Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên cyfra21 1 nhằm phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ QUANG HUẤN GS.TSKH NGUYỄN TÀI LƯƠNG THÁI NGUYÊN - 2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành tới PGS.TS Lê Quang Huấn – Trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; GS.TSKH Nguyễn Tài Lương, người thầy tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với tơi suốt thời gian thực hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Bộ môn Di truyền Sinh học đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn giúp đỡ Phòng Quản lý Sau đại học Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức tạo điều kiện cho suốt thời gian làm nghiên cứu sinh Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ quý báu tất anh, chị em bạn phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Cuối cùng, tơi muốn tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tất người thân gia đình sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án này! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 NCS Lê Đình Chắc ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết đồng tác giả với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Tác giả Lê Đình Chắc iii MỤC LỤC Mục Tên chương, phần, mục tiểu mục Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục hình ix Danh mục bảng xii Mở đầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Trang Nguồn gốc đặc điểm ung thư 4 1.1.1 Nguồn gốc tế bào ung thư 1.1.2 Đặc điểm tế bào ung thư 1.1.3 Ung thư phổi 1.2 Kháng nguyên CYFRA21-1 12 1.2.1 Cytokeratin 12 1.2.2 Cấu trúc Cytokeratin 15 1.2.3 Biểu Cytokeratin 15 1.2.4 Kháng nguyên CYFRA21-1 17 1.3 1.3.1 Kháng thể Một số kháng thể sử dụng nghiên cứu 21 21 thực tiễn 1.3.2 1.4 Các nghiên cứu kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 Công nghệ phage display 29 30 1.4.1 Giới thiệu công nghệ phage display 30 1.4.2 Ứng dụng kháng thể phage-scFv chẩn đoán 31 điều trị iv Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 33 Vật liệu 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 33 2.1.2 Sinh phẩm hóa chất 33 2.1.3 Trang thiết bị 35 2.1.4 Phần mềm máy tính 36 2.2 Phương pháp 37 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 37 2.2.2 Các phương pháp thao tác với DNA 38 2.2.3 Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 45 2.2.4 Các kỹ thuật phage display 48 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách dòng xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng 55 55 nguyên CYFRA21-1 3.1.1 Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 55 3.1.2 Nhân đoạn gen mã hố kháng ngun CYFRA21-1 57 3.1.3 Tách dịng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 58 3.1.4 Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 62 3.2 Biểu thu kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.1 Nhân vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.2 Tách dịng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên 66 CYFRA21-1 3.2.3 Thiết kế vector biểu pET-21a(+)/Cyfra21-1 67 3.2.4 Biểu protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 72 3.2.5 Tinh kháng nguyên CYFRA21-1 74 3.2.6 Kết phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 75 v 3.3 Gây miễn dịch gà kháng nguyên CYFRA21-1 77 3.4 Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 81 3.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương lách gà 81 gây miễn dịch 3.4.2 Nhân đoạn gen mã hóa vùng biến đổi kháng thể gà 81 đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 3.4.3 Quy trình tạo dịng phage biểu kháng thể scFv 85 (kháng thể phage) 3.4.4 Kết chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng 86 nguyên CYFRA21-1 3.4.5 Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope 89 kháng nguyên CYFRA21-1 3.5 Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu 91 để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 3.6 Kết định lượng CYFRA21-1 mẫu bệnh 97 phẩm bệnh viện Bạch Mai cung cấp KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 101 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ 102 LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AML Acute Myelogenous Leukemia Amp Ampicillin APS Amoniumpersulphate cDNA complement DNA CDR Complement Determining Region CEA Carcinoembryonic Antigen CLL Chronic lymphocytic leukemia ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DEPC Diethyl Procarbonate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidium Bromide FcR Frament cristallisable Recetor FDA Food and Drug Administration HCDM Human Cell Differentiation Molecules HCL Hairy cell leukemia HL Hodgkin Lymphoma HLDA Human Leukocyte Differentiation Antigens HRP horseradish peroxidase vii HT Huyết IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside KN Kháng nguyên Jak Janus tyrosine kinase LAK Lymphokine activated killer LB Luria Betani mAb Monoclonal Antibody MPBS skimmed milk in PBS NHL Non-Hodgkin lymphoma NK Natural Killer NES Neuron specific enolase NRE Negative Regulatory Element NSCLC Non small cell lung carcinoma OD Optical Density PASI Psoriasis Area and Severity Index PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction PD-IPCR Phage display-IPCR PEG Polyetylene Glycol PRR Positive Regulation Region RT-PCR Revert Transcriptase - Polymerase Chain Reaction viii scFv Single chain variable fragment SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SCLC Small cell lung carcinoma TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA TEMED N, N, N’, N’ tetramethylethane-1,2-diamine TMB 3, 3’, 5, 5’ tetramethyl benzidine TPA Tissue polypeptide antigen TPBS Tween 20 in PBS TPS Tissue polypeptide specific antigen VH immunoglobulin heavy chain variable region VL immunoglobulin light chain variable region X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- β - D-galactopyranoside UTP Ung thư phổi 113 73 Patel J L., Erickson J A., Roberts W L and Grenache D G (2010), “Performance characteristics of an automated assay for the quantitation of CYFRA21-1 in human serum”, Clin Biochem, 43(18), pp 1449-1452 74 Pavićević R., Bubanović G., Franjević A., Stancić-Rokotov D and Samarzija M (2008), “CYFRA21-1 in non-small cell lung cancerstandardisation and application during diagnosis”, Collegium Antropologicum, 32(2):485- 498 75 Perkins D N., Pappin D J., Creasy D M and Conttrell J S (1999), “Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data”, Electrophoresis, 20(18), pp 3551-3567 76 Pierre A., Coulombe M and Bishr O (2002), “‘Hard’ and ‘soft’ principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments”, Cell Biology, 14, pp 110–122 77 Pujol J L., Molinier O., Ebert W., Daurès J P, Barlesi F., Buccheri G., Paesmans M., Quoix E., Moro-Sibilot D., Szturmowicz M., Bréchot J M., Muley T and Grenier J (2004), “CYFRA21-1 is a prognostic determinant in non-small-cell lung cancer: results of a meta-analysis in 2063 patients”, Br J Cancer, 90(11), pp 2097-2105 78 Raats J., van Bree N., van Woezik J and Pruijn G (2003), “Generating recombinant anti-idiotypic antibodies for the detection of haptens in solution”, J Immunoassay Immunochem, 24(2), pp 115-146 79 Ran S., Gao B., Duffy S., Watkins L., Rote N and Thorpe P E (1998), “Infarction of solid Hodgkin’s tumors in mice by antibody-directed targeting of tissue factor to tumor vasculature”, Cancer Research 58, pp 4646-4653 114 80 Roland M., Markus D and Lutz L (2008), The human keratins: biology and pathology, Institute of Pathology, Philipps University 81 Romanov V I (2003), “Phage display selection and evaluation of cancer drug targets”, Current Cancer Drug Targets 3, pp 119-129 82 Ruibal A., Nuñez M I., Rodríguez J., Jiménez L., del Rio M C and Zapatero J (2003), “Cytosolic levels of neuron-specific enolase in squamous cell carcinomas of the lung”, Int J Biol Markers, 18(3), pp 188-194 83 Sambrook J., Fritsch E F., and Maniatis T (1989), Molecular cloning I, II, III, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 84 Sanger F., Schreier P H., Smith A J H., Staden R and Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochodrial genome”, Nature 290, pp 457-465 85 Schneider J (2006), “Tumor markers in detection of lung cancer”, Adv Clin Chem, 42, pp 1-41 86 Shi G L., Hu X L., Yue S D and Song C X (2005), “The value of serum tumor marker in the diagnosis of lung cancer”, Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 27(5), pp 299-301 87 Song W A., Liu X., Tian X D., Wang W., Liang C Y., Zhang T., Guo J T., Peng Y H and Zhou N K (2011), “Utility of squamous cell carcinoma antigen, carcinoembryonic antigen, CYFRA21-1 and neuron specific enolase in lung cancer diagnosis”, Chin Med J (Engl), 124(20), pp 3244-3248 88 Sugio K., Sugaya M., Hanagiri T and Yasumoto K (2004), “Tumor marker in primary lung cancer”, J UOEH, 26(4), pp 473-479 89 Suzuki H., Ishikawa S., Satoh H., Ishikawa H., Sakai M., Yamamoto T., Onizuka M and Sakakibara Y (2007), “Preoperative CYFRA21-1 115 levels as a prognostic factor in c-stage I non-small cell lung cancer”, Eur J Cardiothorac Surg, 32(4), pp 648-652 90 Stensballe A., Jensen O N (2001), “Simplified sample preparation method for protein identification by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: in gel digesion on the prope surface”, European Journal of Mass spectrometry 7, pp 111-121 91 Stone M R., O'Neill A., Catino D and Bloch R J (2005), “Specific interaction of the actin-binding domain of dystrophin with intermediate filaments containing keratin 19”, Molecular Biology of the Cell, 16(9), pp 4280-4293 92 Takahashi H., Kurishima K., Ishikawa H., Kagohashi K., Kawaguchi M and Satoh H (2011), “Optimal cutoff points of CYFRA21-1 for survival prediction in non-small cell lung cancer patients based on running statistical analysis”, Anticancer Research, 30(9), pp 3833-3837 93 Takahashi N., Tsunematsu K., Suzuki A and Kaneda T (2005), “Lung carcinomas with interstitial pneumonia; detection of lung cancers by CYFRA and selection of surgical procedure”, Kyobu Geka, 58(1), pp.15-19 94 Tomita M., Shimizu T., Ayabe T., Yonei A and Onitsuka T (2010), “Prognostic significance of tumour marker index based on preoperative CEA and CYFRA21-1 in non-small cell lung cancer”, Anticancer Research, 30(7), pp 3099-3102 95 Tufman A., Huber R M (2010), “Biological markers in lung cancer: A clinician’s perspective”, Cancer Biomark, 6(3-4), pp 123-135 96 Uchikov A., Dimitrov I., Terzieva D., Mateva N., Kuznanova D and Batashki A (2008), “Diagnostic value of the serum tumor markers 116 CEA and CYFRA21-1 in patients with non-small cell lung cancer”, Khirurgiia (Sofiia), (3):18-20 97 Vaporciyan., Amino Acid., Nesbitt J C., Lee J S et al (2000), Cancer Medicine, B C Decker, pp 1227–1292 98 Vivian B., Helena G., Katja W P and Roland E (2004), “Clinical utility of Cytokeratins as tumor markers”, Clinical Biochemistry, 37, pp 529-540 99 Wang J., Shi G., Zhang S., Wang Q., Yang X., Li X., Wang H., Zhang H and Song C (2010), “Clinical value of serum TPS, CEA, Pro-GRP and CYFRA21-1 in patients with lung cancer”, Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 13(5), pp 500-505 100 Wang J., Yi Y., Li B., Wang Z., Sun H., Zhang P and Huang W (2010), “CYFRA21-1 can predict the sensitivity to chemoradiotherapy of non-small-cell lung carcinoma”, Biomarkers,15(7), pp 594-601 101 Wang J., Zhang N., Li B., Wang Z., Sun H., Yi Y and Huang W (2011), “Decline of serum CYFRA21-1 during chemoradiotherapy of NSCLC: a probable predictive factor for tumor response”, Tumour Biol, 32(4), pp 689-695 102 Wang Q., Lu J B., Wu B and Hao L Y (2010), “Expression and clinicopathologic significance of proteolysis-inducing factor in nonsmall-cell lung cancer: an immunohistochemical analysis”, Clin Lung Cancer, 11(5), pp 346-351 103 Willats W G T (2002), “Phage display: practicalities and prospects”, Plant Molecular Biology 50, pp 837-854 104 Winter G., Griffiths A D., Hawkins R E and Hoogenboom H R (1994), “Making antibodies by phage display technology”, Annual Review of Immunology 12, pp 433-455 117 105 Wu F., Nishioka M., Fujita J., Murota M I., Ohtsuki Y., Ishida T and Kuriyama S (2002), “Expression of Cytokeratin 19 in human hepatocellular carcinoma cell lines”, International Journal of Oncology, 20, pp 31-37 106 Wu G P., Ba J., Zhao Y J and Wang E H (2007), “Diagnostic value of CEA, CYFRA21-1, NSE and CA 125 assay in serum and pleural effusion of patients with lung cancer”, Acta Cytol, 51(4), pp 679-680 107 Yang L., Chen X., Li Y., Yang J and Tang L (2012), “Declines in serum CYFRA21-1 and carcinoembryonic antigen as predictors of chemotherapy response and survival in patients with advanced nonsmall cell lung cancer”, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 4(2), pp 243-248 108 Yeh J J., Liu F Y., Hsu W H., Wang J J., Ho S T and Kao A (2002), “Monitoring Cytokeratin fragment 19 (CYFRA21-1) serum levels for early prediction of recurrence of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in the lung after surgical resection”, Lung, 180(5), pp 273-279 109 Zissimopoulos A., Stellos K., Permenopoulou V., Petrakis G., Theodorakopoulos P., Baziotis N and Thalassinos N (2007), “The importance of the tumor marker CYFRA21-1 in patients with lung cancer after surgery or chemotherapy”, Hellenic journal of nuclear medicine , 10(1), pp 62-66 110 Zwick M.B., Shen J and Scott J.K (1998), “Phage-displayed peptide libraries”, Current Opinion in Biotechnology 9, pp 427-436 111 http://www.antibodies-online.com/antibody/573309/anti-Cyfra-21-1/ 112 http://www.raybiotech.com/files/manual/antibody/RB-16-0001 118 Phụ lục Các mẫu máu bệnh nhân UTP Phụ lục Kết điện di RNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm Phụ lục Bảng phổ đo hàm lượng độ tinh mẫu RNA tổng số máy đo NanoDrop-1000 119 Phụ lục Sơ đồ vector tách dòng pCR-TOPO Phụ lục Sơ đồ mơ tả q trình gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng 120 Phụ lục Kết So sánh trình tự nucleotide cDNA đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 thu với trình tự nucleotide cDNA gen mã hóa CYFRA21-1 Ngân hàng liệu Quốc tế mang ký hiệu K1C19_HUMAN 121 Kết tách đoạn dòng gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 Phụ lục Sơ đồ vector tái tổ hợp pCR2.1-TOPO mang đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 122 Phụ lục Kết tách đoạn dịng gen mã hóa vùng epitope kháng ngun CYFRA21-1 123 Phụ lục Kết OD600 dịch nuôi tế bào E coli chứa vector tái tổ hợp Không bổ sung IPTG Bổ sung IPTG (1 mM) Thời gian sau bổ sung (h) 0.80 0.80 1.74 1.28 1.97 1.42 2.48 1.57 4.14 5.09 22 Phụ lục 10 Đường cong sinh trưởng E coli chứa vector tái tổ hợp Đường cong sinh trường Đường cong sinh trưởng Bổ sung IPTG Không bổ sung IPTG OD600 0 10 15 Thời gian [h] 20 25 124 Phụ lục 11 Danh sách bệnh nhân cung cấp mẫu huyết Ký hiệu Tên bệnh nhân Tuổi, khoa Ngày lấy HT M1 Nguyễn Thị N NH4-1962 24/09/2009 M2 Võ Thị H M3 Nguyễn Thanh B K4B-1957 22/09/09 M4 Vũ Tăng H KH4-1953 19/09/09 M5 Kim Xuân N NH4-1978 22/09/09 M6 Phạm Văn T KYHHN-1959 24/09/09 M7 Trần Văn A KYHHN-1944 25/09/09 M8 Hồ Thị T KHn-1925 23/09/09 M9 Lý Thị T KYH-1926 26/09/09 M10 Đào Thị P NH4-1952 01/10/09 P1 Đỗ Thị H Ho-1945 12/09/09 P2 Phạm Thị L Ho-1960 12/09/09 P3 Phạm V KYHHN-1942 15/09/09 P4 Nguyễn Thị T Ho-1938 12/09/09 P5 Mai Xuân K NH0-1958 19/09/09 P6 Nguyễn Văn K NHo-1960 02/10/09 23/09/09 125 P7 Vũ Thị H Ho-1955 12/09/09 P8 Nguyễn Văn V NYH-1954 25/09/09 P9 Vũ Thanh T KYHHN-1958 15/09/09 P10 Nguyễn Hữu Đ Ho-1981 12/09/09 P11 Nguyễn Văn C KYH-1946 16/09/09 P12 Nguyễn Văn H YHHN-1953 15/09/10 P13 Hồng Văn M KYHHN-1956 15/09/10 P14 Tơ Ngân T KYHHN-1965 15/09/10 T1 Vũ Thị Minh H KNT-1989 15/09/10 T2 Đặng Thị P NCC-1971 18/09/10 T3 Đào Thị H NNT-1978 16/09/10 T4 Trần Văn H KYHHN-1951 18/09/10 T5 Đoàn Thị Tuyết A NNT-1981 24/09/10 Phụ lục 12 Kháng sinh môi trường tăng sinh Dung dịch kháng sinh Thành phần Hàm lượng Ampicilin Ampicillin Na-salt 1g (100mg/ml) H2O 10 ml Kanamycin Kanamycin 1g (100mg/ml) H2O 10 ml 126 Môi trường Thành phần Hàm lượng LB lỏng Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Agar 15g/l Bacto tryptone 16 g/l Bacto yeast extract 10 g/l NaCl g/l Bacto-agar 15 g/l NaCl g/l tryptone 10 g/l Yeast extract g/l LB đặc 2xTY TYE Phụ lục 13 Đệm dung dịch Đệm Tên Thành phần Hàm lượng PBS (10X) NaCl 80.0 g/l KCl 2.0 g/l Na2HPO4.7H2O 27.2 g/l KH2PO4 2.4 g/l Tên Thành phần Hàm lượng Dung dịch I Tris-HCl pH 8,0 25 mM EDTA pH 8,0 10 mM Glucose 50 mM Dung dịch 127 Dung dịch II NaOH 0,2 N SDS 1% CH3COOK 60 ml M CH3COOH đậm đặc 115 ml Nước cất 28,5 ml CaCl2 CaCl2 100 mM PEG/NaCl Polyethylene glycol 8000 20% NaCl 2,5 mol/l Skimmed milk 2% PBS 1X Tween 20 0,05% PBS 1X Dung dịch III MPBS TPBS Triethylamine Triethylamine TMB stock TMB 10 mg DMSO ml Dung TMB dịch nhuộm Citrate buffer ml TMB stock 100 µl H2O2 30% µl H2O ml