Nghiên cứu biểu hiện protein insulin glagine tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn escherichia coli

BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH Nin ĐÀO ANH KIỆT NGHIÊN CỨU BIÊU HIỆN PROTEIN INSULIN GLARGINE TAI TO HOP TU TE BAO VI KHUAN ESCHERICHIA COLI Nganh: CONG NGHE SINH HOC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hề Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS.Đồn Chính Chung & TS Bùi Hồng Quân Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 06 tháng 10 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Tiến sĩ Nguyễn Thị Kim Anh - Chủ tịch Hội đồng 2; Tiến sĩ Lao 'ĐfQ: ThUậNguasssneaasnadsannasins - Phản biện I 3: Tiến siPham Tiến Vi hussssssssaaaiinttastaadein - Phản biện Tiến sĩ Nguyễn Minh Nam - Ủy viên Tiến sĩ Trần Thị Huyền -2 - - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc Si) CHU TICH HOI DONG VIEN TRUONG VIEN CONG NGHE SINH HỌC VÀ THỰC PHAM BỘ CÔNG THƯƠNG TRUONG DAI HQC CONG NGHIEP THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH CONG HOA XA HOI CHU NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Đào Anh Kiệt MSHV: 20125621 Ngày, tháng, năm sinh: 03/03/1998 Nơi sinh: TP.HCM Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TEN ĐÈ TÀI: Nghiên cứu biểu protein Insulin Glargine tái tô hợp từ tế bào vi khuân E Cøïi NHIEM VU VA NOI DUNG: -Téng hop Gen mã hóa Insulin Glargine tạo dịng vector tái tổ hợp mang gen mã hóa Insulin Glargine (pENanogen-Insulin Glargine) -Nghiên cứu tối ưu hóa qui trình nuôi cấy té bao £ coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine biéu protein Insulin Glargine quy mơ phịng thí nghiệm -Kiểm tra, đánh giá sơ chất lượng protein Insulin Glargine II NGÀY GIAO NHIEM VU: 30/11/2022 Il NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 6/10/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Đồn Chính Chung & TS Bùi Hồng Quân Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng 10 năm 2023 NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Ho tên chữ ký) (Ho tên chữ ký) Đồn Chính Chung NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Ho tên chữ ký) Bùi Hồng Quân VIEN TRUONG VIEN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THUC PHAM LOI CAM ON Em xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Đồn Chính Chung Thầy TS Bùi Hồng Quân tận tình hướng dẫn hỗ trợ suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Luận văn tiến hành phòng nghiên cứu phát triển, thuộc Xưởng Nguyên liệu Công ty Dược Nanogen Tôi chân thành cảm ơn TGD TS Hồ Nhân với đồng nghiệp phòng nghiên cứu phát triển, thành viên ban quản lý Công ty Dược Nanogen giúp tạo điều kiện thuận lợi cho trinh thực đề tài Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô giảng dạy truyền đạt nguồn cảm hứng cho suốt thời gian học tập Trường Đại học Công Nghiệp TP.HCM Nhờ dẫn cúa quý Thầy Cô, em trang bị thêm kiến thức mở rộng khả tư duy, khám phá suốt trình nghiên cứu thực dé tai Tôi xin gửi lời cảm on tới tất bạn bè đồng nghiệp, người bên tơi, động viên khích lệ q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình nuôi dưỡng suốt quãng thời gian TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Insulin Glargine, mét analog cua insulin, dạng insulin tác dụng kéo dai sứ dụng đề điều trị tăng đường huyết bệnh tiêu đường loại I loại gây Trong nghiên cứu này, trình tự nucleotide gen Insulin Glargine tham khảo từ ngân hàng gen GENBANK(https:/www.nebi.nlm.nih.gov/proten/AWO14628.1) Sau tạo dòng vector tái tổ hợp pENanogen mang gen mã hóa protein Insulin Glargine vao tế bào E coli BL21 (DE3), tién hành lên men chủng £ coli cảm ứng biểu protein Insulin Glargine Ma trận Placket-Burman Phương pháp đáp ứng bề mặt — Phương án cấu trúc có tâm sử dụng để tối ưu hóa điều kiện lên men cảm ứng biểu nhằm thu lượng sinh khối lượng protein cao Số liệu được xứ lý phần mềm Design Expert 13 Điều kiện tối ưu hóa xác định: nông độ IPTG (0.987mM), nhiệt độ cảm ứng (255C) pH môi trường lên men (5.5) Môi trường điều kiện tối ưu hóa sử dụng cho lên men, biểu quy mơ pilot dung tích 20L lặp lại lần Kết thực nghiệm so sánh với dự đốn mơ hình Phân phối student trac nghiém t-test với độ tin cậy P > 0,05 Kết cho thấy khơng có khác biêt mơ hình thực nghiệm đự đốn mơ hình tối ưu Q trình ly giải tinh protein Insulin Glargine thu nhận từ trình lên men gửi mẫu thực dựa theo qui trình chuẩn từ cơng ty CNSH Dược Nanogen Sản phẩm protein Insulin Glargine sau tỉnh có nồng độ tương đương (= 0,31 g/L) so với sản phâm từ nghiên cứu Satish cộng (2021) (0,3 g/L) cao sản phẩm trước từ cơng ty CNSH Dược Nanogen (0,2 g/L) Protein IG thu đáp ứng thành công tiêu chuẩn nguyên liệu đặc tính, độ tạp, định tính đánh giá với phương pháp chạy HPLC hoạt tính làm giảm nơng độ glucose máu Kết từ cứu il thí nghiệm trình bày nghiên ABSTRACT Insulin Glargine, an insulin analog, is a long-acting form of insulin used to treat hyperglycemia caused by type and type diabetes In this study, the nucleotide sequences of the Insulin Glargine Gen were referenced from the GENBANK bank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein‘AWO14628.1) After Gen creating the recombinant vector pENanogen carrying the Gen encoding the IG protein into F coli BL21 (DE3) cells, this £ coli strain was fermented and the IG protein expression was induced Placket-Burman matrix and Response Surface Method — Centered structural scheme were used to optimize the fermentation and expression induction conditions to obtain the highest biomass and protein content Data were processed using Design Expert 13 software Optimization conditions were determined: IPTG concentration (0.987mM), induction temperature (25°C) and fermentation medium pH (5.5) Optimized media and conditions were used for the fermentation, expressed at a pilot scale of 20L and replicated three times The experimental results are compared with the prediction of the model by student t-test distribution with confidence P > 0,05 The results show that there is no difference between the experimental model and the prediction of the optimal model The process of lysing and purifying the insulin Glargine protein obtained from the fermentation process was sent to the sample and performed according Biotechnology The to the protein standard product procedure Insulin from Glargine Nanogen Pharmaceutical after purification has an equivalent concentration (~ 0.31 g/L) compared to the product from the study of Satish et al (2021) (0.3 g/L) and higher than the previous product from Biotechnology Pharmaceutical Company Nanogen (0.2 g/L) The Insulin Glargine protein product after purification has a higher concentration than the product from the study by Satish et al and the previous product from the pharmaceutical biotechnology company Nanogen The obtained IG protein successfully met the raw material criteria for characterization, purity, and quality as assessed with HPLC run method and blood glucose lowering activity The results from these experiments are presented in this study 1H LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu từ thân hỗ trợ cúa công ty CNSH Dược Nanogen Các kết nghiên cứu kết luận đề tài cam kết trung thực, khơng có hình thức chép từ nguồn tài liệu Các nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn quy định, đảm bảo tính xác minh bạch Học viên (Chữ ký) Đào Anh Kiệt 1V LỚN GÁIMUDẨN pannueninsibnntbnigdsddeiiitisoitrggSDIBSUEUIGUGGUIB004G911180101011002G9188 i TOM TAT LUAN VAN THAC §SĨ .-252222 222222 tt mrre ii ABSTRACT 1H LỜI CAM ĐOAN iv 00906.918.435 22t tt Huệ V INSNEEMUE BÌNHUẤ NI nnounenonpnntstinttSSIGSGSIHIGERGASHGSDEDIDIGSINGERGEISt000010-G80 viii DANH MUC BANG BIEU o cccecsssssseeseessssssssenneeeeeesssssnneseesssssnitsessnnnmiitessssssen x 9I28)00/919 (040A5i506.00135®® xi "6010005 CHUONG TONG QUAN TAI LIEU coeeciiccecceccscesscsscsstessesscssessssstesstesesseseeees 1.1 Giới thiệu chung bệnh đái tháo đường . -©222 2222222212222 1.1.1 Tinh hình bệnh đái tháo đường giới Việt Nam 1.1.2 Thude xe na 1.2 Insulin Glargime 1.2.1 Nguồn gốc 2222 222 221222122212221222122121121221121222222 re 1.2.2 Chức sinh học Insulin GÏargine :scccc St srnrreirerrrrrrrerres 13 Tổng quan tạo dòng biểu protein ngoại lai # Col 1.3.1 Tổng quan tạo dòng hệ thống biểu tế bào # col 1.3.2 Biểu protein ngoại lai # COU cccccccccccccss esse ves esse teseeecteseeeeneees 14 — Phuong phap sàng lọc tối ưu hóa .522-222 222222221112111 2111222 xe 11 1.4.1 Ma trận Plackett-Burman .-2c 201122111115 119k kg kg xxx ke 11 14.2 Phương pháp đáp ứng bề mặt - thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD) 12 1.5 _ Tình hỉnh nghiên cứu va HƯỚC ác che 12 CHƯƠNG _ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP c +ccccccccee 14 2.1 Vat HOU 14 2.1.1 Ching vi sink vat nh 14 14 PC 2:1:3: Gien:m€ tIỀU :::zccizirciitirstristiii0140101161110184EHAVHEHLAHEVEEHNSHEYHHSAIAIENEUAVHHRNtHaytidadgta 14 2.1.4 Các thang chuẩn đùng cho điện di -2-22222222212221222122222222E e6 16 2.1.5 Hóa chất sứ dụng nghiên cứu -22222222212221222122212212.e6 16 2.1.6 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu -22222222222122ee 18 2.1.7 Động vật thí nghiỆm - ác t1 SH HH HH TH HH tre 19 2.2 — Nội dung phương pháp nghiên cứỨu ác set sirirrrrrrrrrse 19 2.2.1 Tạo đòng vector biểu protein Insuline Glargine -+2s2 19 2.2.2 Tạo đòng tế bào biểu .-2 222 2222212221221222122121222222 re 21 2.23 Tối ưu hóa điều kiện lên men tế bào # col BL21 (DE3) biểu protein Insulin Glargine quy mơ thí nghiệm St nhe 23 22.4 Lên men # coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine quy m6 pilot voi điều kiện 61 WU 2.2.5 eee ccccceceecsecsecscscesesseseesetsecsessessessnsevsstestetsessnseeseessesetsnentesevseseees 28 Tinh protein Insulin Glargine từ tế bào E coli BL21(DE3)/pENanogen- mm 28 2.2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm 22222S2222212221222122711221222222.22 e6 28 22.7 Xử lý số liệu thống kê 22222 22222122212221122122212221221221222 xe 34 CHƯƠNG3 KÉT QUÁ VÀ BIỆN LUẬN .cct cnn Hnren 35 3.1 Tạo dòng vector biểu protein Insuline Glargine . -5-2 35 3.1.1 Chuẩn bị Gen cắt mở vòng veetor PENanogen . -2222s+zs22zcce 35 3.12 Kết qua tạo dịng tế bào chọn lọc (E coli TĨP 10F) 36 vi 3.2 Tao dong E.coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine biéu protein 0008605501 (44 39 3.2.1 Tao dong E.coli BL21(DE3) chtra vector tai t6 hop pENanogen-IG 39 3.2.2 Cảm ứng biểu hién protein Insulin Glargine dong E coli BL21 /8/75/0.2.-7 0i 6000000808868 ea 3.3 _ Tối ưu hóa điều kiện lên men tế bào E coli BL21 40 (DE3) biêu protein Insulin Glargine quy mơ thí nghiệm St sssrrrrrerrerrrrrreree 41 3.3.1 Sang loc điều kiện lên men EF coli BL21(DE3) biểu protein Insulin Glargine ma trận Plackeft - Burman -22: 22222222112211211122112111 22122 xe 41 3.3.2 Téi wu héa diéu kién 1én men thu sinh khéi E.coli BL21(DE3)/pENanogen- Insulin Glargine va protein Insulin Glargine bang ma tran RSM — CCD 46 3.4 Lén men F coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine quy m6 pilot voi điều kiện 61 WU eee ccccceceecsecsecscscesesseseesetsecsessessessnsevsstestetsessnseeseessesetsnentesevseseees 47 3.5 Đánh giá sơ chất lượng protein Insulin Glargine . 2-s+c-2 48 3.5.1 D&o tinh cess cececcccscecsessessesseessesssesevesecseeesvssessaeesessussecssesaetenssnssatesessnsaneeseanteeess 48 Em: nh 3.5.3 Định tính 5c tt 2E 3.5.4 Hoạt tính cQ TH CHUONG HE TH HH TT k KT ng k KĐT tk ng 49 grrrrrro 5] KT KH k1 k kg kg ykt 57 KET LUAN VA KIEN NGHLI o.u.ccccccccccccsecsecsesseseescseeseveeveveeveteees 60 4.1 Kếtluận n2 HH Hee 60 42 Kiếnnghị .220.2 0222222222222 2eerree 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC - c 5c 2c 222222112111111271771 2112 21 1111Errere 62 cc 21 221 1112111111111 2T1 T1 1E 1g treo 66 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CUA HỌC VIÊN -252cc gererrerrre 73 Vii 2.2.1.2 Cat mở vịng vector pENanogen Tiến hành ni cấy ching E coli TOP10F mang vector pENanogen môi trường LB agar, sau tách chiết thu nhận vector kit DNA-SpinTM Plasmid DNA Extraction Kit (Intron) theo đẫn nhà sản xuất Thanh phan st dung cho phan ứng cắt bao gồm: nước cất, dung dich red, enzyme NdeI va HindIII , plasmid (pENanogen) Phan tmg t & 37°C gid dé mé vong vector Vector pENanogen sau thu nhận từ kit kiểm tra với phương pháp dién di trén gel agarose 1% Thành phẩm sau phản ứng cắt điện di gel agarose 1% nhằm kiểm tra kích thước tiến hành tỉnh chế kit MEGA SpinTM Agarose Gel Extraction Kit (Intron) thu plasmid pENanogen mở vòng 2.2.1.3 Tạo dòng vector tái tổ hợp Gen Insulin Glargine thu nhận từ vector pUC57 sau xử lý với hai enzyme Ndel/HindIIl, ghép nỗi vào vector pENanogen cắt mở vòng cặp enzyme Ndel/HindlI théng qua phan ứng nối Thành phần phản ứng nối gồm buffer ligase, DNA (Gen IG), plasmid pENanogen va enzyme néi la T4 ligase Cac vector tái tổ hợp nối thành công đặt tên pENanogen-Insulin Glargine (5236) DraTIT a (57) StyL a Paelt/1 - PSpXI - Khol (158) Eagl - Notl (166) Hindi 73) {Insulin Glaraine BglII (510) SgrAI (551) (4535) AsiSI - Pvul (4226) BspDI - ClaT (4192) Nrul SphI (707) BstaPI (315) BclI* (1246) pENANOGEN-INSULTN GLARGINE 5478 bp BetETT (1413) NHIeATIT (3433) PspOMI (143) Apal (1443) 3881) Acul BssHIT (1643) EcoRV (1682) HincHH - HpaẨ (1730) PshAL (2077) BglT (2295) FSDI - FspAI (2314) PpuMT (2339) (3076) PfITT - Tth1111 Hình 2.3 So dé plasmid PENanogen [Nanogen] 20 2.2.1.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli chọn lọc (E coli TOP 10F) Hỗn hợp phản ứng nối duoc bién nap vao E coli Top 10F véi khang sinh chọn lọc Kanamycin nhằm kiểm tra chon loc vector tái tổ hợp dịng hóa gen thành cơng Biến nạp pENanogen-Insulin Glargine mang gen mã hóa Insulin Glargine vào E coli Top 10F theo tỉ lệ (1:5), ủ 49C 30 phút, ủ 420C phút, thêm môi trường LB (không chứa kháng sinh) ủ 37°C 45 phút Sau cùng, trải lên đĩa chứa LBkan, ủ 379C 20 chọn lọc đòng đự tuyên (khuẩn lạc) mang vector tái tổ hợp pENanogen-Insulin Glargine 2.2.1.5 Kiểm tra kết tạo dòng tế bào chọn lọc (E coli TOP 10F) Với khuẩn lạc thu nhận từ trinh hóa biến nạp, tiến hành đánh số dùng tăm vô trùng chấm nhẹ lên khuẩn lạc cấy sang ống nghiệm pha sẵn mÍ môi trường L.Bkan, ú lắc 37°C thời gian 12 Thu sinh khếi tế bào tách chiết vector theo chi dan từ nhà sản xuất Kiểm tra vector tách chiết phản ứng PCR với 77 promoter/T7 terminator San pham sau phan tng PCR kiểm tra điện di gel agarose (kích thước sản phẩm có chứa đoạn Gen Insulin Glargine 470 bp) Kiểm tra vector pENanogen mang Gen mã hóa Insulin Glargine phản ứng cắt giới hạn Phản ứng cắt ngoại sử dụng cặp enzyme Nadel HindIII , san phẩm thu được điện di gel agarose 1%, c6 kich thước 233 bp 5245 bp Phân ứng cắt ndi sir dung enzyme cat Smal cat tai vi tri bén bên đoạn Gen, san pham thu được điện di gel agarose 1%, có kích thước 1327 bp 4151 bp Plasmid thu nhận qua sàng lọc gửi giải trình tự Gen cặp T7 (Nam Khoa Biotek) 2.2.2 2.2.2.1 Tao dong tế bào biểu Chuẩn bị tế bào khả nạp Tế bào biểu E coli BL21DE3) vào ống nghiệm chứa ml môi trường LB, điều kiện: 200 víp, 379C giá trị ODsoo đạt vào khoảng 0,8—1,0; tiến hành ly tâm thu sinh khối Tiếp tục, bô sung Iml CaCls 100mM lạnh vô trùng vào effendorf 21 chứa sinh khối Z eoli vừa ly tâm huyền phù nhẹ với pipet, ly tâm thu phan cặn Tiếp tục bỗ sung 1ml CaCl› 100mM lạnh vô trùng, ủ đá 15 phút ly tâm thu phần cặn Sau cùng, bỗ sung Iml CaCl; 100mM + 20% glyeerol vào phần cặn thu nhận bước trên, huyền phù nhẹ với pipet lưu giữ tế bào tủ -800C 2.2.2.2 Thu nhận vector tái tổ hợp từ té bao E coli d& chon loc (E coli TOP 10F) Tiến hành nuôi cấy tăng sinh chúng E col TOP10F chọn lọc mang vector tái tổ hợp PENanogen-Insulin Glargine, sau tách chiết thu nhận vector kit DNA-SpinTM Plasmid DNA Extraction Kit (Intron) theo hướng dẫn nhà sản xuất 222.3 Biến nạp vector tai tổ hợp vào tế bào E coli biểu Biến nạp vector tái tổ hợp pENanogen-Insulin Glargine vào tế bào E coli BL21(DE3) DNA vector có nồng độ nhỏ 50 ng trộn déu vao 200 pl té bao E coli BL21 (ĐE3), giữ bê đá 30 phút Hỗn hợp chuyên nhanh vào bề ôn nhiệt 42°C, dé yên 60 giây; sau nhanh chóng chuyển hỗn hợp trở lại bể đá 12 phút Bễ sung ml môi trường LB vào hễn hợp tiến hành ni cấy lắc 37°C 45 phút Cuối cùng, sử dụng dịch cấy trải lên môi trường LB;z„ vô trùng có bổ sung kháng sinh kanamycin, ủ 370C qua đêm 2.2.2.4 Điện di SDS-PAGH kiểm tra biểu protein Insulin Glargine Thu mẫu cách ly tâm thu sinh khối địch nuôi E.coli BL21(DE3)/pENanogenIG da duoc cam img bang IPTG sau 8h Sau ly tâm loại bó dịch nỗi, bể sung 50 nước cất 50 HÍ đung dịch nạp mẫu 2X vào eppendorf, huyền phù thật kỹ, đun cách thủy I0 phút 100°C, sau làm lạnh nhanh Ly tâm 10 phút, thu dịch nạp lượng mẫu từ I0 — 15 ul vào giếng gel gom gel polyacrylamide 14% (100 x 100 x 0,75 mm), sau chạy điện di với cường độ dòng điện 2mA/giếng mẫu, hiệu điện 80V 15 phut cho gel gom va 100V 80 phút cho gel tach Kết thúc quy trình điện di, tháo gel từ miếng kiếng loại bó lớp gel gom Nhuộm gel với dung địch nhuộm (Coomassie Brilliant Blue) khoảng 30-45 phút, sau tiếp tục giải nhuộm với dung dịch giải (gồm Ethanol, Acid Acetic, nuéc), dùng dung dịch 22 giải nhuộm sau đồng hồ đến lúc bề mặt gel trở nên vạch protein hiến thị rõ So sánh vạch protein mục tiêu với thang protein, tìm kích cỡ protein mục tiêu (8,9 kDalton) 2.2.3 Tối ưu hóa điều kiện men té bao E coli BL21 (DE3) biểu protein Insulin Glargime quy mơ phịng thí nghiệm Tiến hành cấy vào mơi trường LBan trùng khuẩn lạc đơn chủng E coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine, ni cấy lắc hoạt hóa qua đêm Dịch nuôi cấy qua đêm sứ dụng cho q trình ni cấy sinh tổng hợp protein Insulin Glargine Tiến hành khảo sát điều kiện cảm ứng môi trường lên men tối ưu phương pháp sàng lọc với ma trận Placket-Burman tối ưu hóa phương pháp đáp ứng bề mặt — phương án cấu trúc có tâm sử dung phan mềm Design Expert Hàm đáp ứng duge chon 1a ham long sinh khéi E coli BL21(DE3) (Y1: mg/ml dung dich nudi cay) thu hàm lượng protein (Y2: ng/g tế bào vi khuẩn) 2.2.3.1 Sang loc điều kiện lên men E coli BL2I(DE3) Glargine bang ma trén Plackett - Burman biểu protein Insulin Để xác định yếu tố mức ảnh hướng (Bảng 2.3) đến lượng sinh khối E coli BL21(DE3) thu (Y1: mg/ml dụng địch môi trường nuôi cấy) hàm lượng protein (Y2: ng/g tế bào vi khuẩn) thí nghiệm thiết kế theo ma trận Plackett-Burman thực Bang 2.3 Các yếu tố sử dụng ma trận Plackett — Burman sảng lọc môi trường men F coli BL21(DE3) Thành phần Khoảng khảo sát bà Thấp mee (1) XI 0,1 0.5 [29], [30] X2 25 31 37 [29] [31] pH môi trường lên men |_ X› 5,5 8,5 [21], [29] Nông độ IPTG (mM) Nhiét d6 cam ung °C) | Trung bình (0) | 23 Cao TLTK GD Nhiệt độ lên men (0C) | Xu 30 36 42 Tỷ lệ giống X5 1/40 1/20 1⁄10 | [21], [29], [31] Téc dé vao (vvm) Xs 0,5 0,75 Tốc độ lắc (rpm) X 150 200 250 Xs 10 25 50 Luong oxy hoa tan(%) | [21] [29] [32] [21], [29] | [21], [29] [32] [21] [29] Ma trận Placket-Burman thực theo ma trận chuẩn thiết kế sử dụng phan mém Design Expert 13.0 [35] Thiét ké ma tran Placket-Burman duoc trinh bay bang 2.4 với 17 thí nghiệm cho 11 yếu tế (3 biến giả) Thí nghiệm số 12 thực mức thấp Bảng 2.4 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman Yếu tố-Biến Sinh Protein (mgiinl) Glar gine khối Y, Thí nghiệm Xi | X2| Xs | Xo | X7 | Xs | Xo | Xuo | Xa Xs | Xa] Insulin Y2 (ug/g) 1|1|-1|1|11|-11-11-11 -l} 1] ]-1] 1] 1} 1] -t]-1) -1 1]-1} 1] }-1] 1] 1] 1] 1| -L}-1] -L}-1]-1] 1] -1)-1]-1} 1] 1) -1]-1}-1] 1] 1] 10 -1l|1|1{1|-1|-1-111|-1] 11 1]-1) 1-11 | 1|-1T1 -14] 1-1 - - - - -1 4] -1 - - -1 - - | -1 - - 11-11 17-1] 1] ]}-1]) 171 1] -1] 1) 1] -17 1 - - 1} -1]) 1) 1) -14 1 - - ]-1}) 1] 14-1 - - -1 - - we st - - 1] ]-2}-1]-1]) 1] 1] 4) -1) -1)-1)-1) 24 1 | 1 -1 12 +1|-1|-1|-1|-1|-L|-L|-1|-LI-1 | -1 = 13 ofoloflolo]lo};o;lolo]o]o ` 14 0001000010100 - - 15 0001000010000 - - 16 ofoloflolo]lo}lo;lo}lo]o]o ` 2 |Jo0|ø0|10|0|0|0|0|0|010 Trong dé: Xi, X2, X3, Xa, Xs, Xe, X7, Xs la ky hiéu cdc bién yếu tế với giá trị cụ thể tùy thuộc vào thí nghiệm X¡ đến Xs yếu tế khảo sát ứng với bảng 2.4, Xo đến Xịi xem biến ảo Ky hiệu (-l): giá trị cận yếu tố Ký hiệu (+1): gid tri cAn yếu tố Ký hiệu (0): giá trị tâm yếu tế Hàm đáp ứng duge chon 1a ham long sinh khéi E.coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine (¥1: mg/ml) thu môi trường nuôi cấy hàm lượng protein l gram tế bào vi khuan (Y2: ug/g) Thí nghiệm ma trận Plackett-Burman thực quy mơ Ï lít với mơi trường theo bảng 2.4 sử dụng cho trỉnh lên men Sau cảm ứng thời gian giờ, tiến hành đo hàm đáp ứng Y¡ Y¿ Hàm lượng sinh khối (Y1) xác định khối lượng sau ly tâm cân Sau xứ lý phá vỡ tế bào bào E.coli BL21 (DE3) đánh sóng siêu âm với dung dịch ly giải (Triton X, NaCl, EDTA), thu dich va tiến hành đo nồng độ protein tổng số (Y2) phương pháp đo OD (sử dụng máy Ezdrop bước sóng Azso hệ số & để đo nồng độ protein tổng số) Nồng độ protein tính theo cơng thức (Định luật Beer): A; = ee (Trong A¿ độ hấp thụ, c nơng độ protein hệ số hấp thụ mol) Các số liệu thu thí nghiệm nhập vào phần mềm Design Expert 13 tiến hành xứ lý với độ tin cậy œ < 0,05 Hệ số ảnh hưởng yếu tố đến hàm đáp ứng sứ đụng để lựa chọn yếu tố ánh hưởng đến hàm đáp ứng Thí nghiệm tối ưu hóa ma trận RSM — CCD hưởng [22] 25 thực cho yếu tố ảnh 2.23.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối E.coli BL21(DE3)/pENanogenInsulin Glargine va protein Insulin Glargine bang ma tran RSM - CCD Sau sàng lọc xác định yếu tế ánh hưởng đến hàm lượng sinh khối Z coli BL21(DE3) (Y, mg/ml) thu hàm lượng protein (Y2 ug/g), thí nghiệm tối ưu hóa mơi trường ni cấy thực theo phương pháp đáp ứng bề mặt - thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD), kết xử lý Design expert® 13 Sau phân tích ANOVA, phương trình hồi quy sử dụng để tiên đoán lượng sinh khéi E coli (mg/ml) va long protein (g/g) thu Tùy vào kết qua thi nghiệm mà số yếu tế ảnh hưởng yếu tố Ma tran day dia cho yếu tố với điểm thí nghiệm tâm phương án bảng 2.5: Bảng 2.5 Ma trận RSM-CCD đú cho yếu tế Sinh khéi Y1 | Protein Y2 (ug/g) (mg/m— l) - a-1 Yếu tổ me-1 1 -] - -] I - -1 I — - Thí nghiệm 5sĨ - - ¬ +a 0 - - 2W +a - 0 -ữ — - 10 0 0 +0 “ — _ - 12 0 13 0 - 14 0 - 15 0 - 16 0 - 26 : — - Ghi chú: XI, X2, Xã: ký hiệu biến yếu tố với giá trị cụ thé tùy thuộc vào thí nghiệm | Yi hàm đáp ứng, đơn vị tùy thuộc vào thí nghiệm cụ thể | (-1): giá trị cận yếu tế | (+1): giá trị cận yếu tế | (0): giá trị yếu tế tâm | (-a@): giá trị cận cánh tay đòn | (+ơœ): giá trị cận cánh tay đòn Ma trận rút gọn sử dụng nguyên tắc hiệp biến đề thu gọn số thí nghiệm Việc rút gọn ma trận làm giảm số thí nghiệm tâm ma trận I nửa 24-1 (8) thay vi 24 (16) số thí nghiệm tâm cánh tay địn œ khơng thay đối so với ma trận đầy đủ [23] Kết tính tốn độ tái lặp nghiệm thức thực cách xác định độ tái lặp thí nghiệm điểm tâm phương án (lặp lại lần) Vì vậy, tồn thí nghiệm thiết kế ma trận cần thực lần [29] Ma trận thiết lập xứ lý phần mềm DE 13.0 Kết mơ hình tối ưu kiểm tra tính tương thích với thực nghiệm để đưa kết luận cuối Sau xác định điều kiện tối ưu theo mơ hình (sử dụng phương trình hồi quy) Tiến hành xác định tương thích mơ hình lý thuyết thực nghiệm cách thực nuôi cấy vi khuân điều kiện tối ưu với lần lặp lại thí nghiệm Bố trí thí nghiệm trỉnh bày bảng 2.6 Bảng 2.6 Đánh giá tương thích mơ hình lý thuyết thực nghiệm = Yếu tổ ưu X1 | X2 | X3 Sinh khối Y¡ (mg/ml) M6 hinh Thực nghiệm Protein Y2 (ug/g) Mơ hình Thực nghiệm Thí nghiệm với điều kiện tối ưu lặp lại lần Sau đến giá trị ODaoo dich nuôi cấy thời điểm pha tăng trưởng (0.8-1) [21] tiến hành cảm ứng theo nông độ IPTG khảo sát tối ưu Sau cảm ứng với IPTG [21], kết thúc q trình ni cấy mẫu tiến hành khảo sát, hàm đáp ứng Y¡ Y› xác định mô tả Kết qua thí nghiệm xử lý cách so sánh theo chuẩn student t-test để xác định tương thích mơ hình tối ưu lý thuyết với 27 thực nghiệm Độ tin cậy œ> 0,05 (P < 95%) coi tương thích Điều kiện tối ưu dùng cho thí nghiệm lên men quy mô pilot 2.2.4 Lén men E coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Glargine quy m6 pilot voi điều kiện wu Điều kiện tối ưu hóa xác định thí nghiệm sử dụng cho lên men quy mô pilot Ban đầu điều kiện thí nghiệm tối ưu giữ khơng thay đối Nếu kết khơng tương thích tính tốn chuẩn số đồng dạng cho nâng quy mơ (seale up) sứ đụng để tính tốn hiệu chuẩn điều kiện lên men cho quy mô pilot Thí nghiệm tiến hành cách ni cấy E.coli BL21(DE3)/pENanogen-Insulin Gilargine bình ni cấy 20L theo điều kiện tối ưu xác định Hàm đáp ứng xác định mô tả tiến hành so sánh với kết thực nghiệm mơ hình tối ưu Phân phối student trắc nghiệm t-test sử dụng với độ tin cậy P > 0,05 Kết P > 0,05 đạt Trong trường hợp kết hàm đáp ứng quy mô pilot lớn so với kết thực nghiệm mơ hình tối ưu với P < 0,05 kết đạt Trong trường hợp kết hàm đáp ứng quy mô pilot nhỏ so với kết thực nghiệm mơ hình tối ưu với P< 225 0,05 kết khơng đạt Tỉnh protein Insulin BL21(DE3)/pENanogen-IG Glargine từ té bào E.coli Qua trinh ly giai va tinh sach protein Insulin Glargine thu nhận từ trình lên men gửi mẫu thực nhóm tỉnh chế (Cơng ty Nanogen) dựa theo qui trình tinh chuẩn từ cơng ty CNSH Dược Nanogen Quá trình tỉnh chế sử đụng phương pháp sắc kí trao đơi ion Sau giai đoạn tinh sạch, nhận mẫu từ nhóm tinh chế tiến hành đánh giá chất lượng san pham protein Insulin Glargine 2.2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm Kiểm tra sơ chất lượng sản phẩm protein Insulin Glargine: thong qua tiếu trình bày bảng 2.7 28 Bảng 2.7 Đánh giá sơ sản phẩm protein Insulin Glargine STT | Chỉ tiêu Đặc tinh Tiêu chuẩn chấp nhận Phương pháp kiểm tra Bột hút âm màu trăng tương ø x tự trăng Hâu không tan nước va etanol khan, tan , , Quan sát băng mắt thường axit vơ lỗng Tông tạp với thời gian lưu nhỏ thời gian lưu cua insulin glargine: Tạp không lớn 0.3 % tổng diện tích peak; bé qua bat ky peak nao cé HPLC thời gian lưu lớn peak insulin glargine Peak phơ đỗ mẫu thử có thời gian lưu tương đương với ° ° ° , thời gian lưu peak chinh phô Định tính HPLC đồ mẫu chuẩn — m Kiêm tra peptid: Phô đô dung š fo dich thử dung dịch đôi chứng phải tương đồng với phổ đề HPLC insulin glargine chuẩn Nghiên L ; ven àm giảm nơng Hoạt tính | máu wal độ glucose 29 tiến hành chuột nhắt chuột nhắt sử dụng Insulin thương mại chứng Phương pháp kiểm tra tạp (EP 10) [36] cứu cho Glargine „ nhóm đơi (a) Chuẩn bị - Dung dịch thứ: Hòa tan 15.0 mg chất thứ nghiệm 1.5 mL dung địch axit clohydrie pha loãng đến 10.0 mL, với nước chạy sắc ký - Dung dịch đối chứng (a): Làm khô khoảng 200 mg chất thử nghiệm tủ ủ 100oC khoảng 1.5-3 Hòa tan 15.0 mg chất khô I.5 mL dung dịch axit clohydrie g/L pha loãng đến 10 mL với nước chạy sắc ký - Dung địch đối chứng (b): Pha loãng mL dung địch thử đến 100 mL với nước chạy sắc ký Pha loãng mL dung dịch đến 20 mL với nước chạy sắc ký - Pha động: Trộn 200 mL axit acetie khan, 300 mL acetonitrile chay sắc ký 400 mL nước chạy sắc ký, chỉnh pH 3.0 với ammonia đậm đặc pha loãng đến 1000 mL nước chạy sắc ký (b) Tiến hành - Hệ thống sắc ký: +Dong: LC +Dau do: UV 276 nm +Cột: 8.0-mm x 30-em; 5-ùm packing L20 (2 cột nối với nhau, khối lượng khớp nối cột giữ mức tối thiểu) +Tốc độ địng: 0.5 mL/phút +Thể tích tiêm: 100 uL Phương pháp kiêm tra peptid (EP 10) [36] (a) Chuẩn bị - Dung địch thứ: Chuẩn bị dung dịch 10 pg/mL chất thử dung dịch axit clohydrie Ig/L chuyên uL dung dịch ống Thêm 1.0 mL đung dịch đệm tris-hydrochloride 1M pH 7.5 va 100 uL dung dich Staphylococcus aureus strain 30 V8 protease, nhóm XVII-B 20U/mL vào dung dịch đệm tris-hydrochloride IMpH7.5 Trộn ủ 45°C Dừng phản ứng cách thém pL axit phosphoric - Dung dịch đối chứng: Chuẩn bị lúc theo cách tương tự dung dịch thử sử đụng Insulin Glargine chuẩn - Dung dich dém: Hoa tan 11.6 g axit phosphoric va 42.1 g natri perclorat 1600 mL nước dùng cho sắc ký, pH 2.3 với triethylamine pha loãng đến 2000 mL nước dùng cho sắc ký (b) Tiến hành -Hệ thống sắc ký: +Dong: LC +Dau do: UV 214 nm +Cột: 3.0-mm = 12.5-cm; 4-um packing L1 +Nhiệt độ cột: 355C +Tốc độ địng: 0.6 mL/phút +Thể tích mẫu: 50 uL +Pha động: Sử dụng theo bảng: *Pha động A : Acetonitrile, dung dich dém (7:93 V/V) *Pha déng B: Dung dich dém, acetonitrile (43:57 V/V) Thoi gian/ Time (phtit/ min) | Dung dich/ Solution A (0) Dung dich/ Solution B (%) 0-30 90 —> 20 10 — 80 30-35 20 80 Phương pháp đánh giá hoạt tính làm giảm nơng độ giucose máu [37] 31 Sản phẩm thử nghiệm ¢ San pham protein Insulin Glargine e Thuốc đối chứng: Lantus (Sanofi-Aventis, Pháp) e Đối chứng âm: Dung địch bảo quản Hóa chất thiết bị May néng dé glucose Onetouch ultra (Lifescan - Johnson & Johnson (USA)) e Que thử đường huyết Onetouch ultra (Lifescan - Johnson & Johnson (USA)) Đơng vật thí nghiêm e Chuột nhắt trắng dong Swiss, Mus musculus var Albino, 8-12 tuần tuổi, cân nặng 18 - 22g e Số chuột dùng cho thí nghiệm: eNhóm I8 chia làm nhóm, con/nhóm chuột bình thường, nhóm chuột tăng đường huyết tiêm Streptozocin (60 mg/kg) vao bung Bề trí thí nghiệm e Thuốc thử nghiệm: IG liều IU/kg e Thuốc đối chứng dương: Lantus liều IU/kg e Đối chứng âm: Dung địch bảo quản se Đường tiêm: Tiêm da (S.C.) e Thể tích tiêm: 0,1 m1/10 g Bảng 2.8 Đánh giá hoạt tính giảm glucose mau cua protein Insulin Glargine chuột nhắt khỏe mạnh bình thường Thời gian | JG (2 IU/kg) | Lantus (21U/kg) | Chứng âm -3h -> 0h trước tiêm thuốc 0h Tiến hành tiêm, thể tích tiêm 0,1 ml/10g Ghi Tu EilGSQI Bhyyi đình nơng độ glucose 1h Thu mẫu máu, xác định 2h Thu mẫu máu, xác định nông độ glucose nong glucose 32 4h Thu mau mau, xác định 6h Thu mau Sh Thu mẫu máu, xác định x nong d6 glucose máu, xác định nông độ glucose nồng độ glucose Bảng 2.9 Đánh giá hoạt tính giảm glueose máu protein Insulin Glargine chuột nhắt tăng đường huyết đo Streptozocin Thời gian | JG (2 IU/kg) | Lantus (21U/kg) | Chứng âm -3h -> 0h trước tiêm thuốc Tiến hành tiêm, thể tích tiêm 0,1 ml/10g Ghi ihe am THẬN; mas dinh nông độ glucose Thu mẫu máu, xác định Thu mẫu máu, xác định Thu mẫu máu, xác định Thu mẫu máu, xác định g Thu mau 10 Thu mẫu máu, xác định 12 Thu mẫu máu, xác định 24 Thu mẫu máu, xác định nông độ glucose nông độ glucose nông độ glucose nông độ glucose máu, xác định nông độ glucose nông độ glucose nông độ glucose nông độ glucose Quy trình lầy máu chuột tiêm Insulin Glargine (Phụ lục) Thực dựa theo chương 15: Đánh giá khả dung nạp insulin ím vivo chuột thuộc sach Animal Models of Diabetes (Phu luc) [38] Đánh giá kết qua e Mẫu máu thu thập sử dụng để xác định nông dé glucose máu chuột máy đo glucose e Sứ đụng công thức đưới day dé tinh ty 16 néng dé glucose co ban mau: 33 Ti 16 néng dé glucose mau (%) = (Néng dé glucose mau sau tiêm (mmol/1))/(Nằng độ glueose máu trước tiêm (mmol/L))x 100 e Số liệu nghiên cứu phân tích sử đụng thống kê ANOVA, giá trị p