Trang 1 NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNHBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNHCÔNG NGHỆ SINH HỌCNGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CH
NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ 2016B Hà Nội – Năm 2018 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205253581000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS TRƯƠNG QUỐC PHONG Hà Nội – Năm 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các kết nghiên cứu luận văn hoàn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu nào, phần kết cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm với cam đoan Học viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Trương Quốc Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội người trực tiếp hướng dẫn định hướng phương pháp nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên công tác học tập Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa Hà Nội góp ý kiến q báu cho tơi, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Với tất kính u biết ơn chân thành, tơi xin cảm ơn gia đình người thân yêu động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua khó khăn suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2018 Nguyễn Thị Ngọc Ánh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.1 Lịch sử phát Aflatoxin 1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin 1.3 Đặc điểm Aflatoxin 1.3.1.Cấu trúc hóa học phân loại .5 1.3.2.Tính chất hóa học tính chất vật lý 1.3.3.Sự chuyển hóa tiết aflatoxin 1.3.4.Độc tính aflatoxin 10 1.4 Tình hình nhiễm độc aflatoxin giới Việt Nam 12 1.4.1.Trên giới 12 1.4.2.Tại Việt Nam 13 1.5 Các phương pháp phát Aflatoxin 14 1.5.1.Phương pháp sắc kí 14 1.5.2.Phương pháp quang phổ .17 1.5.3.Phương pháp miễn dịch 18 1.5.4.Phương pháp que thử sắc ký miễn dịch 21 1.6 Đặc tính que thử 23 1.6.1.Hạt nano vàng (GNPs) 23 1.6.2.Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 23 1.6.3.Miếng thấm mẫu 24 1.6.4.Miếng cộng hợp 24 iii 1.6.5.Màng .25 1.6.6.Miếng thấm hút .25 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 26 2.2 Vật liệu 26 2.1.1.Hóa chất 26 2.1.2.Các kháng thể sử dụng 27 2.1.3.Thiết bị 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1.Phương pháp sản xuất kháng thể 28 2.2.2.Phương pháp tinh kháng thể kháng AFB protein A 28 2.2.3.Phương pháp điện di SDS – PAGE 29 2.2.4.Phương pháp ELISA gián tiếp 30 2.2.5.Phương pháp Dot – blot .30 2.2.6.Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 31 2.2.7.Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp .32 2.2.8.Phương pháp phân tích mẫu que thử 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu tạo kháng thể kháng AFB 33 3.1.1.Nghiên cứu sản xuất kháng huyết kháng AFB1 33 3.1.2.Nghiên cứu tinh chế kháng thể đa dòng kháng AFB1 34 3.1.3.Đánh giá đặc tính kháng thể kháng AFB tinh 37 3.2.Nghiên cứu chế tạo que thử 38 3.2.1.Thiết lập điều kiện ban đầu tạo que thử .38 3.2.2.Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp .39 3.2.3.Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 48 3.3.Đánh giá que thử 53 3.3.1.Độ lặp lại que thử 54 3.3.2.Ngưỡng phát 55 iv 3.3.3.Thử nghiệm mẫu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi 56 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 65 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AF : Aflatoxin AFB : Aflatoxin B AFB : Aflatoxin B AFG1 : Aflatoxin G1 AFG2 : Aflatoxin G2 AFM : Aflatoxin M AFM : Aflatoxin M AP : Alkaline phosphatase BICP : –Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt BSA : Bovine Serum Albumine EDC : 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FCA : Freund’s Complete Adjuvant FIA : Freund’s Incomplete Adjuvant FPLC : Fast protein liquid chromatography GNP : Gold Nanoparticles (hạt nano vàng) GST : Glutathione S-transferase HPLC : High – performance liquid chromatography HPTLC : High – performance thin layer chromatography HRP : Horseradish peroxidase Ig : Immunoglobulin KLH : Keyhole Limpet Hemocyanin LFA : Lateral Flow Immunoassay MS Mass spectrometry NHS N-hydroxysuccinimide PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline vi PEG Polyethylene glycol PrA Protein A TLC Thin Layer Chromatography UV-VIS Ultraviolet–visible spectroscopy WHO World Healthy Organization vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus bào tử nấm nhìn kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần Hình Cấu trúc nhóm Aflatoxin điển hình B G Hình Các nhóm Aflatoxin khác Hình Quá trình chuyển hóa aflatoxin B thể Hình Nguyên lý que thử hoạt động dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh 22 Hình Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 26 Hình 2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31 Hình 3.1 Biểu đồ ELISA trình gây đáp ứng miễn dịch thỏ AFB1KLH 34 Hình Sắc ký đồ tinh IgG từ huyết thỏ sử dụng cột Protein ASepharosevới thể tích gel ml, tốc độ ml/phút 35 Hình 3 Phổ điện di protein tinh kháng thể kháng AFB 36 Hình Đánh giá tính đặc hiệu kháng thể kháng AFB tinh 37 Hình Kiểm tra hoạt động que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 39 Hình Xác định hàm lượng kháng thể kháng AFB1 cộng hợp với GNPs thích hợp 40 Hình Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 42 Hình Phản ứng tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng điều kiện nhiệt độ khác 43 Hình 3.9 Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể hạt nano vàng 44 Hình 10 Ảnh hưởng cơng thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử 45 Hình 11 Kết thử nghiệm loại vật liệu khác làm miếng cộng hợp 46 Hình 12 Nhiệt độ cố định cộng hợp 47 Hình 13 Thời gian sấy miếng cộng hợp 48 Hình 14 Ảnh hưởng vật liệu màng đến kết nghiên cứu 49 Hình 15 Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra (vạch T) 50 viii