Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI H C BÁCH KHOA HÀ NỘI ỌLUẬN VĂN TH C SĨ ẠNghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hi u virus Dengue ệCẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng th ời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue CẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướ ng dẫ n: PGS TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ Sinh họ c Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132203881000000 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng th ời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue CẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướ ng dẫ n: PGS TS Trương Quốc Phong Viện: Chữ ký GVHD Công nghệ Sinh họ c Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lậ p – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CH ỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Cả nh Huy ền Trang Đề tài luận văn: Nghiên cứu phát tri ể n que thử nhanh phát hiệ n đ ng thời IgG IgM đặ c hiệu virus Dengue Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: CB170124 Tác giả , Người hướng d ẫn khoa họ c Hộ i đồ ng chấ m luậ n văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hộ i đồ ng ngày 30 tháng 10 năm 2020 với nội dung sau: Sửa đổi số thuật ngữ Sửa lỗi tả, in ấ n Bổ sung trích dẫ n hình ảnh phần tổng quan Sửa đổ i cách trình bày tài liệu tham khảo Bổ sung số lượng mẫ u thử phả n ứng chéo Bổ sung cách tính độ nhạy, độ đặ c hiệ u que thử Ngày Giáo viên hướng dẫ n tháng năm 2020 Tác giả luận văn CHỦ TỊ CH HỘI ĐỒNG LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Bả n luậ n văn nghiên cứu với h ỗ trợ củ a Phịng thí nghiệm kỹ thuật Protein - Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh họ c, Đại học Bách khoa Hà Nội Các kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, số liệ u, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọ i liệu, hình ả nh trích d ẫn tham khảo luận văn đề u thu thập sử d ụng nguồn liệu mở trích d ẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm với cam đoan Học viên Cảnh Huyền Trang LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Phó Viện trưởng Việ n Công nghệ sinh họ c công nghệ th ực phẩm, Trưởng phịng thí nghiệm Proteomics ln tậ n tình hướng dẫ n, đ ộng viên giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học tạo điều kiệ n tố t nhấ t để tơi hồn thàn h lu ận văn Tơi xin gửi lời m ơn tới bạn sinh viên, học viên làm việ c phịng thí nghiệm Proteomics, đặc biệ t bạ n Tr ần Vân Trang, K61 - Công nghệ sinh học, giúp đỡ đồ ng hành tơi q trình thực nghiên cứu Kinh phí để thực nghiên cứu hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu tạo que thử nhanh phát hiệ n virus Dengue ứng dụng phát tác nhân gây bệ nh sốt xuất huyết”, mã số B2020- BKA- 08 Bộ Giáo d ục Đào tạ o tài tr ợ Tôi xin chân thành cảm ơn Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán Khoa Kiểm đị nh Hóa lý – Viện Kiểm định Vắc xin Sinh phẩm y tế tạo mọ i điề u kiện tố t nhấ t cho hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình người thân ủng hộ, động viên, tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Người viế t báo cáo Cảnh Huyền Trang TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: “Nghiên cứu phát triển que thử nhanh phát hiệ n đồ ng thời IgG IgM đặ c hiệu virus Dengue” Tác giả luậ n văn: Cảnh Huyền Trang Khóa: 2017B Người hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong Từ khóa (Keyword): Nội dung tóm tắt: a) Lý chọ n đề tài: Bệ nh sốt xuấ t huyết Dengue (SXHD) bệnh nhiễm virus dengue cấ p tính muỗi Aedes aegypti (thường gọ i muỗi vằ n) truy ền SXHD bệnh ghi nhận có từ k ỷ 18, số ca bệ nh có xu hướng liên tục tăng lên vòng 50 năm gần Hiện chưa có vắc xin giúp phòng (ngừa) b ệnh SXHD cách hiệu quả, chưa có thuố c hay phương pháp điề u trị mang tính đặc hiệ u đố i với bệ nh SXHD Theo Tổ chức y tế giới (WHO), hiệ n bệnh lưu hành 128 quốc gia, 3,9 tỷ người số ng vùng nguy mắ c bệ nh, hang năm có khoảng 390 triệu người nhiễm b ệnh Bệnh có xu hướng phổ biế n nước nhiệ t đ ới c ận nhiệ t đới, coi nguyên nhân hang đầu dẫn đế n tình trạ ng nhập viện, tử vong khu vực Bệ nh SXHD có mặ t hầ u hế t tỉnh/thành phố tạ i Việt Nam, tính từ đầu năm 2020 đến ngày 15 tháng năm 2020, nước ghi nhậ n 65.046 trường h ợp mắc SXHD, có trường h ợp tử vong Bệnh nguy hiểm với nguy tử vong cao khơng phát sớm, xác xử lý kị p thời Hiện việc chẩn đoán virus Dengue thực nhiều phương pháp như: phương pháp nuôi cấy, phân lập virus; phương pháp huyết học (ELISA-NS1 phát kháng nguyên NS1; Mac-ELISA phát kháng thể); kỹ thu ậ t sinh học phân tử (Nested RT-PCR; Real-time RT-PCR) Tuy nhiên phương pháp c lộ nhiều hạ n chế thời gian phân tích kéo dài, cho k ết chậm, khơng phù hợp việc chẩn đốn điề u trị , chủ yế u phụ c vụ công tác giám sát dịch tễ; mặt khác đòi hỏ i trang thiết bị đắt tiề n, nhân viên thực cầ n phải đào tạo giá thành phân tích cao Trong bệnh SXHD xuấ t mọ i nơi, từ thành phố l ớn đế n vùng nông thôn Việc xét nghiệm cần thực tạ i nhiều sở k ể c ả sở có hệ thống trang thiết bị cịn thơ sơ, kỹ thu ật cao hồn tồn khơng phù hợp Thực tế nay, sở xét nghiệ m đề u có nhu cầ u sử d ụng que thử nhanh, nhiên hoàn toàn phải nhậ p khẩ u sinh phẩ m Việc nhậ p d ẫn đến mộ t số v ấ n đề không chủ độ ng ngu ồn sinh phẩ m, giá thành cao Do đó, việ c phát triể n que thử nhanh phát virus Dengue cách đơn giản, khơng địi hỏi trang thiế t bị chuyên dụ ng, với độ nhạ y, đ ộ đặ c hiệu cao đặc biệt từ nguồn gen virus Việ t Nam mộ t đề tài thực có ý nghĩa v ề khoa học thực tiễn Chính vậ y, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phát triển que thử nhanh phát đồ ng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue” b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đố i tượng, phạ m vi nghiên c ứu - Mục đích: Tinh protein NS1 tái tổ hợp có hoạt tính, xác định điều kiện thích hợp để chế tạo que thử nhanh phát đồ ng th ời IgG IgM đ ặc hiệu virus Dengue xác định đặ c tính củ a que thử - Đối tượng: Đố i tượng nghiên cứu củ a đề tài que thử nhanh phát đồ ng th ời IgG IgM đ ặ c hiệu virus Dengue - Phạm vi: quy mô phịng thí nghiệm c) Tóm tắt đọng nội dung đóng góp tác giả - Tinh protein NS1 tái tổ hợp kiể m tra đặc tính c protein NS1 tái tổ hợp - Nghiên cứu tối ưu điều kiện tạ o cộng h ợp kháng nguyên (protein NS1 tái tổ h ợp) hạ t nano vàng - Nghiên cứu tối ưu điều kiệ n phun kháng thể kháng IgG kháng thể kháng IgM lên màng lai - Nghiên cứu xác định đặc tính que thử d) Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp vi sinh: + Phương pháp nuôi cấy giữ giống vi sinh vật + Phương pháp tạo tế bào khả biến + Phương pháp biến nạp vào E coli + Phương pháp biểu protein NS1 tái tổ hợp vi khuẩn E coli - Phương pháp hóa sinh: + Phương pháp điện di SDS-PAGE + Phương pháp tách chiết protein + Phương pháp tinh protein + Phương pháp Dot Blot + Phương pháp ELISA - Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch e) Kết luận - Tinh protein NS1 tái tổ h ợp có hoạt tính với hiệu suất thu hồi sau đổi đệ m đạt 93,2% - Tối ưu điều kiệ n chế tạo que thử, bao gồm: + Điề u kiện tạ o cộng h ợp: kích thước hạ t vàng: 15 nm; hàm lượng NS1 tạo cộng hợp: µg/miếng cộ ng hợp; pH tạo cộng hợp: pH = 9; nhiệt độ tạo cộng hợp: 4°C; th ời gian tạo cộng hợp: 30 phút; nhiệ t độ s ấ y miếng c ộng h ợp: 37°C; thời gian sấy miếng cộng hợp: 30 phút + Điề u kiện cố đị nh kháng thể kháng IgG IgM lên màng lai: hàm lượng kháng thể kháng IgM cố đị nh lên màng lai: 0,5 µg/que; nhiệ t đ ộ x lý màng lai: 37°C; thời gian sấy màng lai: 30 phút; đệ m cố định kháng thể lên màng lai: IB (2% Sucrose/20 mM SB - Xác định mộ t số đặ c tính củ a que thử, bao gồ m: độ l ặp lạ i (đ ạt yêu cầu); phản ứng chéo (không phản ứng với virus cúm, sởi gây triệu chứng lâm sàng giống Dengue); độ nhạ y (87%); độ đặ c hiệu (100%); thể tích mẫu huyết cầ n tải lên que thử (10 µl) MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh sốt xuất huyết Dengue .3 1.1.1 Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) 1.1.2 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết Dengue giới 1.1.3 Tình hình dịch bệnh s ốt xuất huyế t Châu Á – Thái Bình Dương 1.1.4 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết diễn Việ t Nam 1.2 Virus Dengue 10 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc virus Dengue 10 1.2.2 Đặc điểm di truyề n virus Dengue 11 1.2.3 Đặc điểm protein NS1 13 1.2.4 Quá trình nhân lên virus tế bào 14 1.2.5 Protein NS1 – dấu ấn sinh học cho chẩn đoán sớm sốt xuất huyết 15 1.3 Một số phƣơng pháp chẩn đoán sốt xuất huyết 16 1.3.1 Phương pháp phân lập virus 17 1.3.2 Phương pháp chẩn đốn dựa phát axít nucleic 18 1.3.3 Phương pháp chẩn đoán qua xét nghiệm huyết 18 1.4 Que thử 21 1.4.1 Nguyên lý que thử 21 1.4.2 Đặc tính thành phần que th 22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu 25 i 2.1.1 Hóa chất kháng thể 25 2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp vi sinh 27 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 29 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng nguyên – hạt nano vàng 33 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp c ố định kháng thể lên màng nitrocellulose 35 CHƢƠNG KẾT QU Ả VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Kết tinh kháng nguyên - protein tái tổ hợp NS1 37 3.1.1 Tinh kháng nguyên NS1 tái tổ hợp 37 3.1.2 Kết đổi đệm tái cuộn gấp NS1 38 3.1.3 Kiểm tra NS1 tái tổ hợp với kháng thể đơn dòng thương mại kháng NS1 40 3.1.4 Kiểm tra kh ả bắt cặp đặc hiệ u protein NS1 tái tổ hợp tinh với IgM huy ết dương tính với virus Dengue 41 3.2 Kết nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng nguyên – hạt nano vàng 42 3.2.1 Kích thước hạt vàng 42 3.2.2 Hàm lượng kháng thể tạo cộng hợp 43 3.2.3 pH tạo cộng hợp 44 3.2.4 Nhiệt độ tạo cộng hợp 45 3.2.5 Thời gian tạo cộng hợp 46 3.2.6 Nhiệt độ sấy miếng cộng hợp 47 ii