Nghiên ứu phát triển que thử nhanh xá định đồng thời igg và igm đặ hiệu virus dengue

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI H C BÁCH KHOA HÀ NỘI ỌLUẬN VĂN TH C SĨ ẠNghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hi u virus Dengue ệCẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định

CẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướ ng d n: PGS TS Trương Quốc Phong ẫ Viện: Công nghệ Sinh h c và Công ngh ọ ệ Thực phẩm

HÀ NỘI, 2020

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132203881000000

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ NỘI Ọ

Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định

CẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướ ng d n: PGS TS Trương Quốc Phong ẫ

Viện: Công nghệ Sinh h c và Công ngh ọ ệ Thực phẩm

HÀ NỘI, 2020

Chữ ký của GVHD

CỘNG HÒA XÃ H I CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Ộ

Độ ậ c l p – Tự – H do ạ nh phúc

BẢN XÁC NHẬN CH Ỉ NH SỬ A LU Ậ N VĂN TH C SĨ Ạ

H ọ và tên tác giả luận văn : Cả nh Huy n Trang ề

Đề tài luận văn: Nghiên cứ u phát tri n que th nhanh phát hi n đ ng ể ử ệ ồ

thờ i IgG và IgM đ c hi u virus Dengue ặ ệ

Chuyên ngành: Công ngh Sinh hệ ọc

Mã số SV: CB170124

Tác giả, Ngư i hướờ ng d n khoa h c và Hộ ồẫ ọ i đ ng ch m lu n văn xác nhận ấ ậtác giả đã s a chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hộ ồử i đ ng ngày 30 tháng

10 năm 2020 với các nội dung sau:

1 Sửa đổi một s ốthuật ngữ

2 Sửa lỗi chính tả, in n ấ

3 Bổ sung trích d n cẫ ủa các hình ảnh trong phần tổng quan

4 Sửa đổi cách trình bày tài li u tham khảo ệ

5 Bổ sung số lượng m u th ph n ẫ ử ả ứng chéo

6 Bổ sung cách tính độ nhạy, độ đặ c hi u c a que th ệ ủ ử

Ngày tháng năm 2020

Giáo viên hướ ng d n ẫ Tác giả luận văn

CHỦ TỊ CH H I ĐỒNG Ộ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Bản lu n văn là nghiên cứu cậ ủa tôi v i sớ ự ỗ h trợ ủ c a Phòng thí nghiệm kỹ thuật Protein - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Bách khoa Hà Nội Các kết quả nghiên c u trong luứ ận văn hoàn toàn trung thực, các số ệ li u, tính toán là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào

Mọ ữi d liệu, hình ảnh và trích d n tham kh o trong luẫ ả ận văn đ u đưề ợc thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở ặ ho c được trích d n rõ nguồn gốc ẫ

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Học viên

C ả nh Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày t lòng biỏ ết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Phó Viện trưởng Vi n Công ngh sinh h c và công nghệ ệ ọ ệ th c phẩm, ựTrưởng phòng thí nghiệm Proteomics đã luôn t n tình hưậ ớng d n, đ ng viên và ẫ ộgiúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Trung tâm nghiên cứu

và phát triển Công ngh sinh hệ ọc đã tạo điều ki n tốệ t nh t để tôi hoàn thành luận ấvăn của mình

Tôi xin gử ờ ải l i c m ơn t i các b n sinh viên, học viên làm vi c tớ ạ ệ ại phòng thí nghiệm Proteomics, đặc biệt là b n Tr n Vân Trang, K61 - Công ngh sinh hạ ầ ệ ọc,

đã luôn giúp đỡ và đ ng hành cùng tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu ồKinh phí để thực hiện nghiên cứu đượ ỗ ợc h tr t ừ đềtài “Nghiên cứu t o que ạthử nhanh phát hi n virus Denệ gue ứng dụng phát hi n tác nhân gây b nh sệ ệ ốt xuất huyết”, mã số B2020-BKA-08 do Bộ Giáo d c và Đào tạụ o tài tr Tôi xin chân ợthành cảm ơn

Xin gửi l i cờ ảm ơn chân thành tới các cán bộ trong Khoa Kiểm định Hóa

lý – Viện Kiểm định Vắc xin và Sinh phẩm y tế đã t o mọạ i điều kiện tốt nh t cho ấtôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày t lòng biỏ ết ơn tới gia đình và những người thân đã luôn ủng

hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Ngườ i vi t báo cáo ế

C ả nh Huyền Trang

Bệnh s t xu t huy t Dengue (SXHD) là bệnh nhiễm virus dengue c p tính ố ấ ế ấ

do muỗi Aedes aegypti (thường g i là muỗi vằọ n) truy n SXHD là bệnh được ghi ềnhận có từ ế ỷ th k 18, và số ca b nh có xu hướng liên tục tăng lên trong vòng 50 ệnăm gần đây Hiện nay vẫn chưa có vắc xin giúp phòng (ngừa) b nh SXHD m t ệ ộcách hiệu quả, và cũng chưa có thu c hay phương pháp điố ều tr nào mang tính ị

đặc hiệ ố ớ ệu đ i v i b nh SXHD Theo Tổ ứ ch c y tế ế ớ th gi i (WHO), hi n b nh lưu ệ ệhành ở 128 quốc gia, hơn 3,9 tỷ ngư i s ng trong vùng nguy cơ mắ ệờ ố c b nh, hang năm có khoảng 390 triệu người nhi m b nh Bệnh có xu hướng phổ biế ởễ ệ n các nước nhi t đ i và c n nhi t đ i, và được coi là một trong nh ng nguyên nhân ệ ớ ậ ệ ớ ữhang đầu dẫn đến tình tr ng nhập việ ửạ n, t vong ở khu vực này

Bệnh SXHD có m t h u h t các tỉặ ở ầ ế nh/thành ph t i Vi t Nam, tính từ đầu ố ạ ệnăm 2020 đến ngày 15 tháng 9 năm 2020, cả ớc ghi nh n 65.046nư ậ trường h p ợmắc SXHD, trong đó có 7 trường h p tử vong Bệnh rất nguy hiểm với nguy cơ ợ

t ửvong cao nếu không được phát hiệ ớn s m, chính xác và xử klý p thời ị

Hiện nay việc chẩn đoán virus Dengue có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp như: phương pháp nuôi cấy, phân lập virus; phương pháp huyết thanh học (ELISA-NS1 phát hi n kháng nguyên NS1; Macệ -ELISA phát hiện kháng thể); các kỹ thu t sinh học phân t ậ ử(Nested RT-PCR; Real-time RT-PCR) Tuy nhiên các phương pháp này bộ ộc l nhiều hạn ch ế như thời gian phân tích kéo dài, cho

kết quả chậm, không phù hợp trong việc chẩn đoán và điều tr , ch y u phụ ụị ủ ế c v công tác giám sát d ch tị ễ; mặt khác đòi hỏi các trang thiết bị đắ ềt ti n, nhân viên thực hiện c n phầ ải được đào tạo và giá thành phân tích cao Trong khi đó bệnh SXHD có thể xu t hiện ở ọấ m i nơi, từ thành ph l n đ n các vùng nông thôn ố ớ ếViệc xét nghiệm cần được th c hi n t i nhiều cơ sở ể ảự ệ ạ k c các cơ sở có hệ thống

trang thiết bị còn ít và thô sơ, do đó các kỹ thu t cao là hoàn toàn không phù hợp ậThực tế ệ hi n nay, các cơ sở xét nghiệm đều có nhu c u sầ ử ụ d ng que thử nhanh, tuy nhiên chúng ta hoàn toàn phải nhập kh u sinh ph m này Viẩ ẩ ệc nhập kh u dẩ ẫn

đến mộ ố ất s v n đ như không chề ủ động được ngu n sinh ph m, giá thành cao ồ ẩ

Do đó, việc phát tri n que thử ể nhanh có thể phát hiện được virus Dengue một cách đơn giản, không đòi hỏi trang thi t bế ị chuyên d ng, vớ ộ ạụ i đ nh y, đ c ộ đặhiệu cao và đặc biệt là từ nguồn gen virus tại Vi t Namệ là mộ ềt đ tài thực sự có ý nghĩa cả ề v khoa học và thực tiễn

Chính vì v y, chúng tôi tiậ ến hành th c hi n đ tài: “Nghiên cứu phát triển ự ệ ềque thử nhanh phát hiện đồng th i IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue” ờ

b) Mục đích nghiên cứu của luận văn, đố i tư ợ ng, ph m vi nghiên c ạ ứ u

- Mục đích: Tinh sạch protein NS1 tái tổ hợp có hoạt tính, xác định được điều kiện thích hợp để ế ch tạo que thử nhanh phát hiện đồng th i IgG và IgM đ c ờ ặhiệu virus Dengue và xác định đặc tính c a que th ủ ử

- Đối tượng: Đối tượng nghiên cứu củ ềa đ tài là que th nhanh phát hiện ử

đồng th i IgG và IgM đ c hi u virus Dengue ờ ặ ệ

- Phạm vi: quy mô phòng thí nghiệm

c) Tóm tắt cô đọng các nội dung chính và đóng góp mớ ủ i c a tác giả

- Tinh sạch protein NS1 tái tổ ợ h p và ki m tra đặể c tính c a protein NS1 ủtái tổ hợp

- Nghiên c u tứ ối ưu các điều kiện tạo c ng h p gi a kháng nguyên ộ ợ ữ(protein NS1 tái tổ ợ h p) và h t nano vàng.ạ

- Nghiên c u tứ ối ưu các điều ki n phun kháng thể kháng IgG và kháng ệthể kháng IgM lên màng lai

- Nghiên c u xứ ác đ nh các đị ặc tính của que thử

d) Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp vi sinh:

+ Phương pháp nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật

+ Phương pháp tạo tế bào khả biến

+ Phương pháp biến nạp vào E coli

+ Phương pháp biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp trong vi khuẩn E coli

- Phương pháp hóa sinh:

+ Phương pháp điện di SDS-PAGE

+ Phương pháp tách chiết protein

+ Phương pháp tinh sạch protein

+ Phương pháp Dot Blot

- T ối ưu được các điều kiện ch tạo que thử, bao gồm: ế

+ Điều ki n t o c ng h p: kích thướ ạệ ạ ộ ợ c h t vàng: 15 nm; hàm lượng NS1 tạo cộng hợp: 5 µg/miếng c ng hộ ợp; pH t o cạ ộng hợp: pH = 9; nhiệ ột đ tạo cộng hợp: 4°C; th i gian tờ ạo cộng hợp: 30 phút; nhiệt độ ấ s y miếng c ng hộ ợp: 37°C; thời gian sấy miếng cộng hợp: 30 phút

+ Điều ki n c nh kháng thể kháng IgG và IgM lên màng lai: hàm lượng ệ ố địkháng th kháng IgM cể ố định lên màng lai: 0,5 µg/que; nhiệt độ ử x lý màng lai: 37°C; th i gian sờ ấy màng lai: 30 phút; đệm c nh kháng thể lên màng lai: IBố đị 2(2% Sucrose/20 mM SB

- Xác định được mộ ố đặt s c tính c a que th , bao gồủ ử m: độ ặ l p l i (đ t ạ ạyêu cầu); phản ứng chéo (không phản ứng với các virus cúm, s i gây ra các triở ệu chứng lâm sàng giống Dengue); độ nhạy (87%); độ đặ c hiệu (100%); thể tích mẫu huyết thanh c n tầ ải lên que thử (10 µl)

i

MỤC LỤC

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh s t xuất huyết Dengue 3ố 1.1.1 S t xu t huy t Dengue (SXHD) ố ấ ế 3

1.1.2 Tình hình dịch b nh s t xu t huyệ ố ấ ết Dengue trên thế ớ gi i 4

1.1.3 Tình hình dịch b nh s t xu t huy t ệ ố ấ ế ở Châu Á – Thái Bình Dương 6

1.1.4 Tình hình dịch b nh s t xu t huy t di n ra t i Vi t Namệ ố ấ ế ễ ạ ệ 7

1.2 Virus Dengue 10

1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc của virus Dengue 10

1.2.2 Đặc điểm di truy n c a virus Dengue ề ủ 11

1.2.3 Đặc điểm protein NS1 13

1.2.4 Quá trình nhân lên của virus trong t ế bào 14

1.2.5 Protein NS1 d u n sinh h c m i cho ch– ấ ấ ọ ớ ẩn đoán sớm s t xuố ất huy t ế 15

1.3 M t s ộ ố phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết 16

1.3.1 Phương pháp phân lập virus 17

1.3.2 Phương pháp chẩn đoán dựa trên phát hiện axít nucleic 18

1.3.3 Phương pháp chẩn đoán qua xét nghiệm huy t thanh 18ế 1.4 Que th ử 21

1.4.1 Nguyên lý của que th 21ử 1.4.2 Đặc tính các thành phần c a que th 22ủ ử CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ 25U 2.1 V t liậ ệu 25

ii

2.1.1 Hóa chất và kháng thể 25

2.1.2 Các vậ ệt li u ch t o que th 26ế ạ ử 2.1.3 Thi t b ế ị 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp vi sinh 27

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 29

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợ ạp t o c ng hộ ợp kháng nguyên – ạt nano vàng h 33

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp c ố định kháng thể lên màng nitrocellulose 35

CHƯƠNG 3 KẾT QU VÀ BÀN LUẬN 37Ả 3.1 Kết qu tinh sạch kháng nguyên protein tái tổả - hợp NS1 37

3.1.1 Tinh sạch kháng nguyên NS1 tái tổ ợ 37 h p 3.1.2 K t qu ế ả đổi đệm tái cuộn g p NS1ấ 38

3.1.3 Kiểm tra NS1 tái tổ ợ h p với kháng thể đơn dòng thương mại kháng NS1 40

3.1.4 Kiểm tra kh ả năng bắ ặp đặt c c hi u cệ ủa protein NS1 tái tổ ợp h tinh s ch v i IgM trong huyạ ớ ết thanh dương tính với virus Dengue 41

3.2 K t qu ế ả nghiên cứu điều kiện thích hợ ạp t o c ng hộ ợp kháng nguyên – hạt nano vàng 42

3.2.1 Kích thước hạt vàng 42

3.2.2 Hàm lượng kháng thể ạ t o c ng h p 43ộ ợ 3.2.3 pH t o c ng h p ạ ộ ợ 44

3.2.4 Nhiệt độ ạ t o c ng h p ộ ợ 45

3.2.5 Th i gian t o c ng h p ờ ạ ộ ợ 46

3.2.6 Nhiệt độ ấ s y mi ng c ng h p ế ộ ợ 47

iii

3.2.7 Th i gian s y mi ng c ng h p ờ ấ ế ộ ợ 48

3.3 K t quế ả nghiên cứu các điều kiện thích hợp c ố định kháng thể kháng IgM lên màng nitrocellulose 49

3.3.1 Hàm lượng kháng thể kháng IgM cố định lên màng lai 49

3.3.2 Nhiệt độ ử lý màng lai x 49

3.3.3 Th i gian sờ ấy màng 50

3.3.4 Đệm c ố định kháng thể lên màng lai 51

3.4 K t quế ả nghiên cứu các điều kiện thích hợp c ố định kháng thể kháng IgG lên màng nitrocellulose 52

3.5 Kết qu chế ạả t o que th 53ử 3.6 Kết qu ả nghiên cứu các đặc tính của que th 53ử 3.6.1 Phả ứng chéo n 53

3.6.2 Khảo sát độ nhạy và độ đặ c hi uệ 54

3.6.3 Khảo sát độ ặ ạ 56 l p l i 3.6.4 Khảo sát thể tích huyết thanh tải lên que thử 57

K T LUẾ ẬN 59 KIẾN NGH 59Ị TÀI LIỆU THAM KH O 60Ả

iv

Hình 1 1 Muỗi Aedes aegypti truy n b nh SXHD [63] 3 ề ệ Hình 1 2 Quá trình truyền b nh SXHD c a mu i Aedes aegypti [63] 3 ệ ủ ỗ Hình 1 3 Các giai đoạn lâm sàng củ ốa s t xu t huy t Dengue [38] 4 ấ ế

Hình 1 4 Những quốc gia và khu vực có dịch SXHD trên ế ớ th gi i [39] 5

Hình 1 5 Phân bố ỷ ệ t l m c theo khu v c [2] ắ ự 7

Hình 1 6 Biểu đồ ố s ca m c, t ắ ử vong do SXHD giai đoạn 1980-2020 t i Vi t Nam ạ ệ [2] 9

Hình 1 7 Số ca m c SXHD nh p viắ ậ ện và tử vong của các năm 2019 và 2020 [2] 9 Hình 1 8 Cấu trúc của virus Dengue [61] 10

Hình 1 9 Cấu trúc thể gen c a virus Dengue [34] 11 ủ Hình 1 10 Cấu trúc kháng nguyên NS1 [9] 13

Hình 1 11 Chu kỳ nhân lên của virus Dengue [18] 15

Hình 1 12 Động học các dấ ấu n sinh h c trong s t Dengue [5] ọ ố 17

Hình 1 13 Thời điểm phát hiện d u n sinh h c virus Dengue [5] 20 ấ ấ ọ Hình 1 14 Ý nghĩa lầm sàng trong xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue bằng xét nghiệm kháng nguyên, kháng t ểh [5] 20

Hình 1 15 Nguyên lý que thử 21

Hình 3 1 ện di đồĐi kiểm tra độ tinh sạch protein NS1 tái tổ ợ h p 37

Hình 3 2 Hiệu su t thu h i sau tinh sấ ồ ạch protein NS1 tái tổ ợ h p 38

Hình 3 3 ện di đồĐi của protein NS1 sau khi tái cuộn gấp 39

Hình 3 4 Hiệu su t thu hấ ồi sau đổi đệm s dử ụng màng Amicon® Ultra Centrifugal Filters 40

Hình 3 5 ế K t qu ki m tra s bi u hi n protein NS1 vả ể ự ể ệ ới kháng thể đơn dòng thương mại kháng NS1 (ant-531) .40

Hình 3 6 So sánh kết qu ELISA 6 m u b nh ph m 41 ả ở ẫ ệ ẩ Hình 3 7 Màu của c ng hộ ợp kháng nguyên và hạt nano vàng ở các kích thước khác nhau 42

Hình 3 8 Kết qu th ả ử que trên mẫu huyết thanh âm tính ở 3 kích thước hạt vàng .42

v

Hình 3 9 Kết qu th ả ử que trên mẫu huyết thanh dương tính sử ụ d ng hạt vàng kích

thước 15 nm 43

Hình 3 10 Kết qu th ả ử màu dung dịch c ng h p khi cho NaCl 1M 44 ộ ợ Hình 3 11 Kết qu th ả ử que trên các hàm lượng NS1 t o c ng h p ạ ộ ợ 44

Hình 3 12 Xác định giá trị pH thích hợp cho ph n ng t o c ng h p gi a ả ứ ạ ộ ợ ữ kháng nguyên và hạt nano vàng 45

Hình 3 13 Xác định nhiệt độ thích hợp cho ph n ng t o c ng h p giả ứ ạ ộ ợ ữa kháng nguyên và hạt nano vàng 46

Hình 3 14 Xác định thời gian thích hợp cho ph n ng t o c ng h p giả ứ ạ ộ ợ ữa kháng nguyên và hạt nano vàng 47

Hình 3 15 Xác định nhiệt độ thích hợp s y mi ng c ng h p 48 ấ ế ộ ợ Hình 3 16 Xác đị nh thời gian thích hợp s y mi ng c ng h p ấ ế ộ ợ 48

Hình 3 17 Xác định hàm lượng kháng thể kháng IgM thích hợp c ố định lên màng 49

Hình 3 18 Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng lai 50

Hình 3 19 Xác định thời gian thích hợp sấy màng lai 51

Hình 3 20 Xác định h ệ đệm thích hợp c ố định kháng thể lên màng lai 52

Hình 3 21 Kết qu th nghiả ử ệm trên mẫu huyết thanh dương tính IgG virus Dengue 52

Hình 3 22 Kết qu th nghi m que th 3 vả ử ệ ử ạch trên mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với IgG và IgM virus Dengue 53

Hình 3 23 Kết qu ả nghiên cứu ph n ả ứng chéo 54

Hình 3 24 Kết qu khả ảo sát độ nh y c a que th ạ ủ ử 55

Hình 3 25 Kết qu khả ảo sát độ đặ c hi u c a que th ệ ủ ử 56

Hình 3 26 Kết qu khả ảo sát với 10 que th ử trên 1 mẫ âm tính (n=10)u 57

Hình 3 27 Kết qu khả ảo sát với 10 que th ử trên 1 mẫu dương tính (n=10) 57

Hình 3 28 Kết qu khả ảo sát thể tích huyết thanh tải lên que thử ớ v i 3 m u huyẫ ết thanh dương tính có tín hiệu OD (ELISA) th p 58 ấ Hình 3 29 Kết qu khả ảo sát thể tích huyết thanh tải lên que thử ớ v i 4 m u huyẫ ết thanh dương tính có tín hiệu OD (ELISA) cao 58

1

MỞ ĐẦU

B nh s t xu t huyệ ố ấ ết Dengue (SXHD) là bệnh nhiễm virus dengue cấp tính

do muỗi Aedes aegypti (thường gọi là muỗi v n) truy n ằ ề [24] SXHD là bệnh được ghi nhận có từ thế ỷ 18, và số k ca bệnh có xu hướng liên tục tăng lên trong vòng 50 năm gần đây Theo T ch c y t th gi i (WHO), hi n bổ ứ ế ế ớ ệ ệnh lưu hành ở

128 quốc gia, hơn 3,9 tỷ ngườ ống trong vùng nguy cơ mắi s c b nh, hệ àng năm có kho ng 390 triả ệu người nhi m b nh [62]ễ ệ Bệnh có xu hướng ph biổ ến ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, và được coi là một trong những nguyên nhân hàng đầu

dẫn đến tình trạng nh p vi n, t vong khu vậ ệ ử ở ực này [58] [49 ]

Bệnh SXHD có mặt ở ầ h u hết các tỉnh/thành phố ạ t i Việt Nam, tính từ đầu năm 2020 đến ngày 15 tháng 9 năm 2020, cả nước ghi nhận 65.046 trường h p ợ

m c SXHD, tronắ g đó có 7 trường h p t vong ợ ử [59] B nh r t nguy hi m v i nguy ệ ấ ể ớ

cơ tử vong cao nếu không được phát hiện sớm, chính xác và xử lý kịp th i ờ

Hiện nay vi c chệ ẩn đoán virus Dengue có thể th c hi n b ng nhi u ự ệ ằ ềphương pháp như: phương pháp nuôi cấy, phân lập virus; phương pháp huyết thanh h c (ELISA-ọ NS1 phát hiện kháng nguyên NS1; Mac ELISA phát hiệ- n kháng thể); các kỹ thu t sinh hậ ọc phân tử (Nested RT-PCR; Real-time RT-PCR) Tuy nhiên các phương pháp này bộ ộc l nhi u h n ch ề ạ ế như thời gian phân tích kéo dài, cho kết qu ch m, ả ậ có thể không phù hợp trong vi c chệ ẩn đoán và điều tr , ịchủ ế y u ph c v ụ ụ công tác giám sát dịch t ; mặt khác đòi hỏi các trang thiế ị đắễ t b t tiền, nhân viên thực hi n c n phệ ầ ải được đào tạo và giá thành phân tích cao Trong khi đó bệnh SXHD có thể xu t hi n mấ ệ ở ọi nơi, từ thành phố ớn đến các vùng lnông thôn Việc xét nghiệm cần được th c hi n t i nhiự ệ ạ ều cơ sở ể ả các cơ sở k c có

h ệ thống trang thi t b ế ị còn ít và thô sơ, do đó các kỹ thuật cao là hoàn toàn không phù hợp Th c t hiự ế ện nay, các cơ sở xét nghiệm đều có nhu cầu s d ng que th ử ụ ửnhanh, tuy nhiên chúng ta hoàn toàn phải nh p kh u sinh phậ ẩ ẩm này Việc nh p ậkhẩu dẫn đến m t s vấn đề như không chủ động đượộ ố c ngu n sinh phồ ẩm, giá thành cao Do đó, việc phát triển que th ử nhanh có thể phát hiện được virus Dengue một cách đơn giản, không đòi hỏi trang thi t b ế ị chuyên dụng, với độ

nhạy, độ đặ c hiệu cao là một đề tài thực s ự có ý nghĩa cả ề v khoa học và thực tiễn

2

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát

triển que th ử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue”

Mục tiêu của đề tài:

 Tinh sạch và xác định đặc tính của protein NS1 tái tổ hợp

 Xác định điều kiện thích hợp chế tạo que thử nhanh phát hiện đồng thời IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue

 Xác định các đặc tính của que thử

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

 Tinh sạch và xác định đặc tính của protein NS1 tái tổ hợp

 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp tạo cộng hợp giữa hạt nano vàng (AuNP) với kháng nguyên NS1 (AuNP-NS1)

 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cố định kháng thể kháng IgG

và IgM của người lên màng

 Chế tạo que thử

 Nghiên cứu xác định đặc tính que thử

3

CHƯƠNG 1 ỔT NG QUAN 1.1 Bệnh sốt xuất huyết Dengue

1.1.1 Sốt xuất huyết Dengue (SXHD)

S t xu t huyố ấ ết Dengue là một b nh truy n nhi m cệ ề ễ ấp tính do virus Dengue gây ra Bệnh lây theo đường máu, trung gian truyền b nh ch yệ ủ ếu là do muỗi Aedes aegypti 8[4 ] Đây là loại muỗi thường sống trong nhà, gần người, trú đậu nơi có ánh sáng yếu, thích đẻ ứ tr ng nh ng d ng c ở ữ ụ ụ chứa nước sạch và những nơi nước đọng, chúng thường đốt người vào sáng sớm và chiều t i, ch ố ỉmuỗi cái mới đốt người vì chúng cần protein để đẻ ứ tr ng [63]

Hình 1 1 Mu i Aedes aegypti truy n b nh SXHD ỗ ề ệ [63]

Hình 1 Quá trình truyề2 n b nh SXHD c a mu i Aedes aegypti ệ ủ ỗ [63]

B nh s t xu t huyệ ố ấ ết có những bi u hiể ện lâm sàng rất đa dạng, bi u hi n t ể ệ ừ

nh n n ng, nẹ đế ặ ếu không được phát hiện và xử lý kịp thời có thể ẫ ớ ử d n t i t vong

do s t xu t huy t B nh di n bi n qua ố ấ ế ệ ễ ế ba giai đoạn: giai đoạn sốt, giai đoạn nguy

hiểm và giai đoạn ph c h [1 ụ ồi ]

4

Hình 1 Các giai đoạn lâm sàng củ ố3 a s t xu t huy t Dengue ấ ế [38]

Giai đoạn sốt thường trong 3 ngày đầu c a b nh vớủ ệ i nh ng bi u hi n: xu t ữ ể ệ ấ

hi n sệ ốt cao đột ng t 39-40ộ ℃, kèm các triệu ch ng m t mứ ệ ỏi, đau đầu, đau nhức

h c mố ắt, đau các khớp, có thể có viêm long đường hô hấp trên, chán ăn, cảm giác nôn và buồn nôn, da xung huyết, có thể có biểu hi n nh ng ch m xu t huyệ ữ ấ ấ ết dưới

nặng hơn có thể là dấu hi u xu t huyệ ấ ết não, xuất huy t trong b ng Nế ổ ụ ếu không

bù đủ ị d ch, bệnh nhân có thể ị ạ b h huyết áp do hiện tượng cô đặc máu, nặng hơn

có thể ẫn đế d n s c do gi m khố ả ối lượng tuần hoàn

Giai đoạn h i ph c, bồ ụ ệnh nhân hế ốt trên 48 giờ, đỡt s mệt, t ng th ổ ể khỏe lên, thèm ăn và tiểu ti n nhiệ ều hơn, xét nghiệm ti u c u bể ầ ắt đầu tăng

1.1.2 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết Dengue trên thế giới

Theo T ổ chức Y t ế thế giới (WHO), b nh s t xu t huyệ ố ấ ết đang diễn biến

ph c tứ ạp, gia tăng về phạm vi và số lượng người m c b nh qua tắ ệ ừng năm tại nhi u qu c gia Hi n bề ố ệ ệnh lưu hành tại 128 quốc gia, hơn 3,9 tỷ ngườ ối s ng trong

5

vùng nguy cơ bị m c bắ ệnh, hàng năm có khoảng 390 triệu người nhi m b nh, ễ ệtrong s ố này có khoảng 500.000 ca chuy n bi n th nể ế ể ặng và khoảng 20.000 ca t ửvong [49]

Hình 1 4 Nh ng quữ ốc gia và khu vực có ịch SXHD trên thế ớd gi i [39]

S t xu t huyố ấ ết đã được biết đế ừ nhi u th k n t ề ế ỷ trước Các triệu chứng đầu tiên tương thích vớ ối s t xu t huyấ ết đã được ghi nhận trong bách khoa toàn thư y

h c Trung Quọ ốc vào năm 992 sau Công nguyên Bệnh được gọi là “chất độc nước” và có liên quan đến côn trùng bay [50] [51] B nh d ch giệ ị ống như sốt xu t ấhuy t, v i ngu n truy n bế ớ ồ ề ệnh và quá trình lây bệnh tương tự ả, x y ra s m nhớ ất là vào năm 1635 và 1699 ở Tây Ấn và Trung Mỹ Đại dịch SXHD đã xảy ra ởPhiladelphia vào năm 1780 và dịch bệnh sau đó đã trở nên phổ ế ở bi n M ỹ vào

những năm đầu th kế ỷ 20, đợt bùng phát cuối cùng ở M ỹ là vào năm 1945 tại New Orleans [52]

Trước năm 1970, chỉ có 9 quốc gia xu t hi n dấ ệ ịch SXHD, ngày nay bệnh

đã ảnh hưởng t i 128 quớ ốc gia và vùng lãnh thổ trên thế ớ gi i, thuộc các khu vực Châu Phi, Châu Mỹ, Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương Đặc biệt, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương là hai khu vực b nh ị ảhưởng nghiêm trọng nh t vấ ới hơn 2,2 triệu trường hợp được công bố nhi m ễSXHD trong năm 2010 và đã tăng lên 3,34 triệu trư ng hờ ợp vào năm 2016 Trong năm 2015, chỉ riêng ở Châu Mỹ, có tới 2,35 triệu trường h p mắc SXHD ợ

M ỹ La Tinh, đã ghi nhận t ng s 1.992.477 ca mổ ố ắc SXHD, 725 trường h p t ợ ửvong Trong đó, cao nhấ ạt t i Brazil (1.330.245 ca m c, 465 ca t vong), Paraway ắ ử(220.234 ca mắc, 73 ca t vong), Bolivia (83.533 ca m c, 19 ca t vong) ử ắ ử [59].

1.1.3 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết ở Châu Á – Thái Bình Dương

Khoảng 1,8 t ỷ người (hơn 70%) dân số có nguy cơ mắc SXH trên toàn thếgiớ ối s ng ở các quốc gia thành viên của khu vực Đông Nam Á và khu vực Tây Thái Bình Dương [56]

K t ể ừ năm 2000, dịch SXH đã lan rộng t i nhi u qu c gia trong khu vớ ề ố ực này Năm 2003, 8 quốc gia bao g m: Bangladesh, ồ Ấn Độ, Indonesia, Malvides, Myanmar, Sri Lanka, Thái Lan, và Đông Timor báo cáo có những trường h p ợnhiễm SXH Năm 2004 – Bhutan và năm 2016 – Nepal đã báo cáo quốc gia v ề

và tử vong ở trẻ em T l t ỷ ệ ử vong được báo cáo xấp x ỉ 1%, nhưng ở Ấn Độ, Indonesia và Myanmar, dịch b nh x y ra ệ ả ở các khu vực cách xa vùng thành thịthì tỷ ệ ử vong có thể lên tớ l t i 3-5% [56]

Theo báo cáo mới nh t cấ ủa WHO ngày 13/8/2020, nhiều qu c gia khu ố ởvực Đông Nam Á vẫn ti p t c ghi nh n s ca mế ụ ậ ố ắc SXHD và tử vong cao, trong

đó Malaysia (66.199 ca mắc, 109 ca t vong), Philippines (55.160 ca m c, 200 ca ử ắ

t vong), Singapore (21.834 ca mử ắc, tăng cao hơn cùng kỳ 2019 và giai đoạn 5 năm trước), Lào (4.155 ca mắc, 9 ca t vong), Campuchia (4.450 ca m c, 5 ca t ử ắ ửvong) [59 ]

7

1.1.4 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết diễn ra tại Việt Nam

Ở Vi t Nam d ch s t xu t huy t x y ra ệ ị ố ấ ế ả ở phía Nam chiếm ưu thế và đứng vào tốp nh ng tữ ỉnh, thành phố có số ca m c cao nh t c a c ắ ấ ủ ả nước Những năm trở

lại đây số ca m c tắ ại các tỉnh B c b ắ ộ cũng gia tăng nhất là Hà Nội có xu hướng gia tăng nhanh và là điểm nóng củ ốa s t xu t huy t cấ ế ủa toàn miền b c ắ

Hình 1 Phân bố ỷ ệ ắ5 t l m c theo khu v c ự [2]

T ừ năm 1913, Gaide đã thông báo về ệ b nh s t Dengue c ố ổ điển t i miạ ền Bắc và miền Trung Năm 1929, Boyé có viế ềt v mộ ụ ịt v d ch s t Dengue c ố ổ điển (1927) ở mi n Nam Vi t Nam ề ệ Đến năm 1958, lần đầu tiên Chu Văn Tường và

c ng s ộ ự có thông báo về ộ ụ ị m t v d ch nh SXH ỏ ở Hà Nội Năm 1960, hai vụ ị d ch

ở Cái Bè và An Giang với 60 bệnh nhân nhi tử vong Đến năm 1963, dịch SXD

x y ra ả ở Cái Bè, Châu Đốc, H ng Ngồ ự, Tân Châu và Cao Lãnh vớ ổi t ng s b nh ố ệnhân đươc thông báo là 331, trong đó có 116 trẻ em t vong T ử ừ đó bệnh lưu hành, phát tán ra nhiều vùng khác nhau trên cả nước, xu hướng tăng dần vào

những năm 1975, 1977, 1979, 1980, 1983, 1987 vớ ổi t ng s bố ệnh nhân lớn d n: ầ40.544 (1977), 63.976 (1979), 95.146 (1980), 149.519 (1983), 130.000 (1987) và

t l mỷ ệ ắc trên 10 vạn dân cũng tăng dần Năm 1983 là năm có số ca m c cao nh t ắ ấ

v i 260 bớ ệnh nhân trên 10 vạn dân Từ 1988-1998, SXH ti p tế ục gây ra nh ng vụ ữ

d ch l n v i s ca mị ớ ớ ố ắc/tử vong vào các năm 1988 (72.600/710), 1991 (92.122/347), 1995 (80.447/222), T 1995-1998 dừ ịch gia tăng liên tục, bùng phát

mạnh vào năm 1997 (107.188/226) và số ca mắc/tử vong gia tăng đột biến vào

1998 (234.920/377) t i 56/61 tạ ỉnh, thành phố [42] [43 ]

8

Theo thống kê của WHO thì ở Việt Nam từ năm 1963 1988 có số bệnh nhân chết trên số bệnh nhân mắc SD/SXHD là 9.4/1000, lớn nhất so với các nước trong khu vực Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương, tính trung bình hàng năm

-có 50.000-100.000 người mắc SD/SXHD Bệnh SD/SXHD lưu hành rộng rãi ở vùng châu thổ sông Hồng (miền Bắc), sông Cửu Long (miền Nam) và dọc theo

bờ biển miền Trung Bệnh không chỉ xuất hiện ở đô thị mà cả vùng nông thôn, nơi có muỗi véc tơ sinh sống ệB nh s t xu t huyố ấ ết đã giảm trong những năm gần đây, có tỷ ệ l mắc trên/100.000 dân là 56,7, thấp hơn so với m t s ộ ố nước và tỷ ệ l

t vong (0,029) th p nh t so vử ấ ấ ới các quốc gia trong khu vực

Dịch SD/SXHD bùng nổ theo chu kỳ với khoảng cách trung bình từ 4-5 năm, năm 1998 với 234.920 ca, năm 2009 với 105.370 ca, năm 2010 với 128.710

ca, 109 ca tử vong, năm 2019 cả nước đã ghi nhận 320.331 trường h p mợ ắc, 53 trường h p t vong, s mợ ử ố ắc cao nhất trong 32 năm trở ại đây Tại Hà Nội, hàng lnăm đều ghi nh n s m c cao so v i ậ ố ắ ớ các tỉnh, thành phố khu v c mi n Bự ề ắc, đặc

bi t tệ ại các quận nội thành và các huyện vùng ven đô Năm 2019 toàn Thành phố ghi nhận 12.256 trường h p m c s t xu t huyợ ắ ố ấ ết, không có ca tử vong [60 Ở ]những nơi khác, nếu có, bệnh được coi như là kết quả của sự xâm nhập virus Dengue từ vùng có bệnh dịch lưu hành tới Mức độ lan rộng của SD/SXHD tùy thuộc vào sự phát triển giao thông và sự giao lưu của dân cư giữa các vùng Ở những vùng núi, cao nguyên biên giới phía Bắc, không thấy xuất hiện bệnh, kể cả những năm có dịch lớn Nguyên nhân SXH gia tăng là do biến đổi khí hậu như nhiệt độ cao, mưa nhiề ạo điều t u ki n thu n lệ ậ ợi cho véc tơ truyền b nh sinh s n, ệ ảphát triển, các chỉ ố giám sát côn trùng tại các điể s m x y dả ịch đều cao

9

Hình 1 6 Biểu đồ ố s ca m c, t ắ ử vong do SXHD giai đoạn 1980-2020

t i Vi t Nam [2] ạ ệ

Hình 1 7 S ca m c SXHD nh p viố ắ ậ ện và tử ng cvo ủa các năm 2019 và

2020 [2]

Virus dengue Dengue virus ( ) gây bệnh SD/SXHD gồm 4 týp huyết thanh (D1, D2, D3, D4) Cả 4 týp huyết thanh đều có thể gặp ở Việt Nam và luân phiên gây dịch và khác nhau giữa các địa phương ừ đầu năm đến ngày 15/9/2020 cảT nước ghi nhận 65046 trường h p mắợ c, 7 ca t vong So vử ới cùng kỳ năm 2019 số

ca m c gi m 65,6%, tắ ả ử vong giảm 32 trường h p ợ [60]

10

1.2 Virus Dengue

1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc của virus Dengue

Virus Dengue thu c chi ộ Flavivirus, h ọ Flaviviridae [29] mang đặc điểm

của Arbovirus, có cấu trúc hình cầu, đố ứi x ng kh i H virus ố ạt có đường kính 50nm V ỏ ngoài là lớp lipide kép (vì vậy mà nó nhạy c m với các dung môi hoà ảtan lipít, virus b ị phá huỷ ở b i tia cực tím, bị tiêu diệt ở 600C/30 phút, 40C/ vài giờ nhưng nó tồ ại được vài tháng đến vài nămn t trong dung d ch glycerol 50% hay ị ở-700C), chứa glycoprotein và protein có nguồn g c t ố ừ màng sinh chấ ủ ế bào t c a t

35-V capsid bao quanh acid nucleic tỏ ạo thành nucleocapsid có đường kính 30nm, chứa 32 capsome Gắn vào vỏ ủ c a virus là 180 bản sao c a 2 glycoủ protein màng (M) và vỏ (E), các protein này hình thành nên mộ ớt l p b o v ả ệ bên ngoài đồng thời kiểm soát quá trình xâm nhiễm của virus vào trong các tế bào của con người

Hình 1 8 Cấu trúc của virus Dengue [61]

Hạt virus Dengue chưa trưởng thành được bao phủ bởi 60 trimer không đối xứng nhau của heterodimer của tiền thân protein màng (prM) và protein vỏ (E), chúng nhô ra như các gai trên bề mặt của hạt virus Đối với các hạt virus Dengue đã trưởng thành thì bề mặt hạt virus thường trơn nhẵn và lớp màng của

nó hoàn toàn được bao bọc bởi một lớp vỏ protein

Virus Dengue có kháng nguyên kết hợp bổ thể, trung hòa và ngăn ngưng kết hồng cầu Dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định kháng nguyên, người ta chia virus Dengue ra làm 4 type khác nhau : DENV-1, DENV-2, DENV-3 DENV-4 [13] Mặc dù 4 type Dengue có tính chất kháng nguyên khác nhau nhưng chúng có một số quyết định kháng nguyên chung, nhất là các kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu, nên chúng có hiện tượng ngưng kết chéo giữa

11

các type ấ ả ốn týpe huyết thanh này đều có thể gây ra bệT t c b nh cảnh lâm sàng đầy đủ ủ c a b nh SXHD Mi n dệ ễ ịch trong SXHD không bền vững do đó tấ ảt c

mọi người, k c nhể ả ững người đã mắc SXHD, đều có thể nhiễm VR dengue và

có thể tái mắc bệnh Nghiên ứ c u cho th y, c ấ ả 4 týpe VR dengue đều có khả năng gây ệ b nh với các triệu chứng lâm sàng tương tự nhau, nhưng các ca bệnh n ng, ặ

t vong ử thường được ghi nhận đố ới týp DENV-2 i v

1.2.2 Đặc điểm di truyền của virus Dengue

H gen cệ ủa virus Dengue chứa m t s i RNA ộ ợ đơn dương kích thước kho ng 11 kb, vả ới đầu 5‟ vùng không dịch mã (5‟- UTR) kho ng 100 bp, trong ảkhi đầu 3‟-UTR ch a kho ng 450 bp [32] Giứ ả ữa vùng không dịch mã ở hai đầu là một khung đọc m ở(ORF- open reading frame) mã hóa một polypeptide đơn gồm kho ng 3400 axit amin ả [24] Các axit amin này mã hóa cho 3 protein cấu trúc là protein C (protein lõi Capsid), protein M (protein màng-membrance), protein E (protein envelop -v ỏ bao) và 7 protein phi cấu trúc (NS) bao g m NS1, NS2A, ồNS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5 [16, 34, 47] Nh ng protein ữ này đượ ạc t o ra trong quá trình phân tách sau dịch mã bởi protein c a virus ủ và vậ chủ và chúng t đều có các vai trò khác nhau trong khả năng gây bệnh c a DENV ủ [20] Ngoài ra,

những protein này đóng vai trò thực hiện quá trình sao chép RNA b m t m ng ở ề ặ ạlướ ội n i chất (ER) trong đó RNA mạch kép đượ ổc t ng h p t ợ ừ quá trình phiên mã

c a RNA mủ ạch đơn thì được cung c p b i b gen cấ ở ộ ủa virus

Hình 1 9 Cấu trúc thể gen c a virus ủ Dengue [34]

Các protein cấu trúc được mã hóa bởi đoạn gen nằm ở đầu 5‟ củ ợa s i RNA đơn, bao gồm:

Protein C có khối lượng kho ng 11 kDa nả ằm ở bên trong lớp lipit kép [15] Vùng ỵ nướ k c ở trung tâm của protein C có khả năng tương tác với màng tếbào và đóng vai trò trong quá trình lắp ráp virus [21] Protein C chứa một vùng C-terminal tác động như một chuỗi tín hiệu cho s ự chuyển đoạn c a protein M ủvào khoang của lư i n i chớ ộ ất Capsid được tách ra khỏi polyprotein c a virus ủ

N-Protein E thường là glycosylate v i khớ ối lượng phân tử ấ x p x 50 kDa ỉ

Đầu Cterminal c a protein E ch a mộủ ứ t chuỗi tín hiệu chuyển NS1 vào trong lưới

n i ch t ộ ấ [28] Đây là một protein c n thiầ ết cho độc tính Đột bi n t ế ừ các vùng khác nhau củ protein này đã tạo nên các chủa ng nh c a virusỏ ủ Ngoài ra, vỏglycoprotein có thể tham gia vào quá trình củ ế bào chủa t

H virus Dengue gạt ồm có 7 protein không cấu trúc bao gồm:

NS2A là một lo i protein k ạ ỵ nước v i khoớ ảng 231 axit amin NS2A được tách ra ừ NS1 trong lướ ộ t i n i chất và được tách ra kh i NS2B b i protease NS3 ỏ ởNS2A đã được chứng minh là bản địa của các vị trí sao chép RNA, nơi nó liên

k t vế ới các thành phần c a phủ ức hợp NS1, NS3 và NS5 [40] NS2A cũng liên kết

với đầu 3‟- UTR trong h gen cệ ủa virus, liên quan đến kh ả năng lắp ráp và bài

ti t ế virus [17] NS2B là một protein liên kết màng, khối lượng 14 kDa, có chứa 2 miền k ỵ nướ bao quanh vùng ưa nước [28, 31] NS2B là mộc t lo i ph c h p v i ạ ứ ợ ớNS3, như là một co-factor cho chức năng serine của NS3 [32] NS3 là một protein trong t ế bào chấ ớt v i m t s chộ ố ức năng liên quan đến s ự sao chéo RNA

NS4A và NS4B là protein kỵ nước, có cấu trúc liên quan đến màng [33, 34] NS4A cũng đã được chứng minh là co-factor với các vị trí sao chép trong các tế bào ị b nhi m virus ễ liên quan đến dsRNA và đã được chứng minh là tương tác với NS1 bằng các nghiên cứu di truy n [35, 36] Mề ặc dù chức năng của NS4B chưa xác định, nhưng nó cũng được biết và co-factor với NS3 và dsRNA,

và gần đây đã được chứng minh là một ph n c a ph c hầ ủ ứ ợp sao chéo virus [37]

NS5 là protein có hầu h t trong t t c ế ấ ả các Flavivirus và rấ ầt c n thi t cho s ế ựnhân lên của virus V i khớ ối lượng lớn (103 kDa), nó cùng với enzym methyl transferase tham gia vào việc hình thành RNA, chịu trách nhiệm về tính ổn định

c a RNA bủ ằng vi c t o ra cệ ạ ấu trúc 5‟ RNA [38, 39]

13

1.2.3 Đặc điểm protein NS1

NS1 là một polypeptide có độ dài 352 axít amin và tồ ạ ởn t i nhi u d ng ề ạoligomer khác nhau Dạng monomer của phân tử này nặng t 46-ừ 55 kDa, tùy thuộc vào trạng thái glycosyl hóa [33] Monomer của NS1 có 12 cysteines, tạo thành 6 cầu nối disulfide, góp phần tạo nên sự ổn định và chính xác trong quá trình hình thành protein Ở ạng monomer, NS1 có tính ái nước nhưng sau khi ddimer hóa, nó trở nên kỵ nước một ph n [8] Hai dầ ạng ph bi n cổ ế ủa NS1 là dạng dimer và dạng hexamer [11]

Hình 1 10 Cấu trúc kháng nguyên NS1 [9]

M t monomer cộ ủa NS1 có 3 vùng chức năng chính: miền cu n g p ( -ộ ấ β βroll), miền cánh (wing) và miền trung tâm „„bậc thang‟‟ β ( -ladder) Vùng cu n ộ

g p ấ β trải dài từ axít amin 1 đến 29, tạo thành hai cấu trúc kẹp tóc, được gi ữ ổn

định b ng c u disulfide gi a hai v ằ ầ ữ ị trí Cys4 và Cys15 Trong cấu trúc dimer của NS1, 4 cấu trúc kẹp tóc đan xen với nhau và tạo thành mặt ph ng beta Mẳ ặt

phẳng này sau đó cuộn tròn lại và tạo thành cấu trúc hình ống Vùng chức năng thứ 2 kéo dài từ axít amin 30 tới axít amin 180 tạo thành một đầu nhô được gọi

là „„wing‟‟ Vùng này bao gồm 2 điểm glycosyl hóa (Asn130 và Asn175), một

c u disulfide giầ ữa Cys55 và Cys143 và 2 vùng chức năng phụ α β và vùng nố ( / i

„„connector‟‟ „„β-ladder‟‟ là vùng chức năng chính của NS1, kéo dài từ axít amin

14

181 tới axít amin 352 Ở ạng dimer, vùng „„β ladder‟‟ bao gồ d - m 18 phi n nế ếp

g p beta, tấ ạo thành cấu trúc có hình thang [9]

Các dimer của NS1 có khả năng tạo thành hexamer đố ứi x ng dạng thùng (barrel-shaped hexamer) Vùng „„β roll‟‟ và các cấu trúc kị nước được quay vào -trong, trong khi các vòng lặp, điểm glycosyl hóa và một ph n cầ ủa vùng „„wing‟‟ được hướng ra ngoài [9] Hexamer NS1 dạng thùng được gi ữ ổn định bởi các tương tác kị nước và có thể ị phá bỏ ởi các chấ ẩ b b t t y r a, nhiử ệt độ cao ho c axit ặ[8]

NS1 có khả năng gây phả ứn ng mi n dễ ịch cao và có 108 epitope dạng

m ch thạ ẳng Các epitope chủ đạ o nằm ở vùng dễ tiế p c n cậ ủa protein như là vùng

„„wing‟‟, các vòng lặp hoặc đầu C của vùng „„β-ladder‟‟ và „„β roll‟‟ [9] Các epitope nằm ở ặ m t trong c a hexamer dủ ạng thùng cũng có thể đư c ti p c n b i ợ ế ậ ởkháng thể khi cấu trúc hexamer được phân giả ởi các phương pháp nêu trên.i b

-Proten NS1 t n tồ ại ở ả ạng liên kết màng (kể ả ở c d c ong ttr ế bào cũng như

ở trên bề mặ ủ ế bào) và dạt c a t ng ti t ra ngoế ại bào NS1 khi mớ ạo ra nó tồ ại t n t i

ở ạng monomer tan, sau đó nó được dimer hóa trong lướ ộ d i n i chất Trong lưới

n i chộ ất, NS1 đồng thời được glycosid hóa bằng cách thêm vào các đường manose, quá trình glycosid hóa này rất quan tr ng cho s ọ ự polymer hóa sau này

c a NS1 Sau khi biủ ến đổi xong ở lướ ội n i chất NS1 được v n chuyậ ển đến mạng lưới Golgi và tiế ục đượp t c biến đổi nhiều hơn và tạo thành dạng hexamer

1.2.4 Quá trình nhân lên của virus trong tế bào

Virus Dengue xâm nhập vào tế bào bằng con đường dung hợp (fusion) và chủ yếu nhân lên ở đại thực bào Genome RNA(+) làm nhiệm vụ mRNA gắn vào ribosome của tế bào chủ mã hoá cho một phân tử polyprotein duy nhất Nhờ protease, phân tử polyprotein này bị phân cắt thành 10 đoạn, trong đó có RNA-polymerase (đóng vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã)

Khi đi vào cơ thể người theo tuyến nước bọt của muỗi, virus sao chép ở các tổ chức đích Tại đây, chúng sẽ xâm nhập vào tế bào bạch cầu và tổ chức lympho Sau đó, virus được giải phóng vào máu Khi con muỗi thứ hai nuốt virus cùng với máu, virus sẽ sao chép trong dạ dày muỗi và các cơ quan khác, gây nhiễm vào tuyến nước bọt Từ đó, virus sao chép trong tuyến nước bọt Quá trình

15

lây nhiễm, tái bản của virus Dengue trong tế bào vật chủ có thể được chia làm 10 giai đoạn, bao gồm:

Hình 1 11 Chu k ỳ nhân lên của virus Dengue [18]

(1) Virus liên kết với thụ thể của tế bào chủ

(2) Xâm nhập vào tế bào thông qua trung gian thụ thể

(3) Phản ứng tổng hợp màng xảy ra

(4) Sự phân tách nucleocapsid và giải phóng bộ gen của virus

(5) Quá trình dịch mã RNA của virus dẫn đến việc tạo ra polyprotein tiền thân của virus và tái tổ chức màng tạo thành các gói nang (vesicle packets-VP)

và mảng màng/paracrystalline (convoluted membrane/paracrystalline-CM/PC)

(6) Quá trình phân tách thành các protein riêng lẻ của CM/PC bởi các protease của virus và tế bào

(7) Tổng hợp mẫu virus xảy ra trong VP

(8) Nucleocapsid của virus được tập hợp và thu nhận màng virus xảy ra khi virus đi vào lưới nội chất (ER)

(9) Virus được vận chuyển từ ER qua bộ máy Golgi – nơi diễn ra quá trình trưởng thành của virus

(10) Virus được giải phóng bằng phản ứng tổng hợp hạt

1.2.5 Protein NS1 – dấu ấn sinh học mới cho chẩn đoán sớm sốt xuất

huyết

Gần đây, kháng nguyên Dengue NS1 (NS1 antigen) được cho là mộ ấu t d

ấn sinh h c m i (new biomarker) cho chọ ớ ẩn đoán sớm nhi m virus Dengue [41ễ ,

16

44] Kháng nguyên Dengue NS1 là một glycoprotein phi cấu trúc, được t ng h p ổ ợ

ở ả ở ạng màng tế bào và dạng được bài tiế c d t, xu t hi n trong huy t thanh b nh ấ ệ ế ệnhân nhiễm virus Dengue giai đoạn sớm, có thể phát hiện trước khi hình thành các kháng thể Dengue IgM và IgG Trong quá trình xâm nhiễm, NS1 có thể gây

ra một đáp ứng mi n d ch d ch th r t m nh, kễ ị ị ể ấ ạ háng nguyên Dengue NS1 có thểphát hiện trong máu từ ngày đầ tiên cho đến ngày thứu 9 sau khi xu t hi n s t, ấ ệ ố ở

c bả ệnh nhân nhiễm Dengue th ể nguyên phát hoặc th ứ phát, ngay cả khi RNA còn ( ) tính và Dengue IgM còn chưa xuấ- t hi n [41 Nệ ] ồng độ NS1 khác nhau giữa các cá thể trong suốt quá trình của b nh, t ệ ừ vài ng/ml đến vài µg/ml,

Dengue-có trường hợp được báo cáo lên đến 50 g/ml huy t thanh[10]μ ế Điều đặc biệt là

nồng độ NS1 không khác biệt đáng kể trong các mẫu huyết thanh thu đượ ừc t

nh ng bữ ệnh nhân bị nhiễm virus Dengue nguyên phát hay thứ phát[10] Nh ng ữphát hiện này chỉ ra r ng việc phát hiện protein NS1 có thể cho phép chẩn đoán ằ

s m vi c nhi m Dengue ớ ệ ễ

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứ ập trung vào nghiên u t

cứu các đặc tính của protein NS1 nh m ph c vằ ụ ụ cho nhi u mề ục đích khác nhau Năm 2012, Beti Ernawati Dewi; et al, đã nghiên cứu tách dòng và biểu hi n ệthành công protein NS1 của virus Dengue serotype 2 trong E.Coli, NS1 tái tổ ợ h p này được s dử ụng để gây miễn d ch chu t tị ở ộ ạo ra kháng thể, kháng thể này đã được ki m ể tra là có khả năng đáp ứng mi n d ch v i NS1 c a bễ ị ớ ủ ệnh nhân Năm

2014, Danielle Ferreira Oliveira; et al đã sử ụng pET28a để tách dòng và biể d u

hi n protein NS1 trong ệ E.Coli BL21 DE3 Ngoài ra, năm 2001, Jau-Ling Huang;

et al, đã tách dòng biểu hiện thành công toàn bộ gen mã hóa NS1, protein NS1 đã được tinh sạch và thử nghi m ELISA v i 19 mệ ớ ẫu kháng thể đơn dòng khác nhau kháng lại NS1

1.3 Một số phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết

S t xu t huyố ấ ết có biểu hiện đặc trưng bao gồm s t, xu t huyố ấ ết và thoát huyết tương Bệnh có thể ẫn đế d n h u qu s c do gi m th ậ ả ố ả ể tích tuần hoàn, rối loạn đông máu, suy tạng và có thể ẫn đế d n t vong nử ếu không được chẩn đoán

sớm và điều tr k p th i Bị ị ờ ệnh có biểu hiện lâm sàng đa dạng, di n bi n nhanh ễ ếchóng từ nh n n ng Do v y, viẹ đế ặ ậ ệc phát hiện sớm, điều tr k p thị ị ời có vai trò quan tr ng trong vi c c u sọ ệ ứ ống ngườ ệi b nh

17

Trên thự ếc t , vi c chệ ẩn đoán SXHD gần như dựa vào chẩn đoán lâm sàng Tuy nhiên, có nhiều nguyên nhân gây sốt giống như những th sể ốt dengue đơn thuần ho c SXHD, do v y cặ ậ ần có chẩn đoán xác định của phòng xét nghiệm đểkhẳng định

Hình 1 12 Động học các dấ ấu n sinh h c trong s t Dengue [5] ọ ố

1.3.1 Phương pháp phân lập virus

Phân lập virus t ừ các mẫu b nh phệ ẩm đã được ch n ẩ đoán lâm sàng, mẫu

b nh phệ ẩm là huyết thanh ho c huyặ ết tương được tách từ máu bệnh nhân, khi

bệnh nhân đang sốt, thời gian không quá 4 ngày kể ừ cơn sốt đầ t u; ho c t ch c ặ ổ ứgan, lách, hạch lympho… lấ ừ ửy t t thi chết không quá 6 giờ và được b o qu n ả ả

b i glycerol 50% ; ho c muở ặ ỗi đượ ấ ừ các khu vực l y t c b d ch b nh B nh phị ị ệ ệ ẩm

l y xong phấ ải được b o qu n lả ả ạnh, riêng muỗi ph i gi cho sả ữ ống trước khi g i ửđến phòng thí nghiệm

Hiện nay, thường dùng 3 phương pháp để phân lập virus Dengue:

 Phân lập trên chuột bạch mới đẻ: bệnh phẩm được tiêm vào não chuột 1-3 ngày tuổi và theo dõi hàng ngày Nếu chuột bị bệnh, chuột sẽ liệt hai chân sau Mổ lấy não để tiêm tiếp lần 2 Sau khi gây nhiễm được một tuần, mổ lấy não

để xác định virus Sử dụng kỹ thuật này, đã phân lập được cả 4 tuýp dengue, nhưng đòi hỏi rất nhiều thời gian, độ nhạy thấp, lại rất tốn kém nên ít được sử dụng

 Phân lập trên muỗi sống: bệnh phẩm được tiêm vào ngực muỗi Toxorhynchites Sau khi tiêm, nuôi muỗi trong lồng ở 28℃ trong 14 ngày, bắt những con muỗi sống và giữ trong -70 ℃để xác định virus Phương pháp này có

độ nhạy cao, nên có thể được sử dụng trong chẩn đoán virus trên lâm sàng

18

 Phân lập trên tế bào nuôi: cấy bệnh phẩm vào tế bào nuôi một lớp C6/36 của Aedes albopictus, sau 7 ngày, thu hoạch tế bào để xác định virus Phương pháp này phân lập virus nhanh hơn và ít tốn kém hơn, nhưng lại không nhạy bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp vào muỗi

 Sau khi phân lập virus, có thể xác định được virus b ng mằ ột trong các phương pháp : ph n ng k t h p b ả ứ ế ợ ổ thể, ph n ả ứng trung hòa (làm giảm m ng ả

ho i t ạ ử trên các tế bào nuôi cấy mộ ớt l p), k thu t mi n d ch hu nh quang tr c ỹ ậ ễ ị ỳ ự

tiếp, k ỹthuật PCR

1.3.2 Phương pháp chẩn đoán dựa trên phát hiện axít nucleic

M t s ộ ố phương pháp phát hiện RNA virus bằng cách sử ụ d ng k ỹ thuật RT-PCR đã được phát triển vào những năm 90 [42] [43] K ỹ thuật được mô tả

bởi Lanciotti et al có thể phát hiện và xác định c ả 4 tuýp huyết thanh của Dengue Trong 10 năm qua, mộ ố phương pháp sử ụt s d ng RT-qPCR đã được phát triển [44] Đây là mộ ỹt k thuật cho phép việc chẩn đoán sớm Nó có thể phát

hiện và định lượng virus Dengue trong t t c ấ ả các giai đoạn virus [45], từ đó có thể nhận định về ức độ nghiêm trọ m ng c a b nh ủ ệ

Nhiều phương pháp Real time PCR đã được phát triể- n dựa trên kỹ thu t ậTaqMan ho c SYBR Green TaqMan real-ặ time PCR có tính đặc hiệu cao để có thể lai tạo các đầu dò Hơn nữa, mồi và đầu dò đã được công bố có thể phát hiện đượ ấ ả các chuỗ ủc t t c i c a virus Dengue : s nh y c m c a mự ạ ả ủ ồi và đầu dò dựa trên

s ự tương đồng của chúng với trình tự gen đích của virus được phân tích, SYBR Green real-time PCR lại có nhiều ưu điểm hơn ở ự đơn giả s n c a thi t k mủ ế ế ồi cũng như quy trình nhưng lại kém đặc hiệu hơn [46]

1.3.3 Phương pháp chẩn đoán qua xét nghiệm huyết thanh

1.3.3.1 Phương pháp xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1

Kháng nguyên NS1 của virus Dengue là một protein có tính bảo th cao, ủ

t n tồ ại ở ả ạng bám màng tế bào và dạ c d ng tiết ra ngoài Nó có thể phát hiện trong máu bệnh nhân từ ngày đầu tiên cho đến ngày thứ 9 sau khi xu t hi n s t, ấ ệ ố ở

c bả ệnh nhân nhiễm Dengue th ể nguyên phát và thứ phát Kháng nguyên NS1 có thể được phát hiện trước khi các kháng thể được hình thành Điều nay m ra kh ở ảnăng chẩn đoán sớm sự lây nhiễm của virus Dengue khi mà việc chẩn đoán nhiễm Dengue thông qua phát hiện s ự có mặ ủa kháng thể IgM, IgG và bằt c ng

19

RT-PCR vẫn chưa thể ự th c hiện đượ ởc những ngày đầu tiên của b nh Gệ ần đây xét nghiệm Elisa b t cắ ặp kháng nguyên NS1 và que thử phát hiện nhanh NS1 đã được phát triển và đánh giá Đã có nhiều nghiên cứu cho th y r ng, vi c s d ng ấ ằ ệ ử ụNS1 là dấu ấn để chẩn đoán nhanh cho kết qu ả nhanh, độ nhạy cao đến 92,8% và

độ đặ c hi u tệ ới 98,4% khi so sánh với RT-PCR [47]

Nguyên tắc c a k thuủ ỹ ật ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 dựa trên nguyên tắc mi n dễ ịch liên kết enzyme ki u sandwich mể ột bước trên plaque Đầu tiên, bệnh phẩm đượ ủ ực tr c tiếp, cùng lúc vớ ội c ng hợp trong các giếng đã gắn kháng thể đơn dòng từ chu t (Mab) nhiộ ở ệt độ 37 ℃ trong 90 phút Nếu mẫu có kháng nguyên sẽ ạo thành phứ t c h p Mab-NS1-ợ Mab/peroxidase Sau khi r a, ử

ph c h p mi n dứ ợ ễ ịch được bi u hiể ện khi thêm vào giếng dung d ch tị ạo màu đểkhởi đầu cho ph n ng tả ứ ạo màu Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, ngừng ph n ả

ứng b ng dung dằ ịch axit Đọc k t qu b ng quang ph k vế ả ằ ổ ế ới bước sóng 450/620nm Sự hi n di n khệ ệ áng nguyên NS1 trong mẫu được xác định bằng cách

so sánh độ ấ h p thu c a mẫủ u th (OD) vử ới độ ấ h p thu của ngưỡng phát hiện (CO) [6]

Ngoài ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 thì hiện nay đã có những b ộsinh phẩm phát hiện virus Dengue đã được phát triển và có ặt trên thịm trư ng ờnhư bộ kit c a Bio-rad, Bioline-ủ SD…, các bộ kit này đều được đánh giá và cho các kết qu ả phát hiện nhanh Dengue r t kh quan H u hấ ả ầ ết các bộ sinh phẩm này được ch t o dế ạ ựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch Tuy có khả năng phát hiện nhanh, nhạy nhưng nhược điểm của các kit này đó là giá thành khá cao và không phân loại được các serotype của Dengue

1.3.3.2 Phương pháp xét nghiệm phát hiện IgM/IgG

Việc phát hiện IgM và/hoặc IgG đặc hi u s t xu t huyệ ố ấ ết thường được th c ự

hi n b ng k ệ ằ ỹ thuật ELISA hoặc các xét nghiệm nhanh IgM có thể được phát

hi n t ệ ừ ngày thứ 5 sau khi xu t hiấ ện các triệu chứng lâm sàng và tồ ạn t i trong 1-2 tháng Trong khi đó, IgG xuất hiện cùng lúc ở giai đoạn nhiễm trùng thứ ấ c p

ho c mu n ặ ộ hơn ở nhiễm trùng tiên phát nhưng có thể ồ ạ t n t i suốt đời Hi n nay, ệMAC ELISA (Dengue IgM Capture ELISA® của PANBIO; SD Dengue IgM Capture ELISA c a ủ Standard diagnostic Inc.) và các xét nghiệm nhanh (Dengue

qu cho thả ấy IgG là dương tính, tức là bệnh nhân đang gặp tình trạng s t virus ốDengue th ứ phát Thông thường các kháng nguyên NS1 sẽ xu t hiấ ện trong máu ngày 1 9, còn kháng thể- IgM s thư ng xu t hi n t ẽ ờ ấ ệ ừ ngày 3 4 và các kháng thể-IgG thì xuất hi n muộn hơn vào ngày 14 sau thời điểm nguyên phát nhiễm ệDengue

Hình 1 14 Ý nghĩa lầm sàng trong xét nghiệm chẩn đoán sốt Dengue

bằng xét ngh ệm kháng nguyên, kháng thể [5]i

21

Các xét nghiệm nhanh hỗ trợ và sàng lọc chẩn đoán chính xác và sớm nhất

sự xuất hiện của virus Dengue Xét nghiệm nhanh mang lại kết quả với độ nhạy lên tới 92%, và độ đặc hiệu 75 đến 95%

1.4 Que thử

1.4.1 Nguyên lý của que thử

Hình 1 15 Nguyên lý que thửQue th ử phát hiện nhanh IgG và IgM đặc hi u virus ệ Dengue được thi t k ế ếdựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch: kháng nguyên NS1 được g n c ng h p v i ắ ộ ợ ớcác hạt nano vàng và được c ố định trên miếng c ng hộ ợp Kháng thể kháng IgG

của người được c nh t i v ố đị ạ ị trí vạch ki m tra ể thứ nh t c a que thấ ủ ử Kháng thểkháng IgM của người được c nh t i v ố đị ạ ị trí vạch ki m tra th hai c a que th ể ứ ủ ửKháng thể th ứ 2 là kháng thể th ỏ kháng NS1 được c nh t i v ố đị ạ ị trí vạch đối chứng c a que th N u trong m u huy t thanh bủ ử ế ẫ ế ệnh nhân có kháng thể Ig G/IgM kháng lại NS1 thì khi nhỏ mẫu lên que sẽ ạo thành phức kháng thể t - kháng nguyên – ạt nano vàng Khi phứ h c hợp này di chuyển d c theo que th t i v trí ọ ử ớ ị

v ch ki m tra s tạ ể ẽ ạo thành phức kháng thể 1 – kháng thể kháng nguyên – ạ - h t nano vàng, hình thành một vạch màu hồng và thể hi n trệ ạng thái dương tính Phần c ng hộ ợp còn lại không gắn với kháng thể di chuy n t i v ể ớ ị trí đối chứng và

b b t l i bị ắ ạ ởi kháng t ểh 2 s cho vạch màu hồẽ ng ch ng t que th hoứ ỏ ử ạt động bình thường, k t qu ế ả có giá trị Như vậy, khi xu t hi n c ba vấ ệ ả ạch màu hồng v ở ị trí

v ch kiạ ểm tra và vạch đối ch ng, ch ng t trong mứ ứ ỏ ẫu có IgG và IgM dương tính

v virus Dengue c p th ới ở ấ ể thứ phát; khi chỉ có mộ ạch màu hồt v ng t i v ạ ị trí vạch

22

kiểm tra c a IgM, chứng t trong mủ ỏ ẫu có IgM dương tính với virus Dengue c p ở ấthể nguyên phát; khi chỉ có mộ ạch màu hồt v ng t i v ạ ị trí vạch ki m tra c a IgG, ể ủchứng t trong mỏ ẫu có IgG dương tính với virus Dengue c p th th ở ấ ể ứ phát; và khi ch ỉ có mộ ạt v ch h ng v ồ ở ị trí đối ch ng, k t qu ứ ế ả âm tính, trong mẫu không có IgG/IgM đặc hi u vệ ới virus Dengue

và gia nhiệ ởt 100 ℃cho đến khi dung dịch này bắt đầu sôi Tiế ục cho thêm tác p tnhân khử vào dung dịch đang khuấy Do đó, Au3+ b ị khử thành nguyên tử vàng, vàng bắt đầu k t tế ủa dưới d ng h t nh ạ ạ ỏ nano mét và lớn d n cho t i khi dung ầ ớ

d ch tr ị ở nên siêu bão hòa

Kích thước hạt vàng phụ thuộc vào nồng độ citrate Đã có nghiên cứu ch ỉ

ra rằng kích thước hạt nano vàng tăng khi tăng nồng độ ch t kh ấ ử citrate [7]

Các hạt nano vàng rất thân thiện với môi trường sinh học, tuy nhiên sự ết k

h p c a hợ ủ ạt vàng với phân tử sinh h c vọ ới vai trò là chất đánh dấu đòi hỏi phải

đảm bảo các yêu cầu sau :

- Gắn kết bền vững với các phân tử sinh học đánh dấu

- Hạt vàng không làm ảnh hưởng tới chức năng nhận biết của phân tử sinh học Các chức năng của phân tử sinh học không bị hạt vàng làm ảnh hưởng

- Kích thước của hạt vàng thường từ vài chục đến vài trăm nano mét, vì vậy quá trình gắn kết có thể làm biến đổi phân bố không gian của phân tử sinh

1.4.2.3 Mi ng th m m u ế ấ ẫ

Miếng th m mấ ẫu được s dử ụng để ậ v n chuy n mể ẫu đến các thành phần khác của que th : mi ng c ng hử ế ộ ợp, màng nitrocellulose Miếng th m m u phấ ẫ ải có khả năng vận chuy n mể ẫu liên tục và đồng nh t V i m t s que th đượấ ớ ộ ố ử c thi t ế

k c biế đặ ệt thì vùng nhận mẫu có thêm quá trình tiền x ử lý (đối v i m u chớ ẫ ứa nhi u t p ch t hoề ạ ấ ặc thành phần khó phân tích) Quá trình tiền x ử lý mẫu thường bao g m viồ ệc tách tạp chất có trong mẫu, điều ch nh nhiỉ ệt độ, pH V t liậ ệu được

s d ng ph biử ụ ổ ến để làm miếng th m mấ ẫu là cellulose, bởi kh ả năng thấm hút rất

tốt, cho phép nạp một lượng l n dung d ch, chớ ị ất ổn định pH, và giá thành tương

đố ẻi r

1.4.2.4 Mi ng c ng h p ế ộ ợ

Miếng c ng h p th c hi n nhi u nhi m vộ ợ ự ệ ề ệ ụ, nó là nơi cố đị nh c ng hộ ợp kháng nguyên – ạt nano vàng và khi có dòng mẫ h u t mi ng th m m u chuy n ừ ế ấ ẫ ểtới, nó giải phóng cộng hợp kháng nguyên – ạt nano vàng theo mẫu vào màng hYêu cầu đối với mi ng c ng h p cế ộ ợ ần có là:

- Khả năng liên kết không đặc hiệu thấp: nếu cộng hợp hoặc chất phân tích liên kết chặt chẽ với miếng cộng hợp, nó sẽ không tạo thành phức hợp miễn dịch tại vạch kiểm tra, do đó giảm cường độ tín hiệu và độ nhạy

24

- Ổn định đặc điểm dòng chảy: nếu như vật liệu miếng cộng hợp không duy trì đều dòng mẫu vào màng thì cộng hợp có thể chuyển lên màng nhưng sẽ tạo thành các vệt tín hiệu không đồng đều tại vạch kiểm tra và vạch đối chứng

- Thể tích chống thích hợp: khi nạp cộng hợp vào miếng cộng hợp thì lượng phức hợp trên mỗi que thử phụ thuộc vào thể tích chống của vật liệu Nếu thể tích chống thay đổi đáng kể thì biến đổi cường độ tín hiệu có thể được quan sát thấy khá rõ dù các thành phần khác giữ cố định

- Độ ly giải thấp: các hạt tự do trong vật liệu làm miếng cộng hợp nếu dễ dàng ly giải khỏi vật liệu có khả năng gây tắc nghẽn tại vùng tiếp xúc của miếng cộng hợp và màng

Miếng c ng hộ ợp có ảnh hưởng r t lấ ớn đến độ nhạy và độ đặ c hi u c a que ệ ủthử Các vật liệu thường dùng làm miếng c ng h p bao g m: s i th y tinh, sộ ợ ồ ợ ủ ợi cellulose, polyester và polypropylene

1.4.2.5 Màng nitrocellulose

Màng nitrocellulose là một trong những thành phần quan tr ng nh t trong ọ ấchế ạ t o que th Thuử ộc tính vật lý và hóa học của màng có ảnh hưởng tới đặc tính nano d n cẫ ủa nó Đặc tính mao dẫ ại ảnh hưởng đến l n s kế ủa, độự t t nhạy, độ đặ c

hiệu và tính ổn định c a v ch kiủ ạ ểm tra Ngoài ra, các tính chấ ật lý khác củt v a màng ảnh hưởng t i s ớ ự nguyên vẹn c a que th ủ ử hoàn thiện Một màng lý tưởng cần có những đặc tính sau:

- Kiểm soát tốc độ dòng chảy mao mạch

- Liên kết chặt chẽ với kháng nguyên

- Ít hấp phụ không đặc hiệu tại vùng vạch kiểm tra và vạch đối chứng

- Dễ sử dụng và xử lý, rẻ tiền và có ái lực cao với các phân tử protein hoặc các phân tử sinh học khác

1.4.2.6 Miếng hút mẫu

Miếng hút mẫu có chức năng chính là làm tăng tổng th ể tích mẫu vào que thử, đồng thời tham gia vào việc duy trì tốc độ dòng chảy c a ch t l ng qua ủ ấ ỏmàng Do tổng th ể tích mẫ ạo thành tín hiệu được điều t u khi n b i th ể ở ể tích hòa tan các hạt đánh dấ ở ạu v ch kiểm tra và vạch đối ch ng, ch ứ ứ không phải th ể tích mẫu đi vào que thử nên các miếng hút mẫu tác động rất ít đến độ nh y cạ ủa phép thử

Các thông số ỹ k thu t cậ ần quan tâm của miếng hút mẫu: kích thước, độ

bền cơ học, độ dày

25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Hóa chất và kháng thể

- Môi trường nuôi cấy, bao g m: ồ

+ Môi trường LB (Luria Bertani) lỏng và đặc

+ Protein A tái tổ ợp có mã hiệ h u ab52953 (Abcam- M ) ỹ

+ Các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính IgM Dengue đã được kiểm tra t b nh vi n Xanh-ừ ệ ệ pôn

- Các hóa chất khác bao gồm: BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium Salt, NBT (Nitrotetrazolium Blue Chloride), TMB (Tetramethylbenzidine), BSA (Bovine Serum Albumin), đệm PBS 10X, Sodium chloride, Potassium carbonate, Sodium borate, Sucrose…đảm bảo độ tinh khi t ế

s dử ụng cho nghiên cứu

- Thang chuẩn protein “GangNam-STAIN Prestained Protein Ladder” của hãng Intron Biotechnology gồm 12 băng, kích thước thang chu n t ẩ ừ 10 kDa đến

245 kDa