Nghiên ứu phương pháp xá định đồng thời một số độ tố nhóm pyrrolizidine alkaloids trong thự phẩm hứ năng từ thảo dượ

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI H C BÁCH KHOA HÀ N IỌỘLUẬN VĂN THẠC SĨKHOA HỌC Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số độc tố nhóm Pyr olizidine Alkaloids rtrong thực phẩm chức năng từ thảo

TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời

NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG Ngành Công nghệ ực phẩm th

Giảng viên hướng dẫn: 1 PGS.TS Cung Thị Tố Qu nh ỳ

2 TS Trần Cao Sơn

HÀ NỘI, 2020

TRƯỜ NG Đ Ạ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời

NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG Ngành Công nghệ ực phẩm th

Giả ng viên hư ớ ng dẫn: 1 PGS.TS Cung Thị Tố Qu nh ỳ

C Ộ NG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độ ậ c l p – T – H ự do ạ nh phúc

B Ả N XÁC NHẬN CHỈNH SỬ A LU ẬN VĂN THẠC SĨ

H ọ và tên tác giả ậ lu n văn : Nguyễn Xuân Trư ờng

Đề tài luận văn: Nghiên cứu phương pháp xác đ nh đ ị ồ ng th i m t s c ờ ộ ố độ

t ố nhóm Pyrrolizidine alkaloids trong thực phẩm chứ c năng t ừ thả o dư ợ c

Chuyên ngành: Công nghệ ự th c phẩm

Mã số SV: CB170131

Tác gi ả , Ngư i hư ờ ớ ng dẫn khoa học và Hộ ồ i đ ng chấ m lu ận văn xác nh ậ n tác gi ả đã s ử a ch ữ a, bổ sung lu n văn theo biên b n h p H ậ ả ọ ộ ồ i đ ng ngày 30/6/2020

v ớ i các nội dung sau:

- B ổ sung Danh mục chữ viết tắt;

- B ổ sung kết quả khảo sát thông số nguồn ESI(+) trong mục kết luận;

- S ửa lỗi chính tả

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Nguyễn Xuân Trường

T CHỦ ỊCH HỘ Ồ I Đ NG

M ẫ u 1c

L Ờ I CẢM ƠN

Qua thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện luận văn dướ ự i s chỉ ẫ d n của PGS.TS Cung Th ị ố T Qu ỳ nh và TS Tr ần Cao Sơn, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắ ớ c t i:

PGS.TS Cung Thị T ố Quỳnh - bộ môn Quản lý chất lượ ng Vi n Công ngh ệ ệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đạ ọ i h c Bách Khoa Hà N i và TS Tr n ộ ầ Cao Sơn – Phó Viện trưở ng Vi n Ki m nghi m an toàn v sinh th c ph m Qu c ệ ể ệ ệ ự ẩ ố gia đã dành nhi ề u th i gian và tâm huy ờ ế t hư ớ ng d n tôi th c hiệ ề ẫ ự n đ tài này

Ban Lãnh đạ o Cụ c An toàn th c ph m và Ban Lãnh đạ ự ẩ o Vi n Ki m nghi m ệ ể ệ

an toàn vệ sinh th ự c phẩm Quố c gia đã t o đi ạ ề u ki ệ n thuậ ợi nhấ n l t giúp đ ỡ tôi đ ể hoàn thành nhiệm vụ nâng cao kiên th c trong quá trình đào t o ứ ạ

C ác thầy, cô Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩ m, Trư ờ ng

Đạ ọ i h c Bách Khoa Hà N i đã gi ng d y và giúp đ tôi trong quá trình h c t p và ộ ả ạ ỡ ọ ậ nghiên cứu tạ i Trư ờ ng

T ấ t cả anh chị em đồng nghiệp phòng Quản lý tiêu chuẩn và kiểm nghiệm,

C ụ c An toàn thực phầm đã động viên, chia sẽ ới tôi về những khó khăn trong v công vi ệ c trong th i gian tôi tham gia h c t ờ ọ ậ p và nghiên c ứ u

Các anh chị ỹ k thu ậ t viên tại Việ Kiểm nghiệ n m an toàn v sinh thực phẩm ệ Quố c gia đã h ỗ ợ tr , giúp đ tôi trong quá trình thực hiện tại phòng thử ỡ nghi m ệ

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cả m ơn gia đình, b n bè đã quan tâm cổ ạ

độ ng cho tôi trong quá trình h c t p và th c hi n lu n văn ọ ậ ự ệ ậ

Trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễ n Xuân Trư ờ ng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Pyrrolizidine alkaloids 2

1.1.1 Khái quát về Pyrrolizidine alkaloids 2

1.1.2 Nguồn thực vật chứa độc tố Pyrrolizidine alkaloids 5

1.1.3 Độc tính của PAs 7

1.1.4 Quy định hiện hành đối với PAs 8

1.2 Phương pháp xác định độc tố PAs 8

1.2.1 Phương pháp chiết 8

1.2.2 Phương pháp làm sạch 10

1.2.3 Phương pháp xác định 11

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 14

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 14

2.2.2 Dung môi, hóa chất 15

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định độc tố PAs bằng LC-MS/MS 16

2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 16

2.3.3 Thẩm định phương pháp 17

2.3.4 Đánh giá hàm lượng độc tố PAs trên một số đối tượng TPBVSK có nguồn gốc thảo dược trên thị trường 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 17

2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 18

2.4.3 Phương pháp thẩm định 18

2.4.4 Phương pháp lấy mẫu 19

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số PAs trong TPBVSK 21

3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 21

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 26

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nền 32

3.2 Thẩm định phương pháp 33

3.2.1 Độ đặc hiệu 33

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 34

3.2.3 Khoảng tuyến tính 36

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 38

3.2.5 Độ lặp lại khác ngày 40

3.3 Ứng dụng phương pháp để phân tích một số sản phẩm TPBVSK có nguồn gốc thảo dược trên thị trường 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thực vật chứa PAs gây độc trên người và động vật 5

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sử dụng cột SPE SCX 11

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS 13

Bảng 2.1.Các độc tố PAs được sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn trung gian 16

Bảng 2.3 Pha dung dịch chuẩn làm việc của PAs 16

Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích PAs 21

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS để phân tích các PAs 22

Bảng 3.3 Điều kiện gradient 24

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nền mẫu 32

Bảng 3.5 Tỷ lệ ion của các PAs 33

Bảng 3.6 Độ lặp lại và độ thu hồi của Echimidine 38

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ thu hồi của Intermidine 39

Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ thu hồi của Jacobine 39

Bảng 3.9 Độ lặp lại và độ thu hồi của Senecionine 39

Bảng 3.10 Độ lặp lại khác ngày 40

Bảng 3.11 Kết quả phân tích mẫu thực tế 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của PAs và các dạng khác nhau của nó 2

Hình 1.2 Các nhóm PAs phân loại theo base necine 3

Hình 1.3 Cấu trúc của một số acid necic điển hình 3

Hình 1.4 Một số PAs phổ biến 4

Hình 3.1 Sắc đồ Ichimidine và Jacobine sử dụng cột C18 và cột TSK Gel 23

Hình 3.2 Sắc đồ tổng các PAs 24

Hình 3.3 Sắc đồ MRM của từng PAs 25

Hình 3.4 Biểu đồ kết quả khảo sát dung môi chiết 27

Hình 3.5 Biểu đồ kết quả khảo sát nhiệt độ 28

Hình 3.6 Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ acid 29

Hình 3.7 Biểu đồ kết quả khảo sát cột SPE 30

Hình 3.10 Đường chuẩn trên nền dung môi và nền mẫu thực 32

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn PAs 34

Hình 3.12 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,3 µg/kg 35

Hình 3.13 Đường chuẩn phân tích Echimidine 36

Hình 3.14 Đường chuẩn phân tích Intermedine 37

Hình 3.15 Đường chuẩn phân tích Jacobine 37

Hình 3.16 Đường chuẩn phân tích Senecionine 38

MỞ ĐẦU

Hiện nay, xu hướng trong việc sử dụng các sản phẩm thực phẩm bảo

vệ sức khỏe (TPBVSK) từ nguồn gốc thảo dược, chủ yếu xuất phát từ các bài thuốc y học cổ truyền đang ngày càng phổ biến Phần lớn các sản phẩm TPBVSK này đều chưa được kiểm chứng về một số độc tính tiềm ẩn Hơn nữa, phần lớn các thảo dược được sử dụng trong các sản phẩm này không được truy xuất rõ ràng về nguồn gốc xuất xứ Nhiều loại thảo dược có chứa các độc tố tự nhiên có thể gây hại đến sức khỏe người sử dụng

Một trong số các độc tố tự nhiên đang ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên giới đó là các alkaloid nhân pyrrolizidine (Pyrrolizidine alkaloids - PAs) PAs là một nhóm các hợp chất có độc tính, được sinh ra bởi một số loài thực vật do đó được xếp vào nhóm độc tố thực vật (phytotoxin) Con người có thể bị ngộ độc khi sử dụng các loài thực vật

có chứa độc tố PAs như trà thảo dược hoặc các loại thuốc truyền thống, tiêu thụ ngũ cốc hoặc các sản phẩm ngũ cốc bị nhiễm độc tố

Ngày nay, hơn 6.000 loài thực vật (chiếm khoảng 3% thực vật trên toàn thế giới) được biết có khả sinh tổng hợp PAs, chủ yếu các loài thực vật thuộc họ Mồ hôi (Boraginaceae), họ Cúc (Asteraceae) và họ Đậu (Fabaceae) Trong đó, khoảng 600 loại PAs đã được xác định và mô tả có khả năng gây nhiễm độc cấp tính và mãn tính trên gan, độc tính trên gen và nhiễm sắc thể, đôi khi có liên quan đến sự hình thanh một số khối u phát triển trên da, bàng quang, não, tủy sống, tụy và đường tiêu hóa

Giới hạn tối đa cho phép của các PAs trong thực phẩm đã được thiết lập ở một số nước trên thế giới Tuy nhiên tại Việt Nam mới chỉ ban hành TCVN 12053:2017 về quy phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa

và giảm thiểu nhiễm pyrrolizidine alkaloid trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Hiện nay, chưa có phương pháp chính thức để kiểm nghiệm độc

tố PAs trong thực phẩm thực phẩm nói chung và các thảo dược nói riêng

Do đó, đề tài “Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số Pyrrolizidine alkaloids trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược” đã được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số độc tố PAs trong thảo dược bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ

2 Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá mức nhiễm độc tố PAs trong một số loại TPBVSK có nguồn gốc thảo dược trên thị trường

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Pyrrolizidine alkaloids

1.1.1 Khái quát về Pyrrolizidine alkaloids

Pyrrolizidine alkaloids (PAs) là nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp

có mặt trong khoảng 3% thực vật trên toàn thế giới chủ yếu từ các họ thực , vật thuộc họ Mồ hôi (Boraginaceae), ví dụ Heliotropium spp., họ Cúc (Asteraceae), ví dụ Senecio spp và họ Đậu (Fabaceae), ví dụ Crotalariaspp

Về mặt cấu tạo hóa học, PAs là một nhóm các alkaloid có nguồn gốc

từ ornithine được phân bố trong 1 số loài thực vật có hoa Chúng hiếm khi

ở dạng tự do như một base pyrrolizidine, thay vào đó được tìm thấy ở dạng ester (monoester, diester hoặc macrocyclic diesters) hoặc pyrrolizidine alkaloids N–oxides (PANOs) [18]

Hình 1.1 Cấu trúc của PAs và các dạng khác nhau của nó

Nhân pyrrolizidine, bao gồm hai vòng năm cạnh bão hòa với một nguyên tử nitơ giữa chúng, đôi khi có một liên kết đôi ở vị trí 1,2, thường dẫn đến độc tính tăng cường Chúng cũng có thể có một nhóm alcohol tại C-1, một nhóm alcol ở vị trí C-7 (di-hydroxylated) và trong 1 số ít trường hợp nhóm alcohol thứ ba xuất hiện ở vị trí C-2 hoặc C-6 (tri-hydroxylated) [18]

Theo cấu trúc của base necine, PAs có thể được phân loại thành bốn nhóm: Retronecine, Heliotridine, Otonecine và Platynecine (Hình 1.2) trong đó, duy chỉ có platynecine được bão hòa ở vị trí C-1,2 Ngoài ra, từ

đặc điểm cấu trúc, có thể thấy otonecine là khác biệt nhất trong tất cả các

loại, vì nó bị oxy hóa ở C-8 và có một vòng đơn Retronecine và

Heliotridine là các đồng phân quang học không đối quang, với định hướng

khác biệt ở vị trí C-7 [18]

Hình 1.2 Các nhóm PAs phân loại theo base necine Các base necine có thể được ester hóa bởi các acid béo đơn giản

(như acid angelic, acid tiglic), các monocarboxylic ở C-7 (acid trachelantic

và viridifloric) hoặc acid dicarboxylic ở C-10 (acid senecic và acid

isatinecic) (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc của một số acid necic điển hình

Sự kết hợp của các cấu trúc nêu trên dẫn đến các dạng mono-ester

hoặc di-ester Trong các acid monocarboxylic, đặc trưng của họ

Boraginaceae, một số có nhóm hydroxyl ở C-9 được ester hóa bằng acid hydroxyisopropylbutanoic, chẳng hạn như intermedine (Hình 1.4A) Trong trường hợp có một acid necic thứ hai, nó thường xảy ra trong nhóm hydroxyl của C-7, dưới dạng acid angelic hoặc acid tiglic, như trong echimidin (Hình 1.4C) Các thụ thể macrocyclic, đặc trưng từ họ Asteraceae, cũng đã được mô tả, tương ứng với C-7 và C-9 được ester hóa bằng acid dicarboxylic, chẳng hạn như jacobine (Hình 1.4B) hay seneconine (Hình 1.4D) [18] Đây là các PAs được quan tâm nhất hiện nay

C Intermedine

D Senecionine

Hình 1.4 Một số PAs phổ biến Cấu trúc của một PA bất kì có thể dẫn đến độc tính là [31]:

- Sự có mặt của liên kết đôi ở vị trí C1-2 trong base necine;

- Sự có mặt của một hoặc hai nhóm hydroxyl ở vị trí C-7 và C-9 trong base necine;

- Ester hóa của ít nhất một trong các nhóm hydroxyl trong base necine;

- Ester hóa của nhóm hydroxyl với acid monocarboxylic hoặc acid dicarboxylic

1.1.2 Nguồn thực vật chứa độc tố Pyrrolizidine alkaloids

Mặc dù hơn 6000 loài thực vật được báo cáo có chứa PAs, nhưng gây trực tiếp ngộ độc ở người và động vật thường chỉ liên quan đến một số loài nhất định Cụ thể, các loài thực vật được báo cáo là có liên quan đến ngộ độc ở người thường gặp ở 3 họ thực vật gồm họ Cúc, họ Mồ hôi và họ Đậu, được nêu chi tiết trong bảng 1.1 [2]

Bảng 1.1 Các loài thực vật chứa PAs gây độc trên người và động vật

Asteraceae Eupatorium cannabinum L.; Adenostyles alliariae (Gouan)Kern; Emilia

sonchifolia(L.) DC.;

Petasites hybridus (L.) PH Gaertn., B Mey & Scherb.;

Petasites spurius (Retz) RCHB; S jacobaea ; Senecio vulgaris L.; T

farfara; Senecio nemorensis L.; Ageratum conyzoides L.; Chromolaena odorata (L.) R M King & H.Rob.; Eupatorium chinense L ; Eupatorium fortunei Turcz.; Eupatorium japonicum Thunberg ex Murray.; Cacalia hastata L.; Cacalia hupehensis Hand-Mazz.; Crassocephalum

crepidioides (Benth.) S Moore; Farfugium japonicum (L.) Kitam.; Gynura bicolor (Roxb ex Willd.) DC.; Gynura divaricata (L.) DC.; Gynura segetum; Ligularia dentata (A.Gray) Hara; Petasites japonicus (Siebold & Zucc.) Maxim.; Senecio argunensis Turcz.; Senecio integrifolius (L.) Clairv.; Senecio scandens Buch.-Ham Ex D

Don; Syneilesis aconitifolia (Bunge) Maxim.; Matricaria chamomilla L.; Gynura pseudochina (L.) DC.; Gynura japonica (Thunb.) Juel; Packera candidissima (Greene) W A Weber; Solanecio

mannii (Hook.f.) C Jeffrey; Solanecio tuberosus (Sch Bip ex A Rich.)

C Jeffrey var tuberosus; Bidens pilosa L.; Senecio longilobus Benth Boraginaceae Alkanna tinctoria (L.) Tausch; Anchusa officinalis L.; Borago

officinalis L.; Cynoglossum officinale L.; Heliotropium arborescens L.; Lithospermum officinale L.; Myosotis scorpioides L.; Symphytum asperum Lepech; Symphytum caucasicum Bieb.; Symphytum officinale L.; Symphytum tuberosum L.; Symphytum uplandicum × Nyman; Arnebia euchroma (Royle) I M Johnst.; Cordia myxa L.; Cynoglossum amabile Stapf & J R Drumm; Cynoglossum

lanceolatum Forssk.; Cynoglossum zeylanicum (Vahl) Brand; Cynoglossum grande Dougl ex Lehm.; Cynoglossum virginianum L.; Arnebia benthamii (Wall ex G.Don.) Johnst.; Heliotropium indicum Lappula intermedia (Ledeb.) ;

Popov; Lithospermum erythrorhizon Siebold & Zucc

Fabaceae Crotalaria albida Roth; Crotalaria assamica Benth.; Crotalaria

pallida Aiton; Crotalaria sessiliflora L.; Crotalaria tetragona Andrews

Trong số này, một số loài thực vật sinh sống phổ biến ở Việt Nam gồm:

- Senecico jacobaea: Cỏ lưỡi chó (Cúc dại), họ Cúc Asteraceae

- Senecio vulgaris: Cúc bạc, họ Cúc Asteraceae

- Tussilago farfara: Khoản đông hoa, họ Cúc Asteraceae

- Crotalaria sessiliflora: Lục lạc lá ổi tròn/ Muồng lá ổi, họ Đậu Fabaceae

- Crotalaria pallida: Lục lạc 3 lá tròn/ Muồng lá tròn, họ Đậu Fabaceae

- Crotalaria tetragona : Lục lạc 4 cạnh, họ Đậu Fabaceae

- Crotalaria albida : Lục lạc sợi/ Muồng sợi, họ Đậu Fabaceae

- Crotalaria assamica : Lục lạc lá ổi dài/ Muồng 1 lá, họ Đậu Fabaceae

- Borago officinalis: Lưu ly, họ Mồ hôi Boraginacea

- Heliotropium indicum: Vòi voi, họ Mồ hôi Boraginacea

- Symphytum officinalis: Liên mộc/ Hoa chuông, họ Mồ hôi Boraginacea

- Lithospermum erythrorhizon: Tử thảo họ Mồ hôi Boraginacea ,

Hàm lượng PAs trong thực vật thường thay đổi từ 100 mg/kg đến 40.000 mg/kg (tính theo chất khô) Hàm lượng PAs cao nhất được ghi nhận

là 180.000 mg/kg ở loài Senecio riddelli [14] Cả thành phần và nồng độ của PAs có thể dao động theo điều kiện khí hậu và môi trường, độ tuổi và

sự đa dạng của cây Hơn nữa, các bộ phận khác nhau của thực vật có hàm lượng PAs khác nhau, một số trong đó có thể có mặt chủ yếu ở dạng N-oxide Ví dụ, trong loài Senecio vulgaris và Senecio jacaobaea, các bộ phận được xếp hạng theo nồng độ giảm dần của PAs là: hoa và hạt > lá > thân cây > rễ Các nhà nghiên cứu khác báo cáo rằng rễ của Symphytum officinale tập trung nhiều PAs hơn (từ 1.400 đến 8.300 mg /kg) so với lá (từ

15 đến 55 mg/kg) [26]

1.1.3 Độc tính của PAs

1.1.3.1 Nhiễm độc gan

Gan là cơ quan chính bị ảnh hưởng bởi các độc tố PAs, chủ yếu là do hoạt động sinh học xảy ra trong cơ quan này Dấu hiệu ngộ độc có thể bao gồm nôn mửa, tổn thương gan và tiêu chảy kèm chảy máu [8]

Ngộ độc PAs trên gan có thể xảy ra cấp tính hoặc mãn tính, với các triệu chứng khác nhau Nhiễm độc cấp tính có thể gây ra hoại tử xuất huyết, gan to và cổ trướng; tắc nghẽn tĩnh mạch gan, dẫn đến tổn thương gan và rối loạn chức năng tế bào nhu mô Nhiễm độc mãn tính có thể gây ra hoại tử tế bào gan, xơ gan và sự gia tăng của biểu mô ống mật; suy gan và

tử vong là mức độ độc tính cao nhất [28]

1.1.3.2 Độc tính gen và ung thư

Một số nghiên cứu đã chứng minh PAs có khả năng gây độc tính gen trên động vật thí nghiệm, có thể dẫn đến sự hình thành và phát triển các khối u Năm 1954, Schoental và cộng sự phát hiện ra rằng retrorsine có khả năng gây ra các khối u trong các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật [9] Các khối u phát triển ở gan, phổi, bàng quang, da, não, tủy sống, tụy và đường tiêu hóa Các PAs gây ra tác dụng này thuộc nhóm heliotridine, retronecine và otonecine

Hơn nữa, các PAs có liên quan đến ung thư da, vì chúng có thể dẫn đến tăng nhạy cảm ánh sáng ở động vật Phylloerythrin, một porphyrin có nguồn gốc từ sự phá hủy chất diệp lục do vi sinh vật có trong đường tiêu hóa, đi qua tuần hoàn và được bài tiết qua gan vào mật Tuy nhiên, gan bị

hư hại do PAs không thể loại bỏ phylloerythrin, dẫn đến sự tích tụ của nó trong máu và da Phylloerythrin tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, các chất chuyển hóa của nó có thể gây ra oxy hóa và peroxid hóa pilid trong các mô

da và cuối cùng kích hoạt sự hình thành các khối u [14]

Hiện nay, chưa có bất kỳ báo cáo nào về trường hợp ung thư ở người

do hậu quả trực tiếp của việc tiêu thụ thực phẩm nhiễm PAs Tuy nhiên, với các nghiên cứu trên các loài gặm nhấm, như việc gây ra các khối u gan thông qua sự tác động trên DNA, chương trình độc học quốc gia ở Hoa Kỳ

đã tuyên bố một số PAs được “dự đoán là chất gây ung thư trên người” [30]

1.1.3.3 Các loại độc tính khác

Các PAs có thể gây các tổn thương khác trên hệ tuần hoàn (như suy tim sung huyết), hệ thần kinh (như chóng mặt, đau đầu, có thể dẫn đến mê sảng và mất ý thức) Ngoài ra, PAs có thể vượt qua nhau thai và gây độc cho gan ở trẻ sơ sinh của một người phụ nữ tiêu thụ trà thảo dược được chế biến từ loài Tussilago farfara L [8],[31]

1.1.4 Quy định hiện hành đối với PAs

Với sự tiêu thụ ngày càng tăng của các loại thuốc thảo dược, ngộ độc PAs đã bắt đầu được coi là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng Do đó, một

số nước đã thiết lập các quy định về kiểm soát hàm lượng PAs trong thực phẩm Tại Hoa Kỳ, FDA đã ra lệnh cấm tất cả các chế phẩm từ cây liên mộc (Symphytum officinale L Boraginaceae) [30]

Tại Liên minh châu Âu, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA)

đã khuyến nghị sử dụng tối đa 0,35 µg PAs /ngày đối với người có trọng lượng 50 kg [15] Áo đã loại trừ tất cả các sản phẩm có PAs từ thị trường

và ở Hà Lan, tất cả thực phẩm, chế phẩm thảo dược và chiết xuất thực vật chứa PAs được giới hạn ở 1 µg/L trong sản phẩm [32]

Tại Việt Nam, mới chỉ ban hành Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12053:2017 (CAC/RCP 74-2014) của Bộ Khoa học và Công nghệ về quy phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa và giảm thiểu nhiễm pyrrolizidine alkaloid trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, chưa có quy định cụ thể nào giới hạn nồng độ pyrrolizidine trong thực phẩm [1]

1.2 Phương pháp xác định độc tố PAs

Hiện nay, có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để xác định PAs trong thảo dược như các phương pháp sàng lọc (ELISA, sắc ký lớp mỏng) hay các phương pháp phân tính khẳng định như sắc ký khí; phương pháp sắc ký lỏng với detector UV, DAD, FLD và MS Bất kể phương pháp nào được lựa chọn, việc phân tích độc tố PAs trong mẫu thường gồm 3 giai đoạn: chiết, làm sạch và xác định độc tố (định tính, định lượng) [12]

1.2.1 Phương pháp chiết

Mục đích của việc chiết là thu được càng nhiều các PAs từ nền mẫu càng tốt vào dung môi phù hợp cho kỹ thuật làm sạch và xác định sau đó Việc chiết dung môi là sự chuyển các chất từ pha rắn vào pha lỏng do đó còn được gọi là chiết rắn lỏng

PAs là các hợp chất hữu cơ có bản chất tương đối phân cực Do đó chúng hòa tan khá tốt trong dung môi hữu cơ phân cực như methanol, acetonitrile Cả dạng base tự do và N-oxid đều hòa tan dễ dàng trong methanol và cả trong acid loãng Đây là những dung môi được sử dụng nhiều nhất

1.2.1.1 Chiết bằng dung môi hữu cơ

Nguyên liệu thực vật thường được ngâm trong methanol, đun sôi hoặc trộn đồng nhất bằng cách sử dụng máy siêu âm [12] MeOH có thể được acid hóa (ví dụ với acid tartaric), nhưng những ưu điểm của điều này

chiết xuất các base PAs tự do từ nguyên liệu thực vật, nhưng hiện nay việc

sử dụng dung môi clor hóa gây ra những lo ngại về ô nhiễm môi trường cũng như khả năng xảy ra phản ứng của hydrochloric dư với các nhóm PAs epoxide [10],[17]

Lebanda và cộng sự [22] so sánh một số dung môi hữu cơ để chiết xuất senkirkine và senecionine từ loài Tussilago spp Hiệu suất cao nhất thu được khi chiết nóng với tỉ lệ hệ dung môi methanol và dung dịch acid citric

ở pH = 2 (50:50) Quá trình chiết xuất trong 15 phút Sau đó cần khuấy ở nhiệt độ phòng trong nước ở pH 7 và chiết Soxhlet với methanol trong 48h Tuy nhiên quá trình chiết Soxhlet có thể làm mất PAs đồng thời tăng thời gian quá trình chiết

Bên cạnh đó việc chiết xuất bằng MeOH nóng (100°C) trong một thời gian ngắn (2 h) cũng cho hiệu suất tốt Hiệu suất cao nhất của các alkaloid thu được khi chiết bằng methanol nóng chứa 1% acid tartaric, nhưng cần loại bỏ acid trước khi phân tích bằng HPLC [24]

1.2.1.2 Chiết bằng acid loãng

Nghiên cứu của Crew và cộng sự (2010) [12] chỉ ra rằng các nguyên liệu thực vật được chiết bằng H2SO4 hoặc HCl loãng đều cho hiệu suất cao

Hösch và cộng sự đã thực hiện thí nghiệm so sánh các quy trình chiết khác nhau của loài Senecio leucophyllus sấy khô trong không khí Phương pháp 1: 4 g mẫu thử với 3 x 80 mL HCl 2.5%; phương pháp 2: 2,5 g mẫu thử với 1 x 150 mL MeOH, chiết lặp với 3 x 100 mL MeOH; phương pháp3: 2,5 g mẫu thử với 400 mL MeOH trong 10 phút sau đó ủ trong 6, 16 hoặc 21 giờ; phương pháp 4: chiết Sohlex với 2,5 g thực vật bằng MeOH trong 6, 16 hoặc 21 giờ Kết quả cho thấy khi chiết với HCl 2,5% cho độ thu hồi cao hơn Khi chiết với acid, hiệu suất tốt nhất thu được khi được chiết với sự có mặt của nhiệt độ Đồng thời, chiết Sohlex có xu hướng làm

giảm tỉ lệ thu hồi các PANOs và hiệu suất không có sự khác biệt khi chiết với các thời gian khác nhau [19]

Schuzl và cộng sự đã sử dụng H2SO4 0,05M để phân tích PAs trong

169 mẫu trà dược liệu các loại Mẫu được thêm 2 x 10 mL dung môi chiết, sau đó lắc trong 20 phút, siêu âm 15 phút, ly tâm 6000 vòng trong 5 phút Gộp dịch, điều chỉnh pH 6-7, sau đó làm sạch bằng chiết pha rắn SPE với cột C18 Mẫu đưuọc làm giàu bằng thổi khô N2 Hòa cặn bằng 1 ml MeOH

- H20 (5:95) sau đó phân tích trên LC-MS/MS [29]

Joosten và cộng sự đã so sánh 2 dung môi chiết là acid HCOOH 2%

và H2SO4 0,25M để phân tích PAs và PANO trong mẫu thực vật, sử dụng phương pháp LC-MS/MS để phân tích Kết quả cho thấy không có sự khác biệt khi sử dụng hai loại dung môi chiết này [20]

Mathon và cộng sự cũng sử dụng phương pháp LC-MS/MS kết hợp với dung môi chiết là H2SO4 0,05M để phân tích 9 PAs trong mẫu thực vật Phương pháp có giới hạn định lượng 1 ng/mL; khoảng tuyến tính từ 1 –

100 ng/mL; độ thu hồi nằm trong khoảng từ 91 – 114 % [23]

Griffin và cộng sự sử dụng dung môi chiết H2SO4 0,05M để phân tích 10 PAs và 4 PANOs trong mẫu trà Mẫu sau khi cân được chiết với dung môi trong thời gian 30 phút ở 40oC, làm sạch và làm giàu bằng cột chiết pha rắn SCX và thổi khô N2 Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với các PAs là 0,4 µg/kg, giới hạn định lượng 1,3 µg/kg [16]

1.2.2 Phương pháp làm sạch

Bước làm sạch thường áp dụng cho các kỹ thuật phân tích khẳng định nhằm loại trừ các ảnh hưởng của nền mẫu Hơn nữa, làm sạch thường kèm theo quá trình làm giầu mẫu do đó giảm được giới hạn phát hiện của phương pháp Kỹ thuật làm sạch mẫu thường được sử dụng nhất sau khi chiết PAs từ nguyên liệu thực vật là chiết pha rắn

Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật phổ biến được áp dụng để làm sạch mẫu Dịch chiết mẫu được đưa qua cột SPE đã được hoạt hóa, chất phân tích được giữ lại trên cột, các tạp chất được rửa qua cột, sau đó sử dụng dung môi có ái lực mạnh hơn với chất phân tích để rửa giải các chất này ra khỏi cột Dịch rửa giải có thể được cô đến cạn sau đó hòa lại trong một dung môi thích hợp nhằm làm giầu mẫu Do các PAs có tính phân cực và

độ tan khác nhau, nên khó lựa chọn được một loại cột đặc hiệu cho tất cả các PAs

Cột SPE loại đa cực (Ví dụ: HLB) (vừa có nhóm thân nước và thân dầu) được một số nghiên cứu sử dụng để làm sạch khi phân tích PAs Dịch chiết nước của các PAs (không hòa tan trong dung môi hữu cơ) có thể được cho qua cột sau đó các PAs được rửa giải bằng dung môi hữu cơ có bổ sung thêm amoniac Khi áp dụng cho nền mẫu mật ong, phương pháp cho kết quả tốt, tuy nhiên kết quả không lặp lại đối với một số PA dạng diester

và đã được thay thế bằng các phương pháp trao đổi cation [12],[16]

Cột C8 hoặc C18 là cột chứa các pha tĩnh không phân cực như octylsilane hoặc octadecylsilane (C8 hoặc C18) Hosch và cộng sự đã chứng minh rằng pha tĩnh C18 có độ thu hồi tốt hơn so với pha tĩnh C8 [19] Mroczek và cộng sự chỉ ra rằng việc sử dụng chất hấp thụ C18 có thể rửa giải các tạp chất do tính đặc hiệu thấp [24]

Cột SPE trao đổi cation (SCX) là phương pháp phổ biến nhất sử dụng polymer mạnh để cô lập cả các base tự do và N-oxid Bằng việc sử dụng cột này, các PA tự do và N-oxid của chúng có thể được phân lập đồng thời với năng suất cao, khả năng làm sạch và tập trung mẫu [7] Một số nghiên cứu cụ thể sử dụng cột SCX được tổng hợp trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu sử dụng cột SPE SCX

1.2.3.1 ELISA

Thông qua albumine huyết thanh bò, kháng nguyên liên kết enzyme (AG-E) có thể được tổng hợp và sử dụng để sản xuất của kháng thể (đa dòng cũng như đơn dòng) ở chuột Phương pháp này rất nhạy và không cần phải làm sạch phức tạp Nhược điểm của phương pháp này là chỉ áp dụng được cho một chất hoặc một nhóm PAs có cấu trúc tương đồng [5],[27] 1.2.3.2 Sắc ký khí

Sắc khí khí với detector khối phổ hoặc NPD đã được một số tác giả nghiên cứu để phân tích các PAs Tuy nhiên, một vấn đề của kỹ thuật này

là các PAs N-oxid phải được khử thành các base tự do và dẫn xuất trước khi được phân tích [12]

Michael Kempf và cộng sự sử dụng phương pháp GC-MS để phân tích PAs trong mẫu mật ong Mẫu được chiết với H2SO4 0,05M, làm sạch qua cột SPE SCX, rửa giải bằng NH4OH 6%/MeOH, làm giàu bằng thổi khô N2, sau đó dẫn xuất bằng 100 µL LiAlH4 1M/THF trong 3h ở nhiệt độ

4oC 500 µL CH2Cl2 và 5 giọt NaOH 10% được thêm vào để dừng phản ứng Mẫu tiếp tục được thổi khô và hòa cặn lại bằng 50 µL MSTFA và phân tích trên GC-MS Phương pháp có giới hạn định lượng 10 µg/kg, độ thu hồi 83 ± 3% đối với các PAs [21]

Joosten và cộng sự sử dụng GC-NPD để phân tích PAs trong mẫu thực vật Mẫu được chiết với 15 mL H2SO4 0,1M trong 1h, sau đó lọc lấy phần dịch và kiềm hóa với 5 mL NH4OH và làm sạch qua cột Extrelut Các PAs được rửa giải bằng 120 mL CH2Cl2, sau đó thổi khô và hòa cặn, phân tích trên sắc ký khí Phương pháp có giới hạn định lượng 0,03 mg/g [20] 1.2.3.3 Sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã được sử dụng rất phổ biến do khả năng xác định đồng thời các PAs trong cùng một quy trình chiết, làm sạch và định lượng LC-MS/MS có nhiều ưu điểm vượt trội như

độ nhạy tốt, độ đặc hiệu cao, thời gian phân tích nhanh, xử lý mẫu không quá phức tạp như sắc ký khí đã được nhiều tác giả nghiên cứu để xác định PAs trong các nền mẫu Bảng 1.3 giới thiệu một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS

PAs

Kỹ thuật LC-MS/MS

LOQ

0,18-6,4 µg/kg Dubecke

[13]

Mật ong, phấn

1,0-3,0 µg/kg

µg/kg

Có thể thấy rằng, phần lớn các nghiên cứu sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) ở chế độ ion dương để xác định đồng thời nhiều PAs trong cùng một lần phân tích Nguồn ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) cũng được sử dụng nhưng có giới hạn định lượng cao hơn, hơn nữa APCI ít thông dụng hơn

Trong nghiên cứu này, sắc ký lỏng khối phổ hai lần với nguồn ESI

đã được sử dụng để khảo sát các điều kiện xác định các PAs trong các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược hướng đến đạt được độ nhạy đáp ứng yêu cầu của châu Âu (1 µg/kg)

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng trong nghiên cứu này là 4 loại độc tố PAs được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1.Các độc tố PAs được sử dụng trong nghiên cứu

TT Độc tố PAs Ký hiệu Công thức

phân tử

Khối lượng phân tử

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

2.2.1.1 Thiết bị

Shimadzu và khối phổ ABSciex Triple Quad 5500

- Máy đồng nhất mẫu, Phillips

- Hệ thống chiết pha rắn SPE, Waters

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo

- Máy lắc xoáy, IKA

- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

- Máy rung siêu âm

2.2.1.2 Dụng cụ

- Cột chiết pha rắn SPE SCX, Supelco

- Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200 µL, 100-1000 µL và 1000-5000 µL

- Bình định mức: 10, 50 mL

- Ống ly tâm 50 mL

- Vial loại 1,8 mL

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Methanol (Merck)

- Acetonitrile (Merck)

- Acid formic (Merck)

- Acid sulfuric 98% (Merck)

- Amoni hydroxide (Merck)

- Nước cất hai lần

2.2.3 Chất chuẩn

- Chuẩn Jb 5 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%

- Chuẩn Em 10 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%

- Chuẩn Im 10 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%

- Chuẩn Sn 10 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Chuyển toàn bộ mỗi chất chuẩn vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được các dung dịch chuẩn gốc Jacobine 500 µg/mL, Echimidine 1000 µg/mL, Intermidine 1000 µg/mL, Senecionine 1000 µg/mL Bảo quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng trong 1 năm

chuẩn gốc theo bảng 2.2 vào bình định mức 10 mL, định mức tới

vạch bằng MeOH, lắc đều Bảo quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng trong 1 tháng

Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn trung gian

chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng MeOH, lắc đều Bảo quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng trong 1 tuần

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 100 ng/mL: hút 1 mL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng MeOH, lắc đều Pha mới khi sử dụng

- Dãy dung dịch chuẩn làm việc: pha các dung dịch chuẩn làm việc theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Pha dung dịch chuẩn làm việc của PAs

ng/mL

2 ng/mL

5 ng/mL

10 ng/mL

20 ng/mL

40 ng/mL

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định độc tố PAs bằng LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: so sánh hiệu lực tách giữa các cột tách C18 và TSK Gel; khảo sát điều kiện gradient

2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

Tham khảo các nghiên cứu trước đây và thực hiện các khảo sát

- Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu tốt nhất khi áp dụng trên các nền mẫu thảo dược, sử dụng 3 cột chiết pha rắn khác nhau: cột C18, cột SCX và cột HLB

- Khảo sát nồng độ dung môi chiết

- Khảo sát phương pháp chiết: lắc ngang và siêu âm

- Khảo sát bước làm sạch bằng SPE

- Lấy mẫu tại địa bàn Hà Nội

- Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá kết quả

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu

* Chuẩn bị mẫu sơ bộ:

Mỗi mẫu lấy tối thiểu 20 – 50 g, xay nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu

* Quy trình chiết dự kiến:

- Cân chính xác khoảng 2,5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL

- Chiết với 15 mL dung dịch H2SO4 0,05M

- Vortex trong 1 phút, sau đó lắc ngang hoặc siêu âm trong 30 phút, 70oC

- Lấy 5 mL mẫu làm sạch qua cột SPE

- Thổi khô bằng khí N2, hòa cặn 0,5 mL MeOH

- Phân tích trên LC-MS/MS

2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị LC-MS/MS gồm:

ổn nhiệt cột CTO-20A và bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AC-XR

của hãng Waters, Mỹ

cao hơn được sử dụng để định lượng, ion có cường độ thấp hơn để xác nhận

2.4.3 Phương pháp thẩm định

2.4.3.1 Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng

và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3) LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10) 2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 1 đến 40 ng/mL (tương đương 12,5 đến 500

µg/kg trên nền mẫu) và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực (pha trên nền mẫu trắng), nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn nồng độ ngoại chuẩn (trục hoành x)

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là 1; 10 và 40 µg/kg (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%).:

RSD(%) = 100

x S

N i i

Trong đó:

xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

x: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

n : Số lần thử nghiệm

c 100 Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

2.4.4 Phương pháp lấy mẫu

- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

- Lượng mẫu lấy phù hợp với thông tư 14/2011/TT-BYT

- Địa điểm lấy mẫu: Hà Nội

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Tính hàm lượng PAs trong mẫu bằng phần mềm của thiết bị MS/MS (Analyst 1.5) Các kết quả thẩm định phương pháp được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

LC-CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số PAs trong TPBVSK

3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS

3.1.1.1 Điều kiện MS/MS

Để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của các PAs trong nghiên cứu, tiến hành tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 1 µg/mL vào khối phổ và thực hiện khảo sát ion mẹ, ion con Hai ion con được lựa chọn cho mỗi chất, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, ion còn lại dùng để xác nhận Các kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích PAs

Để tối ưu hóa điều kiện MS cho từng chất, nhóm nghiên cứu sử dụng

kỹ thuật FIA, nghĩa là hỗn hợp chuẩn PAs có nồng độ 1 µg/mL được bơm trực tiếp vào khối phổ cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký với điều kiện như sau: Pha động là (A) dung dịch HCOOH 0,1 % trong

H2O và (B) ACN

Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lượng và định tính của từng chất Khảo sát các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion:

- ISV (IonSpray Voltage - Thế ion hóa)

- TEM (Temperature - Nhiệt độ của nguồn)

- GS1 (Ion Source Gas 1 - Khí nguồn ion 1)

- GS2 (Ion Source Gas 2 - Khí nguồn ion 2)

- CUR (Curtain Gas - Khí màng)

- CAD (Collisionally Activated Dissociation Gas - Khí va chạm ở Q2) Qua khảo sát ta thu được giá trị tối ưu của từng thông số trên cho cả các chất nghiên cứu Các giá trị được liệt kê trong bảng 4.2

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS để phân tích các PAs

Thông số Giá trị tối ưu

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện LC

Pha tĩnh là C18 được ưu tiên lựa chọn do tính chất phổ biến rộng rãi

và có một số nghiên cứu trước đây cũng sử dụng các loại cột có bản chất pha tĩnh này Tuy nhiên, kết quả khảo sát cho thấy pic sắc ký của Intermedine và Jacobine lưu giữ rất kém, thời gian lưu tương ứng là 2 phút

và 2,6 phút Hơn nữa, pic sắc ký của Intermedine bị doãng và chẻ ngọn Sắc ký đồ của Intermidine và Jacobine khi phân tích bằng hai loại cột sắc

ký được đưa ra ở hình 3.1

Để tăng hiệu quả tách, nhóm nghiên cứu đã khảo sát cột TSK Gel với bản chất pha tĩnh là hạt Amide-80 có độ phân cực hơn so với cột C18

Hình 3.1 Sắc đồ Ichimidine và Jacobine sử dụng cột C18 và cột TSK Gel Nhận xét: PAs là các chất tương đối phân cực, khó tương tác với pha tĩnh không phân cực của cột C18 nên không lưu giữ được chất phân tích Khi sử dụng cột TSK Gel pic sắc ký thu được rất nhọn, sắc nét, thời gian lưu khoảng 5 phút với mỗi PAs, do đó cột TSK Gel đã được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo

Gradient rửa giải là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình tách các PAs Do sử dụng cột TSK Gel phân cực nên chương trình gradient đã được khảo sát Qua khảo sát đã lựa chọn được chương trình gradient để rửa

Intermedine

TSKgel Intermedine C18

Jacobine

giải các PAs (bảng 3.3) Sắc ký đồ phân tích hỗn hợp chuẩn PAs được trình bày ở hình 3.2 và 3.3

Bảng 3.3 Điều kiện gradient

Hình 3.3 Sắc đồ MRM của từng PAs Nhận xét: Sử dụng cột TSk Gel kết hợp với gradient đã khảo sát ở trên để phân tích đồng thời 4 PAs cho thấy các pic thu được nhọn, sắc nét,

có thể định lượng từng chất riêng biệt do khối phổ của các chất phân biệt rõ ràng Mỗi chất đều có 2 ion con được sử dụng để định lượng và xác nhận

Echimidine

Jacobine

Senecionine

Intermidine

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

3.1.2.1 Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu

Các PAs có tính bazơ do trong phân tử có chứa nguyên tử N Một số alkaloids có tính bazơ yếu khó tan trong nước nhưng lại tan trong một số dung môi hữu cơ như CH2Cl2,CHCl3, ethylacetate, acetonitril; một số khác

có tính bazơ mạnh hơn có thể tồn tại ở dạng muối acid và tan tốt trong nước Dựa vào đặc điểm này có thể tách chiết các PAs ra khỏi nền mẫu

Sử dụng mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe đã được khảo sát dương tính với các PAs và thực hiện theo hai quy trình chiết cơ bản để tách chiết các PAs:

 Quy trình 1 (chiết alkaloid dạng base bằng dung môi hữu cơ): Khảo sát loại dung môi chiết gồm CH2Cl2,CHCl3, MeOH và ACN [11]

hóa (sử dụng NH4OH 5% do NH3 phù hợp với phân tích khối phổ)

- Cân 2,5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL

- Chiết bằng 15 mL dung dịch acid mỗi loại và siêu âm trong 30 phút

- Thu lấy dịch chiết, lặp lại quá trình chiết với 10 mL acid Gộp dịch chiết và định mức đến 25 mL bằng dung dịch acid

- Lấy 5 mL dịch chiết cho qua cột SPE SCX (500 mg, 3 mL), rửa giải

Hình 3.4 Biểu đồ kết quả khảo sát dung môi chiết Nhận xét: Khi chiết mẫu bằng quy trình 2 (chiết bằng acid) cho kết quả cao hơn đáng kể so với chiết bằng dung môi hữu cơ đối với cả 4 chất PAs Trong đó, sử dụng acid H2SO4 0,05M cho hiệu quả chiết cao nhất Phương pháp chiết alkaloid dạng muối bằng acid loãng có nhiều thuận loại khi kết hợp với giai đoạn làm sạch bằng cột SPE SCX Như vậy, quy trình

2 với dung môi chiết là H2SO4 đã được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo 3.1.2.2 Khảo sát nhiệt độ

Trên mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dương tính với các PAs, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ từ nhiệt độ phòng đến 90oC theo quy trình sau:

- Cân 2,5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL Thêm 15 mL dung dịch H2SO4

3 mL H2O và 3 mL H2SO4 0,05M Lấy 5 mL dịch chiết cho qua cột

SPE, rửa tạp bằng 3 mL H2O, 3 mL MeOH Rửa giải các PAs bằng

3.1.2.3 Khảo sát nồng độ acid

Cố định các điều kiện theo quy trình ở 3.1.2.2, thay đổi nồng độ

H2SO4 trong khoảng từ 0,01 M; 0,025 M; 0,05 M; 0,075 M; 0,1 M; 0,2 M Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.6