Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học Bách Khoa Hµ Néi Luận văn thạc sĩ khoa học Ngành: công nghệ sinh học Tách chiết, nghiên cứu tách dòng, xác định trình tự biểu gen mà hoá mannanase từ nấm mốc aspergillus niger Giang Thị Hương Hun Người hướng dẫn: Đặng Thị Thu Hµ néi 2006 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131579381000000 Li cm n Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp vừa qua, đà nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn quý báu thầy cô, anh chị phòng thí nghiệm, xin bày tỏ lời cảm ơn đến giúp đỡ quý báu Tôi xin chân thành bảy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, ViƯn C«ng nghƯ Sinh häc- C«ng nghƯ thùc phÈm, trường Đại hoc Bách Khoa Hà Nội- người thầy đà tận tình hướng dẫn, bảo suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô, anh chị Bộ môn Hoá sinh sinh học phân tử, Viện công nghệ Sinh học- Công nghệ thực phẩm đà tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian làm đồ án tốt nghiệp Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo sau Đại học, thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm đà tạo điũu kiện thuận lợi cho trình học tập hoàn thnàh luận văn Thạc sỹ khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô, gia đình bạn bè người đà động viên ủng hộ suốt thời gian vừa qua Một lần nữa, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu săc tới tất giúp đỡ quý báu Học viên Giang Thị Hương Huyền Mục lục Bảng chữ viết tắt i Danh mục bảng ii Danh mục hình iii Mở đầu … Ch¬ng I- Tỉng quan tµI liƯu .… 1.1 CÊu tróc cđa mannanase………………………………….… 1.1.1 Cấu trúc bậc nhất…………………………………….… 1.1.2 Cấu trúc khơng gian cđa Pc Man26A……………….… 1.1.3 Cấu tạo trung tâm hoạt động………………………… 1.2 Chức ch tỏc dng ca endo--mannanase 1.2.1 Chức mannanase 1.2.2 C cht đặc hiệu mannanase……………………… 1.2.3 Phức hệ enzymee phân cắt mannan…………………… 11 1.2.3.1 Endo-β-1,4-mannanase (EC 3.2.1.78)……….… 11 1.2.3.2 β-mannosidase (EC 3.2.1.25)………………… 12 1.2.3.3 α-galactosidase (EC 3.2.1.22)……………….… 12 1.3.2.4 β-glucosidase (EC 3.2.1.21)…………………… 13 1.3.2.5 Acetylesterase………………………………… 13 1.2.4 Cơ chế xúc tác endo-β -mannanase……………… 13 1.3 Đặc tính nguồn gốc mannanase…………………… 16 1.3.1 Đặc tính mannanase……………………………… 16 1.3.2 Nguồn thu mannanase………………………………… 18 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp mannanase vi sinh vật ……….… 19 1.4.1 Nguồn cacbon……………………………………….… 19 1.4.2 Nguồn nitơ…………………………………………… 20 1.4.3 pH……………………………………………………… 20 1.4.4 Nhiệt độ……………………………………………… 21 1.5.Tinh 21 1.6 Ứng dụng mannanase 23 1.6.1 Trong công nghiệp dược…………………………….… 23 1.6.2.Trong công nghiệp thực phẩm………………………… 24 1.6.3.Trong khai thác dầu mỏ khí đốt…………………… 25 1.6.4.Trong cơng nghiệp sản xuất thức ăn gia súc…………… 26 1.6.5.Trong công nghiệp sản xuất giy v bt giy 27 1.7 Mannanase công nghệ gen 28 1.7.1 T¸ch dòng giải trình tự gene mà hóa mannanase 28 1.7.2 Xác định trình tự axit amin mannanase 31 1.7.3 BiĨu hiƯn gene m· hãa mannanase 35 Ch¬ng II- VËt liệu phương pháp nghiên cứu 36 2.1 Vật liệu 36 2.1.1 VËt liÖu …… 36 2.1.2 Ho¸ chÊt 36 2.1.3 Trang thiÕt bÞ 37 2.2 Phương pháp nghiên cứu 38 Aspergillus 38 2.2.1 T¸ch chiết RNA từ nấm mốc niger 2.2.2 Nhân dòng gen m· ho¸ mannanase tõ RNA tỉng sè cđa Aspergillus niger kỹ thuật RT- PCR 39 2.2.3 Tách dòng gen mà hoá mannanase 40 E 43 2.2.5 Phản ứng cắt kiểm tra gen 44 2.2.6 Điện di DNA gel agarose 0,8% 45 2.2.7 Xác định trình tự gen máy xác định trình tự DNA 46 2.2.4 Tách chiÕt DNA plasmid tõ coli……………………… tù ®éng…………………………………………………………… 2.2.8 ThiÕt kÕ vector biĨu hiƯn gen m· ho¸ mannanase…… 47 2.2.9 Biểu mannanase tái tổ hợp nấm men 48 Saccharomyces cerevisiae 2.2.10 Điên di biến tính SDS-PAGE gel polyacrylamid 52 Chương III- Kết thảo luận 54 Sơ đồ tóm tắt trình thí nghiệm 54 3.1 Kết tách chiết RNA từ Aspergillus niger 55 3.2 Nhân gen mà hoá mannanase phản ứng RT-PCR 57 3.3 Tách dòng gen mà hoá mannanase 59 3.4 Trình tự gen mà hoá cho mannanase từ Aspergillus niger 62 3.5 Nghiên cứu biểu mannanase tái tổ hợp tế bào 64 nấm men Saccharomyces cerevisiae Kết luận kiến nghị 67 Tài liệu tham khảo 68 Tóm tắt luận văn 74 Summary 75 Bảng chữ viết tắt DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid Amp+ Ampicillin bp base pair (cỈp bazơ nitơ) CD Cluster of differentiation (nhóm biệt hoá) DT Diptheria toxin EF Elongation Factor (yÕu tè kÐo dµi) E coli Escherichia coli EtBr Ethidium bromide KDa Kilodalton OD Optical density (mËt ®é quang häc) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (®iƯn di biÕn tÝnh nhê SDS trªn gel polyacrylamid) Arg Agrinine CMC Cacboxymethylcellulose Da Dalton Galp Galactopyrannose Glup Glucopyrannose Gly Glysine LBG Locust bean gum Leu Leucine Lys Lysine Manp Mannopyrannose Thr Threonine Danh môc bảng Bảng 1.1- Trỡnh t acid amin ca Mannanase 26A Bảng1.2- Công nghệ gene víi mannanase vi khn 31 B¶ng 2.1- Thành phần hỗn hợp phản ứng 40 Bảng 2.2- Các thành phần phản ứng xử lý enzyme giới hạn 44 Bảng 2.3-Thành phần ®ỉ gel polyacrylamid ……… 53 B¶ng 3.1 Các thành phần phản ứng RT-PCR 57 Bảng 3.2- Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR 57 Danh mục h×nh Hình 1.1- Cấu trúc khơng gian Pc Man26A … Hình 1.2- Ph©n bè trơc α-Carbon cđa Pc Man26A Hình 1.3- Cấu trúc trung tâm hoạt động Pc Man26A ………… Hình 1.4- Cấu trúc galactoglucomannan từ gỗ mềm 11 Hình 1.5- Vị trí cắt đặc hiệu enzyme thuỷ phân mannan gỗ mềm 15 Hình 2.1- Nhuộm màu huỳnh quang cho ddNTP 46 Hình 2.2- Kết phân tÝch tÝn hiƯu hnh quang ……………… 46 H×nh 2.3- Vector biĨu hiƯn pPicZα tÕ bµo nÊm men Pichia X-33……………………………………………………………… 47 H×nh 2.4- BiĨu hiƯn Pichia X-33 sử dụng hệ EasySelect 49 Hình 3.1- Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 54 Hình 3.2- Kết điện di RNA tổng số thu từ nấm mốc A.niger 56 Hình 3.3- Điện di sản phẩm RT-PCR gel Agarose 0,8% 58 Hình 3.4- Khuẩn lạc xanh trắng 60