Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRẦN VĂN TUẤN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY HÀ NỘI – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn TS Trần Văn Tuấn PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc cơng bố Tạp chí Khoa học, phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn, Trƣởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN ngƣời thầy cho hội đƣợc thực luận án, tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Trƣởng Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, ngƣời thầy tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, ủng hộ giúp đỡ q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đặc biệt PGS.TS Bùi Thị Việt Hà TS Phạm Thế Hải giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức luôn tạo điều kiện để tơi hồn thành đƣợc khóa học Tơi xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, Giám đốc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein tập thể cán Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện để hoàn thành nghiên cứu Để hoàn thành luận án này, nhận đƣợc hỗ trợ từ đề tài NAFOSTED (mã số: 106-NN.04-2014.75 106.04-2018.36) Tôi trân trọng hỗ trợ Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Trƣờng Cuối tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời thân ngƣời ln ln bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum………………………………………………………… 1.1.1 Sơ lƣợc chi nấm Aspergillus 1.1.2 Nấm Aspergillus niger 1.1.3 Sơ lƣợc chi nấm Penicillium 1.1.4 Nấm Penicillium chrysogenum .9 1.1.5 Nấm Penicillium digitatum 12 1.2 PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT) 15 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens .16 1.2.2 Cơ chế chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 17 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens 19 1.2.4 Vector dùng chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 20 1.2.5 Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23 1.2.6 Promoter điều hòa biểu gen nấm sợi 25 1.2.7 Gen thị DsRed GFP dùng chuyển gen nấm sợi 26 1.2.8 Ƣu điểm phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens .28 1.2.9 Sử dụng phƣơng pháp ATMT nghiên cứu chuyển gen nấm sợi 29 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI 32 1.3.1 Protein LaeA tƣơng tác phức hệ protein velvet nấm sợi 32 1.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA nấm sợi 33 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 VẬT LIỆU 36 2.1.1 Chủng vi sinh vật 36 2.1.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 2.1.3 Thiết bị hóa chất .38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Thu bào tử hệ sợi nấm 39 2.2.2 Đánh giá khả mẫn cảm kháng sinh 40 2.2.3 Tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA 40 2.2.4 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 41 2.2.5 Tối ƣu quy trình chuyển gen nấm A niger, P digitatum P chrysogenum thông qua vi khuẩn A tumefaciens 49 2.2.6 Xóa phục hồi gen laeA nấm sợi nghiên cứu 50 2.2.7 Sàng lọc xác nhận thể chuyển gen 51 2.2.8 Điều tra vai trị gen laeA lồi nấm sợi nghiên cứu 52 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 55 3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT marker gen kháng kháng sinh 55 3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao nấm P chrysogenum P digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh 57 3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum 68 3.2.1 Tạo thành công chủng A niger N402 P chrysogenum VTCC-F1172 đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil 68 3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil 74 3.3 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum 80 3.3.1 Nghiên cứu vai trò gen laeA A niger 80 3.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA P chrysogenum 94 3.3.3 Nghiên cứu vai trò gen laeA P digitatum .106 KẾT LUẬN 117 KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA 5-fluoroorotic acid A nidulans Aspergillus nidulans A niger Aspergillus niger A oryzae Aspergillus oryzae A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) CD Czapek-Dox cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (ADN bổ trợ) DNA Deoxyribonucleic acid DsRed Red fluorescent protein (Protein huỳnh quang đỏ) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ) GFP Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (môi trƣờng cảm ứng) ITS Internal transcribed spacer kb Kilobase pair LaeA Loss of aflR-expression A (Mất biểu aflR) LB Luria- Bertani (môi trƣờng LB) / Left Border (biên trái) MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid MM Minimal medium (môi trƣờng tối thiểu) ORF Open reading frame (khung đọc mở) P chrysogenum Penicillium chrysogenum P digitatum Penicillium digitatum PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PDA Potato dextrose agar PEG Polyethylen glycol RB Right Border (biên phải) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate S aureus Staphylococcus aureus SM Synthetic medium (Môi trƣờng tổng hợp) ura Uracil uri Uridine vir Virulence gene (gen gây bệnh /gen độc lực) WT Wild type (chủng tự nhiên) DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 36 Bảng 2.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 3.1 Kết xác định số gen laeA chủng A niger 92 biểu mức gen laeA ... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ... nghiên cứu chuyển gen nấm sợi 29 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI 32 1.3.1 Protein LaeA tƣơng tác phức hệ protein velvet nấm sợi 32 1.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA nấm sợi ... gen laeA loài nấm sợi nghiên cứu 52 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 55 3.1.1 Nghiên cứu chuyển