Phương pháp phân ễmin dịch phóng xạradioimmunoassay – RIA [28] Hiện nay, RIA phương pháp phân tích miễn dị phóng xạ ch được sử ụ d ng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y họ nô
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - HOÀNG QUỲNH TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ FLAVONOIDS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC- CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ HỒNG HẢO PGS.TS NGUYỄN THỊ MINH TÚ HÀ NỘI – 2014 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131972081000000 Luận văn thạc sĩ Hồng Quỳnh Trang LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu làm việc tôi, kết quả, số liệu luận văn trung thực, thực tế nơi nghiên cứu Hà Nội, tháng 03 năm 2014 Tác giả luận văn Hồng Quỳnh Trang Học viêc cao học khóa 2011B I Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy Viện Công nghệ Sinh Học – Công nghệ thực phẩm, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám hiệu trường Đại học kỹ thuật Y tế Hải Dương, khoa Y học dự phòng – Y tế cộng cộng labo xét nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi để học tập hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Th.s DS Cao Cơng Khánh anh chị labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ nhiều q trình làm thực nghiệm Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, năm 2014 Học viên Hồng Quỳnh Trang II Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID 1.1.1 Khái niệm Flavonoid [4] 1.1.2 Phân loại Flavonoid 1.1.3 Tính chất flavonoid [4] .4 1.1.4 Tác dụng sinh học Flavonoid 1.2 Giới thiệu flavonoids nghiên cứu 1.3 Một số phản ứng định tính flavonoid .9 1.4 Các phương pháp xác định Flavonoid 10 1.4.1 Phương pháp phân miễn dịch phóng xạ(radioimmunoassay – RIA) 10 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng 11 1.4.2.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng với dectecter UV-VIS 11 1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp[28] 14 1.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS [32] .14 1.5 Phương pháp HPLC .16 1.5.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng 16 1.5.2 Phân tích định tính định lượng HPLC [1, 7] 18 1.6 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 19 1.6.1 Mục tiêu 19 1.6.2 Nộidung 19 III Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Hóa chất dụng cụ nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết bị 20 2.2.2 Dụng cụ 20 2.2.3 Hóa chất 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu .22 2.3.2 Phương pháp phân tích 22 2.3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 22 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [5] 25 2.4.1 Tính đặc hiệu chọn lọc 26 2.4.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 26 2.4.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .29 2.4.4 Xác định độ lặp lại (độ xác) 31 2.4.5 Xác định độ 32 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 35 3.2 Tối ưu điều kiện xác định Flavonoid thiết bị HPLC 35 3.2.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng xác định 35 3.2.2 Lựa chọn pha tĩnh để tách chất flavonoids .35 3.2.3 Khảo sát lựa chọn tốc độ pha động 36 3.2.4 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ buồng cột: 36 3.2.5 Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu: .37 3.2.6 Khảo sát pha động 38 3.2.7 Khảo sát chương trình gradient 42 3.3 Khảo sát trình xử lý mẫu : 45 3.3.1 Phương pháp xử lý mẫu xác định chất Flavonol Aglycon .47 IV Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang 3.3.2 Phương pháp xử lý mẫu xác định chất Isoflavon .47 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích: 48 3.4.1 Độ đặc hiệu chọn lọc bước sóng phân tích 48 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại hệ thống 49 3.4.3 Khảo sát lập đường chuẩn 51 3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 52 3.4.5 Độ lặp lại phương pháp: 54 3.4.6 Độ phương pháp 57 3.5 Áp dụng phân tích số mẫu thực tế: .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 79 V Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile Acetonitril GC Gas chromatography Sắc ký khí AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa Chemists học phân tích thức EU European Union Châu Âu HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IUPAC International Union of Pure and Liên minh quốc tế hóa học Applied Chemistry ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng MeOH Methanol metanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE solid phase extraction Chiết pha rắn UV Ultraviolet Tử ngoại VIS Visible Vùng ánh sáng nhìn thấy R Recovery Độ thu hồi S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu nhiễu ppm Parts per million Nồng độ phần triệu USP United States Phamacopeia Dược điển Mỹ USFDA United States Food and Drug Cục dược phẩm thực phẩm Administration Mỹ VI Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học số flavonoid xác định đề tài Bảng 1.2: Các phương pháp phân tích flavonoid HPLC 12 Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn 21 Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc chất 21 Bảng 2.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) .32 Bảng 2.4: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 33 Bảng 2.5: Quy định độ thu hồi hội đồng châu Âu 33 Bảng 3.1: Danh mục pha động khảo sát .39 Bảng 3.2: Mối quan hệ hàm lượng flavonoid (mg/viên) viên nén Ginkgo Intensiv với thể tích methanol dùng để chiết mẫu .46 Bảng 3.3 Mối quan hệ hàm lượng isoflavonoid (mg/g) bột đậu nành với dung môi dùng để chiết 48 Bảng 3.4: Các phương trình hồi quy tuyến tính mối tương quan diện tích pic nồng độ flavonoid .51 Bảng 3.5: LOD LOQ flavonoid .53 Bảng 3.6: Độ lặp lại phương pháp 54 Bảng 3.7: Kết phân tích độ thu hồi, độ lặp lại 55 Bảng 3.8: Kết phân tích độ thu hồi, độ lặp lại 55 Bảng 3.9: Độ lặp lại Daizdein 56 Bảng 3.10: Độ lặp lại Genistein 56 Bảng 3.11: Độ phương pháp 57 Bảng 3.12: Độ thu hồi Daizdein 59 Bảng 3.13: Độ thu hồi Genistein 59 VII Luận văn thạc sĩ Hồng Quỳnh Trang DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc chung flavonoid .3 Hình 1.2: Cấu trúc chung euflavonoid Hình 1.3: Cấu trúc chung isoflavonoid Hình 1.4: Cấu trúc chung neoflavonoid Hình1.5 : Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 19 Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 23 Hình 2.2 Đồ thị tương quan tín hiệu đo nồng độ chất phân tích 27 Hình 2.3 Đường chuẩn mẫu thực .28 Hình 2.4: Xác định LOD cách tính S/N 30 Hình 3.1: Sắc đồ phân tích chất flavonoid cột ODS Inersil 36 Hình 3.2: Sắc đồ phân tích chất flavonoid với tốc độ 0,9ml/min .36 Hình 3.3: Sắc đồ phân tích chất flavonoid với nhiệt độ buồng cột 450C 37 Hình 3.4 Sắc đồ phân tích flavonoid với thể tích tiêm mẫu 50µl 38 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): ACN (B) acid acetic 0,1%; 40 Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm 40 (A): ACN (B): acid acetic 0,1%; 1%TCA 40 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): methanol (B): acid acetic 0,1%; 1%THF .41 Hình 3.8: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): methanol (B): acid formic 0,1%; 1%THF 41 Hình3.9: Sắc đồ tách hỗn hợp flavonoid cột C18 tốc độ dòng 1ml/phút theo chương trình Gradient 43 Hình 3.10 Sắc đồ tách hỗn hợp flavonoid cột C18 tốc độ dịng 1ml/phút theo chương trình Gradient 43 Hình 3.11 Sắc đồ tách hỗn hợp flavonoid cột C18 tốc độ dịng 1ml/phút theo chương trình Gradient 44 Hình 3.12: Đường chuẩn EGCG .51 VIII Luận văn thạc sĩ Hồng Quỳnh Trang Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn LOD flavonoid bước sóng 360nm 52 Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn LOD flavonoid bước sóng 260nm 53 Hình 3.15 Quy trình phân tích mẫu thực 60 IX