Trang 1 NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNHBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNHCÔNG NGHỆ SINH HỌCNGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CH
TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
Lịch sử phát hiện Aflatoxin
Vào cuối những năm 1950 và đầu những năm 1960, hơn 100.000 con gà tây ở Anh đã chết một cách bí ẩn, dẫn đến việc xác định bệnh “Gà tây X” Các cuộc giải phẫu bệnh cho thấy nguyên nhân cái chết là do ăn bột lạc Brazin, loại thức ăn phổ biến trong chăn nuôi Nhiều nghiên cứu sau đó phát hiện bột lạc Brazin bị nhiễm độc tố thực vật, cụ thể là độc tố nấm Năm 1961, các nhà khoa học đã phân lập nấm Aspergillus flavus, xác định đây là loài nấm tiết ra độc chất, và độc tố này được đặt tên là Aflatoxin (AF) vào năm 1962.
Giữa năm 1966 và 1969, nghiên cứu tại Mỹ đã chỉ ra rằng các bệnh nhiễm aflatoxin (AF) là nguyên nhân gây viêm gan ở chó, ngộ độc ngô mốc ở lợn và là chất gây ung thư mạnh trong cá hồi Đồng thời, trong giai đoạn này, mối liên hệ giữa aflatoxin và bệnh gan ở người cũng đã được thiết lập.
Năm 1974, một ổ dịch viêm gan do vi rút AF đã bùng phát tại các bang Gujrat và Rajasthan ở Ấn Độ, gây ra khoảng 106 ca tử vong Ổ dịch này kéo dài trong 2 tháng và chủ yếu ảnh hưởng đến những người có chế độ ăn chính là ngô Phân tích các mẫu ngô cho thấy sự hiện diện của vi rút trong các mẫu này.
Aspergillus flavus là một loại nấm có thể gây ra triệu chứng như cổ trướng và phù nề vùng ngoại biên, thường liên quan đến bệnh xơ gan và các bệnh gan khác Aflatoxin, một chất độc do nấm này sản sinh, được xem là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe con người vì tính chất gây ung thư của nó Năm 2002, IARC đã xếp aflatoxin B1 vào danh sách các chất gây ung thư cho con người.
Năm 1988, nhiều nghiên cứu dịch tễ học ở Châu Á và Châu Phi đã chỉ ra mối liên quan tích cực giữa aflatoxin (AF) và tế bào gan Một đợt bùng phát aflatoxin ảnh hưởng đến cả người và chó đã được báo cáo ở Tây Bắc Ấn Độ vào năm 1974 Đến năm 1981, một vụ phơi nhiễm aflatoxin nghiêm trọng khác đã được ghi nhận ở Kenya Những phát hiện ban đầu này đã dẫn đến các nghiên cứu sâu hơn, cho thấy nguy cơ tiếp xúc với aflatoxin gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho con người và động vật toàn cầu Khám phá này cũng nâng cao nhận thức về nguy hiểm tiềm tàng của nấm mốc trong các vụ ngộ độc thực phẩm Các nghiên cứu sau đó còn chỉ ra rằng aflatoxin được sản xuất bởi nhiều chủng nấm khác nhau như A parasiticus và A nomius.
Điều kiện sản sinh Aflat oxin
Aflatoxin được sinh ra từ các loài nấm thuộc chi Aspergillus, chủ yếu là
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, cùng với một số loài thuộc chi Penicillium, là những loại nấm phổ biến trong tự nhiên Chúng phát triển dễ dàng trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc có sức đề kháng vi sinh vật thấp, xâm nhập vào các chất hữu cơ trong điều kiện độ ẩm tối thiểu 7% và nhiệt độ cao Nấm Aspergillus sản sinh aflatoxin trong khoảng nhiệt độ từ 8 đến 37 độ C, với điều kiện tối ưu ở 25-28 độ C và độ ẩm tương đối từ 83-88% Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm ở Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc Aspergillus và sự sản sinh aflatoxin.
Aflatoxin có thể xâm nhập vào nông sản trong nhiều giai đoạn, bao gồm trước khi thu hoạch, trong quá trình thu hoạch và trong bảo quản Các loại nông sản dễ bị nhiễm aflatoxin bao gồm ngũ cốc như ngô, kê, lúa miến, gạo và lúa mì; hạt có dầu như lạc, đậu tương, hạt hướng dương và hạt bông; cũng như gia vị như ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ và gừng, cùng với một số loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ và dừa.
Đặc điểm của Aflatoxin
được nhìn dưới kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần [58, 59].
Aflatoxin có thể xuất hiện trong sữa của động vật khi chúng tiêu thụ thức ăn nhiễm aflatoxin Tỷ lệ aflatoxin từ thức ăn chuyển vào sữa của bò sữa trung bình dao động từ 1-2% Tuy nhiên, do bò tiêu thụ một lượng thức ăn lớn, tỷ lệ này có thể ảnh hưởng đến chất lượng sữa.
M1 vào sữa có thể đạt 6,2%.
1.3.1 Cấu trúc hóa học và phân loại
Có khoảng 20 chất chuyển hóa nấm liên quan đến aflatoxin, chủ yếu được sản xuất bởi các loài Aspergillus flavus, A nomus và A parasiticus Trong số đó, 6 loại điển hình bao gồm AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 Những chất này là các phân tử difuranocoumarins với hai chuỗi cấu trúc hóa học quan trọng: chuỗi difurocoumarocyclopentenone (AFB1, AFB2, AFM1, AFM2 và aflatoxicol) và chuỗi difurocoumarolactone (AFG1, AFG2) Chữ "B" và "G" trong tên gọi của aflatoxin phản ánh màu huỳnh quang xanh lam và xanh lục được tạo ra dưới ánh sáng tia cực tím trong quá trình phân tích bằng sắc ký lớp mỏng.
Các hợp chất lớn và nhỏ được chỉ định bởi 1 và 2, trong đó AFM 1 và AFM 2 là các chất chuyển hóa tương ứng của AFB1 và AFB2 có mặt trong dịch cơ thể.
Hình 1.2 Cấu trúc 2 nhóm Aflatoxin điển hình B và G [16]
Aflatoxin B1 và B2 được sản xuất bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, trong khi aflatoxin G1 và G2 được tạo ra bởi nấm A parasiticus Cấu trúc hóa học của các loại aflatoxin này đã được nhóm nghiên cứu của Büchi khám phá vào năm 1963.
Năm 1965, nhóm nghiên cứu AFB2 và AFG2 đã làm sáng tỏ hoàn toàn hóa học lập thể của aflatoxin nhóm B và G thông qua sự phân dã hóa học Về cấu trúc, các hợp chất aflatoxin bao gồm năm vòng: một vòng furo furan (B và C), một vòng thơm sáu cạnh (A), một vòng lactone sáu cạnh (D) và một vòng pentanone năm cạnh hoặc vòng lactone sáu cạnh (E) Aflatoxin nhóm B có chứa một vòng cyclopentane, trong khi nhóm G có vòng lactone Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất, xuất hiện trong hơn 75% mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có nhiễm aflatoxin.
Hình 1.3 Các nhóm Aflatoxin khác [16]
Aflatoxin M1 và M2 là các dẫn xuất hydroxyl hóa của aflatoxin B1 và B2, thường được gọi là “độc tố sữa” Aflatoxin M1 là chất chuyển hóa của aflatoxin
Aflatoxin M1 và M2 là những chất chuyển hóa của aflatoxin B1 và B2, có thể xuất hiện trong sữa mẹ và sữa bò Aflatoxin M1 được tìm thấy trong sữa bò khi chúng được cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B2 Cấu trúc của chúng chứa nhóm hydroxy tại các điểm giao nhau của hai vòng furan Mặc dù là dẫn xuất của aflatoxin B1 và B2, aflatoxin M1 và M2 vẫn giữ được tính bền nhiệt trong quá trình chế biến sữa.
Các aflatoxin khác như R0, RB1, RB2 và H1 có nhóm hydroxyl thay vì nhóm cacbonyl ở vòng E Chúng được hình thành thông qua quá trình chuyển hóa sinh học
Aflatoxin B3 còn được gọi là parasiticol, vì nó là lần đầu tiên phân lập từ
Aspergillus parasiticus Tất cả các aflatoxin thể hiện trong Hình 1.3 là các sản phẩm chuyển hóa trao đổi chất từ aflatoxin nhóm B
1.3.2 Tính chất hóa học và tính chất vật lý
Aflatoxin là các tinh thể màu vàng, tan trong dung môi phân cực như chloroform, methanol và acetone, đặc biệt là dimethylsulfoxide, và có thể tồn tại trong các dung môi này nhiều năm nếu được bảo quản lạnh và tránh ánh sáng Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10-20 mg/L Chúng rất bền với nhiệt và không bị phá hủy khi nấu nướng thông thường hay thanh trùng, nhưng dễ bị tiêu diệt bởi tia tử ngoại, đun trong nồi áp suất hoặc xử lý bằng chất oxy hóa Aflatoxin nhóm B phát huỳnh quang màu xanh lam, trong khi nhóm G phát huỳnh quang màu xanh lục dưới ánh sáng tử ngoại, cho phép phân biệt giữa hai nhóm này dựa vào tính phát quang.
Aflatoxin có cấu trúc vòng lactone, khiến nó dễ bị thủy phân bởi các bazo mạnh, do đó có thể sử dụng kiềm để xử lý thực phẩm nhiễm aflatoxin Tuy nhiên, khi axit hóa, các aflatoxin có thể tái tạo lại Ngoài ra, ở nhiệt độ cao, quá trình decarboxylation sẽ làm mở vòng, dẫn đến việc mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm.
Nhiều tác nhân oxy hóa như hypochlorite natri, thuốc tím, clo, H2O2 và ozone có khả năng phản ứng với aflatoxin, dẫn đến sự thay đổi cấu trúc phân tử của chúng Một số phản ứng này còn có thể làm mất đi tính huỳnh quang của aflatoxin.
1.3.3 Sự chuyển hóa và bài tiết aflatoxin
Quá trình loại bỏ các chất hóa học khỏi cơ thể diễn ra qua hai giai đoạn chính Giai đoạn I tập trung vào việc chuyển hóa các xenobiotics như aflatoxin thông qua các phản ứng oxy hóa, acetyl hóa và thủy phân, nhằm bổ sung nhóm cực nhỏ chứa điện tích dương và âm, giúp chúng trở nên vô hại Giai đoạn này chủ yếu được thực hiện bởi enzyme Cytochrome P450 (CYP450) Tiếp theo, giai đoạn II liên quan đến các phản ứng liên hợp với sulfate, glucuronide, glutathione và amino acid, hoàn tất quá trình chuyển hóa và bài tiết.
Sự chuyển hóa của AFB1 đã được nghiên cứu bởi Wild và cộng sự, 2002;
Gallagher và cộng sự, 1996; Vondracek và cộng sự, 2001 (Hình 1.4) [23, 55, 54]
Aflatoxin trải qua quá trình chuyển hóa pha I thông qua các phản ứng oxy hóa như epoxid hóa, hydrat hóa, hydroxyl hóa và O-demethyl hóa, nhờ vào siêu họ enzyme Cytochrome P450s (CYP450s) Quá trình này tạo ra các chất chuyển hóa như AFB1- exo-8,9-epoxide (AFBO), AFB2a, AFM1, AFQ1 và AFP1 Trong số này, AFBO được xác định là chất gây ung thư, trong khi các chất chuyển hóa khác ít độc hơn và thường được liên kết với các phân tử khác để nhanh chóng được bài tiết qua mật và nước tiểu.
Hình 1 4 Quá trình chuyển hóa aflatoxin B 1 trong cơ thể (1A2: CYP1A2, 3A4:
CYP3A4, 3A5: CYP3A5, GST: Glutathione S-transferase, AFAR: aflatoxin aldehyde reductase, aflatoxin-S-G: aflatoxin-glutathione) [54]
AFB1 được chuyển hóa chủ yếu trong gan nhờ các CYP1A2,
CYP3A4/CYP3A5 và CYP3A7 (ở thai nhi) xúc tác chuyển hóa thông qua hai phản ứng oxy hóa vận chuyển điện tử riêng biệt [12, 23, 54, 57] Enzyme
CYP1A2 chuyển hóa AFB1 thành các sản phẩm như exoepoxide, endoepoxide và AFM1, trong khi CYP3A4 chuyển đổi AFB1 thành AFB1-exo-8,9-epoxide và AFQ1, có độc tính thấp hơn Cả AFM1 và AFQ1 đều không bị phân giải tiếp mà được bài tiết qua nước tiểu.
Chất chuyển hóa AFB1 trải qua quá trình enzym giai đoạn II nhờ glutathione S-transferases (GST), chủ yếu thực hiện phản ứng liên hợp AFB1-exo-8,9-epoxide có thể chuyển hóa ngược hoặc thành aflatoxin-mercapturic acid qua con đường GST, hoặc thành aflatoxin glucuronide qua aflatoxin-dihydrodiol Dạng hoạt hóa của AFB1 (exoepoxide và endoepoxide) được khử độc qua quá trình cộng hợp GST sử dụng glutathione dạng khử (GSH), tạo thành các cộng hợp AFB1 exoepoxide-GSH và endoepoxide-GSH Các dạng hoạt động exoepoxide và endoepoxide cũng nhanh chóng bị thủy phân không nhờ enzyme, tạo thành aflatoxin B1-8,9-dihydridiol, sau đó chuyển hóa thành ion dialdehyde phenolate.
Tình hình nhiễm độc aflatoxin trên thế giới và ở Việt Nam
Kể từ năm 2004, đã có nhiều đợt bùng phát aflatoxicosis trên toàn cầu, gây ra 500 ca bệnh cấp tính và 200 trường hợp tử vong Ngộ độc cấp tính do tiêu thụ lượng lớn aflatoxin vượt mức cho phép hiếm khi xảy ra nhưng có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao, với vụ dịch gần đây nhất được ghi nhận tại Kenya vào năm 2004.
Tại Ấn Độ năm 1974, có 397 ca mắc và 106 ca tử vong do nhiễm aflatoxin từ ngô, với lượng aflatoxin trung bình ước tính là 2.6 mg/người/ngày Năm 2013, nhiễm aflatoxin trong sữa đã được ghi nhận ở một số nước châu Âu như Romania, Serbia và Croatia, với tổng số 317 ca mắc và 125 ca tử vong.
Aflatoxin được cho là nguyên nhân gây ra từ 25.200 đến 155.000 trường hợp ung thư tế bào gan hàng năm trên toàn thế giới, chiếm 5-28% tổng số ca ung thư gan Chất này có mặt trong nhiều loại thực phẩm, và người dân ở khu vực Đông Nam Á có mức tiêu thụ aflatoxin trung bình khoảng 30-100 ng/kg thể trọng/ngày Mức độ phơi nhiễm này liên quan đến nguy cơ ung thư tế bào gan từ 3-10 ca/1 triệu dân/năm Đặc biệt, những người đồng nhiễm viêm gan siêu vi B và aflatoxin có nguy cơ mắc ung thư tế bào gan cao gấp 30 lần so với người không nhiễm.
Năm 1988, Viện Dinh dưỡng Việt Nam đã công bố kết quả nghiên cứu về sự hiện diện của aflatoxin B1 trong lạc và các sản phẩm từ lạc, cho thấy 13% mẫu lạc nhân (7/55 mẫu) có chứa aflatoxin.
Giữa năm 1990 và 1995, Viện Dinh dưỡng đã tiến hành kiểm tra 387 mẫu lương thực thực phẩm, phát hiện 73 mẫu (19%) bị nhiễm aflatoxin, trong đó có 19 mẫu (4,9%) có hàm lượng aflatoxin vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế.
Kết quả khảo sát trên 243 mẫu ngô, lạc và sản phẩm chế biến thức ăn chăn nuôi tại 3 xã thuộc huyện Tân Kỳ, Nghệ An cho thấy mức độ nhiễm aflatoxin cao, với 95,4% (232/243) mẫu có nhiễm và tỷ lệ vượt giới hạn cho phép theo quy định của Bộ Y tế là hơn 23% (56/243 mẫu).
56 mẫu có hàm lượng aflatoxin > 10 ppb; 22 mẫu có hàm lượng AF từ 5-10 ppb;
50 mẫu có hàm lượng AF từ 2-5 ppb [4]
Nghiên cứu của Đậu Ngọc Hào và các cộng sự chỉ ra rằng, 50-80% mẫu ngô tại các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa bị nhiễm nấm mốc và aflatoxin, với 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột bị nhiễm Aspergillus flavus.
Viện Vệ sinh Y tế công cộng Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành phân tích 115 mẫu thực phẩm, bao gồm sản phẩm chế biến từ đậu phộng, nước tương, đồ hợp chay, cà phê và thức ăn chăn nuôi Kết quả cho thấy 30% mẫu cà phê, 42,9% mẫu nước tương, 66,7% mẫu đồ hộp chay, và 68,2% mẫu đậu phộng và sản phẩm từ đậu phộng bị nhiễm AFB1 Đặc biệt, 94,6% mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa aflatoxin AFB1, với nhiều mẫu có hàm lượng rất cao (> 10 ppb), trong đó có mẫu chứa từ 140 - 300 ppb.
Vào tháng 5/2017, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành giám sát aflatoxin trong ớt khô, tập trung vào các mẫu ớt khô có nguy cơ cao, như ớt không có đóng gói và nguồn gốc rõ ràng, tại một số điểm kinh doanh nhỏ lẻ Kết quả cho thấy 20,8% mẫu ớt khô vượt ngưỡng AFB1 theo quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam, chỉ ra sự cần thiết rà soát lại chuỗi thực phẩm từ canh tác đến sử dụng.
Theo nghiên cứu của Trần Văn An (1991), hàm lượng aflatoxin trong một số nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam như sau:
Bảng 1 1 Lượng aflatoxin trong nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam
Tên nguyên liệu Số mẫu Hàm lượng aflatoxin trung bình (ppb)
Hàm lượng aflatoxin tối đa (ppb)
Gạo và tấm gạo 2 22 25 Đậu nành hạt 1 50 50
Các phương pháp phát hiện Aflatoxin
• Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) lần đầu tiên được giới thiệu bởi de Iongh và được công nhận bởi Hội các nhà hóa học phân tích (AOAC) như là phương pháp phổ biến từ những năm 1990 TLC đã được sử dụng rộng rãi để xác định aflatoxin trong thực phẩm, với pha tĩnh làm từ silica, alumina hoặc cellulose trên nền thủy tinh hoặc nhựa, và pha động là hỗn hợp dung môi như methanol, chloroform, acetone và nước Phân tích thường mất từ 45 phút đến 2 giờ Mặc dù TLC có độ nhạy cao và có thể xác định nhiều loại aflatoxin trong một mẫu, nhưng nó yêu cầu người phân tích có kỹ năng tốt, cần tiền xử lý mẫu và sử dụng thiết bị đắt tiền, đồng thời có thể thiếu chính xác do các vấn đề trong quá trình tra mẫu và phân tích kết quả Để khắc phục những hạn chế này, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) đã được phát triển, với khả năng tự động hóa trong việc nạp mẫu, hiển thị và phân tích kết quả HPTLC hiện nay là một trong những phương pháp chính xác và hiệu quả trong phân tích aflatoxin, nhưng do yêu cầu kỹ năng cao, chi phí thiết bị lớn và quy trình tiền xử lý phức tạp, nó chỉ phù hợp cho phân tích trong phòng thí nghiệm và không thể áp dụng ngoài hiện trường.
• Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật sắc ký phổ biến nhất, được sử dụng để phân tách và xác định hơn 80% các hợp chất hữu cơ trên toàn cầu Kỹ thuật này sử dụng một pha tĩnh nằm trong cột thủy tinh hoặc cột nhựa, trong khi pha động là hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ, cho phép chạy qua các chất hấp phụ rắn.
Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) là phương pháp chính để phân tích aflatoxin, với khả năng xác định nhanh chóng và chính xác, đạt độ nhạy lên tới 0,1 ng/kg nhờ cảm biến huỳnh quang (FLD) Trong quá trình phân tích, các chất cần xác định được bơm vào pha tĩnh và di chuyển nhờ pha động dưới áp suất cao, với việc phát hiện và ghi nhận thời gian trễ của các chất thông qua cảm biến như UV hoặc DAD Mặc dù HPLC hiệu quả, phương pháp này yêu cầu mẫu phải được tinh sạch cao và cần quá trình tạo dẫn xuất trước khi phân tích Để khắc phục những hạn chế này, HPLC đã được cải tiến bằng cách kết nối với khối phổ (MS), cho phép xác định aflatoxin mà không cần bước tạo dẫn xuất HPLC MS/MS sử dụng lượng mẫu nhỏ và cung cấp thông tin về cấu trúc với giới hạn phát hiện thấp, nhưng do chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật phức tạp, phương pháp này chỉ thích hợp cho phân tích trong phòng thí nghiệm.
Trong sắc ký khí, pha động là khí mang và pha tĩnh là chất lỏng phủ trên các hạt rắn trơ Phân tích mẫu dựa vào sự phân tách khác nhau giữa hai pha, với pha tĩnh thường là các hạt trơ được phủ chất lỏng trong cột thép không gỉ hoặc thủy tinh Mẫu bay hơi vào pha khí và được truyền qua pha tĩnh bằng khí mang, dẫn đến sự phân bố khác nhau của các thành phần hóa học Các thành phần có ái lực cao với pha tĩnh di chuyển chậm hơn, trong khi các thành phần có ái lực thấp di chuyển nhanh hơn Mỗi thành phần có hệ số phân bố riêng, cho phép điều chỉnh tốc độ đi qua cột Sau khi tách, việc phát hiện sản phẩm dễ bay hơi được thực hiện bằng detector FID, ECD hoặc máy đo khối phổ (MS), và có thể cần tạo dẫn xuất aflatoxin để phát hiện do tính không tan của chúng.
Sắc ký khí là một phương pháp phát hiện aflatoxin, nhưng ít được sử dụng trong phân tích thương mại do có nhiều phương pháp sắc ký khác rẻ hơn Phương pháp này yêu cầu bước làm sạch ban đầu, giới hạn khả năng phân tích một số độc tố nấm mốc như A-trichothecenes và B-trichothecenes Thêm vào đó, sắc ký khí gặp khó khăn trong việc lập đường chuẩn và kết quả dễ bị ảnh hưởng bởi các mẫu trước đó.
Cấu trúc của vật liệu có thể được phân tích qua ánh sáng UV-VIS nhờ vào sự hấp phụ tại các bước sóng đặc trưng Một số phân tử, được gọi là chất huỳnh quang, hấp thụ ánh sáng và phát ra năng lượng ở các bước sóng khác nhau Sự phát huỳnh quang rất quan trọng trong việc xác định và phân tích các phân tử, như aflatoxin trong hạt, với khả năng định lượng từ 5 – 5000 ppb trong vòng 5 phút Tuy nhiên, để nâng cao độ nhạy khi phân tích aflatoxin bằng thiết bị huỳnh quang, có thể cần tạo dẫn xuất để tăng cường khả năng phát quang Phương pháp này không phù hợp để kiểm nghiệm mẫu từ sản phẩm xuất khẩu vào Châu Âu do giới hạn phát hiện cao hơn mức quy định (4 àg/kg).
Quang phổ hồng ngoại (IR) là một phương pháp hiệu quả để phân tích aflatoxin, hoạt động dựa trên sự thay đổi trong dao động phân tử khi bị kích thích bởi bức xạ hồng ngoại Mỗi phân tử có một phổ hồng ngoại riêng biệt, cho phép nhận diện hợp chất sạch thông qua việc xác định phổ của nó Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier đã được áp dụng để phân tích aflatoxin trong hạt đậu và bánh hạt đậu, trong khi Pearson và cộng sự đã sử dụng quang phổ truyền qua và quang phổ phản xạ để xác định aflatoxin trong hạt ngô Kết quả cho thấy hơn 95% mẫu hạt được phân tích có chứa aflatoxin, được chia thành hai nhóm: nhóm có nồng độ aflatoxin cao (> 100 ppb) và nhóm có nồng độ aflatoxin thấp (< 10 ppb).
Phương pháp miễn dịch, phát triển từ những năm 1970, nổi bật với tính đặc hiệu trong việc gắn kết giữa kháng thể và kháng nguyên Sự hình thành phức hợp này có thể được định lượng thông qua sự thay đổi độ hấp thụ của photon ánh sáng quang phổ, và có thể được khuếch đại để cải thiện khả năng nhận diện tín hiệu nhờ vào các chất đánh dấu như enzyme, fluorophore và đồng vị phóng xạ Kỹ thuật miễn dịch đã được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sinh học, thực phẩm và dược phẩm, nhờ vào độ nhạy cao và tính đặc hiệu của nó, ngay cả trong điều kiện có vật liệu nhiễm bẩn Phương pháp này không yêu cầu nhân viên có tay nghề cao, tiết kiệm thời gian và công sức Các phương pháp miễn dịch chính trong phân tích aflatoxin bao gồm xét nghiệm phóng xạ (RIA), xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), que thử sắc ký miễn dịch và immunosensors.
Kỹ thuật xét nghiệm radioimmunoassay (RIA) dựa trên nguyên tắc cạnh tranh giữa kháng nguyên có đánh dấu phóng xạ và kháng nguyên không hoạt tính, cho phép xác định nồng độ kháng nguyên trong mẫu Số lượng kháng nguyên có đánh dấu tỷ lệ nghịch với kháng nguyên không đánh dấu, giúp phân tích chính xác các aflatoxin trong thực phẩm Langone và van Vunakis đã chứng minh khả năng phát hiện aflatoxin B1 trong đậu phộng với giới hạn 1 μg/kg Mặc dù RIA có ưu điểm là thực hiện nhiều phân tích đồng thời với độ nhạy và đặc hiệu cao, nhưng nó cũng gặp một số nhược điểm như yêu cầu kháng nguyên tinh khiết, sử dụng đồng vị phóng xạ có nguy cơ sức khỏe, và vấn đề về lưu trữ và xử lý chất thải phóng xạ Những hạn chế này đã ảnh hưởng đến việc áp dụng RIA trong phân tích aflatoxin.
Kỹ thuật ELISA hiện nay được sử dụng phổ biến để xác định aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp và đã phát triển thành nhiều kít thương mại Hầu hết các kít này sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRP) và alkaline phosphatase (AP) làm chất đánh dấu trong phân tích aflatoxin Phương pháp ELISA có nhiều ưu điểm như khả năng phân tích đồng thời nhiều mẫu, tính tiết kiệm và dễ sử dụng so với các phương pháp khác, đồng thời không cần làm sạch mẫu và không gây hại cho con người Tuy nhiên, quy trình này yêu cầu nhiều bước rửa, dẫn đến thời gian thực hiện khá lâu.
Que thử là công cụ phân tích nhanh dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch (LFA), sử dụng tính đặc hiệu và độ nhạy cao của phản ứng kháng nguyên-kháng thể để phát hiện các phân tử cần phân tích Cấu tạo của que thử bao gồm miếng thấm mẫu, miếng cộng hợp, màng và miếng thấm hút, thường được đặt trong hộp nhựa bảo vệ với lỗ nhỏ để tra mẫu Khi mẫu dịch lỏng được đưa vào, nó sẽ chảy qua miếng thấm mẫu để tiền xử lý, sau đó di chuyển đến miếng cộng hợp chứa chất đánh dấu, giúp chất lỏng vào màng Que thử đã được phát triển để xác định AFB1 trong thức ăn lợn, với giới hạn phát hiện là 5 àg/kg trong 10 phút, đáp ứng tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu Một phương pháp sắc ký miễn dịch khác cũng được phát triển, cho phép phát hiện 18 ng aflatoxin trong 12 phút, mang lại ưu điểm về tính dễ sử dụng, thời gian phân tích ngắn và chi phí thấp, phù hợp cho kiểm tra aflatoxin hàng ngày.
Cảm biến miễn dịch là loại cảm biến sinh học sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu như than chì, vàng hoặc carbon để phát hiện các liên kết đặc hiệu Các loại cảm biến miễn dịch phổ biến bao gồm cảm biến điện áp, cảm biến quang học và cảm biến điện hóa Nghiên cứu của Spinella và cộng sự đã chứng minh khả năng phát hiện AFB1 ở mức 0,5 - 10 ppb, trong khi báo cáo của Jn và cộng sự cho thấy AFB1 có thể được phát hiện trong sữa nhiễm bẩn nhân tạo với nồng độ từ 0,01 đến 10,0 ng/ml Mặc dù kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhưng yêu cầu sử dụng kháng thể và kháng nguyên có độ tinh khiết cao.
1.5.4 Phương pháp que thử sắc ký miễn dịch
1.5.4.1 Tình hình sử dụng que thử phát hiện aflatoxin tại Việt Nam
Hiện tại, tại Việt Nam chưa có công bố nghiên cứu về que thử nhanh phát hiện aflatoxin Tất cả các que thử hiện có đều được nhập khẩu hoàn toàn từ Trung Quốc.
Mỹ, Nhật Bản,… với độ nhạy từ 5 – 20 ppb Các que thử trên thị trường Việt Nam gồm có que thử định lượng và que thử định tính aflatoxin
Que thử Aflatoxin (Mĩ) là công cụ định tính nhạy 20 ppb, dùng để phát hiện aflatoxin trong ngô, hạt bông, thức ăn thô, cháo ngô, đậu phộng, bắp rang, gạo, bột đậu nành và lúa mì.
Reveal Q+ for Aflatoxin là sản phẩm que thử định lượng với khoảng đo từ
2 – 150 ppb trong thời gian 6 phút
Reveal Q+ for Aflatoxin Green offers superior advantages, including the ability to deliver precise results with a specific numerical value when used alongside the Reveal Q+ test strip reader.
1.5.4.2 Nguyên lý que thử xác định aflatoxin B 1
Đặc tính que thử
Hơn 70% nghiên cứu hiện nay sử dụng hạt nano vàng làm chỉ thị màu trong que thử Trong nghiên cứu này, hạt nano vàng được tạo ra ở dạng lỏng bằng cách khử hydro tetraclorua vàng (HAuCl4), trong đó Au 3+ bị khử thành Au 2+ Quá trình này bắt đầu bằng việc hòa tan HAuCl4 trong nước, sau đó khuấy từ nhanh và đun sôi ở nhiệt độ thích hợp.
Ở nhiệt độ 280 độ C, khi bổ sung tác nhân khử với tỷ lệ thích hợp, vàng bắt đầu kết tủa dưới dạng hạt nano nhỏ, và kích thước của chúng tăng lên khi dung dịch trở nên siêu bão hòa Hạt nano vàng được chức năng hóa bề mặt bằng các nhóm chức hữu cơ, tạo ra liên kết vô cơ-hữu cơ và được bao phủ bởi lớp phân tử hữu cơ tích điện Điều này cho phép chúng kết hợp với các phân tử sinh học thông qua các nhóm chức, hình thành các chất đánh dấu Để đạt được điều này, hạt nano vàng cần sở hữu những tính chất nhất định.
- Gắn kết bền vững với các phân tử sinh học và không làm ảnh hưởng tới hoạt tính của phân tử sinh học.
Không làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử sinh học và không cản trở khả năng gắn kết với phân tử thụ cảm của chúng.
1.6.2 Cộng hợp kháng thể hạt nano vàng-
Hiện nay, có hai phương pháp chính để kết hợp kháng thể với hạt nano vàng: liên kết không cộng hóa trị (hấp phụ) và liên kết cộng hóa trị Mỗi phương pháp này đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến hiệu quả và ứng dụng trong nghiên cứu và công nghiệp.
Hấp phụ vật lý là quá trình kháng thể được gắn lên bề mặt hạt nano vàng thông qua các tương tác vật lý như kỵ nước, ion và lực Van der Waals Mặc dù liên kết này không bền vững do phụ thuộc vào lớp citrate và các yếu tố môi trường như pH, áp suất, nhiệt độ và điều kiện khuấy trộn, nhưng quy trình tạo cộng hợp lại đơn giản, tiết kiệm chi phí và dễ dàng kiểm soát.
Here is the rewritten paragraph:"Liên kết cộng hóa trị là phương pháp gắn kháng thể lên bề mặt vàng bằng cách hình thành liên kết bền vững và khó bị phá vỡ Để thực hiện, các hạt nano vàng được phủ lớp polyethylene glycol (PEG) với nhóm cacboxyl hướng ra ngoài, sau đó được xúc tác bởi tác nhân EDC/NHS để hình thành liên kết cộng hóa trị với kháng thể Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian hơn."
Miếng thấm mẫu đóng vai trò quan trọng trong que thử, giúp nhận và vận chuyển dịch lỏng đến các thành phần khác một cách liên tục và đồng nhất Nó cũng loại bỏ cặn và yếu tố gây nhiễu, kiểm soát tốc độ dịch lỏng vào miếng cộng hợp Vật liệu làm miếng thấm mẫu cần có trọng lượng, độ dày, kích thước, độ bền cơ học và khả năng ly giải phù hợp Hai loại vật liệu phổ biến là sợi dệt dạng mắt lưới và cellulose, trong đó cellulose được ưa chuộng nhất nhờ khả năng nạp lượng lớn dung dịch, ổn định pH, cường độ ion và tăng cường độ nhớt.
Miếng cộng hợp đóng vai trò quan trọng trong việc kết nối miếng thấm mẫu và màng nitrocellulose, giúp cố định kháng thể hạt nano vàng Vật liệu làm miếng cộng hợp cần đảm bảo không làm hỏng hay bất hoạt kháng thể, duy trì liên kết khi sấy khô, có độ thấm ướt phù hợp và ổn định đặc điểm dòng chảy, cũng như khả năng nhả phức cộng hợp hoàn toàn Sự lựa chọn vật liệu cho miếng cộng hợp ảnh hưởng lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử, với các vật liệu phổ biến như sợi thủy tinh, sợi cellulose, polyester và polypropylene, được đặc trưng bởi kích thước lỗ màng, độ dày và trọng lượng.
Miếng thấm hút, nằm ở cuối que thử, có vai trò quan trọng trong việc tăng tổng thể tích mẫu và duy trì tốc độ dòng chảy của chất lỏng qua màng, ngăn chặn dòng chảy quay ngược Tín hiệu được tạo ra từ tổng thể tích mẫu phụ thuộc vào thể tích hòa tan của các hạt đánh dấu tại vạch kiểm tra và vạch đối chứng, do đó, miếng thấm hút chỉ ảnh hưởng rất ít đến độ nhạy của phép thử Các thông số kỹ thuật của vật liệu làm miếng thấm hút bao gồm kích thước, độ bền cơ học và độ dày.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ đồ tổng thể nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu
Vật liệu
- Các cơ chất sử dụng trong hiện màu phản ứng ELISA, Dot-blot: BICP, NBT, ™B (Sigma)
- Gel sắc kí: AF-Chelate-650 resin của Toso – Nhật Bản, protein Ah - Sepharose của hãng GE Healthcare.
- Dung dịch hydro tetraclorua vàng (HAuCl4) của Sigma.
- Hóa chất cho que thử: Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2 g; Na HPO 1,44 g; KH PO 0,24 g Dẫn HO đến 100 ml
- Các hóa chất: BSA (Sigma, Mỹ), Tween 20 (Merck, Đức), NaCl (Merck, Đức), Sodium Borate (Mỹ), Sucrose (Merck, Đức)
- Miếng cộng hợp Miếng cộng hợp (Hãng Biotech - Conjugate pad ZC J2, size 21x20 cm)
- Miếng thấm mẫu (Hãng Biotech - Sample pad FM Y2)
- Vỏ nhựa (Xuất xứ Trung Quốc).
- Miếng thấm hút (Hãng Biotech –Absorbent pad H5076, size 20x30 cm, Trung Quốc)
2.1.2 Các kháng thể sử dụng
2.1.2.1 Kháng thể cho tạo que thử
- Kháng thể cộng hợp (KT1): kháng thể kháng AFB 1 trong nghiên cứu này
- Kháng thể ở vạch kiểm chứng: kháng thể kháng – kháng thể thỏ có nguồn gốc từ dê (Vector Lab, US)
2.1.2.2 Kháng thể cho ELISA và Dot-blot a Kháng thể đơn dòng sơ cấp
- Kháng thể đặc hiệu với AFB1 có nguồn gốc từ thỏ trong nghiên cứu này. b Kháng thể thứ cấp
- Kháng thể kháng–kháng thể IgG thỏ đánh dấu HPR (Horseaddish peroxidase antibody) (Sigma)
- Kháng thể kháng–kháng thể IgG thỏ đánh dấu AP (Alkaline phosphatase) (Sigma)
Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, nhiều thiết bị hiện đại được sử dụng để phục vụ cho nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực sinh học Những thiết bị này bao gồm máy ly tâm, máy PCR, tủ an toàn sinh học, và các thiết bị phân tích sinh hóa, giúp nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong các thí nghiệm sinh học.
- Cân kỹ thuật TE 612 (Sartorius, CHLB Đức)
- Cân phân tích CPA 324S (Sartorius, CHLB Đức)
- Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Bản)
- Máy đo pH (Mettler Toledo)
- Máy đọc khay vi thể (Biorad, Mỹ)
- Máy spin down C130 1B – 230V (Labnet, Đức)
- Máy li tâm lạnh (Thermo Fisher, Mỹ)
- Máy li tâm eppendorf (Eppendorf 5415C, CHLB Đức)
- Hệ thống điện di (Biorad, Mỹ)
- Máy votex Delta Mixer (Taitex, Nhật Bản)
- Máy AUTOKUN (Sản xuất tại Ấn Độ)
- Máy CAMAG (Sản xuất tại Thụy Sĩ)
- Kim tiờm 100àl (phụ kiện đi kốm theo mỏy CAMAG)
- Lò lai phân tử (UVP Hybrid, Mỹ)
- Tủ lạnh sâu – 20 o C (Sanyo, Nhật Bản)
- Tủ lạnh sâu – 80 o C (Sanyo, Nhật Bản)
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp sản xuất kháng thể
2.2.2 Phương pháp tinh sạch kháng thể kháng AFB 1 bằng protein A Để tinh sạch kháng thể kháng AFB1, chúng tôi sử dụng sắc ký ái lực protein
A, cột protein A – Sepharose với quy trình như sau: (1) Cân bằng cột, (2) Nạp mẫu, (3) Rửa với đệm cân bằng, (4) Rửa giải
Protein A - Sepharose gel được nhồi vào cột Mono TM với thể tích làm việc là
Cột được cân bằng bằng 20 lần thể tích với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,2 với tốc độ 1 ml/phút Một mililit mẫu huyết thanh thỏ chứa kháng thể kháng được sử dụng trong quá trình này.
AFB1 được đưa vào cột với tốc độ 1,0 ml/phút và được rửa bằng 20 lần dung dịch 50 mM Tris HCl, pH 7,0 để loại bỏ các thành phần không bám Kháng thể (IgG) được giải phóng khỏi cột bằng dung dịch 0,1M glycine, pH 2,7, sau đó dịch giải phóng được trung hòa ngay bằng đệm 1M Tris-HCl, pH 9,0 để tránh biến tính kháng thể Cuối cùng, đệm Tris HCl và glycine trong dịch kháng thể được thay thế bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 thông qua cột Amicon Ultra-4 30K (Millipore, Mỹ).
Phân tích nồng độ protein trong từng phân đoạn chạy sắc ký được thực hiện bằng phương pháp Bradford Độ tinh sạch của protein được kiểm tra thông qua phương pháp điện di SDS-PAGE, kết hợp với nhuộm Coomassie Brilliant Blue để xác định mức độ tinh khiết.
2.2.3 Phương pháp điện di SDS – PAGE Điện di trên gel polyacrylamide là kỹ thuật để phân tách các protein theo tính linh động trong điện tích của chúng (phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polypeptide, khối lượng phân tử, cấu trúc protein, các biến đổi sau dịch mã và các yếu tố khác, …) [36]
- Lắp khung bản gel bằng kính có kích thước 10 cm x 10 cm x 0,1 cm vào giá cố định
- Trộn đều hóa chất theo tỷ lệ, hàn đáy, tra gel tách vào trước
- Đổ lớp nước (hoặc Isopropanol) lên phía trên gel tách tránh sự oxi hóa hoặc bay hơi của gel, đợi gel tách khô (khoảng 30 phút – 60 phút)
Sau khi gel tách khô, hãy đổ nước và tra gel cô lên phía trên, sau đó cài lược để tạo giếng mà không tạo bọt khí Đợi khoảng 30 phút cho gel cô đông, sau đó lắp bản gel vào bể điện di Đổ dung dịch chạy điện di đầy buồng trong và ngập chân bản gel, rồi rút lược và rửa giếng.
Nhuộm gel với Comassive Brilliant Blue bao gồm việc nhẹ nhàng gỡ bản gel và cố định nó bằng dung dịch cố định trong 5 phút Sau đó, tiến hành nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm và lắc nhẹ cho đến khi các vạch protein hiện rõ.
2.2.4 Phương pháp ELISA gián tiếp
Phương pháp cơ bản được thực hiện theo Voller (1978) [53].
AFB1-BSA được pha loãng với đệm carbonate 0,05 M pH 9,5 đến nồng độ phù hợp, sau đó được phủ vào giếng ELISA với liều lượng 1 µg/ml và thể tích 100 µl mỗi giếng Hỗn hợp này được ủ ở 4 độ C trong 30 phút trong điều kiện tối Sau đó, giếng được rửa 5 lần bằng đệm PBS-T.
- Block bằng 200 àl sữa gầy 5% pha trong đệm PBS 1X, pH 7,4 Rửa 5 lần bằng đệm PBS – T.
- Huyết thanh thỏ được pha loãng ở độ pha loãng thích hợp bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 Nhỏ 100 àl khỏng thể đó pha loóng, mỗi nồng độ 2 giếng Ủ 2 giờ ở
37 o C Rửa 6 lần bằng đệm PBS – T.
- Nhỏ 100 àl khỏng thể 2 (khỏng thể khỏng thỏ cộng hợp HRP) đó pha loóng 1:30000 lần Ủ 1 giờ ở 37 o C Rửa 6 lần bằng đệm PBS – T.
Để thực hiện phản ứng, nhỏ 100 µl dung dịch TMB/đệm citrate pH 4,0 vào mỗi giếng Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng và trong điều kiện tối Để dừng phản ứng, bổ sung 100 µl dung dịch HCl 1M vào mỗi giếng Cuối cùng, đo OD tại 450 nm bằng máy đọc khay vi thể.
Phương pháp này kiểm tra khả năng gắn kết của kháng thể tinh sạch với AFB1-BSA, đồng thời so sánh với kháng thể thương mại Quy trình thực hiện được tiến hành như sau:
- Chấm 0,1 àg AFB1-BSA lờn màng Nitrocellulose, cố định bằng sấy khụ
- Block màng bằng sữa gầy 1% trong 1 giờ
- Rửa màng bằng PBS T 3 lần, 4ml/lần trong 5 phút -
- Ủ kháng thể 1 là kháng thể kháng AFB1 tinh sạch qua đêm ở 10 o C
- Rửa màng bằng PBS T 3 lần, 4ml/lần trong 5 phút -
- Ủ kháng thể 2 là anti rabbit IgG - Alkaline Photphatase tạo ra ở dê trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng
- Rửa màng bằng PBS T 3 lần, 4ml/lần trong 5 phút -
- Rửa bằng đệm AP pH 9,0 trong 2 phút
- Ủ cho đến khi hiện màu trong dung dịch hiện màu gồm 1ml AP buffer, 6,6 àl NBT, 3,3 àl BCIP
Khi kháng thể kháng AFB1 liên kết với AFB1-BSA, kháng thể 2 sẽ gắn vào kháng thể kháng AFB1 Enzyme alkaline phosphatase trong kháng thể 2 phản ứng với các chất nền NBT và BCIP, tạo ra màu tím Mức độ gắn kết giữa kháng thể kháng AFB1 và AFB1-BSA càng cao, màu sắc xuất hiện sẽ càng đậm.
2.2.6 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng-
Nghiên cứu này trình bày quy trình gắn kháng thể kháng AFB 1 lên bề mặt hạt nano vàng thông qua hấp phụ vật lý Sau khi tinh sạch, kháng thể được thêm vào dung dịch chứa hạt nano vàng ở pH tối ưu Để lấp đầy các vị trí trống trên bề mặt hạt nano sau khi kháng thể đã gắn, Bovine Serum Albumin (BSA) được bổ sung vào dung dịch BSA đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự bắt cặp không đặc hiệu trên bề mặt hạt vàng, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Hình 2.2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng
Việc tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng được thực hiện - theo Zhang et al, 2009:
- D ung dịch hạt nano vàng ban đầu OD530 = 5,0 được điều chỉnh tới pH 9,0 khi bổ sung 0,2 M K2CO3.
- K háng thể được thêm vào dung dịch trên, trộn nhanh và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 90 phút.
Thêm 10 µl 10% BSA vào 20mM sodium borate vào dung dịch GNPs đã gắn kháng thể Khuấy đều và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng BSA giúp phủ kín bề mặt hạt nano vàng không liên kết với kháng thể, ngăn chặn sự bắt cặp không đặc hiệu với kháng nguyên.
Dung dịch được ly tâm ở 10.000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ 4 độ C để thu tủa, sau đó loại bỏ phần dịch nổi Phần tủa chính là các hạt vàng đã gắn kháng thể và được bảo vệ bằng BSA.
- R ửa phần tủa thu được lặp lại 2 lần với 20mM sodium borate chứa 1% BSA, sau đó thu lại bằng li tâm ở 12000 rpm/5 phút, thu tủa, loại bỏ dịch.
- H òa tan trong đệm chứa: 20mM SB; 3% sucrose; 1% BSA; 1% Glycerol
2.2.7 Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp