Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus dengue gây bệnh sốt xuất huyết

Nhan đề : Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết Tác giả : Trần Văn Sơn Người hướng dẫn: Trương Quốc Phong Ngô Thu Hường Từ khoá : Sốt xuất huyết; Bệnh xuất huyết Dengue; Que thử phát hiện nhanh Năm xuất bản : 2020 Nhà xuất bản : Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Tóm tắt : Tổng quan về bệnh xuất huyết Dengue, virus Dengue, đặc tính que thử; vật liệu, phương pháp; kết quả và thảo luận.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển que thử phát nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết TRẦN VĂN SƠN Ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong TS Ngô Thu Hường Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển que thử phát nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết TRẦN VĂN SƠN Ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong TS Ngô Thu Hường Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Trần Văn Sơn Đề tài luận văn: Nghiên cứu phát triển que thử phát nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: CA180120 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 30 tháng 10 năm 2020 với nội dung sau: Sửa đổi nghĩa tiếng Việt số từ viết tắt Sửa lỗi tả số từ viết sai Bổ sung thông tin biến động kháng thể bệnh nhân Sửa đổi cách trình bày tài liệu tham khảo Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm 2020 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Bản luận văn nghiên cứu hướng dẫn PGS TS Trương Quốc Phong, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội TS Ngô Thu Hường, Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) Các kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Học viên Trần Văn Sơn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Trương Quốc Phong – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội TS Ngơ Thu Hường – Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài; Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu; Qua đây, tơi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn học viên, sinh viên công tác học tập Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa Hà Nội góp ý kiến q báu cho tơi, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn; Kinh phí để thực nghiên cứu hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu tạo que thử nhanh phát virus Dengue ứng dụng phát tác nhân gây bệnh sốt xuất huyết”, mã số B2020-BKA-08 Bộ Giáo dục Đào tạo tài trợ Tôi xin chân thành cảm ơn Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân u gia đình ln bên cạnh, ủng hộ tôi, nguồn động viên lớn lao hy sinh nhiều suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Trần Văn Sơn TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Đề tài: Nghiên cứu phát triển que thử phát nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết Tác giả luận văn: Trần Văn Sơn Khóa: 2018A.KH Cán hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – trường Đại học Bách khoa Hà Nội TS Ngô Thu Hường – Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nội dung tóm tắt:  Lý chọn đề tài - Protein NS1 virus Dengue glycoprotein có độ tương đồng tính bảo thủ cao Protein NS1 tiết tế bào nhiễm DENV dạng hòa tan protein NS1 phát máu kể từ ngày mắc bệnh tận ngày thứ chín, chí NS1 phát giai đoạn mà RNA DENV phát RT-PCR kháng thể IgM đặc hiệu cho protein cấu trúc chưa có mặt máu - Bên cạnh xét nghiệm phát nhanh (rapid detection test- RDT) phương pháp chẩn đoán nhiễm virus dễ dàng tiện lợi Phương pháp dựa ngun lí kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic) Ngồi phương pháp thân thiện với người dùng tiết kiệm chi phí, khơng u cầu thiết bị cung cấp kết nhanh so với phản ứng PCR ELISA  Mục đích nghiên cứu: - Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên NS1 virus Dengue - Chế tạo que thử nhanh phát virus Dengue huyết  Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp gây miễn dịch động vật - Phương pháp tinh chế kháng thể - Phương pháp ELISA - Phương pháp cộng hơp kháng thể với hạt nano vàng - Phương pháp cố định kháng thể lên màng nitrocellulose - Phương pháp đánh giá que thử  Kết luận - Đã gây đáp ứng miễn dịch thỏ chuột lang thu nhận huyết tinh chế kháng thể kháng protein NS1 - Xác định điều kiện thích hợp để tạo cộng hợp kháng thể kháng protein NS1 với hạt nano vàng: hàm lượng kháng thể µg; pH 8,5; phản ứng cộng hợp 37℃ thời gian 30 phút; sấy 37℃ 30 phút - Xác định điều kiện thích hợp cố định kháng thể lên màng lai: Hàm lượng kháng thể chuột kháng protein NS1 µg; sấy 37℃ 30 phút - Bước đầu đánh giá số đặc tính que thử: độ lặp lại 100%, độ nhạy 87 %, độ đặc hiệu 100% MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) 1.2 Tình hình sốt xuất huyết Dengue giới 1.3 Tình hình sốt xuất huyết Dengue Việt Nam 1.4 Virus Dengue 1.4.1 Đặc điểm cấu trúc di truyền virus Dengue 1.4.2 Đặc điểm protein NS1 1.4.3 Cơ chế lây nhiễm virus Dengue 10 1.5 Các phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue 11 1.5.1 Phân lập virus 11 1.5.2 Phát axit nucleic 12 1.5.3 Phát IgM/IgG 13 1.5.4 Phát kháng nguyên NS1 14 1.6 Đặc tính que thử 16 1.6.1 Hạt nano vàng (AuNPs) 16 1.6.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 16 1.6.3 Miếng thấm mẫu 17 1.6.4 Miếng cộng hợp 17 1.6.5 Màng 18 1.6.6 Miếng thấm hút 18 CHƯƠNG II VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể 19 2.2 Vật liệu 19 2.2.1 Mơi trường – Hóa chất 19 2.2.2 Thiết bị 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp tạo kháng thể đa dòng động vật 21 2.3.2 Phương pháp tinh kháng thể kháng NS1 21 2.3.3 Phương pháp điện di SDS – PAGE 22 i 2.3.4 Phương pháp ELISA 23 2.3.5 Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Nghiên cứu tạo kháng thể kháng protein NS1 27 3.1.1 Nghiên cứu sản xuất kháng huyết kháng protein NS1 27 3.1.2 Nghiên cứu tinh chế kháng thể đa dòng kháng protein NS1 28 3.2 Nghiên cứu chế tạo que thử 30 3.2.1 Thiết lập điều kiện ban đầu tạo que thử 30 3.2.2 Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp 32 3.2.3 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 39 3.3 Đánh giá que thử 42 3.3.1 Độ lặp lại que thử 42 3.3.2 Đánh giá độ nhạy que thử 43 3.3.3 Đánh giá độ đặc hiệu que thử 44 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 52 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AuNPs Gold nanoparticle Hạt nano vàng Bp Base pair Cặp base BSA Bovine Serum Albumine Albumine huyết bò CBB Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue cDNA Chuỗi Axit Deoxyribonucleic bổ sung Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym EtBr Complementary Deoxyribonucleic acid Enzyme-Linked Immuno Sorbent Asay Ethidium bromide FCA Freund’s Complete Adjuvant Tá dược toàn phần FIA Freund’s Incomplete Adjuvant Tá dược khơng tồn phần FPLC Sắc ký lỏng nhanh HRP Fast protein liquid chromatography Horseradish Peroxidase Ig Immonoglobulin/globulin Enzyme Horseradish Peroxidase Kháng thể Kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton mRNA Messenger Ribonucleic acid ARN thông tin OD Optical Density Mật độ quang PAGE PCR Polyacrylamide Gel Electrophoresis Polymerase Chain Reaction Điện di gel polyacrylamide Phản ứng chuỗi trùng hợp RT-PCR Reverse Transcription PCR SDS Sodium dodecyl sulphase Phản ứng chuỗi trùng hợp chép ngược Sodium dodecyl sulphase TAE Tris-Acid Acetic-EDTA Tris-Acid Acetic-EDTA TMB Tetramethylbenzidine Tetramethylbenzidine UV Ultraviolet Tia cực tím WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới ELISA iii 112 110 106 101 Hình 12 Kết thử nghiệm loại vật liệu khác làm miếng cộng hợp 3.2.1.7 Xác định nhiệt độ sấy cố định kháng thể lên miếng cộng hợp Để tạo miếng cộng hợp hồn chỉnh cần thực có định cộng hợp kháng thể hạt nano vàng lên vật liệu cộng hợp Miếng cộng hợp sau bổ sung dung dịch cộng hợp làm khô nhiệt độ Ngoài việc làm bay ẩm, nhiệt độ cần phù hợp để khơng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể, nhiên cần ý tới thời gian để thực làm khô miếng cộng hợp Để xác định nhiệt độ xử lý thích hợp, miếng cộng hợp xử lý 4oC 25oC 37oC 37℃ 25℃ 4℃ Hình 13 Nhiệt độ cố định cộng hợp Kết hình 3.13 cho thấy điều kiện nhiệt độ xử lý xuất vạch tín hiệu vị trí vạch T Điều kiện 4℃ điều kiện lý tưởng để bảo quản kháng thể, nhiên vạch tín hiệu xuất theo đánh giá trực quan khơng rõ Nhiệt độ phịng 25℃ nhiệt độ làm việc phịng thí nghiệm, gây ảnh hưởng đến kháng thể thời gian ngắn kéo dài thời gian tới để miếng cộng hợp khơ hồn tồn khơng phải điều kiện tốt Khi xử lý miếng cộng hợp điều kiện 37℃, 30 phút để miếng cộng hợp khơ hồn tồn mà vạch tín hiệu rõ nét Vì vậy, lựa chọn điều kiện xử lý miếng cộng hợp 37℃ 30 phút cho nghiên cứu 38 3.2.1.8 Xác định thời gian sấy cố định kháng thể lên miếng cộng hợp Miếng cộng hợp sử dụng cần sấy khơ hồn tồn, chọn nhiệt độ xử lý để miếng cộng hợp khơ hồn tồn cần tăng thời gian sấy Thời gian sấy tăng, độ ẩm giảm, nhiên kéo dài thời gian sấy 37oC, hoạt tính kháng thể bị ảnh hưởng Khi sấy 30 phút, vạch tín hiệu cịn mờ, điều hoàn toàn phù hợp với giả thiết đưa Vì vậy, để bảo tồn hoạt tính kháng thể mức cao tiết kiệm thời gian, nhóm nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ sấy 37oC thời gian 30 phút 15 phút 30 phút 60 phút 120 phút Hình 14 Thời gian sấy miếng cộng hợp 3.2.3 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 3.2.3.1 Lựa chọn vật liệu màng nitrocellulose Đặc tính vật liệu màng sử dụng ảnh hưởng trực tiếp đến độ ổn định độ nhạy, độ đặc hiệu que thử Màng sử dụng nhằm mục đích cố định kháng thể vạch kiểm tra kháng thể vạch kiểm chứng Đặc tính tốc độ độ đồng dòng chảy màng lai que thử ảnh hưởng đến thời gian khả bắt cặp kháng thể kháng nguyên Tốc độ dòng chảy nhanh thời gian đánh giá kết ngắn nhiên độ nhạy giảm bắt cặp kháng thể kháng nguyên bị hạn chế Khi tốc độ dịng chảy chậm phản ứng kháng nguyên kháng thể dễ dàng xảy ra, làm tăng độ nhạy phản ứng Tuy nhiên, thời gian đánh giá kết dài làm giảm độ đặc hiệu Trong nghiên cứu tiến hành thử nghiệm với loại màng nitrocellulose khác tốc độ mao dẫn (Bảng 3.2) 39 Bảng Đặc điểm vật liệu sử dụng làm màng lai TT Tên sản phẩm Loại sản phẩm Hãng sản xuất Tốc độ (giây/4cm) NC-b103 Pall 170 NC-b101 Milipore 140 NC-b102 Milipore 135 NC-b110 Milipore 95 Pall Vivid 170 (Vivid 170) Milipore 140 (NC 140) Milipore 135 (NC 135) Milipore 180 (NC 180) NC-b110 NC-b102 NC-b101 NC-b103 Hình 15 Ảnh hưởng vật liệu màng đến kết nghiên cứu Kết cho thấy loại màng sử dụng xuất vạch tín hiệu theo thứ tự cường độ giảm dần, là: NC-b103, NC-b101, NC-b102, NC-b110 Cường độ vạch tín hiệu đậm rõ nét quan sát màng NC-b103 Từ kết thu thể Hình 3.15, định lựa chọn màng Vivid170 (Pall, Mỹ) cho nghiên cứu 3.2.3.1 Xác định hàm lượng kháng thể kháng protein NS1 cố định lên vạch kiểm tra màng nitrocellulose Kháng thể chuột lang kháng protein NS1 cố định màng gắn với protein NS1 có mẫu để gắn với cộng hợp Ab-AuNPs Trường hợp mẫu âm tính, vị trí cố định kháng thể chuột kháng protein NS1 khơng vạch Trường hợp mẫu dương tính với protein NS1, có tín hiệu vị trí cố kháng thể chuột Chính thế, lượng kháng thể phun lên màng phải đảm bảo đủ để lên tín hiệu trường hợp mẫu dương tính Chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ kháng thể khác µg, µg, µg /que Kết cho thấy hàm lượng kháng thể tăng cường độ vạch tín hiệu tăng Với lượng kháng thể cố định 40 µg /que, vạch tín hiệu xuất với cường độ yếu hai điều kiện lại Do đó, lượng kháng thể chuột kháng protein NS1 cố định lên màng nitrocellulose lựa chọn µg/que để thực cho nghiên cứu 3µg µg µg Hình 16 Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra 3.2.3.2 Xác định nhiệt độ xử lý màng lai Sau phun kháng thể, màng nitrocellulose sấy khô để cố định kháng thể Việc cố định giúp kháng thể khơng bị trơi dịng mão dẫn dung dịch phân tích chảy qua Bên cạnh đó, việc cố định cịn có vai trị trì độ bền kháng thể trình bảo quản Theo lý thuyết nhiệt độ xử lý cao ảnh hưởng đến độ bền kháng thể Chính chúng tơi tiến hành xử lý màng ba nhiệt độ: RT (25oC), 37oC, 50oC 25℃ 37℃ 50℃ Hình 17 Xác định nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose Tại nhiệt độ 25oC, thời gian làm khô màng kéo dài nhiệt độ khác Tuy sấy nhiệt độ 37oC 50oC, thời gian sấy giảm đáng kể lại tốn lượng để thực làm khơ màng Kết Hình 3.17 cho thấy tất ba điều kiện nhiệt độ xuất vạch tín hiệu vị trí vạch T, nhiên nhiệt độ sấy 50oC cho tín hiệu hai điều kiện lại Để thuận tiện cho 41 việc chế tạo que thử tiết kiệm lượng, chọn nhiệt độ xử lý màng 37oC, thời gian xử lý rút ngắn mà đảm bảo chất lượng que thử 3.2.3.3 Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose Nhằm xác định thời gian sấy màng nitrocellulose thích hợp, chúng tơi tiến hành sấy màng 37oC khoảng thời gian: 15 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút Kết Hình 3.18 cho thấy tất que thử xuất vạch tín hiệu vị trí vạch T Khi sấy 37oC 30 phút, vạch tín hiệu có cường độ quan sát tốt Tuy nhiên sấy 37oC 30 phút, tín hiệu so với điều kiện lại chứng tỏ thời gian chưa đủ để làm khô màng Để thuận tiện cho nghiên cứu giảm thời gian sấy màng, định chọn thời gian sấy 37oC 30 phút cho nghiên cứu 15 phút 30 phút 60 phút 120 phút Hình 18 Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose 37℃ 3.3 Đánh giá que thử 3.3.1 Độ lặp lại que thử Để đánh giá độ lặp lại que thử, tiến hành kiểm tra 10 que thử với mẫu âm tính 10 mẫu dương tính với protein NS1 điều kiện người thao tác, thiết bị sử dụng, việc hiệu chuẩn thiết bị, môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, nhiễm khơng khí…) thời gian đọc kết khoảng 15 – 20 phút 42 Hình 19 Kết độ lặp lại que thử mẫu huyết âm tính với protein NS1 Hình 20 Kết độ lặp lại que thử mẫu huyết dương tính với protein NS1 Kết Hình 3.19 cho thấy 10 que thử với mẫu âm tính với protein NS1 cho kết xuất vạch màu hồng tía có cường độ tương đương vạch C Kết Hình 3.20 cho thấy 10 que thử với mẫu dương tính với protein NS1 cho kết xuất hai vạch vạch C vạch T điều khẳng định độ lặp lại que thử đạt 100% 3.3.2 Đánh giá độ nhạy que thử Chúng tiến hành kiểm tra que thử với 30 mẫu huyết dương tính với protein NS1 Với 30 mẫu huyết dương này, tiến hành chạy với que thử đọc kết thời gian 15-20 phút Khi chạy que thử với 30 mẫu dương tính kết cho 26 mẫu xuất vạch màu hồng tía vạch T vạch C (Hình 3.21) từ tính toán cho độ nhạy đạt 87% Như độ nhạy que thấp so với que thử thương mại sử dụng phổ biến Việt Nam Dengue Ag Rapid Test CE (CTK Biotech, USA) với độ nhạy 98 % ONE STEP Dengue NS Ag ( SD BIOLINE Hàn 43 Quốc) 92.8 % Nguyên nhân virus Dengue có týp nhiên nghiên cứu sử dụng protein NS1 virus Dengue týp để tạo kháng thể nên độ phủ dẫn tới độ nhạy thấp Hình 21 Kết đánh giá độ nhạy que thử 3.3.3 Đánh giá độ đặc hiệu que thử Để đánh giá độ đặc hiệu que thử tiến hành kiểm tra que thử với 30 mẫu huyết âm tính với protein NS1 cung cấp bệnh viện Xanh Pôn Với 30 mẫu huyết âm này, tiến hành chạy với que thử đọc kết sau 15-20 phút 44 Kết từ Hình 3.22 cho thấy tất 30 mẫu huyết âm chạy với que thử cho tín hiệu vạch vị trí vạch C, chúng tơi kết luận độ đặc hiệu que thử đạt 100% tương đương với sản phẩm thi trường thâm chí cao que ONE STEP Dengue NS Ag (SD BIOLINE Hàn Quốc) 98.4 % Hình 22 Kết đánh giá độ đặc hiệu que thử 45 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ Phát triển thành sinh phẩm thương mại kết thu được, có số kết luận sau: Đã tạo tinh chế kháng thể đa dòng kháng protein NS1 từ thỏ chuột lang đảm bảo độ hàm lượng đáp ứng yêu cầu nghiên cứu chế tạo que thử nhanh Xác định điều kiện thích hợp để tạo cộng hợp kháng thể kháng protein NS1 với hạt nano vàng: hàm lượng kháng thể µg; pH 8,5; phản ứng cộng hợp 37oC thời gian 30 phút; sấy 37oC 30 phút Xác định điều kiện thích hợp cố định kháng thể lên màng lai: Hàm lượng kháng thể chuột lang kháng protein NS1 µg; sấy 37oC 30 phút sử dụng màng nitrocellulose Pall Vivid 170 với tốc độ dòng chảy 170s/4cm Đã tạo que thử phát protein NS1 bước đầu đánh giá số đặc tính que thử: độ lặp lại 100%, độ nhạy 87 %, độ đặc hiệu 100% Kiến nghị: Đề tài thành công bước đầu để phát triển sản xuất thương mại hóa sản phẩm nghiên cứu, giúp cho Việt Nam có sinh phẩm chẩn đoán nhanh nhiễm virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết Để hoàn thiện sản phẩm, đề tài cần phải tiếp tục số nghiên cứu: - Tăng độ nhạy que thử - Đánh giá ngưỡng phát que thử - Đánh giá thử nghiệm que thử với cỡ mẫu lớn - Thử nghiệm phản ứng chéo với chủng virus Flaviridae khác như: Chikungunya; West nile Viêm não Nhật Bản, virus Zika 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Bộ Y Tế (2016), Niên giám Thống kê Y tế [2] Bộ Y Tế (2017), Niên giám Thống kê Y tế [3] Bộ Y Tế (2018), Niên giám Thống kê Y tế [4] Bộ Y Tế (2019), Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết Dengue, chủ biên, Ban hành kèm theo Quyết định số 43705/QĐ-BYT ngày 22 tháng 08 năm 2019 Bộ trưởng Bộ Y tế [5] Đỗ Quang Hà, Vũ Thị Quế Hương Huỳnh Thị Kim Loan (1996), "Dịch Dengue xuất huyết 1995 tỉnh phía Nam", Chuyên đề sốt xuất huyết viêm não, tr 33-40 [6] Đỗ Quang Hà Trần Văn Tiến (1984), "Dịch dengue xuất huyết tai Việt Nam từ 1975-1983", Tạp chí Y học Việt Nam số 3, tr 28-40 [7] Đoàn Hữu Thiển (2017), Một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng sinh học phân tử vi rút dengue bệnh nhân sốt xuất huyết dengue bệnh viện đa khoa tỉnh Đắk Lắk, 2010 - 2016, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương Tài liệu tham khảo tiếng Anh [8] A.Muller David Paul R Young (2013), "The flavivirus NS1 protein: molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker", Antiviral research 98(2), pp 192-208 [9] Akey David cộng (2014), "Flavivirus NS1 structures reveal surfaces for associations with membranes and the immune system" 343(6173), pp 881-885 [10] Alcon Sophie cộng (2002), "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Specific to Dengue Virus Type Nonstructural Protein NS1 Reveals Circulation of the Antigen in the Blood during the Acute Phase of Disease in Patients Experiencing Primary or Secondary Infections", Journal of Clinical Microbiology 40(2), pp 376-381 [11] Ana C Alcalá cộng (2017), "The dengue virus non-structural protein (NS1) is secreted from infected mosquito cells via a non-classical caveolin-1-dependent pathway", Virology Journal 98(8), pp 2088-2099 47 [12] Bäck Tuiskunen Anne Åke Lundkvist (2013), "Dengue viruses – an overview", Infect Ecol Epidemiol [13] Bharaj Preeti cộng (2008), "Concurrent infections by all four dengue virus serotypes during an outbreak of dengue in 2006 in Delhi, India", Virology journal 5(1), pp [14] Blacksell D Stuart cộng (2011), "Evaluation of Six Commercial Point-of-Care Tests for Diagnosis of Acute Dengue Infections: the Need for Combining NS1 Antigen and IgM/IgG Antibody Detection To Achieve Acceptable Levels of Accuracy", Clin Vaccine Immunol [15] Byk LA Andrea Gamarnik (2016), "Properties and functions of the dengue virus capsid protein", Annual review of virology 3, pp 263-281 [16] Chambers J Thomas cộng (1990), "Flavivirus genome organization, expression, and replication", Annual review of microbiology 44(1), pp 649-688 [17] Chambers J Thomas, David W McCourt Charles M Rice (1989), "Yellow fever virus proteins NS2A, NS213, and NS4B: Identification and partial N-terminal amino acid sequence analysis", Virology Journal 169(1), pp 100-109 [18] Chappell KJ cộng (2008), "West Nile Virus NS2B/NS3 protease as an antiviral target", Current medicinal chemistry 15(27), pp 2771-2784 [19] Chow L Hsu S T (1989), "MAC-ELISA for the detection of IgM antibodies to dengue type I virus (rapid diagnosis of dengue type I virus infection)", Zhonghua Min Guo Wei Sheng Wu Ji Mian Yi Xue Za Zhi 22(4), pp 278-85 [20] Dutra Rocha Nina cộng (2009), "The Laboratorial Diagnosis of Dengue: Applications and Implications", Journal Global Infectious Diseases 1(1), pp 38-44 [21] Faustino Andre cộng (2019), "Structural and Functional Properties of the Capsid Protein of Dengue and Related Flavivirus", International journal of molecular sciences 20(16), pp 3870 [22] Fry R Scott cộng (2011), "The diagnostic sensitivity of dengue rapid test assays is significantly enhanced by using a combined antigen and antibody testing approach", PLoS Negl Trop Dis 5(6), pp e1199 48 [23] Gebhard Leopoldo, Claudia V Filomatori Andrea V Gamarnik (2011), "Functional RNA elements in the dengue virus genome", Journual Viruses 3(9), pp 1739-1756 [24] Guabiraba Rodrigo Bernhard Ryffel (2014), "Dengue virus infection: current concepts in immune mechanisms and lessons from murine models" 141(2), pp 143-156 [25] Gurukumar KR cộng (2009), "Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses", Virology Journal [26] Hsieh Szu-Chia cộng (2014), "Highly conserved residues in the helical domain of dengue virus type precursor membrane protein are involved in assembly, precursor membrane (prM) protein cleavage, and entry", Journal of Biological Chemistry 289(48), pp 33149-33160 [27] Leung Y Jason cộng (2008), "Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly", Journal of virology 82(10), pp 4731-4741 [28] Meng Fanchi cộng (2015), "Unstructural biology of the dengue virus proteins", The FEBS journal 282(17), pp 3368-3394 [29] Murrell Sarah, Suh-Chin Wu Michael Butler (2011), "Review of dengue virus and the development of a vaccine", Biotechnology advances 29(2), pp 239247 [30] Mustafaz ColM.S Lt cộng (2015), "Discovery of fifth serotype of dengue virus (DENV-5): A new public health dilemma in dengue control", Medical journal armed forces India 71(1), pp 67-70 [31] Nemésio Henrique, Francis Palomares-Jerez José Villalaín (2012), "NS4A and NS4B proteins from dengue virus: membranotropic regions", Biochimica et Biophysica Acta -Biomembranes 1818(11), pp 2818-2830 [32] Perera Rushika Richard J Kuhn (2008), "Structural Proteomics of Dengue Virus", Curr Opin Microbiol 4(11), pp 369-377 [33] Ramirez Romel Ramirez Ludert E Juan (2019), "The dengue virus nonstructural protein (NS1) is secreted from mosquito cells in association with the intracellular cholesterol transporter chaperone caveolin complex", Journal of virology 93(4) 49 [34] Rushika Perera Richard J Kuhn (2008), "Structural proteomics of dengue virus", Current opinion in microbiology 11(4), pp 369-377 [35] Scaturro Pietro cộng (2015), "Dengue virus non-structural protein modulates infectious particle production via interaction with the structural proteins" 11(11), pp e1005277 [36] Sun Zhihao cộng (2018), "Development of a colloidal gold-based immunochromatographic strip for rapid detection of H7N9 influenza viruses" 9, pp 2069 [37] Suzuki Keita cộng (2019), "Evaluation of novel rapid detection kits for dengue virus NS1 antigen in Dhaka, Bangladesh, in 2017", Virology Journal 102(2019) [38] World Health Organization (2009), Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control, World Health Organization [39] World Health Organization (2012), Global strategy for dengue preventionand control 2012-2020 [40] Xie Xuping cộng (2013), "Membrane topology and function of dengue virus NS2A protein", Journal of virology 87(8), pp 4609-4622 [41] Zou Jing cộng (2015), "Characterization of Dengue Virus NS4A and NS4B Protein Interaction" 89(7), pp 3455-3470 Trang web [42] Bộ Y Tế (2020), Triển khai cơng tác phịng, chống dịch bệnh sốt xuất huyết địa bàn Hà Nội năm 2020, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật thành phố Hà Nội, truy cập ngày 20-06-2020, trang web http://ytdphanoi.gov.vn/1066n/trien-khaicong-tac-phong-chong-dich-benh-sot-xuat-huyet-tren-dia-ban-ha-noi-nam2020.html [43] Creative-diagnostics Dengue Virus, truy cập ngày 19-03-2019, trang web https://www.creative-diagnostics.com/Dengue-Virus.htm [44] Cục Y tế dự phòng (2020), Tăng cường phòng chống sốt xuất huyết, truy cập ngày 20-9-2020, trang web http://vncdc.gov.vn/vi/tin-tuc-trongnuoc/14057/tang-cuong-phong-chong-sot-xuat-huyet 50 [45] World Health Orgnization (2019), Dengue and severe dengue, World Health Orgnization, truy cập ngày 18-03-2019, trang web https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue 51 PHỤ LỤC Đệm dung dịch điện di protein Tên dung dịch Dung dịch cố định Đệm Tris – Glycerine 10X Dung dịch nhuộm màu Thành phần Nồng độ Ethanol 40% v/v Axit acetic 10% v/v H2 O Điền đầy 100 ml Tris – base 30,3 g/l Glycerine 144 g/l SDS 10 g/l Coomassie Brilliant Blue 0,125% Ethanol 40% Axit acetic 10% H2 O Điền đầy 50 ml Đệm ELISA Tên dung dịch Thành phần Nồng độ Đệm phủ Na2CO3 0,795g NaHCO3 1,46g H2 O Điền đầy 500 ml PBS 1X 50 ml Sữa gầy 5% w/v PBS 1X 100 ml Tween 0,05% Citrate pH 4,0 0,9 ml TMB 0,1 ml H O2 10 µl Đệm Blocking Washing Buffer Developing Buffer 52 ... Do đó, chúng tơi thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phát triển que thử phát nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết? ?? với mong muốn phát triển tiến tới sản xuất que thử nhanh Việt Nam, phục vụ cho công... nhiều suốt trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Trần Văn Sơn TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Đề tài: Nghiên cứu phát triển que thử phát nhanh virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết Tác giả... trình thực luận văn; Kinh phí để thực nghiên cứu hỗ trợ từ đề tài ? ?Nghiên cứu tạo que thử nhanh phát virus Dengue ứng dụng phát tác nhân gây bệnh sốt xuất huyết? ??, mã số B2020-BKA-08 Bộ Giáo dục