Xá định hàm lượng một số flavonoids trong thự phẩm bằng kỹ thuật sắ ký lỏng hiệu năng ao

Phương pháp phân ễmin dịch phóng xạradioimmunoassay – RIA [28] Hiện nay, RIA phương pháp phân tích miễn dị phóng xạ ch được sử ụ d ng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y họ nô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- 

-HOÀNG QUỲNH TRANG

TRONG TH C PH Ự Ẩ M B NG KỸ Ằ THU T Ậ

LUẬN VĂN THẠ SĨ C KHOA H C Ọ

1 TS LÊ THỊ Ồ H NG HẢO

2 PGS.TS NGUYỄ N TH MINH TÚ Ị

HÀ N – Ộ I 2014

L I CAM Ờ ĐOAN

L I C Ờ ẢM ƠN

văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,

Hà Nội, năm 2014

M C L C Ụ Ụ LỜI CAM ĐOAN I

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 20

2.1.Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Hóa ch t và dấ ụng cụ nghiên c u 20ứ 2.2.1 Thi t b 20ế ị 2.2.2 D ng c 20ụ ụ 2.2.3 Hóa ch t 21ấ 2.3.Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1.Phương pháp lấy mẫu 22

2.3.2.Phương pháp phân tích 22

2.3.3 Xây d ng quy trình x lý m u 22ự ử ẫ 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [5] 25

2.4.1.Tính đặc hiệu và chọ ọn l c 26

2.4.2 Kho ng tuyả ến tính và đường chu n 26ẩ 2.4.3 Gi i h n phát hi n (LOD) và gi i hớ ạ ệ ớ ạn định lượng (LOQ) 29

2.4.4.Xác định độ ặ l p lại (độ chính xác) 31

2.4.5 Xác định độ đúng 32

2.5.Phương pháp xử lý s li u 34ố ệ CHƯƠNG 3: KẾ T QU VÀ BÀN LU N 35 Ả Ậ 3.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 35

3.2 Tối ưu điều kiện xác định Flavonoid trên thiế ịt b HPLC 35

3.2.1 Kh o sát lả ựa chọn bước sóng xác định 35

3.2.2 Lựa chọn pha tĩnh để tách các chất flavonoids 35

3.2.3 Kh o sát và lả ựa chọ ốc độ pha độngn t 36

3.2.4 Kh o sát lả ựa chọn nhiệt độ bu ng c t: 36ồ ộ 3.2.5 Kh o sát lả ựa chọn th tích tiêm m 37ể ẫu: 3.2.6 Khảo sát pha động 38

3.2.7 Khảo sát chương trình gradient 42

3.3 Kh o sát quá trình x lý m u : 45ả ử ẫ 3.3.1.Phương pháp xử lý mẫu xác định các chất Flavonol Aglycon 47

3.3.2.Phương pháp xử lý mẫu xác định các chất Isoflavon 47

3.4.Đánh giá phương pháp phân tích: 48

3.4.1.Độ đặc hiệu và ch n lọ ọc của bước sóng phân tích 48

3.4.2.Đánh giá độ ặ l p lạ ủa hệ ối c th ng 49

3.4.3 Kh o sát lả ập đường chu n 51ẩ 3.4.4 Gi i h n phát hi n, gi i hớ ạ ệ ớ ạn định lượng 52

3.4.5.Độ ặp lạ ủa phương pháp: l i c 54

3.4.6.Độ đúng của phương pháp 57

3.5 Áp d ng phân tích mụ ột số ẫ m u thực tế: 59

K T LU N VÀ KI N NGH Ế Ậ Ế Ị 66

TÀI LI U THAM KH O Ệ Ả 73

PH L C Ụ Ụ 79

chromatography

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

MeOH Methanol metanol

USFDA United States Food and Drug

Administration

DANH M C B NG Ụ Ả

B ng 1.1: C u trúc hóa hả ấ ọc của mộ ố flavonoid được xác định trong đề àit s t 7

B ng 1.2: Các ph ng pháp phân tích flavonoid b ng HPLC 12ả ươ ằ B ng 2.1: Danh mả ục các chất chu n 21ẩ B ng 2.2: Nả ồng độ dung d ch chu n gị ẩ ốc của từng ch t 21ấ Bảng 2.3 Độ ặ ạ ối đa chấ l p l i t p nh n tậ ại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 32

Bảng 2.4: Độthu hồi ch p nh n ấ ậ ởcác nồng độ khác nhau theo AOAC 33

Bảng 2.5: Quy định v thu hề độ ồi của hội đồng châu Âu 33

B ng 3.1: Danh mả ục các pha động khảo sát 39

Bảng 3.2: Mối quan hệ ữa hàm lượng các flavonoid (mg/viên) trong viên nén gi Ginkgo Intensiv v i th ớ ể tích methanol dùng để i t m u 46ch ế ẫ Bảng 3.3 Mối quan hệ ữa hàm lượng các isoflavonoid (mg/g) trong bột đậu nành gi với 3 dung môi dùng để chi t 48ế Bảng 3.4: Các ph ng trình hươ ồi quy tuyến tính mối t ng quan giươ ữa diện tích pic và nồng độ các flavonoid 51

B ng 3.5: LOD và LOQ c a các flavonoid 53ả ủ Bảng 3.6: Độ ặ ạ ủ l p l i c a ph ng pháp 54ươ B ng 3.7: K t qu ả ế ả phân tích độ thu hồi, độ ặ ạ l p l i 55

B ng 3.8: K t qu ả ế ả phân tích độ thu hồi, độ ặ ạ l p l i 55

Bảng 3.9: Độ ặ ạ ủ l p l i c a Daizdein 56

Bảng 3.10: Độ ặ l p lạ ủi c a Genistein 56

Bảng 3.11: Độ đúng của ph ng pháp 57ươ Bảng 3.12: Độ thu hồi của Daizdein 59

Bảng 3.13: Độ thu hồi của Genistein 59

ACN và (B) acid acetic 0,1%; 40

(A): ACN và (B): acid acetic 0,1%; 1%TCA 40

methanol và (B): acid acetic 0,1%; 1%THF 41

methanol và (B): acid formic 0,1%; 1%THF 41

Hình 3.13: Sắc đồ y chu n LOD c a các flavonoid b c sóng 360nm 52chạ ẩ ủ ở ướ

ĐẶ T V ẤN ĐỀ

khỏe của mình Tuy nhiên cuộc sống hội nhập khiến con người ngày càng bận rộn

thực phẩm chức năng thì không phải ai cũng tường tận Thực phẩm chức năng là

loại thực phẩm Do nhiều công dụng của các flavonoid mà các dược liệu này được

th ị trường Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào hiện nay xác định xem liệu chất

năng quan tâm

phẩm nhập khẩu, bảo đảm an toàn thực phẩm đối với thực phẩm trong nước và xuất

trong nước mà ph i tho mãn các đi u ki n kh t khe c a khu v c và trên th gi i, ả ả ề ệ ắ ủ ự ế ớ

CH ƯƠNG 1 TỔ NG QUAN

1.1.1 Khái ni m v Flavonoid ệ ề [4]

diol, flavanon, 3-hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon uron

Commented [L1]: Title ko có d u hai ch ấ ấm

Commented [L2]: Format chưa chu n: chưa căn 2 bên ẩ

Hình 1.3: Cấ u trúc chung c ủ a các isoflavonoid

isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen,

coumaronochromon, dihyroisochalcon, homoisoflavon

Hình 1.4: C ấ u trúc chung củ a các neoflavonoid

1.1.3 Tính chất ủ c a flavonoid [4]

Commented [L3]: Format chưa chu n: chưa căn 2 bên ẩ

flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường d tan trong dung d ch ki m loãng ễ ị ề

1.1.4 Tác d ụ ng sinh học củ a Flavonoid

- Tác dụng estrogen: Các dẫn ch t thu c nhóm isoflavonoid có tác d ng ấ ộ ụ

diethylstilbestrol [4]

Sarothamus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capitata, quercitrin trong cây

1.2 Gi i thi v các flavonoids trong nghiên c u ớ ệ u ề ứ

B ng 1.1: C ả ấ u trúc hóa học của mộ ố flavonoid được xác định trong đề t s tài

Công thức phân tử

phân tử (g/mol)

tan trong dung

tan trong dung

Trong th c phự ẩ ECG và EGCG có trong hoa lơ xanh, rau chân vịm t, dâu tây

Hành tây có chứa lượng lớn chất quercetin rất tốt cho việc làm giảm huyết áp và

Tác dụng c a ki m: nủ ề ếu hơ một tổ chức th c vậự t (cánh hoa, lát c t cắ ủa gỗ),

nhóm flavonoid

tiến hành nghiên cứu xác định nhóm hợp chất này bằng nhiều phương pháp khác

1.4.1 Phương pháp phân ễ mi n dịch phóng xạ (radioimmunoassay – RIA) [28]

s dử ụng một phương pháp RIA để xác định chất isoflavone trong bia và đo

1.4.2 Phương pháp sắ c ký lỏng

B ng 1.2: ả Các phương pháp phân tích flavonoid bằ ng HPLC

Phương

Các thông s ố Phương

5µm)

Pack,

ODS-AM-303 (250 x 4,6mm; 5µm)

Phenomexex (150 x 2mm; 3µm)

âm sau 15 phút,

nhược điểm của phương pháp là sử ụng acid phosphoric làm pha độ d ng nên có th ể

genistein và glycitein

dụng là 35% A và 65 % B vào ban đầu , tăng lên đến 95% B sau 10 phút, duy trì

phút , tổng thời gian tách dưới 10 phút Các giới hạn phát hiện của daidzein và

gradient sau: 100% A và B 0% ban đầu , tăng lên đến 40 % B sau 0,5 phút và duy

1.5 Phương pháp HPLC

1.5.1 Nguyên t ắ c chung củ ắc ký lỏng a s

8, 9]

Pha tĩnh trong sắ c ký lỏng [

Pha độ ng trong s c ký l ng [8, 9] ắ ỏ

- Phải có độ tinh khiết cao, có độ nh t th p và phù h p v i detector ớ ấ ợ ớ

Detector trong s c ký [3, 8, 9] ắ

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến, như detector PDA,

1.5.2 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [1, 7]

Hình1.5 : Sơ đồ ấ c u tạ ệ ố o h th ng HPLC

1.6.1 M c tiêu ụ

CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ 2 U

Isoflavon), luteolin, myricetin

- Máy rung siêu âm (Elma, Germany),máy ly tâm

Commented [L4]: Thay mục này bằng m c tiêu dung NC ụ ở trên

Commented [L5]: N ếu có hình hệ HPLC thì đưa vào đây và bình luận 1 chút về ưu đi m /đ c đi m của nó, nếu có thể ể ặ ể

2.3 Phương pháp nghiên cứ u

2.3.1 Phương pháp lấ y mẫ u

- Đối tượng mẫu: Các sản phẩm có nguồn gốc đậu tương như (sữa đậu nành,

mầm đậu nành, bột đậu nành) và thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ trong việc

giảm cân, làm đẹp, tăng cường sinh lực

2.3.2 Phương pháp phâ n tích

2.3.3 Xây d ng quy trình x lý m u ự ử ẫ

b ộ

Commented [L8]: D ẫn xuất ở bước nào?

Commented [L9]: Trước khi vào các mục nhỏ, nên giới thiệu

m ẫu sẽ được xử lý qua các giai đoạn nào, bước nào c ần cho mẫ u gì, sau đó m ớ i chi ti ế t các bư ớc ra Để ế th này c th y rối và ko theo dõi ứ ấ đượ c đ ố ớ i v i 1 lo i m u cụ ể ạ ẫ th nào đó

Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích m u d ki n ẫ ự ế

+ Với viên nén: lấy 20 viên nén, cân trên cân phân tích có độ chính xác đến

+ Với viên nang cứng: lấy 20 viên nang cứng, cân trên cân phân tích có độ

+ Với viên nang mềm: Lấy 20 viên nang mềm, cân trên cân phân tích có độ

chính xác đến 0,0001g, tháo v nang, ph n dỏ ầ ịch trong nang được trộn đều đồng

0,45µm, phân tích trên HPLC

Commented [L11]: Các tiêu đ ề, dù nhỏ cũng nên có format khác

để chú ý vói ngườ ọ i đ c, và th ng nh t gi a các ph n khác nhau ố ấ ữ ầ

- Áp dụng với các đối tượng mẫu là các sản phẩm thực ẩm (thường là các ph

- Với sản phầm dạng lỏng: Hút chính xác 10ml cho vào ống ly tâm 50ml

Theo quy định của USFDA, AOAC, USP các thông số cần thẩm định bao gồm

các yếu tố chính sau:

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào: Kỹ thuật áp dụng, yêu

cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thí nghiệm, trong phạm vi

và thời gian nghiên cứu, chúng tôi thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương

pháp thông qua việc đánh giá các thông số: Tính chọn lọc, khoảng tuyến tính và

đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng (thông qua hiệu

(trueness)+ độ chụm (precision)

2.4.1 Tính đặ c hiệu và chọn ọ l c

- Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp

chất khác như tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự tạp chất… Cụ thể,

trong phép phân tích định tính đó phải chứng minh được kết quả là dương tính khi

có mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt chất phân tích mà có mặt các tạp

chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là

khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả

các yếu tố khác nhằm hướng tới kết quả chính xác nhất.Tính đặc hiệu thường liên

quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích

một số hoặc nhiều chất trong chung một quy trình Nếu chất cần phân tích xác định

rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc Như vậy, tính chọn

lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu do các phương pháp phân tích thường có nhiều

chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

- Cách thực hiện: Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp cần bố

trí tiến hành thí nghiệm như sau:

không được cho tín hiệu chất phân tích

+ Phân tích mẫu thử hoặc mẫu thêm chuẩn, lặp lại tối thiểu 6 lần Mẫu thêm chuẩn

hoặc mẫu thử phải có tín hiệu chất phân tích

2.4.2 Khoảng tuyến tính và đườ g chuẩ n n

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới

hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nồng độ chất phân tích

có mặt trong nền mẫu

• Cách xác định khoảng tuyến tính:

Để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (thường là 6) nồng độ

sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng

Commented [L13]: Có cần mục này ở đây ko, đây hoàn toàn là

lý thuyết, mà ở đây chương 2 là thực nghi ệm, nếu ko nêu ng n g ắ ọn sự

c ần thiế ể t đ d ẫn vào cách làm thôi

độ và quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính

dài hay ngắn phụ thuộc và nhiều yếu tố trong đó quan trọng nhất là bản chất của

chất phân tích và kỹ thuật sử dụng Các chất khác nhau có khoảng tuyến tính khác

nhau do sự khác nhau về tính chất lý hóa

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ

số hồi quy tương quan Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn

ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn

bộ khoảng tuyến tính Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao

nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ

thuật khác nhau, sau đây là các loại đường chuẩn chủ yếu:

Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn, xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương

ứng với nồng độ x Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn

là một phương trình đường thẳng: y = ax + b

b là giá trị hệ số chặn intercept

Hình 2.2 Đồ ị tương quan giữ th a tín hi ệu đo và nồng độ ch t phân tích ấ

Đường chuẩn trên nền mẫu trắng

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ khác nhau, trong khoảng

Commented [L14]: Đóng mở ngoặc với tiếng Anh

tuyến tính ước lượng ở trên Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu đo nồng độ Đường

chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng thường cho độ tin cậy cao hơn so với xây dựng

trên chuẩn tinh khiết vì có thể loại trừ phần nào các ảnh hưởng của nền mẫu Tuy

nhiên nhiều trường hợp khó tìm được nền mẫu trắng phù hợp và không có chất phân

tích Do đó, có thể sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực

Đường chuẩn trên mẫu thực:

như trong phần làm với mẫu trắng Vẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) phụ

thuộc vào nồng độ chuẩn thêm, dạng đường chuẩn trên nền mẫu thực thường có

dạng như hình dưới:

Hình 2.3 Đườ ng chu n trên n n m u th c ẩ ề ẫ ự

Khi sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực có thể loại trừ được các

ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Sau khi lập được phương trình

đường chuẩn y = ax + b, có thể dễ dàng tính được nồng độ X = b/a

- Cần đảm bảo nồng độ chính xác: Đường chuẩn là yếu tố quyết định sự đúng đắn

của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn mắc những

sai số lớn sẽ dẫn đến sự mất chính xác của kết quả Để kiểm soát được nồng độ

chuẩn, điều đầu tiên là kiểm soát được chất chuẩn (chất chuẩn mua từ nhà sản xuất)

Commented [L15]: Có các kiể u đư ờ ng chuẩn rồi, có cần mục này nữa ko?

dựng đường chuẩn, cần tiến hành cẩn thận, chính xác.

- Tín hiệu đo của nồng độ phải có độ lặp đạt yêu cầu, nghĩa là phương pháp có độ

chọn lọc, không bị lẫn tạp, đồng thời độ ổn định của thiết bị cao

- Loại trừ sai số thô nếu cần thiết: Một số trường hợp, có thể gặp các sai số thô

(ngẫu nhiên) xuất hiện trong phân tích dẫn đến việc đường chuẩn xây dựng không

đáp ứng yêu cầu Trong trường hợp này, có thể cân nhắc loại trừ những điểm này để

đảm bảo sự chính xác

• Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

là hệ số tương quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1

- Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi xây dựng đường

chuẩn sử dụng xây dựng đường chuẩn, tính giá trị độ chệch theo công thức sau:

CCCc c

i−

Theo quy định của các tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, giá trị độ chệch

không được vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOD có thể

chấp nhận giới hạn ±20%

2.4.3 Gi i h n phát hi n (LOD) và gi i h ớ ạ ệ ớ ạ n đ nh lư ị ợ ng (LOQ)

• Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác

định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm

cụ thể Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu mà hệ thống có thể

phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

Commented [L16]: Thường là R2

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)

Cách xác định: Phân tích mẫu (có thể thực hiện trên mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân

Signal to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền

-đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

Hình 2.4: Xác đị nh LOD b ng cách tính S/N ằ

• Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà tại đó ta có thể định lượng được bằng phương pháp phân tích và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng

Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ phụ thuộc vào từng phương pháp, kỹ thuật và điều kiện trang thiết bị cụ thể mà lựa chọn phương pháp xác định, tính toán cho phù hợp

Cách xác định: Trong sắc ký, có thể xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu chất phân tích và nhiễu đường nền LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích

mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10)