Định lượng một số hoạt hất nhóm silymarin trong thự phẩm hứ năng bằng phương pháp sắ ký lỏng hiệu năng ao (hplc)

Lê Huy n Trâm và PGS.TS.. Cu i cùng, tôi xin bày t lòng bi i thân và btình ng viên tôi trong su t quá trình th c hi tài.

i

n án này là công trình nghiên c u c

ng d n khoa h c c a TS Lê Huy n Trâm và PGS.TS Lê Th H ng H o Các s

li u và các k t qu nghiên c u trong lu

b trong b t kì công trình nào khác

ng các thông tin trích d n trong lu ghi rõ ngu n g c.

H c viên

toàn V sinh th c ph m Qu c gia) và các cán b Khoa Nghiên c u th c ph

c u hoàn thành lu

Xin trân tr ng c

Hà n i, ngày 15

H  c viên

Nguy n Th Thu H ng

3.2.1 Kh o sát dung môi chi t v i viên nang c ng, viên nén, cao khô k s 37

v

ACN Acetonitril Acetonitrile

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

CE Capillary Electrophoresis

EtOH Etanol Ethanol

HPLC High Performance Liquid

Chromatography HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography LC- MS Liquid Chromatography Mass

Spectrometry

LOQ Limit of Quantification

MAE Microwave Assisted Extraction MeOH Metanol Methanol

NF- B  Nuclear Factor-kappa B

RSD Relative Standard Deviation

vi

tích (AOAC)

3

1.1 Giớ i thi u chung v h ệ ề ọ Cúc (Asteraceae) [2]

H Cúc (Asteraceae hay Compositae) là m t trong nh ng h l n nh t c a ngành

th c v t h

Artemisia (7 loài), Blumea (29 loài), Crepis (6 loài), Eupatorium (8 loài), Gynura (11

loài), Lactuca (10 loài), Seneco (8 loài), Veronia (17 loài)

(Artemisia carvifolia Wall.), Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua Linn.), Ng i c u

indica Less.) C t l n (, Ageratum conyzyoides L.), Atiso (Cynara scolymus L.), Hy

c dùng làm c

ng gai mà gai l i có màu vàng và r t nh n; các lá p

c r ng 3-8 cm Lá b c ngoài và gi a có 1 ph n ph hình tam giác mà l c thu l i

u có 5 cánh hoa, 5 nh và b u 1 ô v i 2 lá noãn và 2 vòi nhu phình ra g c Qu b

n vàng nhi u hay ít [3]

5

Sinh thái:

Phân b:

Cây k s a v n m c hoang dã vùng Ð a Trung H i K t khi y h c phát hi n

ra các ho t ch t silymarin trong cây K s a có tác d ng ch a b nh thì lo

1.2.2

6

ng 60% là axit linoleic, kho ng 30% là axit oleic, và kho ng 9% là ac

Các h p ch t có ho t tính sinh h c trong nhóm Silymarin là Silybin, Silychristin,

Desoxysilydianin, Silandrin, Silybinome, Silyhermin và Neosilymermin Hình d ng,

7

Hình 1.2: H t cây K s a   

Các thành ph n chính c a Silymarin là Silybinin (Silybin A và Silybin B),

Tên IUPAC c a các ch t Silymarin:

8

taxifolin liên k t v i coniferyl alcohol qua m t vòng epoxid Chính nhóm epoxid này

c u C u trúc hóa h c c

h p v i 2,4,6-trimethoxyacetophenone t o thành m t d ng chalcone trung gian [24]

Hình 1.3: Công thc cu t  o c a Silymarin

9

ph i ch

ng Silymarin công b trên nS

c t gây ra b nh viêm gan[7]

Ho t tính ch ng oxy hóa  [52 ]

Quá trình t o ra các g

u c ch quá trình peroxid hóa các lipid do các g c t do gây ra trong ti th

màng gan chu t

11

Ho t tính b o v gan 2]   [5

(acetaminophen), amitriptyline, carbon tetrachloride, ethanol, erythromycin estolate,

galactosamine, nortriptyline và hydroperoxide tert-butyl trong t bào lympho chu t

t ng h p ARN ribosome 20% gan chu t, thông qua s ho t hóa c a RNA

ng thành, và quá trình sinh t ng h p protein

u tr v i Silybin (27mg/kg th tr ng)

màng b ng cho th y hi u qu c ch rõ ràng s t n h i gan do paracetamol

t hi m (ví d : cerium, praseodymium và lanthanum ) và tali trong các mô hình g m

/ml)

12

Silybin c ch s phóng thích histamin trung gian gây ra b i peptit f-met và

thích histamin gây ra b i ionophan A23187 Silymarin c ch s phóng thích

histamine trung gian làm trung gian kích ho t b i

n vi c c ch s hình thành hydrogen peroxide dùng Silymarin trong ru t làm

d ch viêm sau khi dùng cho chu t

Trong m t nghiên c u c t ngang m t cách ng u nhiên, không có ki m soát, v i

13

Sau khi u ng m t li u duy nh

trong 24 gi sau khi u ng Sau khi u ng m t li u duy nh

Sau khi dùng li u duy nh t m t ch ph m chu n Silymarin chu n (140 mg) cho

thành c a s n ph m

14

ng Silymarin nói riêng và cây K s a nói chung r t khác nhau gi a cá

15

1.4 M t s ộ ố phương pháp phân tích Silymarin

ng các thành ph n các ho t ch

Hình 1.5: Ph h p th    UV -VIS c a Silymarin 

nh Silymarin trong các s n ph m nhi u thành ph n th

ng phân c a Isosilybin K t qu tri n khai áp d ng phân tích các m u th c t cho

d ng k thu t HPLC K t qu phân tích các h p ch t nhóm Silymarin b ng

Hình 1.6   c khi phân tích silymarin

18

19

th i gian phân tích Nghiên c u này s d ng ngu n ion hóa ESI (+) v i ch

u này cho th y ngay t i m

Theo nghiên c u c a Wagner và c ng s (2009) [8] các ch t nhóm Silymarin

c phân tích b ng k thu t s c ký l p m ng v i h dung môi khai tri n là

20

Hình 1 7 S c ký HPTLCc a các ho :     t ch  t nhóm Silymarin

và d ch chi   t h   t K s a (UV 366nm)

TLC

ng th i Silymarin và Curcumin trong các d

c 07 ch t Silymarin là Silychristin A, Silychristin B, Silydianin, Silybi

22

ng c a các ch

c hi

ng Silymarin trong h t cây K s a v

c Ahlam Elwekeel và c ng s [9] nghiên c u s d ng k thu t s c ký l ng hi u

ng Silymarin cao nh t: Silybin 311 mg/g; Isosilybin 107 mg/g; Silychristin 56,5 mg/g và Silydianin 207 mg/g Tuy nhiên m t s nghiên c u hi n nay

Hoa K (USP) là m t trong nh ng tài li u tham kh o có giá tr nh t s d ng

, vi c chuy n giao công ngh , tri n khai áp d ng trong th c ti

1.5 M t s k ộ ố ỹ thu t x lý m ậ ử ẫ u trong phân tích Silymarin

Trong phân tích th c ph m nói chung và trong th c ph m ch

i, g n tách riêng l y d ch và ti n hành thêm nhi u l n l p l i

24

l n) K t qu phân tích cho th y h u h t các ho t ch t nhóm Silymarin có t l chi t

c a các ch t phân tích v    i th i gian chi t 

1.5.2 K thu t chi t Soxhlet (Soxhlet extraction)

ch t Silymarin, chi t Soxhlet áp d ng cho ph n l n d ng m u là h t K s a và m t s

25

trong th i gian 05 gi [9

trong các n n m u Theo nghiên c u c a Wang Xin và c ng s [50], các ch t

c t

nh m c, thêm dung môi chi t là MeOH, ti n hành siêu âm cách th y trong 15

c di n ra trong b siêu âm cách th y trong th i gian là 30 phút D ch chi

c qua màng l c và phân tích trên h th

n, th c hi n nhanh chóng và hi u qu cao

c hi n b ng cách l c m u phân tích v i dung môi chi t là chloroform

n s d ng trong kho ng th i gian t

(NCxx), viên nang m m (NMxx), viên nén (VNxx), nguyên li

2.2 Phương pháp nghiên cứ u

(1:1,v/v)

cao khô nguyên li u K s a v

15 ml dung môi chi t

làm s ch m u Chúng tôi ti n hành 03 thí nghi m sau:

+ Lo i lipid s d ng dung môi hexan b ng k thu t siêu âm cách th y Ph n

+ Lo i lipid s d ng dung môi hexan b ng k thu

ete d u h a (petroleum ether) Ph n d ch phía trên lo i b , ph n d

nh m

32

2.3 Nguyên v t li u, thi t b ậ ệ ế ị

2.3.1 Hóa ch t, ch t chu n

- Các ch t chu n nhóm Silymarin: Silybin, Isosilybin, Silydianin, Silychristin, và

Taxifolin (Sigma Aldrich)

Hình 2.1: Thi t b HPLC (Alliance Waters) s d ng trong nghiên c u      

34

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kh o sát và l a ch ả ự ọn các điề u ki n phân tích Silymarin b ng ệ ằ

phương pháp HPLC

35

c hydroxy (-OH) trong các ch t phân tích phân ly t l thu

Hình 3.1: S ký phân tích Silybin và Isosilybin s d  c    ng methanol và acid acetic

Hình 3.2: S ký phân tích Silybin và Isosilybin  c 

D ùng methanol và acid phosphoric

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min -1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mVDetector A Ch1:288nm

20 mV Detector A Ch1:288nm

36

 3.3 S ký phân tích m u cao chi t K s a  c     

trúc không gian c a các phân t Silybin và Isosilybin v i methanol nh n th y chúng có

th t o thành các vòng l p th (stereo)thông qua liên k t hydro Do s

Minutes

các n n m u khác nhau, có th là do hai dung môi này có các nhóm OH nên d t o

38

kh

B ng 3.2: K   t qu kh o sát các dung môi chi khác nhau   t

c l a ch n và quy trình x lý m u d ng b t khi phân tích Silymarin g

hình 3.5

39

| Cân chính xác kho ng 0,1g - 0,5g vào ng ly tâm 50 mL

| Thêm kho ng 25 mL methanol, l c Vortex 1 phút

L c qua màng l c 0,45µm, pha loãng n u c n, phân tích trên HPLC

Hình 3.5: Quy trình phân tích silymarin trong TPCN d  ng b t

l a ch n c a nhi u nghiên c u khác trên th gi i.Bên c

40

khác trong thành ph n các m u viên nang c

Hình 3.6 : S ký phân tích nhóm ch  c   t Silymarin v dung môi chi i t là aceton e

Hình 3.7 : S ký phân tích nhóm ch  c   t Silymarin v dung môi chi i t là ethanol

Hình 3.8: S ký phân tích nhóm ch  c   t Silymarin v dung môi chi t là methanol i 

Minutes

41

ng m u này là n n m u có r t nhi

n lo i t p (lipid) trong quá trình x lý m u Trong các dung môi không ph

| Cân kho ng 1,0g vào ng ly tâm 50 mL

L c qua màng l c 0,45µm, pha loãng (n u c n), phân tích trên HPLC

Hình 3.9  các th nghi m x lý m   u phân tích TPCN viên nang m m

42

b ng MeOH

trong hình 3.11

43

| Cân kho ng 1,0g vào ng ly tâm 50 mL

| Thêm kho ng 25 mL n-hexan, l c Vortex 1 phút

L c qua màng l c 0,45µm, pha loãng n u c n, phân tích trên HPLC

Hình 3.10: Quy trình x  lý m  u phân tích TPCN viên nang m m 

Hình 3.11 : Sc  ký phân tích lymarin trong viên nang m m Si 

  lo i lipid b ng n-hexan 

(Hình 3.12)

Hình 3.12: S  m u tr ng  (viên nang c ng) không có Silymarin

B ng 3.4: K   t qu   i c l p l a các ch t phân tích 

47

Hình 3.1 6 : Sc     a các cht phân tích ký l p l i c

Chu n b các dung d ch chu n các ch t phân tích:    

silymarin

y = 43472x - 3971,2 R² = 1

y = 51211x - 3389,9 R² = 0,9998

50

Minutes

54

Hình 3.25 : Sc     ký l p l i trên n  n m u viên nang m m 

Hình 3.26 : Sc     ký l p l i trên n  n mu b t nguyên li  u

giá b ng cách thêm chu n h n h p Silymarin vào n n m u th c ph m ch

thu h i m unguyên li u (%)

thu h i

m u m u viên nang c ng (%)

thu h i m uviên nang m m (%)

Minutes

55

tr ng t i các ch t phân tích trong các nghiêu c u không gi ng nhau

thu h i trên m t s n n

Hình 3.27 : Sc   ký thu h i trên n   n m u viên nang c  ng

Hình 3.28 : Sc   ký thu h i trên n   n m u viên nang m m 

Minutes

56

Hình 3.29 : Sc   ký thu h i trên n   n mu b t nguyên li  u

3.4 Áp dụng phương pháp HPCL xác định Silymarin trong mẫu thực tế

c

ng Silymarin trong 27 m u nguyên li u và s n ph m TPCN thu th p ng u nhiên

B  ng 3.9: K  t qu phân tích  ng Silymarin trong

m  t s u TPCN m thu th p trên th    ng Hà N i 

Minutes

n 116 mg/viên

3.30, hình 3.31, hình 3.32 và hình 3.33

Hình 3 30: Sc  ký phân tích m u nguyên li   u NL05

58

Hình 3.31 : S   phân tích m u viên nén VN01 

Hình 3.22 : S   phân tích m u viên nang m m NM01  

Hình 3.33 : Sc  ký phân tích m u viên nang c ng NC10  

59

trong các d ng m u b t khô (viên nang c ng, viên nén) l

Silymarin h

chúng có th s kém hòa tan và phân tán trong thành ph n lipid c a viên nang m m

n ph m d ng cao chi t s ch a nhi u ho t ch

liên quan

of Analysis, CoA) c a m t m u nguyên li u cao khô h t K s a (Hình 3.34) có s khác

phòng thí nghi m c a nhà s n xu t cho th y v

ng Silybin + Isosilybin là 31,8%)

Silymarin trong nguyên li u K s a và s n ph m TP

-phân tích 27 m u cao chi t và s n ph m TPCNch a thành ph n K s a thu

th c ph m ch

62

xác hi u qu c

(2010), Milk thistle in liver diseases: past, present, future, Phytotherapy

Research, 24(10), pp 1423-143

Phytochemicals - A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health,

pp 255-272

Medicinal Plants Research, 7(23), pp 1665-1669

Journal of Gastroenterology, 12(3), pp 143-149

64

12 Ding T., Tian S., Zhang Z., Gu D., Chen Y., Shi Y., Sun Z (2001),

Determination of active component in silymarin by RP-LC and LC/MS,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26(1), pp 155-161

13 Enrica B., C Benelli, and Pirona O (1992), Effect of the flavanolignans of

Silybum marianum L On lipid peroxidation in rat liver microsomes and freshly

Extraction of Silymarin Components from Milk Thistle Seeds (Silybum

marianum L.) 36 (6), pp 311- , 318

W, Schneider B(1989), Randomized controlled trial of silymarin treatment in

16 Fraschini F., Demartini G., and D Esposti (2002), Pharmacology of silymarin,

Clinical Drug Investigation,22(1), pp 51-65

17 Ghosh A., Ghosh Tanmoy, and S Jain (2010), Silymarin a review on the

pharmacodynamics and bioavailability enhancement approaches, Journal of

Pharmaceutical Science and Technology, 2(10), pp 348 355

Biology, 46(12), pp 876-882

19 John Buckingham, V Ranjit N Munasinghe (2015), Dictionary of Flavonoid

20 Kevin Anthony and Mahmoud A Saleh (2012), Chemical profiling and

antioxidant activity of commercial milk thistle food supplements, Journal of

Chemical and Pharmaceutical Research, 4(10), pp 4440-4450

21 Kroll D.J., Shaw H.S., and Oberlies N.H (2007), Milk thistle nomenclature:

why it matters in cancer research and pharmacokinetic studies, Integrative

Cancer Therapies, 6, 110-119

65

-23 Lajos Nagy, Ákos Kuki, Gyögy Deák, Bernadett Biri, Miklós Nagy, Miklós

Zsuga, Sándor Kéki (2011), Systematic identification of active ingredients of

Silybum Marianum seed, Arad Medical Journal, XIV(2), pp 9- 12

24 Lee D.Y and Liu Y (2003), Molecular structure and stereochemistry of silybin

A, silybin B, isosilybin A, and isosilybin B, Isolated from Silybum marianum

25 Liu Hong, Du Zhenxia, end Qipeng Yuan (2009), A novel rapid method for

simultaneous determination of eight active compounds in silymarin using a

4159-4163

26 Madaus&Co (1976), Symposium on the pharmacodynamics of silymarin,

Urban & Schwarzenberg, Cologne, German, pp 98-102

27 Mateen S., Tyagi A., Tyagi A, Agarwal C, Singh RP, Agarwal R (2010),

Silibinin inhibits human nonsmall cell lung cancer cell growth through

cell-cycle arrest by modulating expression and function of key cell-cell-cycle regulators,

Molecular Carcinogenesis, 49(3), pp 247-258

28 Mayer K E., Myers R P., and S.S Lee (2005), Silymarin treatment of viral

29 Meghreji Moin A, Patel C.N (2010),Validated method for Silymarin by

Spectrophotometry in Bulk drug and Pharmaceutical formulations, Journal of

Chemical and Pharmaceutical Research, 2(1), pp 396-400

30 Minakhmetov R A., Onuchak L A., V.A Kurkin, E V Evdeeva and A V

Chemistry of Natural Compounds, 37(4), pp 318-321

31 Mira Lurdes, Silva Manuela, and Manso C F (1994), Scavenging of reactive

oxygen species by silibinin dihemisuccinate, Biochemical Pharmacology,

48(4), pp 753-759

Optimization and single-laboratory validation of a method for the determination

of flavonolignans in milk thistle seeds by high-performance liquid

chromatography with ultraviolet detection, Analytical and Bioanalytical

37 Pilat L., Mihali C., Herman H., Popescu C., Turcus V., Ardelean A (2011),

Determination of silymarine in the extract from the dried silybum marianum fruits by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 19(3/4), pp 435-442

39 Radjabian T., Rezazadeh S,H and HuseiniH.F.(2008), Analysis of silymarin components in the seed extracts of some milk thistle ecotypes from Iran by HPLC,

Iranian Journal of Science and Technology (Sciences), 32(2), pp 141-146

40 Saleh I.A., Vinatoru M., T.J Mason, NS Abdel-Azim, EA Aboutabl, and FM Hammouda (2015),Ultrasonic-Assisted Extraction and Conventional Extraction

of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 6(2), pp 709-717