-PCR 13 ỉ.3.2 PCR (Polymerase chain Reaction) 16 CHƯƠNG 2: DỚ1 TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.1 Dổi tượng nghiên cứu 19 2.2 Thời gian vã địa diêm nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.J Thiểt kề nghiền cữu 19 2.3.2 Cờ mẫu 19 2.3.3 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cừu 19 2.3.4 Quy trinh nghiên cứu 21 2.4 Xử lý sổ liệu .31 2.5 Dạo đức nghiên cứu 31 CHƯƠNG 3: KÉT QUÁ NGHIÊN cứu 32 -c «4 ugc V Hl 3.1 Kết qua tách chiết DNA từ vi kliuấn nuôi cấy 32 3.2 Kct qua đo mật độ quang cua DN/\ tách chiết từ mỏ nến 33 3.3 Kết qua tối ưu hóa nhiệt độ gan mồi phản ứng PCR 37 3.4 Ket qua tối ưu hóa nồng độ DNA phàn ứng PCR 39 3.5 Kct qua khuếch đại gen vi khuẩn Ureplama urealyticum mầu mô đúc nến 40 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 44 4.1 Kết quã tách chiết DNA từ mẫu mỏ dúc 44 4.2 Lựa chọn cặp khuếch đại vũng gen 16S rRNA 46 4.3 Kct qua khuếch đại gen vi khuân Ưreaplasma urealyticum 49 4.4 Tinh hĩnh nghiên cứu vi khuấiì Ureaplasma urealyticum the giới 51 4.5 Tiiứi hình nghiên cứu vi khuân Ureaplasma urealyticum Việt Nam 52 4.6 ưu nhược diêm cua mẫu mò dúc nến 54 4.7 Cầu trúc đặc tinh cua vi khuẩn ư.urealyticum với tế bào mô ngườỉ55 4.8 ưu nhược diem cua kỳ thuật PCR 55 4.9 Các yếu tổ anh hướng tói hình ánh điện di san phàm PCR 56 4.10 Các kỳ thuật có thê sư dụng dê phát vi khuân u.urealyticum .57 KÉT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO -ãc ^H ô4 ugc V Hl DAM MC CHVTT TT u.urealyticum Ureaplasma urealyticum PCR Polymerase Chain Reaction Bp Basepair Kb Kilobase FFPE Formalin fixed paraffin embedded MBA Multiple Banded Antigen NCB1 National Center for Biotechnology Information Tin melting temperature Ta annealing temperature PC positive control NC negative control -ãc ô4 ugc V Hl DANH MỤC BÁNG Bang Trinh tự cặp mồi 16S lira chọn Bàng 2 Thành phần tối mi hóa nhiệt dộ gắn mối phàn úng PCR Bang Thành phần tối ưu hóa nồng dộ DNA phan ứng PCR Bâng Kct qua đo OD cua DNA dirợc tách từ mị nến «4 ugc V Hl DANH MỤC HỈNH ÁNH Hĩnh 1 Các khuẩn lạc cua u.urealyticum (mùi tên trăng) thạch A7 sau 18h u kỵ 37°c Các mành vờ cua te bào bạch cầu hạt dịch não (mùi ten đen) Hiến thị hình anh kinh hiền vi tương phan độ phóng dại soo (thanh tỷ lè 25pm) Hĩnh Cư che phát huỳnh quang cua SYBR Green Hĩnh Nguyên lý hoạt động cùa đầu dó Taqman probe Hĩnh Nguyên lý phan ứng chuồi PCR Hĩnh Máy đo OD Nanodrop 2(X)0c Hĩnh 2 Chu kỳ nhiệt cùa phàn úng PCR tối tru nhiệt độ gắn mồi Hình Chu kỳ nhiệt cùa phân úng PCR tối ưu nồng độ DNA Hình 3.1 Kêt quang mầu DNA chứng dương máy Nanodrop 2000c Hĩnh Kct khuếch dại mầu DNA chửng dương Hình 3 Minh họa kềt qua đo quang máy Nanodrop 2000c cua mầu HniuOrO25 sau tách chiết Hĩnh Kết tối ưu hóa nhiệt dộ gắn Hĩnh 3.5 Ket qua tối ưu hóa nồng độ DNA Hình Hình anh khuếch đại màu Hĩnh Hình anh minh họa cẩu trúc ribosome vã vùng gen 16S rRNA -ãc ô4 ugc V Hl TểM TT KHểA LUN Kliucch đại gen vi khuẩn ưreaplasma ITealytỉcuin mẫu mò dúc nến sứ dụng kỳ thuật PCR ưreapỉasma Urealyticum (U.urealyticum) lã loại vi khuân thưởng tim thấy dạng hội sinh (commensals) dường tiết niệu sinh dục người Nhưng không giống hầu hết vi khuẩn Ư.urealyticum khơng cỏ thành tế bào khiển trở nên độc nhắt sinh lý học diều trị y tế Mục tiêu cùa nghiên cứu nảy sứ dụng kỳ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR), gọi phan ứng chuồi polymerase dè khuếch đại gen cua vi khuân ư.urealyticum với DNA dược tách từ mầu mô đúc nén Nghiên cứu mô tá khao sát cắt ngang gốm 73 niảu bộnli phàm dã dưục đúc paraffin Trong phan ứng biện pháp kiểm soát dương tinh âm tính xù lý song song với mầu đưục thư nghiệm đê phát ket qua ám tinh gia Nghiên cứu chưa xay tượng khuếch đại vi khuân Ư.realyticum cua DNA tách từ nhũng mầu mị dúc nến (FFPE) dtrụrc lựa chọn, với kích thước mục tiêu 898 bp Tỉr khóa: Ưreaplasma urealyticum m dỳc nn PCR -ãc ^H ô4 ugc V Hl 51 4.4 Tinh hình nghiên cứu vi khuẩn ưreaplasma urcalyticum giới Vi khuẩn Ureaplasma urcalyticum biết đến tác nhân gây viêm niệu dạo không lậu cầu viêm khớp mấc phái vã viêm tuyến tiền liệt nam giới Nó dược chia thành u.parvum bao gồm kiêu huyết 1.3.6.14 dược chi định biển thê sinh học I Biến thê sinh học u.urealyticum với 10 kiểu huyết lại 60% DNA tương đồng biến the sinh học nên sư dụng phương pháp nuôi cấy dé phát lồi Ưreaplasma bệnh phàm mơ sè tồn nhiều còng sức dòi hoi trinh độ cao Vi hầu hết nghiên cứu vi khuẩn sứ dụng nhừng phương pháp PCR hiệu quà nhanh chóng vã dè thực hiện' Gần dày, nghiên cứu cua Gholanueza Irajian cộng Sự (2016) dà thục đặc biệt mẫu mò tuyến tiền liệt người trường hợp viêm tuyến tiền liệt dựa kỳ thuật PCR-RFLP để phát vi khuân Ư.urealyticuni Mặc dù đê chân đoán viêm tuyển tiền liệt vi khuân có thê sư dụng mầu gạc niệu đạo vả dịch tuyến tiền liệt, nhiên đè trành gày nhiem hộ vi khuẩn binh thường khu vực sũilì dục tiết niệu lãm khó khàn việc dien giai kết nén nhà nghiên cứu lựa chọn sư dụng mẫu mô đà nhùng bang paraffin Kct qua 200 mầu mỏ dưục tách chiết DNA kiêm tra phương pháp PCR cỏ trường hợp dương tinh với u.urealyticum thu dược đoạn có kích thước 559 bp Tại nghiên cứu khác cua II Zeighami vã cộng (2009) đà phát thấy lồi Ư.urealyticum tinh dịch cua nam giới vơ sinh với ty lệ cao (9%) so với nhóm dối chứng khoe mạnh (1%) xong nhận thấy rang ty lộ tinh trùng binh thường, the tích tinh dịch tý lệ tinh trúng có kliã nâng di động PCR dương tinh với nhóm lồi u.urcalyticum thắp so với PCR dương tinh nhóm u.parvum I6 Nhiều nglũèn cứu khỏc cng nhn -ãc ^H ô4 ugc V Hl 52 thấy tương quan diện cua ư.urealyticum bất thưởng cùa tinh trừng Nghiên cứu cua ZH Zhang vá cộng (2011) cờ mẫu lớn lum với 967 nam giới vỏ sinh 201 tinh nguyện viên khỏe mạnh có khả nàng sinh sàn Ket qua nghiên cứu cho thấy nhùng bệnh nhàn dương tính với u.urealyticum đản dẽn giam đáng ke tý lộ tinh trùng có hình thái bình thường, đồng thời gây tăng bạch cầu tinh dịch hình thái bất thường cũa tinh trùng41 Mặc dù biết đến phần cua hệ vi sinh vật binh thường, xâm lấn cùa Ureaplasnia lại có hên quan đen biến chứng mang thai, bệnh tật ữ tre sơ sinh vã tư vong chu sinh Trong nghiên cứu cua Ho Seon Eun cộng (2013) trẽn dịch hút quân vã dãy cùa 344 tre sinh non có tuổi thai 34 tuần, kết qua cho thấy có 31/344 trê dương tinh với u.urealyticum Nhỏm dương linh điều trị thơ oxy thơ máy nhiều ngày nhóm âm linh, viêm màng ối mơ học vã chúng loạn san phế quàn phôi từ trung binh đến nặng thưởng gụp nhóm dương tinh với Ureaplasma p Mối quan hệ giừa u.urcalyticum nước ối phụ nừ mang thai khoe mạnh lam cá nguyệt thứ hai kết qua mang thai sau dược nghiên cứu Trong nghiên cứu cua Stefan Gerber vã cộng (2003), nưởc ối từ chục hút ô bụng thu dược từ 254 phụ nừ triệu chửng tuồi thai 15-17 tuần kiêm tra bang phân ứng PCR u.urcalyticum phát liiộn 29/254 (11.4%) Sinh non dược ghi nhận 7/29 (24.1%) phụ nừa dương tinh Ư.urealyticum so với chi phụ nử âm tinh với u.urealyticum u 4.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Urea plasma urealyticum Việt Nam Việt Nam nước dang phát triển với nguồn lire y tế hạn chế nhu cầu sống cùa tâng lên rầt nhiều, nên củng đà có nhiều cặp vợ chồng quan tâm tởi sức khoe sinh san Trong dó vần dề vị sinh -•c ^H «4 ugc V Hl 53 anh hương đến 15% cua cập vợ chổng mà nam giới lã nguyên nhàn chinh cua 40% trường họp vô sinh Mặc dù nguyên nhân vỏ sinh nam thường không rô số yếu tố gày vỏ sinh liên quan tới nhiễm trùng CƯ quan sinh dục Và u.urealyticum có thê mẩm bệnh có khả dóng vai trị nguyên ca nhiễm trùng sinh dục vô sinh nam Theo dó nghiên cứu cùa Lê Tàm Minh cộng Sự (2022) dã phát thầy tinh dịch cua nam giói vị sinh có 16.05% dương tinh với Ư.urealylicum diện cua Ư.ureaỉyỉictun lại không gảy anh hướng dền dậc tinh cua tinh trùng Vì mục dù mối tương quan giừa u.urealyticum vã kha nâng sinh sán cua nam giới dà nghiên cứu rộng rãi kết luận cho nghiên cứu gãy tranh cài khia cạnh da yếu tố khác tình trạng kinh tể hoạt động tinh dục tiền sư bệnh, cần có nghiên cứu sâu với cừ mầu lim him nên dược thực dê xác nhận mối liên quan giừa diện cua u.urcalyticum dối với cãc thòng số cùa tinh trùng 2S Một nghiên cửu khác cua Lè Tâm Mini) cộng (2020) thực bệnh phẩm có tư cung lấy từ nhũng phụ nừ bị vô sinh thứ pliát Trung tâm Nội tiết sinh san vỏ sinh Bệnh viện Đại học Y Dược Hue Kct qua cho thầy ty lộ nhiẻm Ư.urealyticum tởi 37.9% vã nhận thấy có tương quan nhiêm trùng Ư.urealyticum với tốn thương ống dần trứng theo siêu âm dồ Như biết, u.urealyticum chu yếu cư trủ đường niệu sinh dục cua người vã hệ vi khuân âm đạo nỏ không gáy bệnh điều kiện binh thường, trữ kha nãng miền dịch bị suy giâm niêm mạc âm dạo bị tồn thường Tuy nhiên, tác dộng cua cãc bệnh nhiêm trùng đến võ sinh nữ vần chưa rò ràng Một số tác gia báo cáo ràng Ư.urealyticum cõ the gày tác dộng bệnh lý tiêm ấn dối với sinh san nữ nghiên cứu khác lại khụng cho thy cú mi -ãc ^H ô4 ugc V Hl 51 liên quan Liệu ư.urealyticum cỏ phai nguyên dẫn tỡi vô sinh hay liệu mồi quan hệ chi ngẫu nhiên hay không vàn lã càu hòi chưa dược trá lởi42 Vi cần có nghiên cứu sâu tâm vào vi khuân với tác động cùa đến bệnh nhiêm trùng người 4.6 Ưu nhược diem cúa mẫu mô dúc nen Hiện mầu mỏ đúc dược coi lã nguồn vật liệu sinh học lớn có vai trị quan trọng chân đốn nghiên cứu phân tứ Thòng thưởng, cãc kỳ thuật xét nghiệm đột biến gen dựa phan ứng PCR vã giái trinh tự DNA bang cách sư dụng mầu FFPE Ưu diêm cua màu FFPE bao gồm dề đãng VC mặt kỳ thuật, giúp bão quán hiệu cãc chi tiết, cấu trúc hỉnh thái tể bào cho phép có thê lưu trừ dề dàng nhiệt độ phòng thin gian dài với chi phi thấp4} Tuy nhiên, mô FFPE dược coi lã nguyên liệu ban dầu lại có vấn đề dối với hầu hết kỳ thuật di truyền phân tư chất lượng DNA chiết xuất thưởng thắp Các điều kiện cách xư lý khẩc nghiệt trinh cố định vả nhúng paraffin thường khiến cho DNA dễ phân mánh trinh tách chiết, có the bị biến tinh vã xuất liiện nhũng liên kết ngang DNAprotein DNA-DNA Trong trinh cố định, biến dối hóa học cua bazơ xáy khứ purin vá khứ amin cua cãc cytosine, dần đen trao dối dơn nucleotide Nhiều yếu tố trinh cố định góp phần vảo chất lượng cùa DNA chiết xuất từ mò FFPE chẳng hạn thòi gian từ lẩy mõ đền bẳt dầu cổ dịnli thởi gian nhiệt dộ cỗ định Hơn nừa, chắt lượng cua mầu DNA chiết xuất mò FFPE bị anh hương bơi phương pháp chiết xuất đà chọn ’ Theo nghiên cứu cua Zhi-Oang Yao cộng (2021) so sánh dử liệu xẽt nghiệm da gcn cãc mầu mô tươi vã mầu mô FFPE bnh nhón -ãc ^H ô4 ugc V Hl 55 ung thư phổi không phãi te bào nho Trong trinh phân tích cho thấy khơng cỏ khác biệt đáng ke nồng độ cua DNA chiết xuất từ mô tươi mô FFPE nhiên độ tinh khiết cùa DNA mỏ tưưi lại cao lum đáng kê so với mô FFPE vã quy trinh xét nghiệm sư dụng mẫu sinh thiết tươi giúp rút ngắn đáng kê thời gian đợi cùa bệnh nhân Nhưng sè đáng quan ngại nêu sư dụng mầu DNA tách từ mỏ FFPE để thực hiộn khuếch đại giai trinh tự gcn có kích thưóc mục tiêu lớn 500 bp bơi theo nghiên cứu cua Gregory Verhoest cộng (2012) dã cho thấy chắt lượng DNA bị suy giam nghiêm trọng dược khuếch dại it lum dáng kê so với mẫu đông lạnh Chi nưa sổ đột biến quan sát dược phũ hợp với phân tích cố định cxon dột biến dược tim thầy 10.5% 28.9% đột biến dà biết mầu dông lạnh không dược phát khối paraffin u 4.7 Cấu trúc đặc tinh cua vi khn v.ureah ticum vói tế bào mơ người Việc thiết lập mối quan hộ vật chu - vi sinh vật thường lien quan đen sụ kết họp mật thiết, qua trung gian bám dính cúa vi sinh vật với bề mật tề bão vật chu Một số mycoplasma bâm vào tể bão biêu mỏ cua niêm mạc dưởng niệu sinh dục đường hỏ hấp Cho đến che bám dinh cùa u.urealyticum dược chúng minh cõ thê bám vảo biéu mỏ niệu dạo (Shepard & Masover 1979) tinh tiling (Busalo cộng 1984) nguyên bão sợi (Masover cộng 1977) tế bão hồng cầu (Robertson & Sherburne, 1991: Saada cộng 1991)45 4.8 v’u nhược diem cùa kỹ thuật PCR Trong nglũẻn cứu cùa chùng tỏi kỳ thuật PCR dược lựa chọn dè khuếch dại gen vi khuẩn với nhiều lý Đầu tiên, đày lã kỹ thuật nhanh chóng, chi tốn khoảng có the khuch i mt trinh t mong -ãc ^H ô4 ugc V Hl 56 muốn dà bict so với kỳ thuật công nghệ di truyền "cồ dien" cõ the phái inất tuần Tiep theo PCR kỳ thuật dơn gián có thê dược thực ống nho với thành phần tối thiều vã chi việc trộn chúng lại với Các phương pháp tạo dịng gen diên hĩnh khác cần có vật liệu dắt tiền mãng vả nuclcotid triphosphate dược đánh dấu Xọ kỳ thuật dậc biệt PCR có thề dược thực trẽn mầu chứa DNA tương dối thị ví dụ vết máu chưa xứ lý cho việc phàn tích pháp y Điều ngược lại với phương pháp thao tác gen cần phai cỏ ca DNA khuôn mẫu lần vector tương dối tinh khiết Các yểu tố cho thấy PCR lã thay dôi dáng kê so với phương pháp cỏ dien cho việc khuếch dại cãc trinh tự dặc biệt Quan trọng hết dó độ nhạy cùa phán ứng PCR có thè chi cần dùng phân tư DNA khn thu sán phẩm Tuy nhiên, cần phai nhấn mạnh ràng cãc ứng dụng rộng rãi cua kỳ thuật PCR địi hoi phai biết rỏ trinh tự DNA khn mầu Đây diêm giới hạn cũa kỳ thuật này, nghĩa vần phai dựa vào tiền tăng cua kỳ thuật cõng nghệ di truyền không hãn thay thề kỳ thuật Trong vãi trường hợp phương pháp PCR không áp dụng dược với đoạn DNA kích thước k’m 3kb (thường kb lã tốt nhắt) Ngoài kha nâng ngoại nhiễm dối với phương pháp lớnJỉ 4.9 Các yếu tố ánh hướng tói hình ánh điện di sân phẩm PCR Diện di gel agarose lã phương pháp tương dối dễ sư dụng, áp dụng phó biên để đánh giã mức dộ thành cóng cua phan úng PCR Các chất xen kè thuốc nhuộm dược sư dụng de giúp chùng ta có thề hĩnh dung cãc đoạn DNA khuếch dại Tuy lìhiẻn cằn lưu ý rang di chuyên cua DNA cấu trúc có the bị anh hường nhiều yếu tố trinh điện di bao gồm số yếu tố sau: nàng phân tách cãc đoạn DNA điện di -ãc ^H ô4 ugc V Hl 57 trờn gel agarose phù hợp đê phân tách đoạn DNA cô kich thưởc từ kb trờ xuống, nồng độ gel cao thi di chuycn cua phân tir chậm vả ngược lại Nhiệt độ diện di sè gày ánh hường tới phàn tách đoạn DNA trinh điện di thường tiến hãnh nhiệt độ phịng có diều hỏa (khoang 25-28° C) Do vậy, chạy với nhiệt độ cao cõ the khiến cho gel bị nóng chày, dặc biệt xãy chạy diện với hiệu điện the cao gian dài Nồng dộ mồi cũa phàn ứng PCR dôi ánh hường đen phân tách quã trinh điện di tượng liên kết bò sung cua mồi vói phân đoạn DNA Dung dịch dộm có vai trị tạo pH cung cap ion cho trinh diện di Lira chọn dung dịch đệm phũ hợp vói kích thước đoạn DNA muốn phàn tảch nghiên cứu chủng tỏi tiến hành điện di với đệm TBE (Tris/Borate/EDTA) sir dụng cho việc phân tách đoạn DNA có kích thước từ 0.1-3 kb 4.10 Các kỹ thuật có thê dược sử dụng dê phát vi khuẩn t'.urealyticum Bẽn cạnh việc sư đụng kỳ thuật sinh học phàn tư u.urealyticum có thê phát báng phương pháp nuôi cấy Trên mơi trưởng thạch huyết ngụa thích họp cãc khuẩn lạc cua u.urealyticum thường nho (20 đen 30 pm) Canh trường dê nuôi cẩy u.urealyticum thưởng vá không cõ bàng chúng độ đục sinh trướng cũa vi khuẩn Sự phát triển xây nhanh chóng mói trường ni cấy thích hợp đạt sau 16 đến 20 u 36° c Nuôi cấy u.urealyticum mơi trưởng có độ pH (được bỗ sung đen 10% chiết xuất nấm men 10 den 2Q°/o huyết ngụa binh thưởng khơng đun nóng) thường cho hiệu giã từ 10' đến 10 dơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU: colony-forming-units) mililit số lượng vi khuẩn u.urealyticum giảm dằn môi trường nuôi cấy canh thang huyết ngựa sau 16 đến 20 u vã khơng cịn kha nàng sống sau 48 đến 72 ủ ^H «4 ugc V Hl 58 36° c Trong môi trường pll đưực bố sung 0.05 đến 0.1% lire chi thị đo phenol, phép chuẩn độ u.urcalyticum biếu thị đơn vị đỗi màu (CCƯ: colot-changing-units) mililit môi trường nuôi cầy sè nàng sống sót nhanh phản ứng dạt đến pH s.o u.urealyticum lã vi khuẩn vi hiếu vi việc bồ sung 5-15% CO2 cần thiết để giúp vi khuân có thê phát triên tốt mơi trường thạch Ngồi ure vá cholesterol cho lã cần thiểt cho phát triên nhân lẽn tốt cùa Ư.urealyticum, chúng cung cầp băng cách lãm giàu huyết ngựa từ 10% đến 20% Tuy nhiên, phương pháp ycu cầu kỳ thuật chặt chè phức tạp thời gian nuôi cấy nhiều thời gian so với k thut S1è1 hc phõn t -ãc ô4 ugc V Hl 59 KÉT LUẬN Cân cử vào kết qua vá nhùng phàn tích trcn chúng tói dưa kết luận sau: Điều kỉện tối tru hóa phán ímg PCR sir (lụng cáp mồi dặc hiệu bắt cập vào trình tự gen 16S-1RNA cua vi khuẩn ưreaplasnta urealytìcunt xới kích thước mục tiêu 898 bp nghiên cứu nhiệt độ gắn mồi 51,7’C nồng dộ DNA khuôn 0,1 ng/pl Áp (lụng diều kiện dã tối iru hóa khơng phát dược vi khuẩn I Teaplasma urealyticum mầu mơ đúc nen «4 ugc V Hl TÀI LIỆU THAM KHÁO Kokkayil p Dhawan B ưreaplasma: current perspectives Indian J Med Microbiol 2015:33(2):205-214.doi: 10.4103/0255-0857.154850 Runge M Rykena s Wildhagen K Deicher H Kirchhoff H Detection of Ureaplasma urealyticum in urine of patients with systemic lupus erythematosus and healthy individuals by culture and polymerase chain reaction J Med Microbiol 1997;46(5):413-418 doi: 10.1099/0022261546-5-413 Shepard MC Lunceford CD Ford DK Ct al Ureaplasma urealyticum gen nov sp nov.: Proposed Nomenclature for the Human T (T-Strain) Mycoplasmas Im J Syst Evol Microbiol 1974:24(2): 160-171 doi: 10.1099/00207713-24-2-160 Aguilera-Arreola MG Gonzalez-Cardcl AM, Tenorio AM, CurielQuesada E, Castro-Escarpulli G Highly specific and efficient primers for in-house multiplex PCR detection of Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum BMC Res Notes 2014:7(1 ):433 doi: 10.1186/1756-0500-7-433 Naessens A Foulon w Cammu H Goossens A Lauwers s Epidemiology and pathogenesis of ureaplasma urealyticum in spontaneous abortion and early preterm labor Acta Obstet Gynecol Scand 1987:66(6):513-516 doi: 10.3109/00016348709015726 Pinna GS Skevaki CL Kafetzis DA The significance of Ureaplasma urealyticum as a pathogenic agent in the paediatric population Clirr Opin Infect Dis 2OO6:19(3):283-289 doi: 10.1097/01.qco.0000224824.73223.e7 Gcipdorfcr w Sandncr G John s, Gessner A, Schocmcr c Schrõppcl K Ureaplasma urealyticum Meningitis in an Adult Patient J Clin Microbiol 2008:46(3):! 141-1143 doi: 10.1128/JCM.01628-07 Smorgick N Frenkel E Zaidenstcin R I.azarovitch T Sherman DJ Antibiotic Treatment of Intra-Amniotic Infection with Ureaplasma nrealyticiim Fetal Diagn Ther 2007:22(2):90-93 doi: 10.1159/000097103 Irajian G Sharifi M Mirkalantari S Mimejad R Jalali Nadoushan M reza Ghorbanpour N Molecular Detection of Ureaplasma urealyticum from Prostate Tissues using PCR-RFLP Tehran Iran Iran J Pathol 2016:11(2):138-143 -c ^H «4 ugc V Hl 10 Shah ss Ureaplasma urealyticum In: Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases Elsevier: 2018:1030-1032.62 doi: 10.1016/B978-0-323-401 s -4.00198-5 11 Glass JI Lefkowitz EJ Glass JS Heiner CR Chen EY Cassell GH The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum Nature 2000:407(6805):757-762 doi:10J038/35037619 12 Povlsen K Jensen JS Lind I Detection of LTeaplasma urealyticum by PCR and Biovar Determination by Liquid Hybridization J Clin Microbiol 1998:36(11):3211-3216 13 Cheng SY Ling TS Fu QH [Ureaplasma urealyticum infection in spontaneous abortion] Zhonghua Fil Chan Ke Za Zhi 1994:29(4):230231.254 14 Gerber s Vial Y Hohlfeld p Witkin ss Detection of L'reaplasma urealyticum in second-trimester amniotic fluid by polymerase chain reaction correlates with subsequent pretenn labor and delivery J Infect Dis 2003:187(3):518-521 doi:l 0.1086/368205 15 Eun HS Lee SM, Park MS Park KI Namgung R Lee c Serological investigation of Ureaplasina urealyticum in Korean preterm infants Korean J Pediatr 2013:56(11):477-481 doi:10.3345/kjp.2013.56.11.477 16 Zeighami H Peerayeh SN Yazdi RS Sorouri R Prevalence of Ureaplasma urealyticum and Urcaplasma parvum in semen of infertile and healthy men IntJSTDAIDS 2OO9:2O(6):3 87-390 doi:10.1258/ijsa.2008.008334 17 Zhu X Li M Cao H Yang X Zhang c Epidemiology of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in the semen of male outpatients with reproductive disorders Exp Ther Med 2016:12(2):! 165-1170 doi:10.3892/etm.2016.3409 18 Farkas B Ostorhazi E Pónyai K et al [Frequency and antibiotic resistance of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in genital samples of sexually active individuals] Oiv Herd 2011:152(42): 16981702 doi: 10.1556/OH.2011.29217 19 Lee MY Kim MH Lee WI Kang SY Jeon YL Prevalence and Antibiotic Susceptibility of Mycoplasma hominis and Ureaplasma -c ^H «4 ugc V Hl urealyticum in Pregnant Women Yonsei Med J 2016:57(5):1271-1275 doi: 10.3349/ymj.2016.57.5.1271 20 Paulsen LK Dahl ML Skaare D Guide N Forekomst av M genitalium og Ư urealyticum i Ul in lestct for c trachomatis Tidsskr Den Nor Legeforening Published online January 26 2016 doi: 10.40-15/tidsskr 14.1574 21 Wang QY Li RH Zheng LQ Shang XH Prevalence and antimicrobial susceptibility of Ureaplasma urealyticmn and Mycoplasma hominis in female outpatients 2009 -2013 J Microbiol Immunol Infect 2016:49(3):359-362 doi: 10.1016/j.jmii.2014.06.007 22 Zhang D Li T Chen L Zhang X Zhao G Liu z Epidemiological investigation of the relationship between common lower genital tract infections and high-risk human papillomavinis infections among women in Beijing China PLOS ONE 2O17;12(5):eO178O33 doi: 10.13 71 /journal pone.017SO33 23 Zhang w Li L Zhang X Fang H Chen H Rong c Infection Prevalence and Antibiotic Resistance Levels in Ureaplasma Iirealyticum and Mycoplasma hominis in Gynecological Outpatients of a Tertiary Hospital in China from 2015 to 201 s Can J Infect Dis Med Microbiol 2021:2021 :e8842267 doi: 10.1155/2021/8842267 24 Moridi K Hemmaty M Azimian A Fallah MH Khaneghahi Abyaneh H Ghazvini K Epidemiology of genital infections caused by Mycoplasma hominis M genitalium and L'reaplasma urealyticum in Iran; a systematic review and meta-analysis study (2000 2019) BMC Public Health 2020:20:1020 doi: 10.1186/sl 2889-020-08962-5 25 Nguyền Minh Hằng Nghiên Cứu Dặc Diềm Làm Sàng Hiện Quà Diều Trị Nhiễm Mycoplasma Dường Sinh Dục Bằng Azithromycin Luận vản Bác sĩ chuyên khoa cấp II: 2011 26 Lâm Th i Hậu Xác Định Tỳ Lệ Nhiễm Mức Dộ Nlụiy Cám VỞ! Kháng Sinh Cua M.Hominis U.Urealyticum Trên Bệnh Nhân Cô HỘI Chúng Tiết Dịch Niệu Dạo Am Dạo Luận văn Thạc sĩ Y hục: 2013 27 Bùi Quang Hào Dực Diêm Làm Sàng, Các Yếu TồLièn Quan Hiệu Quá Diều Trị Nhiễm Mycoplasma Dường Sinh Dục Bằng Doxycyclin Luận vân Bâc chuyên khoa câp II; 2015 -c ^H «4 ugc V Hl 28 Lẽ Minh Tâm Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma genital ium detection and sperm quality: A cross-sectional study in Vietnam, hit J Reprod Biomed Published online 2022 https://www.ncbLnlni.nih.gov/pmc/articles/PMC9099368/ 29 Ma Tien Hồng Ngơ Xn Thái Mai Bá Tiến Đũng Đinh Nguyền Tấn Hòa Khao sát ti lệ tãc nhân gảy viêm niệu đạo câp nam gicri.https://sti.vista.gov.vn/tw/Lists/TaiLieuKHCN/Attaclunents/334480/ CVv395V26SlCD12022145.pdf Published 2022 30 Dietrich D U111 B Sailer V et al Improved PCR Performance Using Template DNA from Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissues by Overcoming PCR Inhibition PLoSONE 2013:8(10):e77771 doi:10.1371/joumal.pone.0077771 31 Dietrich D Uhl B Sailer V et al Improved PCR Performance Using Template DNA from Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissues by Overcoming PCR Inhibition PLoS ONE 2013:8(10) doi:10.1371/joumal.pone.0077771 32 Harshitha R Arunraj DR Real-time quantitative PCR: A tool for absolute and relative quantification Biochem Mol Biol Educ 2021:49(5):800-8I2 doi:10.1002/bmb.21552 33 Nguyen Vãn Thanh Sinh I lục Phân Tir Published 2009 Accessed April 10 2023 http://nliasachsinlilioc.blogspot.com/201 7/03/2009-nguyen-vanthanli-sinh-hoc-phan-tu.html 34 Canene-Adams K Chapter Twenty Four - General PCR hi: Lorsch J ed Methods in Enzymology Vol 529 Laboratoiy Methods in Enzymology: DNA Academic Press: 2013:291-298 doi: 10.1016/B978-0-12-4186873.00024-0 35 Kct qua Primer-Blast Accessed May 21 2023 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/prhnerblast/primertool.cgi?ctg_time= 1684684909&job_key=zw7aVHzXFt7ZVlgVAB9Ui4bbGADCHd9Ag&CheckStatus=Ki°/o26%2378 75%3Bm+tra-f- 36 Zada A Susanto PS Putri RL el al Optimization of DNA isolation method from Formalin-Fixed-Paraffin-Embedded tissues (FFPE) and comparative performance of four different Polymerase Chain Reaction -c ^H «4 ugc V Hl (PCR) kits Cell Mol Biol 2018:64(13):38-41 doi: 10.1471S/cmb/2018.64.13.8 37 Atanesyan L Steenkamer MJ Horstman A Moelans CB Schouten JP Savoia SP Optimal Fixation Conditions and DNA Extraction Methods for MLPA Analysis on FFPE Tissue-Derived DNA Am J Clin Pathol 2017:147( ):60-68 doi: 10.1O93/ajcp/aqw2O5 38 Yi Q qing, Yang R S1Ú J feng et al Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity J Int Med Res 2020:48(6):0300060520931259 doi: 10.1177/0300060520931259 39 Clarridge JE Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases Clin Microbiol Rev 2004;17(4):840-862 doi: 10.1128/CMR 17.4.840-862.2004 40 Fukuda K OGAWA M TANIGUCHI H Saito M Molecular Approaches to Studying Microbial Conununities: Targeting the 16S Ribosomal RNA Gene J UOEH 2016:38:223-232 doi:10.7888/juoeh.38.223 41 Zhang ZH Zhang HG Dong Y Han RR Dai RL Liu RZ Ureaplasma urealyticum in male infertility in Jilin Province North-east China, and Its relationship with sperm morphology J hit Med Res 201 l;39(l):33-40 doi: 10.1177/147323001103900104 42 Lẽ Minh Tàm Prevalence and risk factors of Ureplasina urealylicum and Mycoplasma genitalium among women with secondary infertility in Vietnam A cross-sectional study.ResearchGate Published 2020 43 Yao ZG Wei ZG Cheng XK et al Comparison of Multi-Gene Testing Data Between Fresh and Formalin-Fixed Specimens From Core Needle Biopsy in Patients With NSCLC Pathol Oncol Res 2021:0 doi: 10.3389/pore.2021.1609931 44 Verhoest G Patard JJ Fergelot p et al Paraffin-embedded tissue is less accurate than frozen section analysis for determining VHL mutational status in sporadic renal cell carcinoma Urol Oncol Semin Ol ig Investig 2012:30(4):469-475 doi: 10.1016/j.urolonc.2010.07.005 -c ^H «4 ugc V Hl 45.Smith DGE Russell wc Thirkell D Adherence of Ureaplasma urealyticumto human epithelial cells Microbiology 1994; 140(10):28932898 doi: 10.1099/00221287-140-10-2893 -c «4 ugc V Hl