11 Hỡnh 1.5- Vị trớ cắt đặc hiệu của cỏc enzyme thuỷ phõn mannan của gỗ mềm...……… 15 Trang 12 Mở đầu Endo-β-1,4-mannanase [EC 3.2.1.78] là enzyme xỳc tỏc thủy phõn một cỏch ngẫu nhiờn
Trang 1Luận văn thạc sĩ khoa học
Ngành: công nghệ sinh học
Tách chiết, nghiên cứu tách dòng, xác
định trình tự và biểu hiện gen mã hoá
mannanase từ nấm mốc aspergillus niger
Giang Thị Hương Huyền
Người hướng dẫn: Đặng Thị Thu
Hà nội 2006
Trang 2Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp vừa qua, tôi đã nhận được rất nhiều
sự giúp đỡ, hướng dẫn quý báu của các thầy cô, các anh chị trong và ngoài phòng thí nghiệm, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn đến những sự giúp đỡ quý báu đó
Tôi xin chân thành bảy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ thực phẩm, trường Đại hoc Bách Khoa Hà Nội- người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô, anh chị ở Bộ môn Hoá sinh và sinh học phân tử, Viện công nghệ Sinh học- Công nghệ thực phẩm đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm đồ
án tốt nghiệp
Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo sau Đại học, các thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm đã tạo những điũu kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thnàh luận văn Thạc sỹ khoa học
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô, gia đình và bạn bè những người đã động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian vừa qua
Một lần nữa, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu săc tới tất cả sự giúp đỡ quý báu trên
Học viên
Giang Thị Hương Huyền
Trang 3Bảng các chữ viết tắt………
Danh mục các bảng……… ii
Danh mục các hình……… iii
Mở đầu … 1
Chương I- Tổng quan tàI liệu … 2
1.1 Cấu trúc của mannanase……….… 2
1.1.1 Cấu trỳc bậc nhất……….… 2
1.1.2 Cấu trỳc khụng gian của Pc Man26A……….… 3
1.1.3 Cấu tạo trung tõm hoạt động……… 6
1.2 Chức năng và cơ chế tỏc dụng của endo-β-mannanase…… 7
1.2.1 Chức năng của mannanase……… 7
1.2.2 Cơ chất đặc hiệu của mannanase……… 8
1.2.3 Phức hệ enzymee phõn cắt mannan……… 11
1.2.3.1 Endo-β-1,4-mannanase (EC 3.2.1.78)……….… 11
1.2.3.2 β-mannosidase (EC 3.2.1.25)……… 12
1.2.3.3 α-galactosidase (EC 3.2.1.22)……….… 12
1.3.2.4 β-glucosidase (EC 3.2.1.21)……… 13
1.3.2.5 Acetylesterase……… 13
1.2.4 Cơ chế xỳc tỏc của endo-β -mannanase……… 13
Trang 41.3.2 Nguồn thu mannanase……… 18
1.4 Cỏc yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp mannanase ở vi sinh vật ……….…
19 1.4.1 Nguồn cacbon……….… 19
1.4.2 Nguồn nitơ……… 20
1.4.3 pH……… 20
1.4.4 Nhiệt độ……… 21
1.5.Tinh sạch 21
1.6 Ứng dụng của mannanase 23
1.6.1 Trong cụng nghiệp dược……….… 23
1.6.2.Trong cụng nghiệp thực phẩm……… 24
1.6.3.Trong khai thỏc dầu mỏ và khớ đốt……… 25
1.6.4.Trong cụng nghiệp sản xuất thức ăn gia sỳc……… 26
1.6.5.Trong cụng nghiệp sản xuất giấy và bột giấy………… 27
1.7 Mannanase và công nghệ gen 28 1.7.1 Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa mannanase 28 1.7.2 Xác định trình tự axit amin mannanase 31 1.7.3 Biểu hiện gene mã hóa mannanase 35
Trang 52.1.2 Hoá chất 36 2.1.3 Trang thiết bị 37
2.2.1 Tách chiết RNA từ nấm mốc Aspergillus
niger…………
38
2.2.2 Nhân dòng gen mã hoá mannanase từ RNA tổng số của
Aspergillus niger bằng kỹ thuật RT- PCR………
39 2.2.3 Tách dòng gen mã hoá mannanase……… 40
coli………
43
2.2.5 Phản ứng cắt kiểm tra gen……… 44 2.2.6 Điện di DNA trên gel agarose 0,8%……… 45 2.2.7 Xác định trình tự gen bằng máy xác định trình tự DNA
2.2.10 Điên di biến tính SDS-PAGE trên gel polyacrylamid 52
Trang 63.2 Nh©n gen m· ho¸ mannanase b»ng ph¶n øng RT-PCR… 57
3.3 T¸ch dßng gen m· ho¸ mannanase……… 59
3.4 Tr×nh tù gen m· ho¸ cho mannanase tõ Aspergillus niger… 62 3.5 Nghiªn cøu biÓu hiÖn mannanase t¸i tæ hîp trong tÕ bµo nÊm men Saccharomyces cerevisiae………
64 KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ 67
Tµi liÖu tham kh¶o 68
Tãm t¾t luËn v¨n……… 74
Summary……… 75
Trang 7DNA Deoxyribonucleic Acid
Amp+ Ampicillin
bp base pair (cặp bazơ nitơ)
CD Cluster of differentiation (nhóm biệt hoá)
EF Elongation Factor (yếu tố kéo dài)
E coli Escherichia coli
OD Optical density (mật độ quang học)
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis (điện di biến tính nhờ SDS trên gel polyacrylamid)
Trang 8Lys Lysine
Trang 9Bảng 1.1- Trỡnh tự acid amin của Mannanase 26A 4 Bảng1.2- Công nghệ gene với mannanase vi khuẩn 31 Bảng 2.1- Thành phần hỗn hợp phản ứng … 40 Bảng 2.2- Các thành phần của phản ứng xử lý bằng enzyme giới hạn………
44 Bảng 2.3-Thành phần đổ gel polyacrylamid ……… 53 Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng RT-PCR……… 57 Bảng 3.2- Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR……… 57
Trang 10Hỡnh 1.1- Cấu trỳc khụng gian của Pc Man26A … 5 Hỡnh 1.2- Phân bố trục α-Carbon của Pc Man26A 5 Hỡnh 1.3- Cấu trỳc trung tõm hoạt động của Pc Man26A ………… 6 Hỡnh 1.4- Cấu trỳc của galactoglucomannan từ gỗ mềm 11 Hỡnh 1.5- Vị trớ cắt đặc hiệu của cỏc enzyme thuỷ phõn mannan
Hình 2.1- Nhuộm màu huỳnh quang cho các ddNTP 46 Hình 2.2- Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang ……… 46 Hình 2.3- Vector biểu hiện pPicZα trong tế bào nấm men Pichia X-33………
47 Hình 2.4- Biểu hiện trong Pichia X-33 sử dụng hệ EasySelect…… 49 Hình 3.1- Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm……… 54 Hình 3.2- Kết quả điện di RNA tổng số thu được từ nấm mốc
A.niger………
56 Hình 3.3- Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel Agarose 0,8% 58 Hình 3.4- Khuẩn lạc xanh trắng …… ……… 60
Trang 11Hình 3.7- Thiết bị xác định trình tự gen tự động (ABI- Mỹ)……… 62 Hình 3.8- Trình tự gen và trình tự acid amin của mannanase……… 63 Hình 3.9- Sự biểu hiện mannanase ở Pichia X-33……… 65
Trang 12Mở đầu
Endo-β-1,4-mannanase [EC 3.2.1.78] là enzyme xỳc tỏc thủy phõn một cỏch ngẫu nhiờn liờn kết β-1,4-mannosidic của cỏc mannan, galactomannan và glucomannan tạo thành mannobiose, mannotriose, mannooligosaccharide và một lượng nhỏ mannose Cỏc polysaccharide chứa đường manose này là những thành phần quan trọng của sinh khối thực vật, Glucomannan đóng vai trò thiết yếu trong thành tế bào của các loài hạt kín Còn galactomannan thường có trong thành tế bào của hạt carob (một loại hạt giống hạt cacao) và đóng vai trò dự trữ polysaccharide Tỏc dụng thuỷ phõn cỏc liờn kết β-1,4 trong chuỗi polysaccharide chứa manose của mannanase cú ý nghĩa đặc biệt trong một số lĩnh vực trong đời sống, nú làm tăng giỏ trị sử dụng của nụng sản và tạo thuận lợi cho cỏc quỏ trỡnh cụng nghệ trong sản xuất
Khả năng ứng dụng của mannanase trong cụng nghiệp là rất lớn, nú được ứng dụng trong nhiều ngành cụng nghiệp như: cụng nghiệp sản xuất thức ăn gia sỳc, cụng nghiệp dược, cụng nghiệp giấy và bột giấy, cụng nghiệp khai thỏc khớ đốt và dầu mỏ, cụng nghiệp thực phẩm và đồ uống Đặc biệt ở nước ta, Việt Nam vốn là nước cú sản luợng cà phờ và dừa rất lớn, lượng bó cơm dừa thải ra trong cụng nghiệp sản xuất dầu dừa là rất nhiều, trong cà phờ và cựi dừa lại cú rất nhiều mannan, thành phần làm tăng độ nhớt trong quỏ trỡnh chế biến và làm giảm khả năng tiờu hoỏ nờn việc nghiờn cứu ứng dụng mannanase vào cụng nghệ sản xuất cà phờ tan (giảm độ nhớt) và thuỷ phõn bó cơm dừa (giảm lượng bó thải) làm thức ăn gia sỳc được cỏc nhà cụng nghệ sinh học rất quan tõm
Trang 13Mannanase có nguồn gốc rất phong phú, chúng được thu từ các vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, tảo biển, tảo nước ngọt, hạt nảy mầm, động vật… Hàm lượng cũng như đặc tính của các mannanase từ các nguồn khác nhau là rất khác nhau, chính vì vậy mà các nghiên cứu về các nguồn thu của mannanase đã thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà chuyên môn Một loạt các nghiên cứu về mannanase từ các loại vi khuẩn như Bacillus, Chlorela, Aracicus, Pseudomonas, Cellulomonas, Aspergillus, Candida…đã được công bố Cũng
trong khuôn khổ nghiên cứu về nguồn thu mannanase, bên cạnh các nghiên cứu
từ Bacillus đã đạt được, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Tách chiết, nghiên cứu
tách dòng, xác định trình tự và biểu hiện gen mã hoá mannanase từ nấm mốc
Aspergillus niger” với mục đích:
• Tỏch chiết RNA từ mẫu nấm mốc Aspergillus niger
• Khuyếch đại gen mó hoỏ mannanase bằng phương phỏp PCR
• Tỏch dũng gen mó hoỏ mannanase bằng cỏch chuyển vector tỏch dũng (là
vector tỏi tổ hợp chứa gen mó hoỏ mannanase) vào tế bào vật chủ E coli
• Tiến hành xỏc định trỡnh tự gen mó hoỏ mannanase đó tỏch dũng bằng mỏy xỏc định trỡnh tự gen tự động
• Gắn gen mó hoỏ mannanase với vector biểu hiện và chuyển vector này vào
tế bào vật chủ để nghiờn cứu mức độ biểu hiện của gen này
Trang 14Chương I Tổng quan tài liệu
1.1 Cấu trúc của mannanase
Mannanase (endo-β-1,4-mannanase [EC 3.2.1.78]) là enzyme xỳc tỏc thủy phõn một cỏch ngẫu nhiờn liờn kết β-1,4-mannosidic của cỏc mannan, galactomannan và glucomannan tạo thành mannobiose, mannotriose, mannooligosaccharide và một lượng nhỏ mannose [1,5]
Mannanase cú cấu tạo là một glycoprotein, khối lượng phân tử của các mannanase từ các nguồn gốc khỏc nhau là khỏc nhau: mannanase từ S rolfsii là một glycoprotein cú khối lượng phõn tử là 46,5 kDa, từ A niger cú khối lượng phõn tử là 45 kDa, mannanase của vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga neapolitana
5068 cú khối lượng phõn tử 65 kDa, mannanase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn
biển Vibriosp chủng MA 138 là một glycoprotein với phần appoprotein cú khối lượng là 49 kDa; mannanase được tỏch từ loài nhuyễn thể biển Litto vena brevicula cú khối lượng phõn tử 42 kDa [9,13,17,20]
Tất cả cỏc mannanase đều cú khả năng xỳc tỏc cắt mối liờn kết mannosidic trong mạch mannan của một số loại polysaccharide, nhưng cấu trỳc của chỳng lại khỏc nhau dựa theo nguồn gốc khác nhau của chúng Dưới đõy là kết quả nghiên cứu chi tiết về cấu trỳc của mannanase 26A (Pc Man26A) thuộc nhóm GH26 từ vi khuẩn Pseudomonas cellulose do Deborah Hogg và cộng sự
β-1,4-đưa ra [14]
Trang 151.1.1 Cấu trỳc bậc nhất
Mannanase 26A là một chuỗi peptide chớnh gồm 385 axit amin, bắt đầu bằng Arginine ở vị trớ 39 và kết thỳc bằng lysine 423 Ba chuỗi protein được hình thành từ 337 axit amin tương ứng là Pa (Pro-44-Ile-323), Pb (Leu-332-Trp-360),
Pc (Thr-392-Thr-419) Các gốc axit amin còn lại hình thành 4 cấu trúc nối không sắp xếp theo trật tự nhất định (gốc 324-331; 361-391; 5 gốc amin đầu Nitơ Arg39-Lys43; và 4 gốc đầu carboxy Leu420 Trong cấu trỳc mannanase cú phõn đoạn peptid tớn hiệu từ axit amin 1 đến axit amin 38 [14]
Bảng 1: Trỡnh tự acid amin của Mannanase 26A [14]
1.1.2 Cấu trỳc khụng gian của Pc Man26A
Cấu trỳc khụng gian của Mannanase gồm 3 vựng: Vựng A từ proline 44 đến isoleucine 323, vựng B từ leucine 332 đến tryptophan 360 và vựng C từ threonine 392 đến threonine 419 Cỏc chuỗi axit amin Arg 39- Lys 43, Arg 324-Gly 331, Arg 361- Thr 391 và Leu 420- Lys 423 cú chức năng nối cỏc vựng trờn với nhau Phân tử Pc Man26A cấu tạo bởi 8 chuỗi xoắn α và 8 chuỗi β (Hình 1.1) Chuỗi Pa và Pb có cùng kích thước 93.2 Ao Chuỗi Pc có kích thước 5.8 Ao
Trang 16Chuỗi Pa hình thành vùng xúc tác của enzyme Tâm hoạt động cấu tạo bởi các gốc axit amin nằm trên các chuỗi β4,5,7và8 Axit/bazơ (Glu-212) ở cuối sợi β4 và nucleophile (Glu-320) ở cuối sợi β7 được chỉ rõ trên hình
Hỡnh 1.1: Cấu trỳc khụng gian của Pc Man26A [14]
(Màu xanh: chuỗi α, màu đỏ: chuỗi β)
Hỡnh 1.2: Phân bố trục α-Carbon của Pc Man26A [14]
Trang 171.1.3 Cấu tạo trung tâm hoạt động
Các acid amin cấu tạo nên trung tâm hoạt động của mannanase nằm trên 4 chuỗi β là β4, β5, β7 và β8 (hình 1.3) vµ ®îc cÊu t¹o bëi c¸c gèc axit amin nh: His-211, Glu-212, Tyr-285, Glu-320, Trp-360, vµ Arg-208; cÊu tróc liªn kÕt c¬ chÊt t¹o thµnh bëi Asn-127, Glu-128, Tyr-198, Glu-225, Trp-254, vµ Arg-50 Vị trí hoạt động của enzyme tạo bởi hai phân tử axit glutamic: glutamic 212 và glutamic 320 lần lượt ở cuối chuỗi β4 và cuối chuỗi β7 Hai axit glutamic này cách nhau 5,5 Ao Ngoài ra còn có các axit amin phụ trợ như histiodine 211 và Arginine 208 trên chuỗi β4, aspartic 283 và tyrosine 285 trên chuỗi β5 và trytophan trên chuỗi β8 Các acid amin này liên kết với nhau theo liên kết hydro Glutamic 212 liên kết với aspartic 283 bởi nhóm caboxyl Nhóm cacboxyl của glutamic 320 liên kết với vòng imidazol của histidine 211 bởi liên kết hydro Glutamic 320 liên kết với nhóm hydroxyl của tyrosine 285, và nhóm amin của Arginine 208 Tryptophan 360 cùng liên kết với glutamic 320 [14]
Cấu trúc trung tâm hoạt động của Pc Man26A [14]
β 4
β 7
β 8
β 5
Trang 18Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân mannan được thực hiện bởi các axit amin không nằm tại tâm xúc tác và thay đổi tùy thuộc độ lớn của khối lượng phân tử cơ chất Nếu cơ chất là manno-oligosaccharide thì Tryp162 sẽ tương tác kỵ nước với cơ chất Tuy nhiên Tryp162 không liên kết với polysaccharide Khác Tryp162, His143 liên kết với cả hai loại cơ chất trên nhờ liên kết hydro giữa vòng imidazol với nhóm hydroxyl của mannose Nếu cơ chất
là mannopyranose thì Tryp217 sẽ hình thành tương tác kỵ nước với cơ chất Ngoài các axit amin trên còn có Tryp156 Trong tâm xúc tác, Tryp360 ngoài vai trò xúc tác cũng đóng vai trò liên kết cơ chất để ổn định trạng thái cho enzyme Còn His211 có vai trò duy trì tâm xúc tác
1.2 Chức năng và cơ chế tỏc dụng của endo-β-mannanase
1.2.1 Chức năng của mannanase
Endo-β-mannanase (EC 3.2.1.78) là enzyme thuộc nhóm thủy phân glycoside, thủy phân polymannan tạo ra các mannooligosaccharide Endo-β-mannanase xúc tác cắt đặc hiệu liên kết β-1,4 mannose trong mạch mannan cũng như liên kết β-1,4 giữa mannose và glucose trong mạch glucomannan Mức độ cắt mạch mannan phụ thuộc vào tỉ lệ glucose và mannose trong mạch Vídụ: Bột glucomannan salep (glucose:mannose =2:8) bị cắt nhiều hơn so với glucomannan konjac (glucose:mannose = 66:100) Mức độ thay thế và phân bố các nhóm bên làm ảnh hưởng đến hoạt tính của mannanase Nhóm bên galactosyl của galactomannan và nhóm acetyl làm hạn chế sự thủy phân mạch chính [22, 24, 25]
Trang 191.2.2 Cơ chất đặc hiệu của mannanase
β-Mannanase sử dụng cơ chất đặc hiệu là các β-mannan của lignocellulose β-mannan là những polysaccharide dị thể có nhiều trong gỗ mềm, gỗ cứng cũng như trong hạt và rễ cây Dựa trên thành phần monomer cấu tạo nên mạch chính và mạch bên người ta chia các β-mannan thành 4 nhóm: mannan tinh khiết, glucomannan, galactomannan, galactogluco-mannan [17]
• Mannan tinh khiết
Mannan tinh khiết là loại polysaccharide có thành phần gồm trên 90% các gốc D–mannose và dưới 10% các gốc đường không phải mannose như: galactose, glucose… Mannan tinh khiết có trong nội nhũ hạt cọ, hạt của cây có hoa hình tán (cần tây, cà rốt…), hạt hạnh nhân (phytelephas macrocarpa) và trong hạt cà phê xanh với vai trò là polysaccharide dự trữ Polysaccharide dự trữ
sẽ mất dần trong quá trình nảy mầm Mannan tinh khiết đã và đang được nghiên cứu để ứng dụng là mannan tinh khiết trong hạt chà (phoenix dactydifera) và cùi dừa (phytelephas macrocarpa)
Mannan tinh khiết của các loại quả, hạt khác nhau thì khác nhau về độ hoà tan trong dung dịch kiềm, độ polyme hoá và thành phần galactose Mannan tinh khiết của hạt cà phê xanh có khối lượng phân tử nhỏ (7 kDa), cứ 100 gốc mannose trong mạch thì có một gốc galactose gắn vào mạch chính của mannan qua liên kết 1,6–galactosid (gắn vào vị trí cacbon số 6) Mannan trong cà phê có thành phần 88% D–mannose, 6,5% D–galactose, 3,7% D–glucose và D–xylose [11,17,18]
Trang 20• Galactomannan
Galactomannan cấu tạo từ các mạch chính có thành phần là gốc mannose
và các mạch nhánh là các đường galactose 6 cạnh Các mạch nhánh liên kết với mạch chính nhờ liên kết α-1,6-galactopyranosid Hàm lượng cấu tử galactose trong galactomannan dao động trong một khoảng khá rộng 20 ÷ 100% Galactomannan tìm thấy trong nội nhũ hạt cây họ đậu, hạt cọ xanh và hạt của một số loại cây khác Lượng galactomannan thay đổi trong suốt quá trình nảy mầm của hạt, sản phẩm thuỷ phân của chúng là nguồn cacbon cho phôi phát triển Galactomannan háo nước nên chúng được tách ra khỏi nội nhũ của hạt khi nghiền nhỏ hạt bằng nước nóng [18]
Locust bean gum (LBG) là galactomannan thu được từ nội nhũ của hạt cây caratonia siliqua, một loại cây thuộc họ đậu phổ biến ở vùng Địa Trung Hải Khối lượng phân tử của LBG là 350 kDa, được cấu tạo từ một mạch chính có thành phần là các gốc mannose (chuỗi mannose thẳng) và cứ 4 gốc mannose có một gốc D–galactose gắn vào nhờ liên kết α-1,6-galactopyranosid [17]
Guar gum là galactomannan thu được từ hạt cây Cyamopsis tetragonoloba Khối lượng phân tử của Guar gum là 800 ÷ 1000 kDa, tỷ lệ gốc mannose và gốc galactose trong phân tử là 1,6/1
Galactomannan của Caesalpina spinosa có tỷ lệ mannose và galactose là 1/3 Các galactomannan có nguồn gốc khác nhau có cấu trúc khác nhau, tỷ lệ mannose / galactose khác nhau [17]
• Glucomannan
Glucomannan được tìm thấy trong gỗ cứng, trong rễ các loài
Trang 21Iridaceae Về mặt cấu trúc, glucomannan khác mannan tinh khiết ở chỗ một lượng lớn các gốc mannose trong mạch chính β-1,4–mannan được thế chỗ bởi D–glucose Trong gỗ cứng thành phần glucomannan có tỷ lệ glucose/ mannose chiếm 3 ÷ 5% và không chứa D–galactose
Glucomannan từ hạt cây thuộc họ hoa huệ tây, hoa diên vĩ được cấu tạo từ các mạch chính có chứa các gốc D–mannose và D–glucose phân bố một cách ngẫu nhiên và một tỷ lệ nhỏ (3 ÷ 6% ) D–galactose gắn với mạch chính nhờ liên kết α-1,6-galactoside
Glucomannan trong rễ loài Amorphophallus konjac có trọng lượng phân
tử 300 kDa, tỉ lệ D–glucose và D–mannose cấu tạo lên mạch chính là 66/100 Các nhóm axetyl gắn vào mạch chính với tỷ lệ trung bình 1 nhóm axetyl liên kết với phân tử đường thứ 10 [11, 17]
• Galactoglucomannan
Galactoglucomannan được cấu tạo bởi một mạch chính gồm các đường D–glucopyranose và mannopyrannose phân bố một cách ngẫu nhiên và liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4–D–galactopyranosid Galactoglucomannan là một polysaccharide dị thể Dựa vào tỷ lệ mannose/glucose/galactose người ta chia galactoglucomannan ra làm 2 loại: Galactoglucomannan tan trong nước với tỷ lệ mannose/glucose/galactose là 3/1/1 và galactoglucomannan kém tan trong nước với tỷ lệ mannose/glucose/galactose là 3/1/0,1 Trong đó, galactogluco-mannan tan tốt trong nước là chủ yếu
Khoảng 5,9 ÷ 8,8% các đường mannose và glucose gắn với nhóm acetyl tại C2 và C3 Cấu trúc của galactoglucomannan của gỗ mềm được minh hoạ ở
Trang 22Galactoglucomannan chiếm 15 ÷ 20% khối lượng chất khô của gỗ mềm
Nó là thành phần polysaccharid dự trữ trong nội nhũ một số cây thuộc họ cercis siliquaestrumannanase và Bauhinia
Acetyl Acetyl Hình 1.4: Cấu trúc của galactoglucomannan từ gỗ mềm [17]
1.2.3 Phức hệ enzymee phân cắt mannan
1.2.3.1 Endo-β-1,4-mannanase (EC 3.2.1.78)
Mannanase xúc tác phân cắt liên kết β-1,4-mannosidic trong mạch mannan tạo thành mannobiose, mannotriose và các mannooligosaccharide khác Khả năng thuỷ phân của endo-β-1,4-mannanase lên các cơ chất khác nhau là khác nhau, phụ thuộc vào thành phần galactose trong phân tử Endo-β-1,4-mannanase thuỷ phân tốt LBG, galactomannan chỉ chứa một lượng galactose trong phân tử Guar gum, galactomannan có tỉ lệ galactose cao hơn nên khả năng thuỷ phân bởi Endo-β-1,4-mannanase chậm hơn Mức độ thuỷ phân của Endo-β-1,4-mannanase lên galactomannan tỉ lệ nghịch với hàm lượng galactose trong galactomannan [17]
Trang 231.2.3.2 β-mannosidase (EC 3.2.1.25 hay β-D-mannosid mannohydrolase)
Mannosidase cắt liên kết β-1,4 giữa D-mannose và D-glucose trong mannan, mannan dị thể và mannooligosaccharide bắt đầu từ đầu không khử giải phóng ra β-D-mannose Có thể tìm thấy β-mannosidase trong nhiều loại thực vật, mô động vật và đặc biệt là trong nhiều loài vi sinh vật Tính đặc hiệu cơ chất
của β-mannosidase có giới hạn β-mannosidase từ Tremella fuciformis thể hiện
hoạt tính lớn nhất với cơ chất là mannobiose và vận tốc thuỷ phân mannooligosaccharide của enzyme này tỉ lệ nghịch với sự tăng chiều dài mạch
cơ chất Trong khi đó, β-mannosidase của Aspergillus niger chỉ xúc tác phân cắt
mannobiose và mannotriose chứ không có tác dụng phân cắt mannan Ngoài ra, β-mannosidase còn có hoạt tính chuyển đổi mannose thành rượu bậc nhất và bậc hai Việc bổ sung β-mannosidase vào chế phẩm mannanase sẽ xúc tác thuỷ phân heteromannan làm tăng các loại đường đơn trong sản phẩm [17,18, 29,33]
1.2.3.3 α-galactosidase (EC 3.2.1.22 hay α-D-galactosid galactohydrolase)
Galactosidase xúc tác thuỷ phân liên kết galactosid đầu của chuỗi galactose có trong các oligosaccharide đơn giản cũng như các polysaccharide phức tạp như: galactomannan và galactoglucomannan α-galactosidase được sản xuất trên qui mô công nghiệp từ nhiều chủng vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc:
Penicillium purpurogenum, Aspergillus niger, Trichoderma reesei Khả năng thuỷ phân của α-galactosidase có nguồn gốc khác nhau là khác nhau Khả năng
thuỷ phân của α-galactosidase từ Penicillium simplicissimum giảm khi chiều dài
chuỗi cơ chất tăng Trong khi đó, tốc độ thuỷ phân của α-alactosidase từ
Aspergillus niger lại tăng khi chiều dài mạch cơ chất tăng [17,33]
Trang 241.3.2.4 β-glucosidase (EC 3.2.1.21 hay β-D-glucosid glucohydrolase)
Glucosidase xúc tác thuỷ phân liên kết β-D-glucoside bắt đầu từ đầu không khử của cellobiose và cellooligosaccharide tạo thành β-D-glucose Cơ chất của β-glucosidase là cellobiose, cellooligosaccharide và cũng có thể là oligosaccharide chứa hỗn hợp mannose và glucose [17, 38, 41]
1.3.2.5 Acetylesterase (acetylgalactoglucomannanesterase)
Acetylesterase xúc tác thuỷ phân liên kết ester của mannan tạo thành axit axetic Acetyl esterase từ các nguồn gốc khác nhau có tính
acetylgalactogluco-đặc hiệu lên các cơ chất là khác nhau Acetyl esterase từ Trichoderma reesei có
khả năng xúc tác thuỷ phân các oligosaccharide ngắn tạo thành axit axetic Trong
khi đó, Acetyl esterase sinh tổng hợp từ Aspergillus oryzae lại có khả năng xúc
tác lên các polysaccharide Tính đặc hiệu của Acetyl esterase lên acetyl mannan cao gấp 10 lần so với acetyl xylan [17,41]
1.2.4 Cơ chế xúc tác của endo-β -mannanase
Endo-β-mannanase (EC 3.2.1.78) xúc tác đặc hiệu lên liên kết β-1,4- mannosidic trong mạch mannan Nó thuỷ phân mannan, glucomannan, galactomannan và galactoglucomannan thành mannobiose, mannotriose, mannotetraose và hỗn hợp các oligosaccharide khác [11,17] Quá trình thuỷ phân
của enzymee phụ thuộc vào cấu tạo cơ chất và lượng sản phẩm tạo thành
Mannanase thuỷ phân tốt LBG, galactomannan chỉ chứa 1 lượng nhỏ galactose, trong phân tử Với Guar gum, galactomannan có tỷ lệ galactose cao hơn, mannanase xúc tác thuỷ phân với vận tốc chậm hơn Các nguyên liệu có ít
tỷ lệ galactose khác nhau thì hoạt độ của mannanase là khác nhau Do đó, mức
Trang 25độ thuỷ phân là khác nhau Cỏ linh lăng (48% galactose) bị thuỷ phân 1%, guar gum (38% galactose) bị thuỷ phân 5%, bột trứng cá đối (28% galactose) bị thuỷ phân 20% [11] Nguyên liệu có tỷ lệ galactose trong galactomannan càng cao, mức độ bị thuỷ phân càng nhỏ
Bên cạnh đó, sản phẩm chính của quá trình thuỷ phân là mannotriose, mannobiose lại kìm hãm hoạt động của mannanase Ở nồng độ 90 nM mannobiose làm hoạt động của mannanase giảm đi 50% [3] Sự kìm hãm này cũng giống như sự kìm hãm của xylotriose, xylobiose đến hoạt tính của xylanase, của cellobiose đến hoạt độ của cellulase
Ngoài ra, một vài endo-mannanase còn có khả năng phân cắt liên kết β-1,4 giữa mannose và glucose trong mạch glucomannan, galactomannan khả năng phân cắt phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ glucose/mannose trong mạch glucomannan, galactomannan Galactomannan của bột củ lan (một loại bột uống thay cà phê)
có tỷ lệ glucose/mannose là 2/8 bị thuỷ phân mạch hơn nhiều so với konjac galactomannan có tỷ lệ glucose/mannose là 66/100
Nhóm bên galactose của galactomannan cũng như nhóm acetyl làm hạn chế sự thuỷ phân mạch chính Khi xử lý LBG và galactomannan konjac bằng
mannanase từ S rolfsii, giá trị km lần lượt là 1,81 g/l và 0,3 g/l Sở dĩ như vậy là
do mạch bên galactose của LBG ngăn cản sự kết hợp giữa LBG và mannanase
Ngoài khả năng thuỷ phân mannan, một vài mannanase còn có khả năng chuyển glycosyl (glycosyltranferase) khi có mặt mannaooligosaccharide [11,18]
Thuỷ phân mannan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzymee: β-1,4-mannanase, β-mannosidase, β-glucosidase, α-galactosidase, Acetylesterase Trong đó, endo-β-1,4-mannanase có vai trò phân cắt mạch chính
Trang 27mannan thành mannobiose, mannotriose và hỗn hợp các oligo-saccharide khác Các sản phẩm này sau đó lại được phân cắt bởi β-D-mannosidase, β-D-glucosidse và acetylesterase [4] Cơ chế xúc tác của endo-β-1,4-mannanase được thể hiện ở hình 1.5 [17]
1.3 Đặc tính và nguồn gốc của mannanase
1.3.1 Đặc tính của mannanase
Mannanase có nguồn gốc khác nhau có đặc tính khác nhau Đặc tính của mannanase từ một số loài nấm mốc, vi khuẩn được giới thiệu dưới đây:
∗ Đặc tính của mannanase sinh tổng hợp từ Sclerotium rolfsii [1,2,3]
- Mannanase là một glycoprotein có khối lượng phân tử khoảng 46.5 +/- 2 kDa
- Điểm đẳng điện pI: 2,75
- pH tối ưu: 3,0 –3,5
- Nhiệt độ tối ưu: 75°C (0,5% LBG, 5 phút, pH 4,5)
- T1/2 (thời gian hoạt độ giảm đi một 1/2)
+ Ở nhiệt độ 50°C, pH =4,5 : 41 ngày + Ở nhiệt độ 60°C, pH =4,5 :15 giờ + Ở nhiệt độ 70°C, pH =4,5 :1,5 ngày
- Đặc hiệu cơ chất: hoạt độ tương đối của mannanase trên các cơ chất khác nhau như sau:
+ LBG (galactomannan) 0,5% :100%
Trang 28+ Guar gum (galactomannan) 0,5% : 44%
+ Konjac mannan (galactomannan) 0,5% :22%
+ Dừa (mannan) 0,5% : 58%
+ α-mannan (nấm men) 0,5% :< 1 + Xylan 0,5% :< 1 + CMC 0,5% : < 1
∗ Đặc tính của mannanase sinh tổng hợp từ Thermotoga neapolitana 5068
- Điểm đẳng điện Pi : 5,1
- pH tối ưu : 7,1
- Nhiệt độ tối ưu : 92°C
∗ Đặc tính của mannanase sinh tổng hợp bởi Vibrio sp Chủng MA 138
- Điểm đẳng điện pI : 3,8
- pH tối ưu : 6,5
- Nhiệt độ tối ưu : 40°C
- Bị kìm hãm bởi các ion: Ag+, Hg2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+, Al3+, Fe3+ và N-bromosuccinimid
∗ Đặc tính của mannanase sinh tổng hợp từ Aspergillus niger [18]
- pH tối ưu : 3
- Nhiệt độ tối ưu : 60°C
- Điểm đẳng điện : pI 3,7
Trang 29- Khối lượng phân tử :40 kDa
∗ Đặc tính của mannanase từ Aspergillus aculeatus [12]
- Trọng lượng phân tử : 45 kDa
- Điểm đẳng điện : pI = 4,5
- pH tối ưu : 5,0
- Nhiệt độ tối ưu : 60 – 70 0C
Nhìn chung, mannanase có pH tối ưu tại vùng axit yếu hoặc trung tính Nhiệt độ tối ưu khá cao, độ bền nhiệt tốt Các enzyme bị kìm hãm bởi các ion kim loại mạnh
1.3.2 Nguồn thu mannanase
Nguồn thu mannanase rất phong phú Mannanase có thể tìm thấy trong hạt của các thực vật trên cạn, trong tảo biển, trong cơ thể động vật không xương sống Tuy nhiên, nguồn thu mannanase đang được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là từ các vi sinh vật
Nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mannanase Nhiều công trình nghiên cứu cho kết luận rằng cả vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sinh tổng hợp mannanase Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
mannanase là: Aeromonas, Bacillus, cellulomannan, entercoccus, casseliflavus, pseudomanas, streptomyces … Các chủng nấm mốc gồm: Aspergillus niger, A.awamori, Fomes cennosus, Penicillim, Sclerotium, Trichoderma Chủng nấm
men: Talacromyces [11,17]
Tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố: thành phần môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH và chủng vi sinh vật mà hoạt độ mannanase thu được là khác nhau Nhưng nhìn
Trang 30chung, các công trình nghiên cứu đều cho kết quả là hoạt độ của mannanase thu được từ nấm mốc cao hơn rất nhiều so với hoạt độ của mannanase thu được từ vi khuẩn Tuy nhiên, vận tốc sinh tổng hợp mannanase từ vi khuẩn cao hơn từ nấm
mốc, thời gian nuôi cấy được rút ngắn Vi khuẩn Bacillus subtilis 168 sinh tổng
hợp mannanase với vận tốc là 4250 UI /ml.giờ và đạt hoạt độ cao nhất là 102 UI/ml sau 1 ngày nuôi cấy Trong khi đó, vận tốc sinh tổng hợp mannanase của
nấm mốc Sclerotium rolfsii CBS 191 – 92 là 3740 UI/ml.giờ và đạt hoạt độ cao
nhất là 786 U/ml sau 8 ngày nuôi cấy trong bình lên men Đây là kết quả nghiên cứu duy nhất cho thấy vi khuẩn sinh tổng hợp mannanase có hoạt độ hoạt độ cao hơn nấm mốc [17,18]
Đặc tính của mannanase phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc vi sinh vật tổng hợp ra nó Nếu vi sinh vật sống trong vùng nhiệt độ cao, pH cao thì mannanase
do nó sinh tổng hợp ra sẽ chịu được nhiệt và chịu pH Nói chung hoạt tính của
mannanase nằm trong khoảng 0,16 UI/giờ.ml (Aspergillus tamani) đến 786 UI/giờ.ml (Sclerotium rolfsii) Nguồn thu mannanase phong phú tạo điều kiện
thuận lợi cho việc nghiên cứu và ứng dụng của mannanase
1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp mannanase ở vi sinh vật
1.4.1 Nguồn cacbon
Các nguồn cacbon đóng vai trò là chất cảm ứng cho sinh tổng hợp mannanase là các loại mannan hay các vật liệu lignocellulose giàu mannan Các giống vi khuẩn đều thể hiện khả năng sinh tổng hợp mannanase cao nhất khi mannan được đưa vào môi trường Một số nấm mốc sinh tổng hợp một lượng lớn mannanase khi phát triển trên vật liệu chứa lignocellulose như nguồn cacbon duy nhất
Trang 31Các loại đường dễ sử dụng như D–Glucose, D–Fructose, D–galactose, L–
sorbose kìm hãm sự sinh tổng hợp mannanase [3] S rolfsii và S coffeicoba sinh
tổng hợp một lượng lớn mannanase khi được nuôi trong môi trường chứa mannan nhưng khi phát triển trên môi trường chứa glucose (chất kìm hãm điển hình), chúng cho hoạt độ enzymee nhỏ hơn 3 – 30 lần [9]
Một số loại đường hoà tan có khối lượng phân tử nhỏ như mannose, mannobiose, mannotriose có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp mannanase ở một
số loài vi sinh vật
Khi có mặt chất cảm ứng, nhiều loại enzymee được tạo thành như xylanase, endoglucanase, β-mannosidase, β-glucosidase, α-galactosidase và acetylesterase Tuỳ thuộc loại chất cảm ứng sử dụng mà tỷ lệ các enzyme thu được khác nhau
1.4.2 Nguồn nitơ
Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong suốt quá trình sống để xây dựng tế bào và tạo các sản phẩm sinh tổng hợp bởi lẽ tất cả thành phần quan trọng của tế bào và nhiều sản phẩm sinh tổng hợp đều có chứa nitơ (protein, axid nucleic, enzyme ) Chính do vậy, trong môi trường nuôi cấy cần thiết có nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hoá được Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để đảm bảo được hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh
tế
1.4.3 pH
Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng vi sinh vật khác nhau cũng rất khác nhau Nhưng nhìn chung, pH thích hợp cho sinh tổng hợp mannanase nằm trong cùng acid yếu đến
Trang 32kiềm yếu [11,17] Đa số nấm mốc thích hợp với môi trường acid yếu và trung tính còn vi khuẩn thích hợp với môi trường trung tính và kiềm yếu
1.4.4 Nhiệt độ
Đa số vi sinh vật sinh tổng hợp mannanase là vi sinh vật ưa nấm Nhiệt độ tối thích cho phát triển và sinh tổng hợp enzyme của chúng nằm trong khoảng 30÷450C Một số loài có nhiệt độ tối thích rất cao như Talaromyces byssochlamydoides (450C); Thermonyces lanugosus (500C), Rhodothermus marinus (610C) Thông thường, các vi sinh vật có nhiệt độ tối thích cho phát triển và sinh tổng hợp enzyme cao thì tính bền nhiệt của enzyme tạo thành cũng cao
1.5.Tinh sạch
Tuỳ từng mục đích sử dụng mà người ta có thể tinh chế enzyme ở các mức
độ tinh sạch khác nhau Dựa vào đặc tính của enzyme, người ta đưa ra các phương pháp tinh chế enzyme như: phuơng pháp kết tủa dựa trên tính hào tan, phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên độ tích điện, phương pháp lọc gel dựa vào khối lượng phân tử và kích thước và phương pháp sắc ký ái lực dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu của enzyme Hiện nay, việc tách tinh chế enzyme được tiến hành trên sự kết hợp của nhiều phương pháp
Trên cơ sở của các phương pháp, nhiều công trình nghiên cứu về qui trình tinh sạch endo-beta-mannanase của vi sinh vật đã được công bố trên thế giới Mannanase sau khi tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với mannanase thô Qui trình tinh sạch mannanase phụ thuộc vào nguồn gốc, phụ thuộc vào enzyme là nội bào hay ngoại bào, nhưng đều dựa trên qui trình chung
Trang 33kết tủa muối và chạy sắc ký Để thu dịch mannanase tinh khiết, người ta tủa protein trong dịch enzyme thô bằng dung dịch muối (NH4)2SO4 [16,26]
Sau khi loại muối bằng phương pháp thẩm tích, dịch enzyme được chạy qua cột sắc ký ái lực và trao đổi ion Li và cộng sự đã dùng cột trao đổi anion DEAE-cellulose DE22 để tinh sạch endo-beta-mannanase từ Bacillus substilis
Enzyme sau tinh sạch có độ tinh sạch gấp 45,5 lần so với enzyme thô và hiệu suất thu hồi là 5,9% [26]
Cũng trên cơ sở các phương pháp đó, Bingze Xu và cộng sự đã tiến hành
tinh chế β-mannanase từ Mytilus edulis trên cột lọc gel Sephadex G-25 và cột
trao đổi anion Mono S (HR10/10) Sau tinh chế, mannanase có độ sạch gấp 65 lần so với chế phẩm thô, hiệu suất thu hồi là 18,7% và kết quả chạy điện di trên SDS-PAGE cho thấy mannanase từ Mutylus edulis có khối lượng phân tử là 41
Aspergillus niger có khối lượng phân tử là 40 kDa [36,37]
Trong khi đó, M.M Zakaria và cộng sự tiến hành tách tinh chế 1,4-mannanase từ Bacillus subtilis KU-1 với sự kết hợp của nhiều phương pháp:
endo-β-kết tủa bằng (NH4)2SO4, phương pháp lọc gel và phương pháp sắc ký trao đổi ion [29] Sau khi kết tủa bằng (NH4)2SO4, mannanase được tiếp tục tinh chế trên lần lượt các cột: DEAE-Toyopeal, Mono Q HR 10/10 sử dụng hệ thống FPLC, DEAE-Toyopeal, Phenyl-Sepharose, Mono Q HR 5/5 sử dụng hệ thống FPLC
Trang 34Mannanase thu được có độ tinh sạch 810 lần, hiệu suất thu hồi 39% Tiến hành
chạy điện di trên SDS-PAGE cho thấy mannanase từ Bacillus subtilis KU-1 có
khối lượng phân tử 66,2 kDa [29] Như vậy có thể nói độ tinh sạch của mannanase tỉ lệ thuận với số lần chạy sắc ký Độ tinh sạch của beta-mannanase chủng aeromonas hydrophila subspecíe anaerogenes F-25 có thể đạt tới 4000 lần Ngoài ra, người ta còn sử dụng cột DEAE-sepharose Khối lượng phân tử của
mannanase từ các chủng khác nhau là khác nhau: từ Aspergillus aculeatus là 45 kDa [12], từ Bacillus subtilis BM9602 là 35 kDa [42]
1.6 Ứng dụng của mannanase
Enzyme thuỷ phân mannan được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp dược, công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, cũng như trong công nghiệp khai thác dầu mỏ và khí đốt
1.6.1 Trong công nghiệp dược
Bã cơm dừa (phần còn lại của dừa sau khi ép tách chất béo) chứa một lượng lớn mannan Sự phân giải bã cơm dừa nhờ mannanase làm tăng giá trị sử dụng của dừa và giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phế phụ phẩm của việc ép dầu dừa Dưới tác dụng của mannanase, mannan được phân cắt thành các mannooligosaccharide ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm với vai trò là giá
thể cho vi sinh vật đường ruột, yếu tố tăng trưởng của Bifidobacterium sp và Lactobacillus sp
Bằng cách sử dụng mannanase sinh tổng hợp bởi A niger, người ta đã thu
được 63-α-D-galactosyl-β-D-mannotriose từ galactomannan tách từ Ceratonia siliqua Mannotriose được sản xuất bằng cách thuỷ phân galactomannan nhờ
mannanase của Penicillium, sau đó mannotriose lại được phân cắt thành
Trang 35mannose và mannobiose nhờ tác dụng của nấm men 62mannobiose được sản xuất bằng cách xử lý galactomannan của gỗ mềm bằng
-α-D-galactosyl-β-D-mannanase từ Tyromyces palustris Endo-β α-D-galactosyl-β-D-mannanase của S rolfsii có khả năng
tạo 62-α-D-galactosyl-β-D-mannobiose bằng cách thuỷ phân galactomannan
Các mannooligosaccharide được sử dụng trong công nghiệp dược làm giá thể cho vi sinh vật đường ruột giúp hệ vi sinh vật có lợi cho tiêu hoá phát triển
ổn định
Trong những năm gần đây, oligosaccharide là mối quan tâm rất lớn của công nghiệp dược và công nghiệp thực phẩm Oligosaccharide, đặc biệt là oligosaccharide dị thể đóng vai trò quan trọng trong glycoprotein và glycolipid Chúng là thành phần của màng tế bào tại đó chúng đóng vài trò là các thụ thể nhận biết hoormon, chất độc, kháng thể, virus và vi khuẩn Các kỹ thuật mới bao gồm cả công nghệ enzyme đang được nghiên cứu theo hướng tổng hợp các chất
có cơ sở là oligosaccharide dùng trong điều trị và chuẩn đoán (tác nhân gây sưng
viêm, phát hiện bệnh, kit thử dùng kháng thể…)
1.6.2.Trong công nghiệp thực phẩm
Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, mannanase được sử dụng trong sản xuất cà phê tan và nước quả các loại
Trong quá trình sản xuất cà phê tan, dịch cà phê được chiết từ hạt cà phê bao gồm arabinogalactan, mannan và cellulose chiếm đến 1/2 khối lượng chất khô của hạt cà phê trong đó mannan chiếm đến 20 ÷ 30% Phần lớn mannan này
có mặt trong dịch chiết cà phê Do khối lượng phân tử lớn, mannan làm dịch chiết cà phê rất nhớt, gây khó khăn và tốn năng lượng cho quá trình lọc và sấy phun Việc sử dụng mannanase trong sản xuất cà phê tan làm giảm độ nhớt của
Trang 36dịch chiết cà phê từ đó làm giảm năng lượng tiêu tốn và hạ giá thành sản phẩm Mặt khác, sản phẩm thuỷ phân mannan là các loại đường và oligosaccharide làm
tăng vị tự nhiên của sản phẩm cà phê tan Trên thực tế, mannanase từ S.rolfsii đã được sử dụng để thuỷ phân dịch chiết cà phê Arabica và Robusta, hai giống cà
phê được trồng phổ biến hiện nay Độ nhớt của dịch chiết giảm đi một nửa trong hai giờ xử lý bằng chế phẩm enzyme thô Cùng với sự giảm độ nhớt, hàm lượng đường khử tăng lên [17,19]
Trong công nghiệp chế biến các loại rau quả, mannanase có tiềm năng ứng dụng rất lớn như pectinase Mannan là thành phần chủ yếu của thành tế quả do vậy nó thường làm giảm năng suất lọc và làm tăng hàm lượng cặn lơ lửng trong sản phẩm nước quả trong Việc xử lý quả bằng mannanase trong quá trình sản xuất một mặt làm tăng năng suất lọc, đảm bảo độ trong của dịch quả, mặt khác làm tăng hiệu suất thu hồi quả
Các phế phụ phẩm của công nghiệp sản xuất cà phê, quả còn chứa rất nhiều mannan là nguồn gốc cacbon rất tốt cho sản xuất mannanase thương mại
Ở Mehico, các nhà khoa học đã nghiên cứu quá trình sản xuất mannanase từ
Tricoderma reesei IMI 192656 nhằm tận dụng, biến 600 tấn phế thải cà phê của nước này thành mannanase [17] Ngoài việc tận dụng bã thải cà phê, các nhà
khoa học tại đại học Autúnoma De Querôtaro sản xuất mannanase từ Aspergillus oryzae trên bã cơm dừa Các chế phẩm mannanase này được sử dụng trong sản xuất cà phê tan và trong sản xuất thức ăn gia súc
1.6.3.Trong khai thác dầu mỏ và khí đốt
Một loại dịch có độ nhớt cao thường được cấp vào đầu mũi khoan Dịch này chứa các hạt nhỏ có nhiệm vụ lấp đầy các kẽ nứt xuất hiện do áp suất thuỷ
Trang 37tĩnh, giữ cho mũi khoan không bị gãy dưới tác dụng của áp suất lơn Các chất có
độ nhớt cao thường được sử dụng là galactomannan Để dầu và khí đốt có thể ra khỏi giếng, độ nhớt này phải được loại bỏ hoặc làm giảm bằng cách oxy hoá hoặc thuỷ phân bằng enzyme Dịch có độ nhớt thấp này sau đó được bơm ra trước khi quá trình dẫn dầu và khí đốt bắt đầu Mannanase được sử dụng để làm giảm độ nhớt của dịch này [17]
1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
Mannanase được sử dụng để phân cắt galactomannan có trong thành phần thức ăn gia súc đặc biệt nhiều trong các cây họ đậu như đậu tương, cỏ linh lăng, thịt guar Thịt guar là phế phụ phẩm của công nghiệp sản xuất guar gum, chứa nhiều axit amin cần thiết cho sự phát triển của động vật Tuy nhiên, galactomannan có trong thịt quả guar lại là tác nhân phản dinh dưỡng : guar gum
có trong thức ăn trương nở lên trong hệ tiêu hoá của động vật, làm tăng độ nhớt của khối thức ăn trong hệ tiêu hoá, do đó làm giảm khả năng tiêu hoá và hấp thụ thức ăn Theo nghiên cứu của các nhà chăn nuôi, chỉ cần 2 –4% galactomannan
có trong thức ăn làm giảm sự tăng trưởng của gà và làm giảm hiệu quả của việc
sử dụng thức ăn Việc xử lý thịt guar gum bằng mannanase loại bỏ tác dụng phản dinh dưỡng của galactomannan, giúp tận dụng nguồn phế thải này của công nghiệp sản xuất guar gum thành nguồn thức ăn cho gia súc có giá trị [17]
Mannanase đã được sản xuất thành chế phẩm thương mại nhằm bổ sung vào phế thải công nghiệp như vỏ đậu tương, bột đậu tương, bã cơm dừa, thịt quả
cọ, thịt quả vừng và thịt quả cải dầu làm thức ăn gia súc Ví dụ chế phẩm có tên
là Hemicell của ChemGen Corporation (Mỹ) được thêm vào thức ăn gia súc làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng lượng sữa đối với bò, giảm lượng mỡ trong
Trang 38Enzyme Development Corporation cũng đã đưa ra thị trường chế phẩm
Tricoderma longibrachiatum
1.6.5 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Mannanase có thể sử dụng kết hợp với xylanase nhằm tẩy trắng lớp vỏ gỗ mềm Mục tiêu chính của quá trình tẩy trắng bằng enzyme này là giảm lượng Clo
sử dụng trong phương pháp hoá học Thêm vào đó, việc sử dụng enzyme trong làm trắng giấy và bột giấy lại cho chất lượng giấy rất tốt, điều này là chìa khoá cho sự phát triển công đoạn làm trắng giấy hoàn toàn không dùng Clo Việc sử dụng hemicellulase là một phương pháp làm trắng gián tiếp, cho cấu trúc các sợi
gỗ chặt chẽ hơn so với sử dụng Clo, chất hoá học Tuy nhiên, hiệu quả làm trắng giấy phụ thuộc nhiều vào phương pháp nấu và quy trình làm trắng được sử dụng
Mannanase và xylanase sinh tổng hợp bởi S rolfsii có khả năng làm trắng giấy
và bột giấy gỗ mềm
Cùng với xylanase, mannanase được sử dụng để loại hemicellulose ở bột giấy không tan Bột giấy không tan được sử dụng để làm sợi visco, ether và ester cellulose Trong quá trình tạo sợi visco, một lượng lớn hemicellulose có thể ảnh hưởng đến độ trơn bóng và độ bền của sợi Trong công đoạn axetat hoá, hàm lượng hemicellulose ảnh hưởng đến độ hoà tan của celluloaxetat đặc biệt một lượng nhỏ galactomannan ảnh hưởng xấu đến độ trương nở của sợi axetat
Mannanase từ S rolfsii và xylanase từ Thermomyces lanugiosus hoạt động kết
hợp trên bột giấy giúp loại thêm 50% mannan và 11% xylan ra khỏi bột giấy so với sử dụng riêng rẽ hai enzyme này Việc loại mannan và xylan sẽ tốt hơn nếu
sử dụng thêm endoglucanase
Trang 39Như vậy, mannanase cú tiềm năng ứng dụng rất to lớn và rộng rói Trong phạm vi nghiờn cứu này, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt ứng dụng của mannanase thu được trong canh trường vi sinh vật vào việc thuỷ phõn bó cơm dừa, một loại phế phụ phẩm dồi dào ở miền Nam Việt nam nhằm bổ sung vào thức ăn gia sỳc
và tận dụng phế phẩm của ngành sản xuất dầu dừa
1.7 Mannanase và công nghệ gen
Các nghiên cứu về gene mã hóa mannanase từ vi khuẩn trên thế giới chủ yếu tập trung vào các vi khuẩn chịu nhiệt Các vi khuẩn này sinh tổng hợp mannanase chịu nhiệt, sau khi biểu hiện trên đối tượng thích hợp sẽ tổng hợp enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao, chịu được nhiệt độ cao, thích hợp cho xử lý làm trắng trong sản xuất giấy, ngành công nghiệp chủ yếu ứng dụng mannanase hiện nay
1.7.1 Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa mannanase
Từ các trình tự gene mã hóa mannanase đã được công bố có thể thấy rằng kích thước đoạn gene biến đổi từ 1 kb đến khoảng 4.5 kb (Bảng 1.2) Quá trình tách dòng chủ yếu được thực hiện bởi kỹ thuật PCR (hoặc RT-PCR) với mồi thiết
kế đặc hiệu cho từng chủng hoặc cắt ngẫu nhiên DNA genome vi khuẩn rồi sàng lọc đoạn DNA chứa gene mã hóa mannanase
Các trình tự gene mã hóa mannanase của vi khuẩn có sự tương đồng giữa các mannanase thuộc nhóm GH5 hay GH26 Ngay các mannanase thuộc hai nhóm cũng có sự tương đồng Trong gene mã hóa mannanase vi khuẩn thường chứa trình tự Shine-Dalgarno GAGGAGG hoặc trình tự tương đương như trường hợp Bacillus subtilis NM39 (AGGAGG), Bacillus stearothermophilus
(GGAGGAG) và Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum (AGGCGG)
Đây là trình tự để ribosome liên kết vào gene và phiên mã Ngoài ra ở đầu hoặc
Trang 40cuối gene mannanase còn mang vùng trình tự giàu -AT- Nhiều nghiên cứu chỉ ra ràng các gene mã hóa mannanase thường có vị trí cắt giới hạn với EcoRI Vị trí này thường phân chia phân tử enzyme thành hai domain, một có hoạt động xúc tác thủy phân mannanase (có thể là domain đầu Nitơ hoặc đầu Carboxy) và một domain không xúc tác [9,12,28]
Năm 1998, Nathalie Ethier và cộng sự đã thiết lập ngân hàng gene của
Bacillus stearothermophilus với khoảng 10 000 khuẩn lạc E.coli để sàng lọc
chọn khuẩn lạc có hoạt tính mannanase dựa trên vòng thủy phân cơ chất đặc hiệu Tám khuẩn lạc có hoạt tính được nghiên cứu sâu hơn Ba chủng tái tổ hợp
có đoạn chèn DNA kích thước 7.6 kb, bốnchủng có đoạn chèn 10.7 kb và một chủng có đoạn chèn 16.9 kb Cắt bằng EcoRI tất cả các đoạn chèn được các đoạn cắt kích thước 1.2 và 6.4 kb Tiếp tục cắt kiểm tra với BamHI, HindIII và EcoRI riêng lẻ hặc phối hợp Tiến hành giải trình tự vùng 1.7 kb mang đoạn DNA 1.2
kb có trình tự ORF của đoạn chèn 7.6 kb Trình tự axit amin tương ứng của vùng này phù hợp với protein có hoạt tính mannanase tuy nhiên trình tự gene mã hóa protein lại chưa có codon kết thúc và tiếp giáp với vị trí cắt EcoRI trên pUC18 Tiếp tục giải trình tự nucleotide của đoạn 16.9 kb (đây là đoạn kéo dài của đoạn 7.6 kb có vị trí cắt với EcoRI) để xác định trình tự còn lại của đoạn gene Đoạn ORF tương ứng với codon khởi đầu ATG tại vị trí 351 và codon kết thúc TAA tai
vị trí 2433 Trình tự nucleotide của gene manF mã hóa β-mannanase, protein gồm 694 axit amin Đầu Nitơ của mannanase B.stearothermophilus gồm các gốc
axit amin ở vị trí 33 đến 47 (KTKREPATPTKDNEF) Trình tự 29 axit amin tại
đầu Nitơ mang đặc điểm của trình tự peptide đặc trưng cho vi khuẩn có chứa vùng cơ bản, tiếp theo là vùng kỵ nước và vùng cực Q tại các gốc axit amin 4-8 trước vị trí cắt EcoRI Các axit amin 30-32 (V-H-A) giống dấu hiệu nhận biết
peptidase Trình tự 5′ GGAGGAG 3′ (trình tự liên kết ribosome) nằm ở trước