Nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu với một số vi khuẩn gây nhiễm độc thực phẩm phổ biế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Mai Thị Đàm Linh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LECTIN THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG NGƢNG KẾT ĐẶC HIỆU VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Mai Thị Đàm Linh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LECTIN THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG NGƢNG KẾT ĐẶC HIỆU VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Bùi Phƣơng Thuận PGS.TS Kiều Hữu Ảnh Hà Nội - 2014 MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chƣơng 1:Tổng quan tài liệu 12 1.1Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Việt Nam 12 1.1.1 Trên Thế giới 12 1.1.2 Tại Việt Nam 13 1.2 Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn 14 1.3 Một số vi khuẩn gây bệnh qua đƣờng thực phẩm thƣờng gặp 15 1.3.1Vi khuẩn Salmonella bệnh Salmonella 16 1.3.2 Shigella bệnh lỵ trựckhuẩn 21 Đặc điểm sinh học Shigella 21 Ngộ độc thực phẩm Shigella 24 1.3.3 Escherichia coli gây bệnh 26 Đặc điểm sinh học vi khuẩn E coli 26 1.3.3.2 Các nhóm E coli gây bệnh 28 1.3.4 Staphylococcus aureus 30 1.3.4.1 Đặc điểm sinh học 31 1.3.4.2 Khả sinh độc tố 32 1.3.4.3 Nhiễm độc S aureus 33 1.3.5 Các nhóm vi khuẩn khác 33 1.3.5.1 Bệnh Listeria 33 1.3.5.2 Các bệnh Campylobacter (Campylobacteriosis) 34 1.3.5.3 Bệnh viêm đƣờng ruột – dày Clostridium perfringens 34 1.3.5.4 Bệnh đƣờng ruột- dày Bacillus cereus 35 1.3.5.5 Vibrio cholera 35 1.3.5.6 Clostridium botulinum bệnh Clostridium botulinum (Botulism) 1.4 Các kĩ thuật phân tích, kiểm tra vi khuẩn thực phẩm 36 36 1.4.1 Các phƣơng pháp truyền thống 36 1.4.2 Các phƣơng pháp đại 37 1.4.3 Phƣơng pháp sử dụng lectin 40 1.5 Lectin ứng dụng chẩn đoán vi khuẩn 41 1.5.1 Lectin 41 1.5.1.1 Định nghĩa lectin 41 1.5.1.2 Nguồn lectin tự nhiên 42 1.5.1.3 Cấu tạo phân tử lectin 43 1.5.1.4Tính đặc hiệu đƣờng lectin 44 1.5.1.5 Ứng dụng lectin 45 1.5.2 Các ứng dụng lectin chẩn đoán vi khuẩn 46 1.5.2.1 Ứng dụng lectin chẩn đoán vi khuẩn Gram dƣơng 47 1.4.2.1 Ứng dụng lectin chẩn đoán vi khuẩn Gram âm 49 1.5.2.3 Mối liên quan tính đặc hiệu đƣờng lectin khả gây ngƣng kết vi khuẩn 50 1.5.3 Ý nghĩa việc sử dụng lectin làm cơng cụ chẩn đốn vi khuẩn 52 Chƣơng 2: Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 56 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 56 2.2 Dụng cụ - hóa chất – mơi trƣờng 56 2.2.1 Hố chât – sinh phẩm, thiết bị dùng nghiên cứu vi sinh vật 56 2.2.2 Hoá chât – sinh phẩm, thiết bị dùng tách chiết nghiên cứu lectin 57 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy 57 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 57 2.3.1 Phân lập định danh vi sinh vật 57 2.3.1.1 Kỹ thuật phát Salmonella, Shigella thực phẩm 57 2.3.1.2 Phƣơng pháp phát E coli thực phẩm theo kĩ thuật IMViC 60 2.3.1.3 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 62 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu lectin 65 2.3.2.1 Tách chiết tinh lectin 65 2.3.2.2 Xác định hoạt độ lectin phản ứng ngƣng kết hồng cầu 65 2.3.2.3 Phản ứng ngƣng kết tế bào vi khuẩn lectin 66 2.3.2.4 Phƣơng pháp tiến hành phản ứng đặc hiệu đƣờng 67 2.3.2.5 Xác định ảnh hƣởng pH lên hoạt độ lectin 67 2.3.2.6 Xác định ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ lectin 68 2.3.2.7 Phƣơng pháp định lƣợng protein 68 2.3.2.8 Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion cột CM- Sephadex 69 2.3.2.9 Phƣơng pháp điện di biến tính gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 71 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72 3.1 Nghiên cứu khả gây ngƣng kết lectin lên số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp 72 3.2 Tính đặc hiệu đƣờng dịch chiết lectin 74 3.3 Nghiên cứu mối tƣơng tác lectin với số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập đƣợc 78 3.3.1 Phân lập vi khuẩn 78 3.3.1.1 Phân lập Salmonella 78 3.3.1.2 Shigella 80 3.3.1.3 Escherichia coli 81 3.31.4 Staphylococcus aureus 84 3.2.2 Kết gây ngƣng kết lectin thực vật với vi khuẩn phân lập 88 3.2.2.1 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với chủng thuộc chi Salmonella 88 3.3.2.2 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với Shigella 91 3.3.2.3 Tác dụng lectin lên loài vi khuẩn thuộc chi E.coli 93 3.3.2.4 Tác dụng lectin lên loài vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus 96 3.3.2.5 Nghiên cứu tính chất gây ngƣng kết đặc hiệu lectin để ứng dụng lectin vào phân loại vi khuẩn nghiên cứu 101 3.4 TINH CHẾ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH HĨA SINH MIỄN DỊCH CỦA LECTIN CHỌN LỰA 107 3.4.1 Tinh chế nghiên cứu đặc tính lectin hạt Đậu ma 107 3.4.1.1 Lựa chọn đệm chiết thích hợp cho trình tinh chế 107 3.4.1.2 Tinh chế lectin hạt Đậu ma kết tủa phân đoạn nhờ điều chỉnh pH 108 3.4.1.3 Tinh chế ĐM-CP2 cột sắc ký trao đổi ion CM- Sephadex 109 3.3.1.4 Nghiên cứu số tính chất hóa sinh lectin hạt Đậu ma 112 3.4.2 Tinh chế nghiên cứu đặc tính lectin từ Tú cầu đỏ 117 3.4.2.1 Sắc kí qua cột trao đổi ion DE-52 Cellulose 117 3.3.2.2 Kiểm tra độ tinh chế phẩm điện di biến tính 119 3.3.2.3 Nghiên cứu số đặc tính lectin Tú cầu đỏ 120 KẾT LUẬN 125 KIẾN NGHỊ 126 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 PHỤ LỤC BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA Albumin huyết bò (Bovine serum albumine ) CDC Trung tâm kiểm soát ngăn ngừa bệnh dịch (Centers of Disease Control and Prevention) Con A Concanavalin A (lectin từ Đậu rựa – jack bean) Gal Galactose GalNAc N- acetylgalactosamine Glc Glucose GlcNAc N - acetylglucosamine Fuc Fucose FucNAc N – acety L- fucosamine Man Mannose ManNAc N- acety – D - Mannosamine Rha Rhamnose Rib Ribose HAA Hoạt độ ngƣng kết hồng cầu (Hemagglutinating activity ) HĐR Hoạt độ riêng HĐTS Hoạt độ tổng số KN Kháng nguyên LPS Lipopolysaccharide PAGE Điện di gel polyacrylamid (Polyacrylamide gel Electrophoresis ) PBS Phosphate buffered saline PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) WGA Wheat germ agglutinin (lectin mầm lúa mỳ) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam 12 1.2 Các phân tử bề mặt tế bào có khả tƣơng tác với lectin 48 1.3 Một số đặc điểm quan trọng lectin việc ứng dụng thành sản 56 phẩm chẩn đốn vi sinh vật 2.1 Bảng kí hiệu chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thực phẩm 64 3.1 Sự tƣơng tác lectin thực vật với vi khuẩn nghiên cứu 72 3.2 Tác dụng ức chế đƣờng lên dịch lectin thô 75 3.3 Kết phân lập Salmonella mẫu thức ăn 78 3.4 Kết phân lập Shigella nhóm thực phẩm 80 3.5 Kết phản ứng sinh hóa chủng E coli phân lập 82 3.6 Kết ngƣng kết với kháng huyết chủng nghiên cứu 83 3.7 Sự có mặt Staphylococcus aureus mẫu thức ăn 85 3.8 Kết thí nghiệm xác định enzym coagulase chủng phân lập 87 3.9 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với Salmonella 89 3.10 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với Shigella flexneri 92 3.11 Tác dụng gây ngƣng kết lectin với vi khuẩn E.coli 94 3.12 Sự tƣơng tác lectin với loài vi khuẩn Staphylococcus 97 3.13 Sự tƣơng tác lectin với vi khuẩn nghiên cứu 102 3.14 Kết loại bỏ protein tạp DCT lectin hạt Đậu ma pH 3.5 108 3.15 Kết loại bỏ protein tạp DCT lectin hạt Đậu ma pH 9.5 109 3.16 Kết tính đặc hiệu đƣờng lectin Đậu ma 116 3.17 Khả ngƣng kết vi khuẩn dịch thô chế phẩm hạt Đậu ma 117 3.18 Kết tinh chế lectin Tú cầu đỏ qua cột DE – 52 120 3.19 Kết tính đặc hiệu đƣờng lectin Tú cầu đỏ 122 3.20 Tác dụng gây ngƣng kết lectin Tú cầu với vi khuẩn nghiên cứu 123 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình thái vi khẩn Salmonella dƣới kính hiển vi điện tử 17 1.2 Thành phần kháng nguyên vi khuẩn Salmonella 17 1.3 Cấu trúc kháng nguyên O Salmonella O6,7 19 1.4 Cấu trúc kháng nguyên O Salmonella O62 ssp.arizonae 19 1.5 Cấu trúc kháng nguyên O Shigella flexneri serotype Y 23 1.6 Mơ hình cấu tạo độc tố vi khuẩn Shigella 24 1.7 Sự xâm nhập Shigella tế bào biểu mô ruột 25 1.8 Cấu trúc oligosaccharide (1) O-polysaccharide (2) E coli 27 O150 1.9 Cấu trúc lớp glycan Staphylococcus aureus 31 1.10 Vị trí liên kết đặc hiệu đƣờng Gal/GaNAc loại lectin họ Đậu 44 1.11 Lectin ConA ngƣng kết với E coli gián tiếp qua đƣờng mannose 50 2.1 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan mật độ quang học nồng độ 68 protein chuẩn theo phƣơng pháp Lowry 3.1 Kết phản ứng sinh hoá chủng Salmonella phân lập 79 3.2 Hình dạng tế bào chủng Shigella 80 3.3 Kết phản ứng sinh hoá chủng Shigella 80 3.4 Hình thái khuẩn lạc tế bào E.coli 81 3.5 Kết phản ứng sinh hóa E.coli 82 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc S aureus mơi trƣờng Chapman 84 3.7 Hình ảnh tế bào chủng S aureus phân lập 85 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc S aureus môi trƣờng Baird-Parker chứa 86 lỏng đỏ trứng gà 3.9 Kết ngƣng kết lectin thực vật với chủng Salmonella 90 3.10 Hình ảnh ngƣng kết nhóm lectin thực vật với chủng E coli 95 3.11 Sơ đồ khoá định loại chủng vi khuẩn E coli 96 3.12 Sơ đồ khoá định loại chủng thuộc chi Staphylococcus 101 3.13 Sơ đồ khố định loại tổng qt lồi vi khuẩn nghiên cứu 104 3.14 Sắc ký đồ ĐM-CP2 cột CM-Sephadex 110 3.15 Ảnh điện di lectin hạt Đậu ma 111 3.16 Ảnh hƣởng pH lên hoạt độ lectin hạt Đậu ma 113 3.17 Độ bền với pH lectin hạt Đậu ma 113 3.18 Độ bền với nhiệt lectin hạt Đậu ma 114 3.19 Sắc kí đồ cột DE - 52 Cellulose dịch chiết thô Tú cầu đỏ 118 3.20 Ảnh điện di lectin Tú cầu đỏ 119 3.19 Ảnh hƣởng pH lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ 120 3.20 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ 121 ... NHIÊN Mai Thị Đàm Linh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN LECTIN THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG NGƢNG KẾT ĐẶC HIỆU VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40 01 LUẬN... nghiên cứu dừng lại vi? ??c thăm dò khả 10 ngƣng kết lectin số loài vi khuẩn Tại Vi? ??t Nam chƣa có cơng trình nghiên cứu thống kê đầy đủ mối tƣơng tác đặc hiệu lectin với loài vi khuẩn gây bệnh, đặc. .. đến ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng thực phẩm bệnh thực phẩm Mỗi năm Vi? ??t Nam có khoảng triệu ngƣời bị ngộ độc thực phẩm ngộ độc có liên quan đến thực phẩm, chi phí cho vi? ??c giải vụ ngộ độc ƣớc