Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRẦN VĂN TUẤN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY HÀ NỘI – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn TS Trần Văn Tuấn PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc cơng bố Tạp chí Khoa học, phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn, Trƣởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN ngƣời thầy cho hội đƣợc thực luận án, tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Trƣởng Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, ngƣời thầy tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, ủng hộ giúp đỡ q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đặc biệt PGS.TS Bùi Thị Việt Hà TS Phạm Thế Hải giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức luôn tạo điều kiện để tơi hồn thành đƣợc khóa học Tơi xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, Giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein tập thể cán Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện để hoàn thành nghiên cứu Để hoàn thành luận án này, nhận đƣợc hỗ trợ từ đề tài NAFOSTED (mã số: 106-NN.04-2014.75 106.04-2018.36) Tôi trân trọng hỗ trợ Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Trƣờng Cuối tơi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, ngƣời thân ngƣời ln ln bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2019 Tác giả luận án Vũ Xuân Tạo MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum………………………………………………………… 1.1.1 Sơ lƣợc chi nấm Aspergillus 1.1.2 Nấm Aspergillus niger 1.1.3 Sơ lƣợc chi nấm Penicillium 1.1.4 Nấm Penicillium chrysogenum .9 1.1.5 Nấm Penicillium digitatum 12 1.2 PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT) 15 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens .16 1.2.2 Cơ chế chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 17 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens 19 1.2.4 Vector dùng chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 20 1.2.5 Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23 1.2.6 Promoter điều hòa biểu gen nấm sợi 25 1.2.7 Gen thị DsRed GFP dùng chuyển gen nấm sợi 26 1.2.8 Ƣu điểm phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens .28 1.2.9 Sử dụng phƣơng pháp ATMT nghiên cứu chuyển gen nấm sợi 29 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI 32 1.3.1 Protein LaeA tƣơng tác phức hệ protein velvet nấm sợi 32 1.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA nấm sợi 33 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 VẬT LIỆU 36 2.1.1 Chủng vi sinh vật 36 2.1.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 2.1.3 Thiết bị hóa chất .38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Thu bào tử hệ sợi nấm 39 2.2.2 Đánh giá khả mẫn cảm kháng sinh 40 2.2.3 Tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA 40 2.2.4 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 41 2.2.5 Tối ƣu quy trình chuyển gen nấm A niger, P digitatum P chrysogenum thông qua vi khuẩn A tumefaciens 49 2.2.6 Xóa phục hồi gen laeA nấm sợi nghiên cứu 50 2.2.7 Sàng lọc xác nhận thể chuyển gen 51 2.2.8 Điều tra vai trò gen laeA lồi nấm sợi nghiên cứu 52 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 55 3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT marker gen kháng kháng sinh 55 3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao nấm P chrysogenum P digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh 57 3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum 68 3.2.1 Tạo thành công chủng A niger N402 P chrysogenum VTCC-F1172 đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil 68 3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil 74 3.3 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum 80 3.3.1 Nghiên cứu vai trò gen laeA A niger 80 3.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA P chrysogenum 94 3.3.3 Nghiên cứu vai trò gen laeA P digitatum .106 KẾT LUẬN 117 KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA 5-fluoroorotic acid A nidulans Aspergillus nidulans A niger Aspergillus niger A oryzae Aspergillus oryzae A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) CD Czapek-Dox cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (ADN bổ trợ) DNA Deoxyribonucleic acid DsRed Red fluorescent protein (Protein huỳnh quang đỏ) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ) GFP Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (môi trƣờng cảm ứng) ITS Internal transcribed spacer kb Kilobase pair LaeA Loss of aflR-expression A (Mất biểu aflR) LB Luria- Bertani (môi trƣờng LB) / Left Border (biên trái) MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid MM Minimal medium (môi trƣờng tối thiểu) ORF Open reading frame (khung đọc mở) P chrysogenum Penicillium chrysogenum P digitatum Penicillium digitatum PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PDA Potato dextrose agar PEG Polyethylen glycol RB Right Border (biên phải) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate S aureus Staphylococcus aureus SM Synthetic medium (Môi trƣờng tổng hợp) ura Uracil uri Uridine vir Virulence gene (gen gây bệnh /gen độc lực) WT Wild type (chủng tự nhiên) DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 36 Bảng 2.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 3.1 Kết xác định số gen laeA chủng A niger 92 biểu q mức gen laeA DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus Hình 1.2 Hình ảnh hiển vi A niger Hình 1.3 Hình thái số nấm mốc thuộc chi Penicillium Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc P chrysogenum mơi trƣờng 10 Hình 1.5 Hình thái nấm P digitatum 12 Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn A tumefaciens dƣới kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.7 Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 18 Hình 1.8 Mốc thời gian quan trọng nghiên cứu phát triển vector từ năm 21 1970 đến Hình 1.9 Cấu trúc vector đồng tích hợp 22 Hình 1.10 Mơ hình tổng qt hệ thống vector nhị thể 23 Hình 1.11 Biểu gen GFP nấm sợi A oryzae 27 Hình 1.12 Biểu gen DsRed nấm sợi A.oryzae 28 Hình 1.13 Các protein velvet hình thành phức hệ phân tử ảnh hƣởng 33 chúng đến phát triển sản sinh chất trao đổi bậc hai nấm Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 39 Hình 3.1 Chuyển gen vào A niger thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử 56 dụng marker gen kháng hygromycin Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra vector pPK2-Red, pGreen3 pPK2-Red2 58 cắt với enzym giới hạn Hình 3.3 Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P chrysogenum P 60 digitatum Hình 3.4 Biểu gen huỳnh quang DsRed GFP P digitatum PdVN1 63 Hình 3.5 Xác nhận biểu gen GFP P chrysogenum VTCC-F1172 64 Hình 3.6 Biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker gen 65 kháng phleomycin P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 Hình 3.7 Sự xâm nhiễm nấm P digitatum PdVN1 mang gen DsRed 67 GFP cam dƣới kính hiển vi huỳnh quang Hình 3.8 Cấu trúc xóa gen pyrG A niger P chrysogenum 69 Hình 3.9 Xác nhận chủng xóa gen pyrG A niger N402 71 Hình 3.10 Khả khuyết dƣỡng uridine/uracil kháng 5-FOA 73 chủng P chrysogenum chuyển gen xóa pyrG Hình 3.11 Cấu trúc cắt kiểm tra vector pEX2A enzym giới hạn 75 Hình 3.12 Quy trình chuyển gen hiệu cao cho nấm A niger P 78 chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil Hình 3.13 Biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed chủng A niger khuyết 79 dƣỡng uridine/uracil Hình 3.14 Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen laeA A niger 81 Hình 3.15 Xác nhận xóa gen laeA A niger 83 Hình 3.16 Cắt kiểm tra vector phục hồi gen laeA A niger 85 Hình 3.17 Xác nhận phục hồi gen laeA A niger 86 Hình 3.18 Xác nhận biểu mức gen laeA A niger 87 Hình 3.19 Sự sinh trƣởng chủng A niger nguồn cacbon 88 Hình 3.20 Sự hình thành bào tử chủng A niger nguồn 89 cacbon Hình 3.21 Sự sinh trƣởng hình thành bào tử chủng A niger 90 nguồn nitơ nitrat amon Hình 3.22 Khả tạo tủa sữa chủng A niger xóa phục hồi gen 90 laeA Hình 3.23 Khả tạo tủa sữa chủng A niger biểu mức 91 gen laeA Hình 3.24 Biểu số gen chủng xóa gen laeA so với chủng tự 93 nhiên N402 Hình 3.25 Tạo cấu trúc xóa gen laeA P chrysogenum 94 Hình 3.26 Xác nhận chủng xóa gen laeA PCR 96 Hình 3.27 Xác nhận phục hồi gen laeA nấm P chrysogenum 98 Hình 3.28 Xác nhận biểu mức gen laeA nấm P chrysogenum 99 khuyết dƣỡng uridine/uracil Hình 3.29 Sự hình thành bào tử chủng P chrysogenum nguồn 101 nitơ nitrat amon Hình 3.30 Khả chịu stress chủng P chrysogenum nguồn 103 nitơ nitrat amon Hình 3.31 Sự sinh trƣởng sinh kháng sinh kháng khuẩn chủng P 104 chrysogenum nguồn nitơ nitrat amon Hình 3.32 Khả sinh kháng sinh kháng khuẩn chủng P 106 chrysogenum biểu mức gen laeA Hình 3.33 Sơ đồ tạo vector xóa gen laeA nấm sợi P digitatum 107 Hình 3.34 Sơ đồ tạo vector phục hồi gen laeA nấm sợi P digitatum 108 Hình 3.35 Xác nhận xóa phục hồi gen laeA P digitatum 110 Hình 3.36 Xác nhận biểu mức gen laeA P digitatum 111 Hình 3.37 Sự sinh trƣởng chủng P digitatum nguồn cacbon 112 Hình 3.38 Sự hình thành bào tử chủng P digitatum dƣới tác động 113 D-sorbitol Hình 3.39 pH dịch ni cấy chủng nấm P digitatum 114 Hình 3.40 Khả gây hỏng cam chủng nấm P digitatum 115 Hình 3.41 Khả gây hỏng cam chủng biểu mức gen laeA 116 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm sợi loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho ngƣời nhƣ enzym, protein, chất có hoạt tính sinh học, nhƣng chúng gây thiệt hại khôn lƣờng nhƣ tàn phá trồng, gây hỏng thực phẩm, sinh độc tố, gây bệnh cho ngƣời động vật Các nghiên cứu giới nấm sợi bƣớc qua nhiều giai đoạn khác từ điều tra sử dụng phƣơng pháp truyền thống nghiên cứu đại mức độ gen protein Nhiều loài nấm có lợi đƣợc xếp vào diện an tồn đƣợc giải trình tự hệ gen hồn tồn nhƣ Aspergillus niger Penicillium chrysogenum Bên cạnh đó, hệ gen nấm bệnh thực vật Penicillium digitatum đƣợc giải trình phân tích Dữ liệu chi tiết hệ gen nấm giúp có nhìn tổng quát gen chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp chất, nhƣ gen giữ vai trò quan trọng q trình lây nhiễm nấm bệnh thực vật A niger lồi phổ biến quan trọng mặt cơng nghiệp thuộc chi Aspergillus Loài nấm đƣợc sử dụng rộng rãi sản xuất nhiều loại enzym axit hữu Gần 99% lƣợng axit citric đƣợc sản xuất giới nhờ A niger Trong số lồi nấm đƣợc ứng dụng nhiều sản xuất cơng nghiệp, P chrysogenum tiếng với khả sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh thuộc họ β-lactam đƣợc phát Alexander Fleming Nhiều chủng P chrysogenum tự nhiên đƣợc gây đột biến thành công để tạo chủng cơng nghiệp có hiệu suất sinh tổng hợp penicillin cao Tuy nhiên, lực sinh tổng hợp chất có lợi chủng phân lập từ tự nhiên thƣờng tƣơng đối thấp Để nâng cấp lực cho chủng tự nhiên, kỹ thuật cải biến chỉnh sửa hệ gen thƣờng đƣợc áp dụng Bên cạnh loài nấm mang lại nhiều lợi ích thiết thực, có nhiều lồi gây hại đặc biệt nghiêm trọng sản xuất nông nghiệp Nấm P digitatum tác nhân gây hỏng nhiều loại có múi giai đoạn sau thu hoạch Loài nấm tồn phổ biến nƣớc nhiệt đới, có Việt Nam Bên cạnh việc công làm hỏng quả, gây tổn thất kinh tế, sản phẩm trao đổi chất bậc hai nấm sinh gây nên ảnh hƣởng tiêu cực sức khỏe ngƣời tiêu dùng Nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò gen liên quan đến gây bệnh vi nấm góp phần tạo dựng tảng phục vụ phát triển giải pháp hiệu nhằm kiểm soát vi nấm gây hại Để cải biến di truyền vi nấm, nhiều phƣơng pháp chuyển gen đƣợc phát triển nhƣ chuyển gen qua tế bào trần, chuyển gen xung điện chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần chuyển gen xung điện có nhiều hạn chế nhƣ kỹ thuật thực phức tạp, chi phí cao khơng ổn định Trong đó, phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens đƣợc chứng minh hiệu có tính ổn định cao Nghiên cứu phát triển đƣợc hệ thống chuyển gen với hiệu cao, chi phí thấp sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi cần thiết Hệ thống chuyển gen kết hợp phƣơng pháp chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn A tumefaciens vector nhị thể đƣợc thiết lập hỗ trợ tích cực cho nghiên cứu cải biến di truyền điều tra vai trò gen quan trọng vi nấm Từ lý trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: “Nghiên cứu phát triển vector nhị thể ứng dụng cải biến di truyền số loài nấm sợi” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Tạo đƣợc vector nhị thể thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum Penicillium digitatum - Điều tra đƣợc vai trò gen laeA ba lồi nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu thiết lập NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tạo vector nhị thể mang marker kháng kháng sinh, marker trợ dƣỡng phục vụ chuyển gen vào ba loài nấm sợi (A niger, P chrysogenum P digitatum) sử dụng vi khuẩn A tumefaciens - Xây dựng hệ thống chuyển gen tối ƣu dựa chế kháng kháng sinh chế trợ dƣỡng - Xóa, phục hồi, biểu mức gen laeA điều tra vai trò gen laeA ba lồi nấm sợi Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đây cơng trình phát triển đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với vector nhị thể để phục vụ cho nghiên cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum Penicillium digitatum Đề tài luận án chứng minh hiệu hệ thống vector nhị thể tạo đƣợc cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu gen, xóa gen ba lồi nấm sợi khác Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thêm liệu vai trò gen laeA điều hòa biệt hóa tế bào trao đổi chất loài nấm sợi nghiên cứu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN * Đã tạo thành công 13 vector nhị thể dùng cho biểu gen, xóa gen bổ trợ gen ba loài nấm sợi gồm A niger, P chrysogenum P digitatum * Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu cao sử dụng vi khuẩn A tumefaciens ba loài nấm sợi nghiên cứu Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn dựa chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập nấm sợi A niger P chrysogenum Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh P chrysogenum P digitatum đƣợc tối ƣu hiệu chuyển gen đạt đƣợc cao từ 10 đến 20 lần so với nghiên cứu trƣớc * Xóa, phục hồi biểu mức thành công gen laeA ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đặc biệt nghiên cứu phát vai trò hồn tồn gen laeA liên quan tới biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi chất kiểm soát khả gây hỏng sau thu hoạch Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum 1.1.1 Sơ lƣợc chi nấm Aspergillus Chi Aspergillus nhóm nấm mốc phổ biến phân bố rộng rãi hành tinh đóng vai trò quan trọng cơng nghiệp Năm 1729, nhà sinh học ngƣời Italia Pier Antonio Micheli quan sát cấu tạo cuống sinh bào tử số loài nấm phát chúng có chung đặc điểm hình thái giống nhƣ “bình nƣớc thánh” Từ đó, ơng đặt tên chi nấm theo từ Latin spargere [20] Hình 1.1 Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus [171] Về mặt hình thái, khuẩn lạc lồi thuộc chi Aspergillus có màu sắc đa dạng, đặc trƣng (Hình 1.1) Hệ sợi nấm có vách ngăn, dài tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển theo chiều dài từ đỉnh sợi phân nhánh liên tiếp tạo hệ sợi (mycelium) khí sinh xù xì nhƣ Trên môi trƣờng đặc số chất tự nhiên, quan sát nấm phát triển thành dạng khuẩn lạc đặc trƣng Khuẩn lạc thƣờng mang màu sắc bào tử Việc tạo màu sắc đặc điểm quan trọng để phân loại nấm mốc, có xuất khuẩn lạc, có hòa tan vào nƣớc khuếch tán môi trƣờng xung quanh [1] Nấm Aspergillus sinh sản chủ yếu phƣơng thức hình thành bào tử vơ tính Trong số 250 lồi thuộc chi Aspergillus, khoảng 64% chƣa phát có giai đoạn sinh sản hữu tính Các lồi đƣợc biết có sinh sản hữu tính gây bệnh cho ngƣời loài đƣợc phát sinh sản nhờ bào tử vơ tính [61] Chi Aspergillus đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghệ sinh học công nghiệp Trong công nghệ sinh học, số loài thuộc chi Aspergillus đƣợc sử dụng: A niger, A oryzae sản xuất thực phẩm enzym Tuy nhiên, bên cạnh đó, loài thuộc chi gây số bệnh định cho vật nuôi động vật hoang dã Khả phát tán bào tử mạnh mẽ vài đại diện khơng khí, nƣớc, hạt sấy khơ nguyên liệu thực vật khiến chúng thƣờng xuyên có hội tiếp xúc với động vật Chúng gây nhiễm trùng nhƣ nhiễm độc Một số độc tố đáng lƣu ý Aspergillus aflatoxin, axit cyclopiazonic, glyotoxin, patulin…[21] Trong chi Aspergillus, A niger loài nấm đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều 1.1.2 Nấm Aspergillus niger 1.1.2.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm A niger Aspergillus niger loài phổ biến khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus A niger đƣợc mô tả vào năm 1867 thảo “physiologie des mucédinées” nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem Ơng phân lập lồi nấm với mục đích nghiên cứu việc sản xuất axit gallic từ q trình lên men nấm Khi đó, ông phân lập đƣợc Penicillium glaucum Aspergillus sp có bào tử tƣơng tự Aspergillus glaucus nhƣng có màu đen môi trƣờng khác nhau, tạo mùi mốc số đặc điểm khác Ông đặt tên A niger [49] A niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm Nigri, gọi phân nhóm Aspergillus đen Trong phân nhóm có 14 lồi khác có bào tử màu đen, dễ nhầm lẫn với A niger [87] Khuẩn lạc nấm A niger có màu trắng vàng, bị che khuất màu đen bào tử sinh sản vơ tính mọc bề mặt Hệ sợi nấm kéo dài, có vách ngăn suốt (Hình 1.2) Bào tử đính thƣờng dài từ 900-1600 µm chứa bọng bào tử dài khoảng 40-60 µm [46] Hình 1.2 Hình ảnh hiển vi A niger [80, 136] A niger có khả sinh trƣởng mạnh mẽ với giới hạn nhiệt rộng từ 6-47°C Khoảng nhiệt độ từ 35 tới 37°C khoảng mà loài nấm phát triển mạnh mẽ Độ ẩm cần thiết cho A niger so với loài khác chi lại cao, đạt 0,88 Khoảng pH cho nấm phát triển rộng, trải dài từ 1,4 tới 9,8 Những đặc điểm giúp cho A niger có khả sinh trƣởng tốt nhiều điều kiện khác nhau, tạo lƣợng lớn bào tử, phát tán dễ dàng khơng khí, có khả lây nhiễm ức chế nhiều loài nấm khác, đặc biệt mơi trƣờng nóng ẩm ƣớt A niger sinh sản chủ yếu bào tử vô tính Chƣa phát thấy giai đoạn hữu tính tồn nấm [148] A niger vi nấm mơ hình quan trọng số lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu trình sinh tổng hợp protein, enzym, chế phân tử chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm Kích thƣớc hệ gen A niger đƣợc ƣớc tính có kích thƣớc khoảng 35,5-38,5 Mb, chia thành nhiễm sắc thể/nhóm liên kết có kích thƣớc khác (từ 3,5-6,6 Mb) Hiện tại, có ba dự án khác độc lập nghiên cứu hệ gen A niger, thể tầm quan trọng vi nấm Lƣợng liệu phong phú từ nhiều trình tự gen A niger đƣợc đƣa vào chƣơng trình nghiên cứu ứng dụng cho phát triển quy trình lên men, hình thái bệnh học [11] Hiện nay, hệ gen ba chủng A niger khác đƣợc giải trình tự NRRL 3, CBS 513.88 ATCC 1015 Hai số chủng đƣợc giải trình tự, NRRL ATCC 1015 chủng hoang dại, chủng CBS 513.88 chủng đột biến để nâng cao khả sản xuất glucoamylase [192, 194] 1.1.2.2 Vai trò nấm A niger A niger đóng vai trò quan trọng phủ nhận công nghiệp Sản phẩm tiêu biểu A niger axit citric đƣợc sử dụng công nghiệp thực phẩm để tạo đồ uống có ga, nƣớc hoa quả, mứt, kẹo rƣợu Axit citric A niger sản xuất có lƣợng lớn nhiều hẳn so với axit hữu khác, ví dụ nhƣ axit gluconic [151] Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) xếp A niger nguồn tạo axit citric tiềm [158] Ngồi ra, A niger có khả sản xuất nhiều loại enzym quan trọng nhƣ pectinase cho sản xuất nƣớc rƣợu để làm giảm độ bột tăng mát, glucose oxidase catalase để phân giải thành phần hƣ hại thực phẩm Một số nghiên cứu gần khẳng định khả phân giải chất mạnh mẽ A niger đƣợc ứng dụng xử lý môi trƣờng, bao gồm việc tẩy khoáng cho nƣớc với khả hấp thu tới 96,61% lƣợng ion thừa nƣớc phân giải phốt-pho đất trồng dạng đá rắn để làm tăng suất trồng [5] Về phƣơng diện nghiên cứu, A niger sinh vật mơ hình có khả ứng dụng hiệu nhƣ hệ thống biểu protein ngoại lai Cải biến di truyền nấm sợi, A nidulans sau A niger đạt nhiều thành tựu, đặc biệt việc biểu phytase công nghiệp [5, 126] 1.1.3 Sơ lƣợc chi nấm Penicillium Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae chi nấm phổ biến, phân bố rộng rãi nhiều môi trƣờng sống khác Trái Đất Tên Penicillium xuất phát từ điểm tƣơng đồng cuống sinh bào tử nấm với chổi cọ - penicillus tiếng La tinh Cho đến nay, có khoảng 200 lồi thuộc chi Penicillium đƣợc mơ tả, nhiều lồi đóng vai trò quan trọng hệ sinh thái nhƣ sống ngƣời [196] Khuẩn lạc loài nấm mốc thuộc chi Penicillium có dải màu sắc đa dạng, màu trắng pha trộn với đỏ, cam vàng; nhiên phần lớn dạng khuẩn lạc có màu xanh lục, vàng lục, lục xám, xám xanh dƣơng (Hình 1.3) Sau khoảng thời gian định, số lồi, khuẩn lạc hoàn toàn màu xanh ngả sang màu sậm nhƣ nâu vàng, nâu đỏ hay xám xanh [146] A C B Hình 1.3 Hình thái số nấm mốc thuộc chi Penicillium (A) P tulipae [84], (B) P sclerotigenum [83], (C) P solitum [85] Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, gần nhƣ không màu, quan sát thấy sắc tố nhƣ vàng hay đỏ phân bố rải rác bề mặt thành tế bào Mặt khác, nuôi cấy môi trƣờng dịch lỏng, sợi nấm mang màu vàng, cam, đỏ, nâu, tím, xanh đen [146] Cơ quan sinh bào tử lồi thuộc chi Penicillium thể bình Thể bình lồi thuộc chi nấm thƣờng có phần đỉnh dài ngắn thon nhỏ dần phía Các bào tử hình thành chuỗi dài đầu thể bình, hình cầu gần cầu, trứng hay elip Khi tồn riêng rẽ, bào tử gần nhƣ không màu, nhƣng tập hợp thành đám, bào tử mang màu đặc trƣng cho loài Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu loài thuộc chi nấm thƣờng khoảng từ 20ºC đến 30ºC Một số loài nhƣ P chrysogenum, P digitatum P italicum sinh trƣởng thích hợp nhiệt độ khoảng 25ºC Trong vài lồi khác tồn đƣợc nhiệt độ cao từ 37ºC đến 40ºC nhiệt độ thấp từ 5ºC đến 7ºC Penicillium có xu hƣớng sinh trƣởng tốt môi trƣờng axit so với môi trƣờng kiềm, pH tối ƣu cho phát triển nấm 5-5,5 Phần lớn loài tồn đƣợc khoảng pH rộng từ 3-9 Ngoài ra, số lồi nhƣ P glabrum sống sót pH nhỏ hay lớn 10 [122] Penicillium chi nấm phổ biến có mặt hầu hết mơi trƣờng sống Chúng gây ảnh hƣởng định sống ngƣời Bên cạnh tác động tiêu cực nhƣ gây mốc hỏng, thối rữa thực phẩm, sinh độc tố nấm (mycotoxin), nhiều loài thuộc chi đƣợc sử dụng để mang lại giá trị to lớn, đặc biệt ngành sản xuất thuốc thực phẩm Có thể kể đến, nấm P roqueforti P camemberti đƣợc biết đến rộng rãi nhờ khả thủy phân chất béo lên men tạo hƣơng vị đặc trƣng cho loại phô-mát tiếng nhƣ Camembert, Brie Roquefort [183] P nalgioverse đƣợc sử dụng để làm tăng hƣơng vị xúc xích dăm-bông, đồng thời ngăn chặn xâm nhiễm nấm mốc vi khuẩn khác [107] Bên cạnh đó, với Aspergillus, vài loài thuộc chi Penicillium đƣợc coi nhà máy tế bào sản xuất enzym (pectinase, lipase, amylase, cellulase…) đại phân tử quan trọng (axit gluconic, axit citric, axit tartaric…) Trong vài năm trở lại đây, Penicillium đƣợc chứng minh có tiềm xử lý sinh học khả phân hủy nhiều dạng hợp chất xenobiotic [98] Nhiều loài thuộc chi Penicillium có khả sinh tổng hợp kháng sinh Trong số đó, P chrysogenum lồi tiếng nhờ khả sinh kháng sinh penicillin, với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, góp phần tạo nên tiến sản xuất kháng sinh phục vụ y học đại [203] 1.1.4 Nấm Penicillium chrysogenum 1.1.4.1 Phân loại đặc điểm sinh học P chrysogenum P chrysogenum loài nấm mốc thuộc chi Penicillium, họ Trichocomaceae, phân bố phổ biến vùng ôn đới cận nhiệt đới Lồi nấm đƣợc mơ tả Dierckx năm 1901 với tên P griseoroseum, P citreoroseum P brunneorubrum [48] Thom năm 1910 với tên P chrysogenum [182] Tuy nhiên sau nghiên cứu hình thái học, sinh lý học sản phẩm trao đổi chất ngoại bào chứng minh loài Khi đó, tên P chrysogenum đƣợc sử dụng phổ biến đƣợc chọn làm tên khoa học thức đƣợc cơng nhận Hiệp hội Nấm Địa y, tên khác bị xoá bỏ [112] Khuẩn lạc nấm P chrysogenum có kết cấu lì, mịn, mỏng, mang nhiều bào tử, xuất rãnh khía sâu đồng tâm giống hình “bánh xe” Vùng mép khuẩn lạc có màu trắng, rộng 1-2 mm Vùng trung tâm khuẩn lạc có sợi nấm màu vàng vàng kem, bào tử có màu đặc trƣng tùy chủng, thƣờng xanh vàng, xanh xám, xanh lục ngả sang màu sậm sau 2-3 tuần Ở hầu hết chủng, giọt tiết xuất nhiều, thƣờng có màu vàng làm biến đổi màu tƣơng ứng mơi trƣờng thạch xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.4) Cuống bào tử đính có độ dài ngắn khác nhau, khoảng 150-300 μm với đƣờng kính từ 3,0-3,5 μm, nhẵn, khơng màu phân thành nhiều nhánh Bào tử đính mọc thành chuỗi dài lên tới 200 μm, phân thành nhánh dài khoảng 15-25 μm Bào tử thƣờng có dạng tròn hay elip, đƣờng kính 2,8-4,0 μm, trơn nhẵn mang màu đặc trƣng [137] Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc P chrysogenum môi trƣờng [208] A: CYA (Czapek Yeast extract Agar), B: CA (Czapek Agar), C: CYAS (Czapek Yeast extract Agar Salt), D: PDA (Potato Dextrose Agar) E: SDA (Sabouraud Dextrose Agar) P chrysogenum sinh trƣởng thích hợp nhiệt độ 25ºC, độ ẩm cao, hoạt độ nƣớc khoảng 0,97-0,98, pH 4,5-6,2 Trong đó, độ ẩm hay hoạt độ nƣớc có ảnh 10 hƣởng mạnh mẽ tới sinh trƣởng nấm, sau nhiệt độ Trái lại, pH mơi trƣờng gần nhƣ khơng có tác động đáng kể tới sinh trƣởng nấm mốc chúng tồn dải pH rộng, khoảng 3-9 [122, 156] Nhiệt độ thích hợp cho việc tổng hợp penicillin nấm P chrysogenum nằm khoảng 23°C-28°C [132] Đã có nhiều nghiên cứu nấm P chrysogenum, nhiên năm 2008 hệ gen loài nấm đƣợc giải trình tự tồn liệu hệ gen đƣợc lƣu trữ https://mycocosm.jgi.doe.gov/Pench1/Pench1.home.html Hệ gen nhân có kích thƣớc 32,19 Mb, gồm 13653 vùng ORF có kích thƣớc tối thiểu 100 axit amin Hệ gen ty thể có kích thƣớc 31790 bp với 17 vùng ORF xác định Các chuỗi mã hóa protein dự đốn chiếm tỉ lệ 56,6% gen P chrysogenum, chiều dài gen trung bình có kích thƣớc 1515 bp Hàm lƣợng GC chiếm 48,9% (52,8% exon, 45,3% intron 44,4% vùng liên gen) Trung bình, gen chứa exon với 83,5% gen chứa intron, 5329 số 12943 protein đƣợc mã hóa nhân đƣợc dự đốn có chức [193] 1.1.4.2 Vai trò nấm P chrysogenum Ứng dụng bật nấm P chrysogenum khả sinh kháng sinh penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, đặc biệt sau đƣợc xử lý đột biến Kể từ phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming có mặt lồi nấm màu xanh - đƣợc cho chủng thuộc lồi Penicillium notatum có khả ức chế sinh trƣởng tụ cầu khuẩn, P notatum trở thành loài vi sinh vật đƣợc sử dụng cho lên men để sản xuất chất kháng sinh (penicillin), tạo nên bƣớc ngoặt y học đại Tuy nhiên phải đến năm 1941, P chrysogenum đƣợc đặc biệt ý phát loài nấm cho khả sinh penicillin nhƣng với hiệu suất cao nhiều lần so với loài nấm sinh penicillin Fleming tìm năm 1928 [145] Từ đến nay, P chrysogenum đƣợc khảo sát tỉ mỉ, nghiên cứu tạo đột biến sàng lọc để tìm chủng có khả lên men sinh kháng sinh với sản lƣợng cao Từ 11 chủng với suất 60 μg/ml đến đạt tới 85000 μg/ml chủng đƣợc sử dụng cơng nghiệp [178] Ngồi khả sinh kháng sinh penicillin ƣu việt, P chrysogenum đƣợc biết đến khả sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất có giá trị nhƣ αamylase [50], lipase [13], polyamine oxidase [144], glucose oxidase [89] xanthocillin X [44] Gần đây, chiết xuất từ sợi nấm P chrysogenum khô đƣợc chứng minh hỗ trợ số trồng nhƣ táo, nho, cà chua hành tây chống lại tác nhân gây hƣ hỏng việc kích thích chế phòng vệ cây, từ giúp tránh khỏi bệnh rụng nấm mốc thông thƣờng [184] 1.1.5 Nấm Penicillium digitatum 1.1.5.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm P digitatum Nấm P digitatum gây bệnh mốc xanh có múi, đƣợc miêu tả phân loại Saccardo năm 1881 [153] Loài đƣợc xếp vào ngành ascomycota (nấm túi), ngành phụ Pezizomycotina, lớp Eurotiomycetes, lớp phụ Eurotiomycetidae, Eurotiales, họ Trichocomaceae chi Penicillium Hình 1.5 Hình thái nấm P digitatum [15] A: Nấm P digitatum gây hỏng cam; B: Nấm P digitatum sinh trƣởng môi trƣờng PDA; C: Cấu trúc sinh bào tử bào tử nấm P digitatum Nấm P digitatum phát triển nhanh môi trƣờng MEA (malt extract agar) PDA, nhƣng lại phát triển chậm môi trƣờng CD Bề mặt khuẩn lạc có màu xanh ơliu mặt sau khuẩn lạc có màu vàng kem màu nâu nhạt Mặt khuẩn lạc mƣợt mà khơng có giọt tiết P digitatum có khả sinh trƣởng phổ nhiệt độ rộng từ 4-30°C, tối ƣu nhiệt độ 25-30°C, khơng sinh trƣởng 12 đƣợc 37°C Lồi nấm sinh sản cách hình thành bào tử vơ tính Bào tử nảy mầm 5°C mơi trƣờng nhân tạo (Hình 1.5) Nấm có mùi đặc trƣng chúng tiết hợp chất chuyển hóa dễ bay nhƣ limonen, valencene, ethylene, ethyl alcohol, ethyl acetate methyl acetate Sợi nấm P digitatum không màu, đƣờng kính 4-20µm, bào tử hình tròn đến hình trứng, thn dài, khơng vách có kích thƣớc từ 4-7 x 6-8 µm [134] P digitatum nấm gây bệnh thực vật thuộc chi Penicillium đƣợc giải mã toàn hệ gen [106] Trƣớc đó, hệ gen ty thể hồn chỉnh nấm P digitatum đƣợc cơng bố nhóm nghiên cứu Trung Quốc [174] Phân tích so sánh Marcet-Houben cộng (2012) trình tự hệ gen ty thể hai chủng Tây Ban Nha Trung Quốc cho thấy phát triển mở rộng loài giới So sánh với loài nấm sinh kháng sinh P chrysogenum cho thấy số lƣợng nhỏ gen có P digitatum điều phù hợp với cách sinh trƣởng chuyên biệt chúng vật chủ Các phân tích liệu hệ gen làm sáng tỏ sở phân tử việc P digitatum khơng có khả sử dụng nguồn nitơ nitrat tạo sản phẩm trao đổi chất bậc hai penicillin [106] Cơ sở liệu hệ gen chủng nấm P digitatum P chrysogenum đƣợc tải lên sở liệu công cộng PhylomeDB (www.phylomedb.org) 1.1.5.2 Cơ chế gây bệnh nấm P digitatum có múi Mối quan hệ “vật chủ - mầm bệnh - môi trƣờng” đƣợc coi tam giác bệnh nấm P digitatum có múi sau thu hoạch Tam giác cho thấy mối quan hệ nguồn gây bệnh, trái vật chủ điều kiện môi trƣờng quy định biểu bệnh Bệnh có múi sau thu hoạch đƣợc chia thành hai nhóm khác dựa thời điểm lây nhiễm: nhiễm trƣớc thu hoạch bị gây nguồn bệnh tiềm ẩn, nhiễm sau thu hoạch nhiễm vào vết xƣớc P digitatum gây bệnh có múi thuộc nhóm thứ [15] P digitatum nhiễm qua vết xƣớc có múi Thơng thƣờng vết xƣớc có q trình thu hoạch bƣớc xử lý nhà kính q trình lƣu thơng thị trƣờng Đơi lây nhiễm xảy trƣớc 13 thu hoạch, bị tổn thƣơng, vỡ xƣớc côn trùng gây Sẽ khơng có lây nhiễm nhƣ vỏ ngun vẹn, bào tử đính tự bề mặt nảy mầm Ngƣợc lại, bào tử nằm vết thƣơng hở, làm vỡ tuyến dầu xâm nhập vào cùi, nảy mầm đó, q trình xâm nhiễm định xảy sau 48 lây nhiễm 20-25°C [15] Nhiều chứng cho thấy rằng, chất dễ bay tiết từ mô tế bào có múi đóng vai trò quan trọng q trình gây bệnh nấm P digitatum Thành phần dầu vỏ loại có múi nhƣ cam, quýt, chanh bƣởi monoterpene limonene (4-isopropenyl-1-methylcyclohexene), chiếm 60 – 95% tổng số chất bay [35] Các hợp chất dễ bay sinh từ có múi khác trƣờng hợp nguyên vẹn, bị hỏng thông thƣờng bị hỏng nhiễm nấm P digitatum Những cam nguyên vẹn có chứa hợp chất thuộc nhóm sesquiterpene nhƣ valencene lƣợng nhỏ monoterpene nhƣ limonene Đối với cam bị dập bị xƣớc, lƣợng lớn limonene monoterpene khác đƣợc giải phóng thay sesquiterpene Limonene hợp chất dầu khác nhƣ terpenes myrcene, α-pinene, β-pinene, sabinene đƣợc chứng minh có tác động kích thích nảy mầm bào tử kéo dài hệ sợi nấm P digitatum, đƣợc coi nhƣ chế nhận biết vật chủ loài nấm [51, 52] Khi nghiên cứu nấm gây bệnh khác nhƣ P expansum P sclerotiorum khơng thấy có tƣợng có gây ức chế nảy mầm kéo dài hệ sợi [198] Trên cam chuyển gen làm giảm hàm lƣợng limonene cho thấy nấm P digitatum giảm khả gây bệnh đáng kể [9] Nhiều nghiên cứu chế gây bệnh nấm P digitatum mức độ phân tử cho thấy số gen đóng vai trò quy định khả gây bệnh nấm P digitatum Gen PdMpkB đƣợc chứng minh gen giữ vai trò quan trọng chế gây bệnh nấm P digitatum Gen PdMpkB điều hòa biểu loạt gen mã hóa enzym phân giải thành tế bào vỏ nhƣ cellulase, pectinase chitinase Khi hệ sợi nấm P digitatum bắt đầu xâm nhiễm vào có múi vị trí vết xƣớc vỏ quả, gen PdMpkB điều hòa biểu loạt gen hoạt 14 động để tiết enzym phân giải phá hủy thành tế bào vỏ Khi thành tế bào vỏ bị phá hủy enzym, hệ sợi nấm P digitatum tiếp tục đâm xuyên vào Khi gen PdMpkB bị ức chế biểu bị xóa bỏ làm giảm biểu gen mã hóa enzym phân giải dẫn tới hệ sợi nấm P digitatum khơng có khả đâm xun gây hỏng [105] Ngồi ra, có nhiều nghiên cứu gen liên quan tới khả gây bệnh nấm P digitatum Gen PdSNF1 đƣợc chứng minh mơi trƣờng có pectin - thành phần vỏ có múi ảnh hƣởng tới hình thành bào tử, kéo dài hệ sợi nấm P digitatum phân giải thành phần pectin [217] Sự hoạt động gen PdSNF1 khiến cho bào tử nấm nhiễm vào qua vết xƣớc (gặp đƣợc thành phần pectin vỏ quả) kích thích chồi hình thành hệ sợi phát sinh bào tử nấm P digitatum làm tăng trình sinh tổng hợp enzym phân giải pectin làm hỏng nhanh Khi gen PdSNF1 bị xóa bỏ cho thấy giảm khả gây bệnh đáng kể nấm P digitatum Tuy nhiên nay, việc điều tra vai trò gen quy định khả gây bệnh nấm P digitatum tiếp tục đƣợc thực 1.2 PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT) Để thực nghiên cứu cải biến di truyền nấm sợi phƣơng pháp chuyển gen công cụ thiếu Hiện nay, số phƣơng pháp chuyển gen đƣợc sử dụng phổ biến nấm sợi chuyển gen qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen xung điện (electroporation) chuyển gen trung gian qua vi khuẩn A tumefaciens Với phƣơng pháp chuyển gen thông qua tế bào trần, đoạn DNA vector mang gen mong muốn đƣợc chuyển trực tiếp vào tế bào nấm đƣợc xử lý loại bỏ thành tế bào enzym Các bƣớc trình chuyển gen gồm tạo protoplast, hấp thụ DNA, phục hồi tế bào trần chọn lọc thể chuyển gen Phƣơng pháp chuyển gen đƣợc đánh giá hiệu quả, đặc biệt loài nấm mà phƣơng pháp chuyển gen khác thực đƣợc Tuy nhiên, trình chuẩn bị tế bào trần nhƣ bƣớc chuyển gen phức tạp, 15 tốn nhiều cơng sức, chi phí cao khơng ổn định, đòi hỏi ngƣời thực phải có nhiều kinh nghiệm, áp dụng rộng rãi phòng thí nghiệm vừa nhỏ Đặc biệt protoplast phải đƣợc sử dụng sau chuẩn bị [103, 110] Phƣơng pháp chuyển gen xung điện phƣơng pháp học đƣợc sử dụng để đƣa phân tử DNA vào tế bào chủ qua màng tế bào Cơ chế phƣơng pháp tạo xung điện cao khoảng thời gian ngắn để làm rối loạn cấu trúc lớp màng phospholipid kép, tạo lỗ thủng tạm thời cho phép phân tử DNA ngoại lai xâm nhập vào bên tế bào Chuyển gen xung điện gồm ba pha: pha thứ tạo lỗ màng, diễn vòng vài micro giây; pha thứ hai mở rộng kích thƣớc lỗ màng xảy vài trăm micro giây đến vài mili giây pha cuối đóng lại lỗ màng, diễn vòng vài phút sau kết thúc xung điện [76] Phƣơng pháp áp dụng thành cơng với số lồi nấm sợi đòi hỏi phải có thiết bị chun dụng dùng cho q trình chuyển gen Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens kể từ công bố đến đƣợc áp dụng thành công nhiều loài nấm khác nhau, thực phƣơng pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu đạt đƣợc cao [113, 170] 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens A tumefaciens vi khuẩn Gram âm sống đất, đƣợc ý nghiên cứu nhiều khả chèn gen vào tế bào vật chủ Loài vi khuẩn sử dụng máy sinh vật chủ để biểu gen dƣới dạng hợp chất dinh dƣỡng cho chúng, tạo khối u thực vật gần điểm tiếp nối rễ thân (Hình 1.6) Cơ chế hình thành khối u thực vật A tumefaciens đƣợc làm sáng tỏ nhiều nghiên cứu: vi khuẩn chuyển phần DNA (T-DNA) plasmid cảm ứng khối u Ti plasmid vào tế bào chủ Các gen nằm T-DNA mã hóa cho enzym ảnh hƣởng đến sinh trƣởng khơng kiểm sốt tế bào thực vật, dẫn đến khối u [113] 16 Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn A tumefaciens dƣới kính hiển vi điện tử [133] Khả chuyển gen hiệu A tumefaciens mang lại nhiều thành tựu quan trọng chuyển gen vào thực vật vi nấm [131] Kể từ lần chuyển gen vào nấm sợi thông qua A tumefaciens thành công vào năm 1998, vi khuẩn đƣợc sử dụng nhƣ hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm khác nhƣ Aspergillius awamori, Aspergillus fumigatus… [63, 131] 1.2.2 Cơ chế chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens Trong trình hình thành khối u, phần T-DNA Ti plasmid vi khuẩn A tumefaciens đƣợc chèn vào hệ gen nấm Lợi dụng chế này, chuyển gen, vùng T-DNA chứa gen gây khối u Ti plasmid bị loại bỏ thay gen mong muốn Ti plasmid mang gen mã hóa cho protein phân giải opine, cắt vận chuyển đoạn T-DNA Ti plasmid chứa vùng gen độc lực vir (virulence region) giúp vận chuyển T-DNA [70] Các gen vir mã hóa cho protein tham gia vào trình vận chuyển T-DNA đƣợc cảm ứng hợp chất acetosyringone (AS) có nguồn gốc từ thực vật, nhờ vào để thu đƣợc thể chuyển gen [59] Sự có mặt cấu trúc tích hợp T-DNA để khẳng định trình chuyển gen vào nấm nhờ hệ thống trung gian [66] Vùng T-DNA đƣợc giới hạn biên trái (LB - Left Border) biên phải (RB - Right Border), chứa trình tự lặp lại dài 24 bp trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA Gen tổng hợp auxin, cytokinin opine T-DNA gen gây khối u bị loại bỏ thay gen 17 mong muốn (Hình 1.7) Gen mong muốn nằm vùng trình tự biên trái biên phải T-DNA đƣợc chuyển vào tế bào nấm tích hợp vào hệ gen nấm vị trí ngẫu nhiên [66] Hình 1.7 Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens [201] Ngoài việc chèn ngẫu nhiên vào hệ gen, nấm xảy tƣơng xóa gen nhờ tái tổ hợp tƣơng đồng Hiện tƣợng xóa gen theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng tƣợng chèn ngẫu nhiên T-DNA vào hệ gen nấm xảy với tần số gần sử dụng vector nhị thể chứa T-DNA gồm marker sàng lọc hai trình tự tƣơng đồng với gen đích tế bào nhận [32, 191] Q trình xóa gen theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng xảy hay khơng tùy thuộc vào lồi nấm Q trình phụ thuộc vào độ dài trình tự tƣơng đồng gen đích có vector Ở số lồi nấm, trình tự tƣơng đồng dài thúc đẩy xóa gen theo chế trao đổi chéo tƣơng đồng [114, 212] Ngồi ra, tích hợp T-DNA xảy vị trí ngẫu nhiên hệ gen nấm gây bất hoạt gen vị trí chèn, dẫn đến đột biến chèn, ATMT đƣợc sử dụng để tạo sƣu tập đột biến chèn nấm, nhƣ nấm gây bệnh ngƣời Cryptococcus neoformans [197] Blastomyces dermatitidis [121], nấm gây bệnh thực vật 18 Fusarium oxysporum [115], Leptosphaeria maculans [30], Magnaporthe oryzae [22, 73] Cơ chế chuyển gen A tumefaciens đóng vai trò quan trọng việc tạo thể biến nạp Một số thông số ảnh hƣởng đến hiệu suất chuyển gen nhƣ chủng Agrobacterium chủng nấm sử dụng, nồng độ acetosyringone, điều kiện đồng ni cấy Mỗi lồi nấm khác đòi hỏi thơng số tối ƣu khác để đạt đƣợc hiệu suất chuyển gen cao 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi gián tiếp qua vi khuẩn A tumefaciens gồm thao tác đơn giản, ổn định hiệu suất tƣơng đối cao Tuy nhiên, thực nghiệm cho thấy hiệu suất chuyển gen loài nấm khác khác Do vậy, để đạt đƣợc hiệu suất chuyển gen cao nhất, yếu tố thơng số chuyển gen cần đƣợc tối ƣu hóa * Chủng vi khuẩn A tumefaciens Chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng cho chuyển gen thông qua A tumefaciens đa dạng Mỗi chủng vi khuẩn mang lại hiệu khác chuyển gen vào loài nấm khác Bởi vậy, đƣa kết kết luận chủng A tumefaciens chủng thích hợp để chuyển gen vào nấm [113] * Vật liệu chuyển gen Phƣơng pháp chuyển gen trung gian qua A tumefaciens đƣợc áp dụng với nhiều dạng vật liệu ban đầu nấm nhƣ: bào tử, tế bào trần hay bào tử nảy mầm Thông thƣờng, bào tử nấm vật liệu chuyển gen đƣợc ƣu tiên sử dụng tiện dụng, dễ thao tác không tốn Nếu sử dụng tế bào trần cần nhiều hóa chất, enzym đắt tiền để tác động phá vỡ thành tế bào, tế bào trần dễ bị vỡ nên hiệu suất chuyển gen thƣờng không cao cần có thao tác thí nghiệm tốt Sử dụng bào tử nảy mầm để chuyển gen không gặp khó khăn thao tác nhƣng dễ có tƣợng mọc - bào tử nấm không nhận đƣợc gen chuyển mong 19 muốn nhƣng mọc đƣợc môi trƣờng chọn lọc, dẫn tới giảm hiệu suất chuyển gen [113] * Tỷ lệ nồng độ vi khuẩn A tumefaciens bào tử nấm Tỷ lệ phối trộn ban đầu vi khuẩn bảo tử nấm yếu tố có ảnh hƣởng nhiều đến hiệu chuyển gen Nếu tỷ lệ không đạt đến thông số tối ƣu, hiệu suất chuyển gen bị giảm đáng kể tƣợng mọc vi khuẩn nấm Tăng nồng độ vi khuẩn hay bào tử nấm có khả làm tăng hiệu suất chuyển gen, nhiên nồng độ sử dụng có giới hạn định Vì vậy, với lồi nấm vi khuẩn khác nhau, cần lập quy trình tối ƣu riêng thích hợp [113, 114] * Điều kiện đồng nuôi cấy vi khuẩn - bào tử nấm Thời gian, nhiệt độ màng chuyển gen yếu tố quan trọng giai đoạn đồng nuôi cấy vi khuẩn - bào tử nấm Nhiệt độ đồng nuôi cấy thƣờng dao động khoảng 20ºC-28ºC, thời gian khoảng 16-96 tùy lồi Màng chuyển gen cellulose, nitrocellulose hay Hybond N+, loại màng cho hiệu suất chuyển gen khác [113, 114] * Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS) Chất cảm ứng AS đƣợc bổ sung vào giai đoạn đồng nuôi cấy vi khuẩn - bào tử nấm, hợp chất có khả cảm ứng gen vir để chuyển đoạn TDNA chứa gen mong muốn từ vector nhị thể vào tế bào chủ Để đạt hiệu tối ƣu nhất, AS thƣờng đƣợc bổ sung từ giai đoạn tiền nuôi cấy vi khuẩn A tumefaciens [113] 1.2.4 Vector dùng chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens Trong nghiên cứu chuyển gen, số công cụ quan trọng đƣợc phát triển vector Năm 1973, lần plasmid đƣợc chỉnh sửa việc trao đổi gen kháng tetracycline từ pSC101 với gen kháng kanamycin trở thành pSC102 [38] Sau đó, pBR322 đƣợc xây dựng đƣợc sử dụng làm môđun sở cho công cụ di truyền khác [28] Từ đến nay, nhiều 20 loại vector đƣợc nghiên cứu cải biến theo hƣớng mà ngƣời mong muốn (Hình 1.8) Hình 1.8 Mốc thời gian quan trọng nghiên cứu phát triển vector từ năm 1970 đến [129] Trong vector, marker chọn lọc thành phần quan trọng cho phép chọn lọc thể đột biến Chúng marker trợ dƣỡng hay marker kháng kháng kháng sinh Xét cách đơn giản, vector đƣợc chia thành ba loại điển hình dựa theo mục đích nghiên cứu, gồm vector nhân dòng (cloning vector), vector biểu (expression vector) vector thị (reporter vector) Vector nhân dòng đƣợc sử dụng để tạo nhiều trình tự DNA mong muốn [149, 164] Vector biểu đƣợc sử dụng để sản xuất lƣợng lớn protein, loại vector thƣờng gồm promoter điều khiển biểu gen mã hóa protein [166, 180] Với vector thị, sử dụng để đánh giá promoter quan tâm điều hòa biểu gen thơng qua việc sử dụng gen mã hóa protein thị nhƣ protein huỳnh quang [161], protein phát quang [206] enzym [74] Những vector thị cho phép phân tích in vivo động học biểu gen suốt trình phát triển sinh vật [55] 21 Đối với nghiên cứu chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens, thành phần phải có vector T-DNA, gen vir mã hóa protein giúp vận chuyển T-DNA mang gen mong muốn từ vi khuẩn sang vật chủ Có hai hệ thống vector thƣờng đƣợc dùng chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens hệ thống vector đồng tích hợp (co-integrated vector) hệ thống vector nhị thể (binary vector) [188] Hình 1.9 Cấu trúc vector đồng tích hợp [133] Vector đồng tích hợp sản phẩm tái tổ hợp tƣơng đồng plasmid nhỏ có nguồn gốc vi khuẩn Ti plasmid (Hình 1.9) Ti plasmid có chứa hệ thống gen vir đƣợc loại bỏ gen liên quan đến hình thành khối u Plasmid nhỏ đƣợc thiết kế để mang gen cần chuyển nằm vùng biên trái (LB) vùng biên phải (RB) [188] Khi hai vector có mặt tế bào A tumefaciens, tái tổ hợp xảy khiến gen cần chuyển tích hợp vào vị trí T-DNA [116] Vector đồng tích hợp trở nên phổ biến năm gần khó khăn việc thiết kế sử dụng chúng [188] Hệ thống vector nhị thể hệ thống phổ biến phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens [188] Hệ thống gồm hai plasmid Ti plasmid (plasmid hỗ trợ) vector nhị thể (Hình 1.10) Ti plasmid bị loại bỏ TDNA có chứa số lƣợng lớn gen vir mã hóa cho máy chuyển T-DNA Các hợp chất phenol, chẳng hạn nhƣ acetosyringone (AS) đƣợc dùng để cảm ứng 22 cho gen vir máy chuyển T-DNA Vector nhị thể có chứa T-DNA nằm hai vùng biên lặp lại dài 24 bp Sau cảm ứng máy chuyển T-DNA, đoạn DNA nằm vùng biên lặp lại đƣợc chuyển phân tử sợi đơn sang tế bào chủ tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen tế bào chủ [12, 113] Hình 1.10 Mơ hình tổng quát hệ thống vector nhị thể [113] Việc sử dụng vector nhị thể có nhiều thuận lợi so với vector đồng tích hợp, chẳng hạn nhƣ khơng cần tái tổ hợp in vivo Tốc độ chuyển gen vector nhị thể 2-3 ngày, tốc độ chuyển gen vector đồng tích hợp lâu hơn, từ 4-7 ngày Hơn nữa, hiệu chuyển gen vector nhị thể cao so với vector đồng tích hợp [116] 1.2.5 Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens Marker chọn lọc gen có mang đặc điểm thích hợp để phục vụ mục đích chọn lọc nhân tạo đƣợc đƣa vào tế bào Chúng kiểu gen báo cáo để nhận biết DNA quan tâm đƣợc chuyển vào tế bào hay chƣa Hiện nay, quy trình chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens thƣờng sử dụng loại marker chọn lọc: gen kháng kháng sinh gen trợ dƣỡng * Gen kháng kháng sinh Một số loại kháng sinh thông dụng đƣợc sử dụng chuyển gen nhƣ hygromycin B, nourseothricin phleomycin Hygromycin B kháng sinh đƣợc sinh tổng hợp xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus Nó tiêu diệt vi 23 khuẩn, nấm sinh vật nhân chuẩn cao cách ức chế tổng hợp protein [140] Kháng sinh nourseothricin, tên thƣơng mại clonNAT, đƣợc sản sinh xạ khuẩn Streptomyces noursei, gây ức chế tổng hợp protein cách gây lỗi mã hóa Kháng sinh đƣợc dùng làm marker chọn lọc phạm vi rộng, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi tế bào thực vật [88] Phleomycin có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces verticillus, kháng sinh phổ rộng có khả chống lại hầu hết loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật tế bào động vật Nó gây chết tế bào cách xen vào DNA làm phá vỡ sợi kép DNA [37] Các gen chọn lọc kháng lại kháng sinh đƣợc ký hiệu lần lƣợt là: hph, nat1, ble, đƣợc sử dụng phổ biến làm marker chuyển gen nhiều loài sinh vật [140] [88, 167] * Gen trợ dưỡng Phần lớn nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi sử dụng loại gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc Tuy nhiên, loại kháng sinh thƣờng có giá thành cao làm tăng chi phí thí nghiệm, gây hạn chế cho việc nghiên cứu chuyển gen Bên cạnh đó, nhiều loại nấm sợi có khả kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh bị ức chế nồng độ kháng sinh cao, tiêu biểu A oryzae khiến cho việc dùng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc không khả thi [175] Vấn đề đƣợc khắc phục cách cải biến di truyền số lồi nấm sợi để dùng gen trợ dƣỡng làm marker chọn lọc Marker sử dụng gen trợ dƣỡng thƣờng gen liên quan đến sinh tổng hợp chất thiết yếu trình sinh trƣởng nấm Marker trợ dƣỡng gen bù vào đột biến khuyết dƣỡng hệ gen vật chủ Các chủng sau gây đột biến khuyết dƣỡng khả sinh tổng hợp chất cần thiết cho sinh trƣởng bình thƣờng, sinh trƣởng đƣợc mơi trƣờng có bổ sung thêm chất Sử dụng marker trợ dƣỡng cho phép sàng lọc thể chuyển gen môi trƣờng khơng có chất dinh dƣỡng thiết yếu mà bị khuyết dƣỡng Gen trợ dƣỡng đƣợc sử dụng phổ biến nấm sợi pyrG Ngoài gen pyrG, gen trợ dƣỡng khác đƣợc sử dụng làm marker nhƣ gen adeA, met, trp, argB Chuyển 24 gen sử dụng marker trợ dƣỡng giúp giảm chi phí, an tồn mơi trƣờng có tiềm ứng dụng vào sản xuất thực tiễn [219] Gen pyrG mã hóa decarboxylase orotidine-5'-monophosphate (OMP), enzym đƣờng tổng hợp pyrimidine quan trọng cho tổng hợp uridine Axit 5fluoroorotic dạng đột biến (5-FOA) ức chế phát triển tế bào hầu hết sinh vật cách vào đƣờng tổng hợp pyrimidine, nơi đƣợc chuyển đổi thành chất tƣơng tự pyrimidine fluoroorotidine monophosphate [23] Khả chống lại 5-FOA đạt đƣợc cách ngăn chặn đƣờng dẫn pyrimidine thông qua việc khử orotidine-5'-monophosphate (OMP) decarboxylase làm xúc tác decarboxyl hoá orotidine monophosphate (OMP) để hình thành uridine monophosphate (UMP) Trong loài nấm sợi, đột biến gen pyrG tạo thể khuyết dƣỡng uridine và/hoặc uracil kháng với 5-FOA [67] 1.2.6 Promoter điều hòa biểu gen nấm sợi Promoter vùng trình tự nucleotit nằm phía đầu 5’ vị trí khởi đầu phiên mã, đóng vai trò điều khiển q trình phiên mã nhờ khả đảm bảo vị trí nhận biết cho protein tham gia vào việc điều khiển biểu gen Kích thƣớc promoter dao động từ 100 - 1000 bp [162] Promoter đƣợc chia làm hai loại chính: promoter khơng đặc hiệu hay gọi promoter định promoter đặc hiệu (gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển promoter cảm ứng) Promoter định loại promoter tham gia điều khiển hoạt động gen hầu nhƣ tất loại mô, tất giai đoạn phát triển khác sinh vật Promoter đặc hiệu quy định biểu đặc hiệu gen một vài loại mô một vài giai đoạn phát triển Promoter cảm ứng loại promoter hoạt động mạnh môi trƣờng xuất điều kiện cảm ứng [2] Ở nấm sợi, promoter định đƣợc sử dụng rộng rãi gpdA mã hóa glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase từ A nidulans Do có mức độ tƣơng đồng cao khả tăng cƣờng mức độ biểu nên promoter gpdA đƣợc sử dụng nhiều loài nấm sợi Năm 2002, Wasylnka Moore biểu thành công gen GFP đƣợc điều khiển promoter gpdA nấm sợi A fumigatus [202] Năm 25 2016, Nguyễn Thị Khuyến cộng chứng minh promoter gpdA A nidulans điều khiển gen DsRed hoạt động mạnh A oryzae Toàn hệ sợi cấu trúc sinh bào tử thể chuyển gen A oryzae cho tín hiệu huỳnh quang đỏ mạnh quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang Đặc biệt, số thể chuyển gen cho kiểu hình màu hồng nhạt đến đậm đĩa chuyển gen hoàn toàn quan sát đƣợc mắt thƣờng [124] Bên cạnh gpdA, promoter trpC (sinh tổng hợp tryptophan) từ A nidulans thƣờng đƣợc sử dụng nghiên cứu chuyển gen biểu gen nấm sợi [64, 94] Ngoài loại promoter định, promoter cảm ứng đƣợc ứng dụng rộng rãi việc biểu gen nấm sợi Ƣu điểm việc biểu enzym protein tái tổ hợp dƣới kiểm soát promoter cảm ứng mức độ biểu cao nhiều lần Các promoter cảm ứng thƣờng đƣợc sử dụng gồm glaA A niger A awamori, amyB (mã hóa cho amylase), thiA (gen liên quan đến sinh tổng hợp thiamine) A oryzae [117] GlaA gen mã hóa cho glucoamylase - enzym tiết nhiều A niger [57] Vì hiệu hoạt động cao nên promoter glaA đƣợc sử dụng phổ biến sản xuất protein tái tổ hợp Takaamylase A sản phẩm gen amyB đƣợc tìm thấy nấm sợi A oryzae Quá trình sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai đƣợc cảm ứng tinh bột maltoologosacharides nhƣ maltose, iso-maltose, panose bị kiềm chế glucose [185, 209] Cụ thể, vùng promoter amyB dài 617 bp đóng vai trò chủ yếu q trình dịch mã gen amyB, đặc biệt vùng trình tự từ vị trí -377 đến -290 đƣợc chứng minh liên quan trực tiếp tới q trình điều hòa biểu mạnh gen [177, 187] Tuy nhiên, vùng trình tự từ vị trí -290 đến -233 promoter amyB giữ vai trò khả đƣợc cảm ứng maltose [77] Promoter amyB đƣợc chứng minh khả biểu mạnh ổn định mà không phụ thuộc vào nhiệt độ nấm sợi A oryzae [86] 1.2.7 Gen thị DsRed GFP dùng chuyển gen nấm sợi Gen thị mã hóa protein tƣơng ứng đƣợc sử dụng đánh giá hiệu chuyển gen dùng nhƣ dấu hiệu để sàng lọc thể chuyển gen Sự có mặt 26 gen thị khiến tế bào/khuẩn lạc thể chuyển gen có kiểu hình khác biệt dễ dàng phân biệt với chủng tự nhiên Gen thị không gây ảnh hƣởng đến chức sinh lý nhƣ sinh trƣởng thể chuyển gen [4] Các gen thị đƣợc gắn liền với gen đích đƣợc điều khiển dƣới promoter biểu độc lập mà khơng có gen đích kèm Một số gen thị hay đƣợc sử dụng nhƣ: GFP, DsRed, GUS, lacZ,…[90, 119, 130] 1.2.7.1 Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP) Gen GFP có chiều dài 720 bp đƣợc phân lập lần từ sứa Aequoreavictoria Osamu Shimomura năm 1962 GFP mã hóa protein có kích thƣớc 238 axit amin (26,9 kDa) Protein phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh tiếp xúc với ánh sáng bƣớc sóng 509 nm [142, 163] Trong lĩnh vực sinh học phân tử, gen GFP thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ gen thị chuyển gen biểu gen (Hình 1.11) GFP thƣờng đƣợc đƣa vào tế bào thơng qua kỹ thuật chuyển gen tích hợp GFP hệ gen tế bào đủ bền vững qua hệ sau Đến nay, GFP đƣợc biểu nhiều loài, bao gồm sinh vật nhân sơ nhân chuẩn, có nấm sợi [104] Gen huỳnh quang GFP hữu ích việc nghiên cứu xác định vị trí protein kiểm tra mức độ biểu gen mong muốn Trong nghiên cứu phát triển phƣơng pháp chuyển gen, biểu gen thị GFP đƣợc chứng minh thành cơng nhiều lồi nấm sợi nhƣ A fumigatus [79], A oryzae [109], A nidulans [31], A niger [62], Fusarium oxysporum [99]… Hình 1.11 Biểu gen GFP nấm sợi A oryzae [124] 27 1.2.7.2 Gen mã hóa huỳnh quang đỏ (DsRed) Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed có chiều dài 678 bp đƣợc phân lập từ lồi san hơ thuộc chi Discosoma Protein DsRed gồm 226 axit amin với kích thƣớc 28 kDa, phát huỳnh quang màu đỏ tín hiệu huỳnh quang mạnh đƣợc quan sát dƣới ánh sáng bƣớc sóng 583 nm [10] Do đặc tính tƣơng tự nhƣ gen huỳnh quang GFP nên DsRed đƣợc sử dụng làm gen thị nghiên cứu nhiều loài sinh vật khác Riêng với nấm sợi, gen DsRed đƣợc biểu thành công nhiều loài nhƣ Sordaria macrospora [54], F oxysporum [120], Acremonium chrysogenum [71], A fumigatus [97]… Các tế bào nhận đƣợc gen DsRed có màu đỏ dƣới kính hiển vi huỳnh quang với bƣớc sóng phù hợp (Hình 1.12) Hình 1.12 Biểu gen DsRed nấm sợi A oryzae [123] 1.2.8 Ƣu điểm phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens có nhiều ƣu điểm thuận lợi so với các phƣơng pháp truyền thống xung điện polyethylen glycol (PEG) Nguyên liệu từ nấm để đồng nuôi cấy với A tumefaciens vô đa dạng, bào tử, tế bào trần, sợi nấm, bào tử nảy mầm chí cặn tế bào [58, 113] Trong đó, phƣơng pháp sử dụng PEG tế bào trần (protoplast) để chuyển gen lại bộc lộ nhiều hạn chế khâu thao tác chuẩn bị vật liệu Tế bào trần tế bào đƣợc loại bỏ thành tế bào nên DNA lạ dễ dàng xâm nhập, nhiên để loại bỏ thành tế bào cần sử dụng đến nhiều hóa chất enzym đắt tiền Hơn nữa, tế bào trần bảo quản thời gian 28 dài nên bắt buộc thí nghiệm chuyển gen phải hồn thành ngày, tn thủ quy trình thực nghiêm ngặt có thao tác tốt chuyển gen thành cơng, đạt hiệu suất cao ổn định lần thực Chuyển gen vào nấm thơng qua vi khuẩn A tumefaciens tốn kém, thao tác quy trình thực đơn giản nhiều so với phƣơng pháp truyền thống khác Hơn nữa, hiệu chuyển gen đạt đƣợc thƣờng cao Điển hình nhƣ chuyển gen vào A awamori thơng qua A tumefaciens đạt hiệu suất cao gấp 400 lần so với phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp PEG [43] Có thể sử dụng trực tiếp hệ sợi hay bào tử nấm làm nguyên liệu để chuyển gen mà khơng cần khâu xử lý Bào tử nấm sau giữ lạnh 4ºC khoảng tháng để thực thí nghiệm khác Sử dụng vi khuẩn A tumefaciens để chuyển gen chuyển đƣợc đoạn DNA ngoại lai có kích thƣớc lớn So với phƣơng pháp cũ chuyển gen tế bào trần chuyển đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai lớn chuyển vào tế bào thực vật nhờ A tumefaciens lên đến 150 kb [19] Vi khuẩn A tumefaciens có xu hƣớng chèn T-DNA vào hệ gen chủng nấm chuyển gen Đoạn T-DNA đƣợc cài ngẫu nhiên vào vị trí hệ gen nấm, gây hỏng gen bị chèn gen giữ vai trò quan trọng Sử dụng kỹ thuật đại nhƣ TAILPCR hay giải trình tự gen hệ cho phép xác định đƣợc gen sai hỏng Lợi dụng đặc tính để nghiên cứu, xác định gen liên quan đến sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất liên quan đến trình sinh trƣởng, gây bệnh nấm [47] 1.2.9 Sử dụng phƣơng pháp ATMT nghiên cứu chuyển gen nấm sợi Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) đƣợc chứng minh phƣơng pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu cao nhiều loài nấm khác Năm 1995, phƣơng pháp ATMT lần đƣợc công bố nấm men Saccharomyces cerevisiae năm 1998 áp dụng thành cơng nấm sợi [43] Từ đó, phƣơng pháp đƣợc áp dụng thành công nhiều 29 chi nấm sợi khác nhƣ: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma , có lồi quan trọng thuộc chi Aspergillus A niger Theo kết nghiên cứu công bố, việc chuyển gen vào A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT thực đƣợc với marker chọn lọc gen kháng hygromycin cho hiệu không cao (83 thể chuyển gen/107 bào tử) [100] Tƣơng tự, hiệu chuyển gen hai loài nấm P chrysogenum P digitatum đƣợc báo cáo tƣơng đối thấp Đối với loài P chrysogenum, việc chuyển gen thành công đƣợc báo cáo với marker chọn lọc gen kháng nourseothricin, hiệu chuyển gen đạt 507 thể chuyển gen/106 bào tử [42] Đối với nấm P digitatum, phƣơng pháp ATMT đƣợc áp dụng thành công với hiệu chuyển gen đạt 60 thể chuyển gen/106 bào tử [199] Hiệu chuyển gen khơng cao khó khăn lớn cho nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp hay điều tra chức gen loài nấm Nhƣ việc nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao cho loài nấm nghiên cứu cần thiết Nhờ có chế tái tổ hợp tƣơng đồng nên phƣơng pháp chuyển gen ATMT đƣợc coi phƣơng pháp phổ biến, hiệu dùng để xóa gen điều tra chức gen nấm Phƣơng pháp đƣợc chứng minh hiệu việc xóa loạt gen NrCat1, NrCat4 NrPex16 nấm Nomuraea rileyi với hiệu suất xóa gen lên tới 36,2 - 82,3% [169] Đặc biệt phƣơng pháp ATMT đƣợc sử dụng phổ biến điều tra chức gen nhiều loài nấm gây bệnh thực vật Nghiên cứu Sørensen cộng (2014) việc sử dụng phƣơng pháp ATMT cho hiệu cao nấm bệnh thực vật Fusarium avenaceum gây bệnh thối rễ bạc ngũ cốc thông qua việc xố thành cơng gen FaPKS6 (FA08709.2) Đồng thời vai trò gen FaPKS6 q trình sinh tổng hợp chất fusaristatin A đƣợc làm sáng tỏ [165] Ở nấm Cercospora zeina gây bệnh đốm xám ngô, chức gen CTB7 đƣợc đánh giá tồn diện thơng qua việc xóa gen CTB7 Gen CTB7 đƣợc chứng minh gen liên quan đến trình sinh tổng hợp cercosporin, chất có liên quan đến việc gây bệnh đốm xám ngô [176] Bằng phƣơng pháp chuyển gen ATMT, gen Clt-1 đƣợc xóa thành cơng nấm Cochliobolus lunatus, nhờ 30 vai trò gen Clt-1 đƣợc chứng minh có liên quan tới trình sinh độc tố gây bệnh đốm ngơ [60] Với lồi nấm gây bệnh ngƣời động vật hay với loài nấm có khả sinh tổng hợp hợp chất có giá trị, phƣơng pháp chuyển gen ATMT đƣợc sử dụng để nghiên cứu chức nhiều gen quan trọng Nghiên cứu Zhang cộng (2015) xóa thành cơng gen URE1 hai lồi nấm gây bệnh dơi ngƣời Pseudogymnoascus destructans Pseudogymnoascus pannorum Đồng thời nghiên cứu cho thấy gen URE1 gen mã hoá cho enzym phân giải ure liên quan tới khả chịu lạnh [215] Với phƣơng pháp này, chế phân tử trình sinh tổng hợp sansalvamide, chất hứa hẹn nhiều tiềm nghiên cứu tạo thuốc chống ung thƣ nấm Fusarium solani đƣợc chứng minh có liên quan tới hai gen NRPS29 NRPS30 Hai gen tham gia trực tiếp vào trình tổng hợp nên sansalvamide [150] Tại Việt Nam, nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi thơng qua vi khuẩn A tumefaciens nên công bố không nhiều Các nghiên cứu tập trung vào việc xác định đặc điểm sinh học bƣớc đầu chuyển gen vào nấm sợi nhƣ nghiên cứu Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Trần Văn Tuấn (2017) tiến hành chủng nấm A niger TL8 Chủng nấm A niger TL8 đƣợc chuyển thành công gen huỳnh quang GFP sử dụng vi khuẩn A tumefaciens với marker gen kháng hygromycin [3] Ngoài việc sử dụng marker chuyển gen gen kháng kháng sinh, Nguyễn Thị Khuyến cộng (2016, 2017) công bố thiết lập thành công hệ thống chuyển gen hiệu vào nấm sợi A oryzae sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG Nghiên cứu tạo thành công chủng nấm A oryzae khuyết dƣỡng uridine/ uracil thơng qua việc xóa gen pyrG biểu thành công protein huỳnh quang sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG [123, 124] Sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG, Thái Hạnh Dung Trần Văn Tuấn (2018) biểu đƣợc enzym laccase tái tổ hợp nấm A oryzae [181] Nhƣ vậy, phƣơng pháp ATMT phƣơng pháp hiệu cho nghiên cứu biểu gen tái tổ hợp, nghiên cứu xóa gen điều tra chức gen nấm sợi Do 31 vậy, khuôn khổ nghiên cứu luận án tiến hành phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao thông qua vi khuẩn A tumefaciens, sử dụng hệ thống để xóa gen laeA điều tra chức gen ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI 1.3.1 Protein LaeA tƣơng tác phức hệ protein velvet nấm sợi LaeA (loss of aflR-expression A) protein có vai trò đa nấm sợi nói chung LaeA đƣợc xem nhƣ protein điều hòa quan trọng tƣơng tác với nhiều protein khác, có phức hệ velvet tiếng Xét khía cạnh protein, LaeA sở hữu vùng chuyển nhóm methyl tham gia vào việc điều hòa q trình trao đổi chất phát triển nấm Trong cấu trúc protein, vùng cấu trúc phụ thuộc S-adenosylmethione (SAM) có hoạt tính chuyển nhóm methyl tƣơng đồng với enzym chuyển nhóm methyl cho axit amin arginin [16] Phức hệ protein velvet nấm giữ nhiều vai trò quan trọng điều hòa sinh trƣởng, trao đổi chất, đáp ứng với điều kiện bất lợi môi trƣờng, kiểm sốt sinh sản vơ tính hữu tính, kiểm sốt khả biệt hóa tế bào gây bệnh nấm Các thành viên phức hệ protein velvet gồm VeA (velvet A), VelB (velvet-like protein B), VelC (velvet-like protein C) VosA (viability of spores A), với LaeA (loss of aflR expression A) đƣợc nghiên cứu nấm sợi mơ hình A nidulans [81, 95] Các nghiên cứu gần LaeA protein velvet gồm VeA, VelB, VelC VosA hoạt động nhƣ protein điều hòa chủ chốt trình phát triển trao đổi chất bậc hai nấm thơng qua việc hình thành phức hệ nhƣ LaeA/VeA/VelB, VeA/VelB, VelB/VosA, VelB/VelB, VelC/VosA, VelC/VeA Phức hệ velvet vai trò chúng sinh trƣởng phát triển A nidulans đƣợc mô tả chi tiết Hình 1.13 32 Hình 1.13 Các protein velvet hình thành phức hệ phân tử ảnh hƣởng chúng đến phát triển sản sinh chất trao đổi bậc hai nấm [155] Các protein thuộc phức hệ velvet có tính bảo thủ cao tham gia vào điều hòa q trình sinh sản, biệt hóa hình thái trao đổi chất nhiều lồi nấm khác [155, 172] 1.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA nấm sợi Ở nấm sợi nói chung, gen laeA đƣợc chứng minh giữ vị trí quan trọng điều hòa hoạt động trao đổi chất Việc xóa laeA cản trở biểu nhiều cụm gen protein, bao gồm sterigmatocystin (độc tố nấm), penicillin lovastatin (hoạt chất dùng điều trị bệnh mỡ máu) Chủng đột biến gen laeA A nidulans khả hình thành độc tố kháng sinh [26] Gen laeA gen cần thiết cho việc tổng hợp kháng sinh P chysogenum nấm gây bệnh F fujikuroi [69, 205] Xóa gen laeA làm giảm khả tạo bào tử, sắc tố tăng tổng hợp roquefortine C P chysogenum [92] Protein LaeA kiểm soát khả trao đổi chất gây bệnh hạt, nhƣ việc biểu lipase A flavus [75] 33 Nguyên nhân vai trò đa dạng laeA đƣợc cho tƣơng tác protein LaeA với nhiều phức hệ protein khác nhau, có phức hệ velvet tiếng Năm 2008, LaeA đƣợc phát có mối liên hệ đặc biệt với VeA VelB phức hệ gồm thành phần (heterotrimeric) với vai trò thiết yếu kiểm sốt q trình trao đổi chất phát triển nấm [17] Thêm vào đó, VelB lại thành phần phức hợp với VosA, nhƣ dimer VelB - VelB tham gia vào nhiều trình trao đổi chất Khơng có LaeA, lƣợng protein VelB VosA tăng lên LaeA có vai trò hạn chế trình biến đổi sau phiên mã VeA, chứng protein VeA thu đƣợc tế bào không biểu LaeA có kích thƣớc lên đến xấp xỉ 10 kDa [16] Ngồi ra, gen laeA dƣờng nhƣ có liên quan tới di truyền ngoại gen [139] Năm 2010, giả thuyết việc LaeA có chức chống lại q trình methyl hóa histon H3K9 cụm gen tổng hợp chất gây ung thƣ đƣợc kiểm nghiệm [147] Ở A niger nhƣ nấm sợi khác, laeA gen mã hóa cho protein LaeA nhân, điều hòa q trình trao đổi chất bậc đáp ứng stress nấm tồn hệ gen A niger Vai trò LaeA đƣợc tập trung nghiên cứu cơng bố qua nhiều nghiên cứu lồi P chrysogenum, nấm sợi có hệ gen tƣơng đồng cao so sánh với chi Aspergillus [92] A nidulans, loài nấm chi [29] Những nghiên cứu vai trò gen laeA A niger cơng bố hạn chế Theo Arentshorst M cộng sự, có mối liên hệ LaeA việc sản sinh axit citric, sản phẩm tiêu biểu A niger Không vậy, liệu mức độ trao đổi chất chủng A niger bị đột biến gen laeA chủng tự nhiên có khác biệt [128] Tuy nhiên, nghiên cứu sâu chức gen với trình trao đổi chất khác chƣa đƣợc tiến hành Gen laeA P chrysogenum gen mã hóa cho protein LaeA nằm nhân, giữ vai trò quan trọng kiểm sốt q trình sinh tổng hợp nhiều sản phẩm trao đổi chất bậc nấm Gen laeA tồn hệ gen P chrysogenum có độ tƣơng đồng cao với số lồi nấm khác thuộc chi Penicillium Aspergillus [92] LaeA với VeA hai protein điều hòa chiếm 34 vị trí cốt lõi phức hệ velvet - phức hệ cao phân tử gồm 10 loại protein tham gia điều hòa kiểm sốt vị trí khác [69, 91] Kể từ báo cáo lần Bok Keller (2003) vai trò LaeA điều hòa cụm gen liên quan tới trình chuyển hóa sản phẩm thứ cấp (penicillin, lovastatin, gliotoxin, sterigmatocystin) loài A nidulans, gen laeA loài nấm thuộc chi Penicillium, đặc biệt P chrysogenum đƣợc đào sâu nghiên cứu [26] Cho đến nay, hiểu biết chứng chức gen khẳng định chắn laeA gen giữ vai trò kiểm sốt nhiều khía cạnh suốt trình sinh trƣởng P chrysogenum, bao gồm sinh tổng hợp sản phẩm bậc nhƣ kháng sinh penicillin, độc tố sắc tố, enzym, sinh trƣởng phát triển hình thành bào tử vơ tính, biệt hóa hình thái cấu trúc quan sinh bào tử, hệ sợi [69, 92, 108] Tƣơng tự nhƣ A nidulans, LaeA P chrysogenum tƣơng tác trực tiếp với VeA thông qua VeA để tƣơng tác với protein khác họ velvet tạo thành phức hệ có chức định [18, 91] Việc xóa hay biểu mức gen laeA có tác động đến trình sinh trƣởng nấm Tuy nhiên mức độ biểu gen laeA loài chủng loài khác nhau, vậy, việc tìm điểm tác động laeA đối tƣợng gần gũi với loài đƣợc nghiên cứu cần đƣợc quan tâm [92] 35 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng nghiên cứu đƣợc thống kê chi tiết Bảng 2.1 Bảng 2.1 Danh sách chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu STT Tên chủng Đơn vị cung cấp Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Escherichia coli DH5α Trọng điểm Công nghệ Enzym Agrobacterium tumefaciens AGL1 Penicillium digitatum PdVN1 Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chủng nấm phân lập nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Penicillium digitatum N11 Nam Penicillium chrysogenum VTCC- Viện Vi sinh Vật học Cơng nghệ F1172 (Kí hiệu khác VTCC 31172) Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Aspergillus niger N402 CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Aspergillus niger CBS 113.46 Staphylococcus aureus Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ ATCC25923 (ATCC) Lan) 36 2.1.2 Các vector sử dụng nghiên cứu Các vector sử dụng nghiên cứu đƣợc thống kê chi tiết Bảng 2.2 trình tự vector đƣợc thể Phụ lục 29 Bảng 2.2 Các vector sử dụng nghiên cứu Vector pRHN1 Đặc điểm vector Đơn vị cung cấp Vector pRHN1 mang cấu trúc biểu gen DsRed bao gồm promoter gpdA từ A nidulans, gen DsRed terminator trpC từ A nidulans, gen kháng nourseothricin dƣới điều hòa promoter TrpC từ A nidulans dùng cho việc tạo vector pPK2-Red pGreen3 pPK2 Phòng Vector nhị thể pPK2 mang gen kháng hygromycin (HPH) Genomic, dƣới điều hòa promoter gpdA từ A nidulans đƣợc Phòng thí pAN8-1 pGreen2 pEX2 dùng làm khung cho việc tạo vector pPK2-Red, pPK2-phleo nghiệm Vector pAN8-1 mang cấu trúc gen kháng phleomycin dƣới Trọng điều hòa promoter gpdA từ A nidulans dùng cho việc điểm tạo vector pPK2-phleo Công Vector nhị thể pGreen2 mang cấu trúc gen kháng nghệ hygromycin dƣới điều hòa promoter gpdA từ A Enzym nidulans đƣợc dùng làm khung cho việc tạo vector pGreen3 và cấu trúc vector phục hồi gen laeA P digitatum Protein, (pG-PdlaeA ) A niger (pGB-AnlaeA) Trƣờng Vector nhị thể pEX2 mang cấu trúc biểu gen DsRed Đại học (gpdA promoter, gen DsRed, trpC terminator) đƣợc dùng Khoa học cho việc tạo vector pPK2-Red, pEX2A pKO2.1.1 Vector nhị thể pKO2.1.1 mang gen kháng nourseothricin Tự nhiên, Đại học dƣới điều hòa promoter trpC từ A nidulans dùng làm Quốc gia khung cho việc tạo cấu trúc xóa gen laeA P digitatum (pKO2ΔPdlaeA) P chrysogenum (pKO2ΔPclaeA) 37 Hà Nội Đặc điểm vector Vector Đơn vị cung cấp pKO2.0.1 Vector nhị thể pKO2.0.1 mang gen kháng nourseothricin dƣới điều hòa promoter gpdA từ A nidulans dùng làm khung cho việc tạo cấu trúc xóa gen laeA A niger (pKO2ΔAnlaeA), vector xóa gen pyrG P chrysogenum (pKO2ΔPcpyrG) A niger (pKO2ΔAnpyrG) pEX2B Vector nhị thể pEX2B mang marker trợ dƣỡng pyrG từ A oryzae, biểu gen DsRed dƣới kiểm soát promoter amyB dùng làm khung cho việc tạo vecror biểu mức gen laeA P chrysogenum (pEX2B-PclaeA) 2.1.3 Thiết bị hóa chất Các hóa chất trang thiết bị đƣợc sử dụng Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh Vật học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (Phụ lục 1) Các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật sử dụng nghiên cứu đƣợc liệt kê Phụ lục Các cặp mồi đƣợc thiết kế tham khảo từ cơng trình khác, đƣợc gửi tổng hợp công ty IDT (Singapore) Công ty Sinh hóa Phù Sa (Việt Nam) Các mồi đƣợc pha nƣớc khử ion vô trùng đến nồng độ sử dụng 10 pmol Danh sách mồi đƣợc liệt kê Phụ lục 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu nhƣ PCR, nhân dòng gen, tạo vector, xử lý enzym giới hạn… đƣợc thực dựa theo cẩm nang Molecular cloning tác giả Sambrook, xuất năm 1989 [154] Các nội dung nghiên cứu đƣợc thể Hình 2.1 38 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1 Thu bào tử hệ sợi nấm Quy trình thu bào tử hệ sợi nấm đƣợc tiến hành theo Nguyễn Thị Khuyến cộng (2016) [124] P digitatum, P chrysogenum A niger đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thạch PDA CD sau 3-5 ngày 25ºC-30ºC Bổ sung nƣớc cất vô trùng lên bề mặt đĩa ni, sau dùng que gạt vô trùng gạt tách bào tử khỏi hệ sợi nấm Lọc dịch thu đƣợc từ đĩa màng lọc Miracloth (Calbiochem, Đức) giữ ống falcon Ly tâm dịch sau lọc tốc độ 4000 vòng/phút thời gian 10 phút, đổ bỏ phần dịch Lặp lại bƣớc kể lần Phần cặn chứa bào tử nấm đƣợc pha nƣớc cất vô trùng đƣợc xác định nồng độ buồng đếm Thoma Sau dịch bào tử đƣợc pha lỗng đến nồng độ thích hợp (106 107 bào tử/ml) để sử dụng cho thí nghiệm Ni cấy thu hệ sợi nấm cách bổ sung 200 μl dịch bào tử nấm nồng độ 106 bào tử/ml vào 50 ml môi trƣờng lỏng PDB, nuôi lắc điều kiện 25ºC nấm P digitatum 28ºC nấm P chrysogenum A niger, tốc độ lắc 200 vòng/phút Sau ngày, thu hệ sợi giấy lọc vô trùng Phần hệ sợi nấm đƣợc giữ 39 lại bên màng lọc đƣợc thấm hết nƣớc giấy thấm chứa vào ống eppendorf ml 2.2.2 Đánh giá khả mẫn cảm kháng sinh Các chủng nấm nghiên cứu đƣợc ni mơi trƣờng PDA có bổ sung kháng sinh hygromycin, nourseothricin (clonNAT) phleomycin với nồng độ khác Các đĩa sau đƣợc ni điều kiện 25ºC-30ºC 3-5 ngày để đánh giá phát triển nấm Nồng độ chất kháng sinh ức chế hoàn toàn sinh trƣởng nấm đƣợc sử dụng làm nồng độ để chọn lọc thể chuyển gen 2.2.3 Tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA 2.2.3.1 Tách chiết DNA Thu 0,2 g sợi nấm vào ống eppendorf vô trùng ml giã nát đũa thủy tinh khử trùng Bổ sung 600 µl đệm chiết GX µl proteinase K vào ống chứa mẫu, vortex 10-15 giây ủ mẫu 60ºC thời gian 30 phút Sau đó, bổ sung thêm 300 µl natri acetate 3M pH 5,2 vào ống chứa mẫu tiến hành ly tâm lạnh 4ºC, 12000 vòng/phút 20 phút Chuyển phần dịch sang ống eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung thêm isopropanol lạnh với thể tích tƣơng đƣơng để kết tủa DNA tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút 4ºC Giữ lại phần tủa ống eppendorf, thêm 700 µl ethanol 70% vào ống ly tâm lạnh 4ºC, 12000 vòng/phút phút để rửa phần tủa Đổ bỏ dịch nổi, làm khô mẫu máy cô quay chân khơng Bổ sung 50 µl đệm TE 1x để hòa tan bảo quản DNA Loại bỏ RNA có mẫu cách ủ mẫu 60ºC 30 phút sau bổ sung µl RNase (10 mg/ml) [124] Tách chiết DNA dùng cho phản ứng real-time PCR, hệ sợi nấm đƣợc nghiền thành bột mịn nitơ lỏng Tồn quy trình đƣợc thực với G-spinTM Total DNA Extraction Kit hãng iNtRON theo hƣớng dẫn nhà sản xuất 2.2.3.2 Tách chiết RNA tổng số Sau ngày nuôi môi trƣờng tối thiểu MM, sợi nấm đƣợc thu nghiền thành bột mịn nitơ lỏng dùng cho tách chiết RNA RNA tổng số đƣợc chiết kit tinh RNA hãng Anabio R&D JSC theo hƣớng dẫn nhà sản 40 xuất RNA sau tinh đƣợc xử lý 20 phút 37ºC enzym DNase I để loại bỏ hồn tồn DNA DNase I sau đƣợc bất hoạt 75ºC 15 phút RNA sau tinh đƣợc sử dụng cho tổng hợp cDNA 2.2.3.3 Tổng hợp cDNA RNA tổng số sau tinh đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA Một lƣợng 800-1000 ng RNA đƣợc sử dụng cho phản ứng tổng hợp cDNA với mồi oligo dT enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase Tồn quy trình đƣợc thực với ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit hãng New England Biolabs theo hƣớng dẫn nhà sản xuất 2.2.4 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 2.2.4.1 PCR đoạn DNA Trình tự đoạn DNA đƣợc lấy từ sở liệu ngân hàng GenBank, cặp mồi khuếch đại gen đƣợc thiết kế phần mềm Primer3 đƣợc tổng hợp hóa học công ty IDT (Singapore) Các đoạn DNA đƣợc PCR từ DNA hệ gen sử dụng enzym Phusion® high-fidelity DNA polymerase hãng Thermo Scientific Thành phần phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen phục vụ cho việc tạo vector: 5X HF buffer : µl dNTPs (40 µM thành phần) : µl Mồi xi (10 pmol) : µl Mồi ngƣợc (10 pmol) : µl Phusion polymerase : µl Khn DNA (50-100 ng/µl) : µl Nƣớc khử ion vơ trùng : 15 µl Tổng thể tích : 25 µl Chu trình nhiệt nhƣ sau: 94ºC (3 phút); 35 chu kỳ 94ºC (30 giây), 5860ºC (30 giây), 72ºC (1 đến phút); 72ºC (10 phút) Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % sau đƣợc tinh kit tinh DNA hãng Promega theo hƣớng dẫn nhà sản xuất 41 2.2.4.2 Xử lý vector đoạn DNA với enzym giới hạn 0,8-1 µg vector đoạn DNA đƣợc cắt với enzym giới hạn dạng FastDigest hãng Thermo Scientific Quy trình xử lý enzym theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm xử lý enzym giới hạn đƣợc điện di gel agarose 0,8% Đoạn DNA gel đƣợc cắt chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml Quy trình tinh đƣợc thực sử dụng kit tinh MEGAquick-spinTM plus hãng iNtRON Sản phẩm sau tinh đƣợc điện di kiểm tra đo nồng độ DNA máy NanoDrop One 2.2.4.3 Nối đoạn DNA vào plasmid (ligation) Plasmid đoạn DNA sau xử lý enzym giới hạn tinh sạch, đƣợc sử dụng cho phản ứng ghép nối dùng enzym nối T4 DNA ligase (Thermo Scientific) Các thành phần 20 µl hỗn hợp phản ứng nhƣ sau: T4 ligase buffer 10x µl, enzym T4 DNA ligase µl, plasmid (50-100 ng), đoạn DNA (50-100 ng) bổ sung H2O đến thể tích 20 µl Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 4ºC qua đêm, sau đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt Quá trình biến nạp nhƣ sau: ống chứa tế bào vi khuẩn E coli DH5α đƣợc giữ nƣớc đá 5-10 phút rã đông Hút hỗn hợp lai vào ống tế bào khả biến, trộn nhẹ pipet đặt đá 20 phút Sau sốc nhiệt 40 giây 42ºC đặt nƣớc đá phút Bổ sung 800 µl LB lỏng ống đƣợc lắc 37ºC Tế bào đƣợc thu ly tâm 8000 vòng/phút 20 giây đƣợc trải môi trƣờng LB chứa kanamycin (100 mg/l) Đĩa đƣợc ủ 37ºC 24 Các khuẩn lạc nhận đƣợc từ đĩa chọn lọc đƣợc kiểm tra colony-PCR (PCR từ khuẩn lạc) với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA Phản ứng colony-PCR sử dụng GoTaq® Green Master Mix hãng Promega Những khuẩn lạc cho kết PCR với kích thƣớc đoạn chèn đƣợc sử dụng để tách plasmid cắt kiểm tra enzym giới hạn Thành phần phản ứng PCR nhằm xác nhận, kiểm tra đoạn gen sử dụng Master Mix (Promega): 2X Master Mix : 2,5 µl Mồi xi (10pmol) : 0,2 µl 42 Mồi ngƣợc (10pmol) Khn DNA/khuẩn lạc : 0,2 µl : 0,2 µl Nƣớc khử ion vô trùng : 1,9/2,1 µl Tổng thể tích : µl 2.2.4.4 Tách plasmid Khuẩn lạc chọn đƣợc cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 10-20 ml môi trƣờng LB lỏng bổ sung thêm kháng sinh kanamycin (100 mg/l) Bình ni cấy đƣợc lắc qua đêm 30-37ºC Ly tâm ml dịch nuôi 12000 vòng/phút 20 giây (ly tâm lần, lần ml) Bổ sung 250 µl buffer P1 (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,6) µl Rnase (10 mg/ml) Cặn tế bào đƣợc hòa tan vào đệm vortex Bổ sung thêm 250 µl buffer P2 (200 mM NaOH, 1% SDS) sau đảo ống nhẹ nhàng lần Tiếp bổ sung thêm 350 µl buffer N3 (kali acetate 3M; pH 5,5) đảo ống nhẹ lần Ly tâm ống 12000 vòng/phút 4ºC 20 phút Hút khoảng 700 µl dịch có chứa plasmid chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh Ống đƣợc trộn máy vortex đƣợc ly tâm tốc độ 12000 vòng/phút 20 phút 4ºC Đổ bỏ dịch rửa cặn 500 µl ethanol 70% Ly tâm phút đổ bỏ dịch Cặn chứa DNA đƣợc làm khô máy cô quay chân không SpeedVac hòa vào 50 µl đệm TE 1x Plasmid đƣợc bảo quản ngăn đá tủ lạnh -30ºC [124] 2.2.4.5 Tạo vector biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker gen kháng kháng sinh hygromycin Cấu trúc biểu gen DsRed bao gồm promoter gpdA từ A nidulans, gen DsRed terminator trpC từ A nidulans đƣợc cắt từ vector pRHN1 [71] enzym SacI, tạo đầu enzym T4 DNA polymerase (Thermo Scientific) sau tiếp tục cắt với enzym HindIII Cấu trúc sau cắt có đầu đầu dính đƣợc tinh kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up (Promega) Khung vector đƣợc sử dụng vector nhị thể pPK2 mang gen kháng hygromycin (HPH) dƣới điều hòa promoter gpdA từ A nidulans [40] Vector pPK2 đƣợc xử lý với enzym XbaI, tạo đầu enzym T4 DNA polymerase sau tiếp tục 43 cắt với enzym HindIII Sản phẩm sau cắt đƣợc tinh kit hãng Promega Cấu trúc biểu gen DsRed đƣợc nối vào khung vector pPK2 sử dụng enzym T4 DNA ligase Sản phẩm sau nối đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt chọn lọc môi trƣờng LB bổ sung kanamycin (100 μg/ml) Khuẩn lạc đƣợc kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi DsRed-F/DsRed-R Vector nhị thể tạo đƣợc cắt kiểm tra enzym StuI đặt tên pPK2-Red 2.2.4.6 Tạo vector biểu gen huỳnh quang xanh GFP với marker gen kháng kháng sinh nourseothricin Cấu trúc vector đƣợc tạo thơng qua việc thay vùng trình tự gen kháng hygromycin khung vector pGreen2 [186] gen kháng nourseothricin hai vị trí cắt enzym PacI SpeI Gen kháng nourseothricin dƣới điều hòa promoter TrpC từ A nidulans đƣợc khuếch đại từ vector pRHN1 [71] cặp mồi NAT-F/NAT-R Vector nhị thể tạo đƣợc cắt kiểm tra enzym KpnI đƣợc đặt tên pGreen3 2.2.4.7 Tạo vector biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker gen kháng kháng sinh phleomycin Vector pPK2 [40] đƣợc tiến hành thay vùng trình tự gen kháng hygromycin vùng trình tự gen kháng phleomycin từ vector pAN8-1 [111] vị trí cắt enzym giới hạn EcoRI XbaI để tạo vector pPK2-phleo Tiếp theo, khung vector pPK2-phleo đƣợc cắt mở vòng hai enzym XbaI HindIII Trình tự dùng cho biểu gen DsRed (gpdA promoter, gen DsRed, trpC terminator) đƣợc cắt từ vector pEX2 [124] enzym SpeI HindIII với kích thƣớc 2,389kb Sản phẩm sau cắt đƣợc tinh kit hãng Promega Cấu trúc biểu gen DsRed đƣợc nối vào khung vector pPK2-phleo sử dụng enzym T4 DNA ligase Vector nhị thể tạo đƣợc cắt kiểm tra enzym StuI đặt tên pPK2-Red2 44 2.2.4.8 Tạo vector dùng cho thiết lập hệ thống chuyển gen trợ dưỡng uridine/uracil nấm sợi A niger Vector xóa gen pyrG A niger: gen pyrG đƣợc khuếch đại từ DNA chủng A niger N402 PCR với cặp mồi AnpyrG-P1/AnpyrG-P2 có trình tự nhận biết enzym giới hạn XbaI Đoạn pyrG sau tinh đƣợc cắt enzym XbaI, tiếp đƣợc nối vào vector pKO2.0.1 đƣợc cắt enzym EcoRV XbaI Việc ghép nối sử dụng enzym T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc tạo cách cắt vector mang gen pyrG nguyên gốc enzym giới hạn EcoRV BamHI, sau tiến hành làm đầu ghép nối để vector tự đóng vòng enzym blunting có kit ClonJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Cấu trúc xóa mang đoạn gen pyrG có kích thƣớc nhỏ gen pyrG nguyên gốc 0,564 kb Cấu trúc đƣợc cắt kiểm tra enzym XhoI đƣợc đặt tên pKO2ΔAnpyrG Vector biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker gen trợ dưỡng pyrG từ A niger: Vector đƣợc tạo dựa cấu trúc vector pEX2, chứa gen mã hóa huỳnh quang đỏ DsRed đƣợc điều khiển promoter gpdA từ A nidulans marker trợ dƣỡng pyrG A niger Đoạn gen pyrG A niger đƣợc khuếch đại với cặp mồi AnpyrG-P1/AnpyrG-P2 (Bảng 2.2), sau đƣợc xử lý với hai enzym XbaI EcoRI Sản phẩm sau cắt đƣợc tinh gắn vào khung vector pEX2 đƣợc xử lý trƣớc enzym giới hạn EcoRI SpeI Vector sau tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzym XhoI đƣợc đặt tên pEX2A 2.2.4.9 Tạo vector xóa, phục hồi biểu mức gen laeA A niger Vector xóa gen laeA A niger sử dụng marker gen kháng nourseothricin: Tiến hành khuếch đại đoạn 5’ laeA (1,407 kb) 3’ laeA (1,163 kb) từ DNA chủng A niger N402 sử dụng cặp mồi AnlaeA-P1/AnlaeA-P2 (khuếch đại 5’ laeA) AnlaeA-P3/AnlaeA-P4 (khuếch đại 3’ laeA) Sản phẩm PCR đƣợc xử lý với enzym giới hạn thích hợp Sử dụng kit để tinh sản phẩm PCR 5’ laeA 3’ laeA Sản phẩm sau tinh đƣợc nối vào vector nhị 45 thể pKO2.0.1 đƣợc xử lý với enzym tƣơng ứng sử dụng enzym T4 DNA ligase Đoạn 5’ laeA đƣợc nối vào vector thông qua vị trí cắt enzym giới hạn EcoRI SpeI Tƣơng tự, đoạn 3’ laeA đƣợc nối vào vector thơng qua vị trí cắt enzym giới hạn XbaI HindIII Cấu trúc xóa laeA A niger hồn chỉnh có kích thƣớc 10,48 kb, chứa trình tự gen kháng kháng sinh nourseothricin nằm đoạn 5’ laeA 3’ laeA Cấu trúc vector xóa laeA sau tạo đƣợc cắt kiểm tra enzym EcoRI BamHI đƣợc đặt tên pKO2ΔAnlaeA Vector phục hồi gen laeA: Khung đọc mở (ORF) phần terminator gen laeA đƣợc khuếch đại từ DNA hệ gen chủng nấm A niger N402 sử dụng cặp mồi AnlaeA-ORF-F/AnlaeA-ORF-R1 (Bảng 2.2) Sản phẩm PCR đƣợc xử lý với enzym cắt giới hạn SnaBI HindIII trƣớc đƣợc nối vào vector pEX2B vị trí hai enzym PmlI HindIII Vector tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzym XhoI HindIII đƣợc kí hiệu pEX2B-AnlaeA Tồn vùng trình tự biểu gen laeA (vùng ORF phần terminator) dƣới kiểm kiểm soát promoter amyB đƣợc cắt từ vector pEX2B-AnlaeA enzym SpeI HindIII Sản phẩm sau cắt đƣợc nối vào vector pGreen2 vị trí hai enzym giới hạn SpeI HindIII Vector tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRI đƣợc đặt tên pGB-AnlaeA 2.2.4.10 Tạo vector xóa phục hồi gen laeA nấm sợi P chrysogenum Vector xóa gen: Tiến hành khuếch đại đoạn 5’ laeA (1,499 kb) 3’ laeA (1,359 kb) từ DNA hệ gen chủng P chrysogenum VTCC F1172 sử dụng cặp mồi PclaeA-P1/PclaeA-P2 (khuếch đại 5’ laeA) PclaeA-P3/PclaeA-P4 (khuếch đại 3’ laeA) Sử dụng kit tinh hãng Promega để tinh sản phẩm PCR 5’ laeA 3’ laeA Sản phẩm sau tinh đƣợc tiến hành cắt với enzym giới hạn, sau nối vào vị trí tƣơng ứng vector nhị thể pKO2.1.1 sử dụng enzym T4 DNA ligase Đoạn 5’ laeA đƣợc nối vào vector thông qua vị trí cắt enzym giới hạn EcoRV SacI Tƣơng tự, đoạn 3’ laeA đƣợc nối vào vector thơng qua vị trí cắt enzym giới hạn XbaI HindIII Cấu trúc xóa laeA P chrysogenum hồn chỉnh có kích thƣớc 10,582 kb, chứa trình tự gen mã hóa cho 46 khả kháng kháng sinh nourseothricin nằm đoạn 5’ laeA 3’ laeA Cắt kiểm tra cấu trúc tạo enzym EcoRI Cấu trúc đƣợc đặt tên pKO2ΔPclaeA Vector phục hồi gen laeA: Để phục hồi lại gen laeA chủng nấm P chrysogenum xóa gen laeA, vector nhị thể đƣợc tạo với vùng T-DNA chứa đoạn ORF terminator gen laeA Từ DNA hệ gen chủng nấm P chrysogenum VTCC F1172, tiến hành khuếch đại đoạn ORF phần terminator gen laeA cặp mồi PclaeA-P6/PclaeA-P7 Sản phẩm PCR có kích thƣớc 2,697 kb đƣợc xử lý với enzym HindIII gắn vào vector nhị thể pPK2-Red2 vị trí nhận biết enzym giới hạn EcoRV HindIII sử dụng enzym T4 DNA ligase hãng Thermo Scientific Vector phục hồi gen laeA nấm P chrysogenum đƣợc đặt tên pPK2PclaeA Vector nhị thể pPK2-PclaeA đƣợc cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRI 2.2.4.11 Tạo vector xóa gen pyrG vector biểu mức gen laeA nấm sợi P chrysogenum Vector xóa gen pyrG: Gen pyrG (2,802 kb) đƣợc khuếch đại PCR với khuôn DNA hệ gen từ chủng P chrysogenum VTCC F1172 với cặp mồi PcpyrGdel-F/PcpyrG-del-R có trình tự nhận biết enzym giới hạn XbaI Phản ứng PCR sử dụng enzym Phusion DNA polymerase để đảm bảo xác Cấu trúc xóa gen pyrG P chrysogenum đƣợc thiết kế dựa khung vector nhị thể pKO2.0.1 Đoạn pyrG sau cắt enzym XbaI đƣợc tinh sạch, tiếp đƣợc nối vào vector pKO2.0.1 đƣợc cắt enzym EcoRV XbaI Việc ghép nối sử dụng enzym T4 DNA ligase theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc tạo cách cắt vector mang gen pyrG nguyên gốc enzym giới hạn StuI, sau tiến hành nối lại enzym T4 DNA ligase Cấu trúc xóa mang đoạn gen pyrG có kích thƣớc nhỏ gen pyrG nguyên gốc 0,999 kb Cấu trúc đƣợc cắt kiểm tra enzym EcoRI EcoRV đƣợc đặt tên pKO2ΔPcpyrG Vector biểu mức gen laeA sử dụng marker pyrG: Cấu trúc ORF terminator P chrysogenum VTCC F1172 đƣợc cắt từ vector pPK2-PclaeA enzym PmlI HindIII Cấu trúc sau cắt đƣợc tinh kit Wizard® SV 47 Gel and PCR Clean-Up (Promega) Khung vector đƣợc sử dụng vector pEX2B [123] mang marker chọn lọc gen pyrG promoter cảm ứng amyB từ A oryzae RIB40 Vector pEX2B đƣợc xử lý enzym PmlI HindIII để loại bỏ vùng gen DsRed TrpC terminator Sản phẩm sau cắt đƣợc tinh kit hãng Promega Cấu trúc ORF terminator gen laeA P chrysogenum đƣợc nối vào khung vector pEX2B sử dụng enzym T4 DNA ligase Vector nhị thể tạo đƣợc cắt kiểm tra enzym EcoRI đặt tên pEX2B-PcLaeA 2.2.4.12 Tạo vector xóa phục hồi gen laeA nấm sợi P digitatum Vector xóa gen laeA: Để xóa gen laeA nấm sợi P.digitatum, vector xóa gen laeA đƣợc tạo với vùng T-DNA mang đoạn 5' 3' gen laeA mà không chứa khung đọc mở (ORF), đoạn 5' 3' gen laeA gen kháng kháng sinh nourseothricin dƣới điều khiển trpC promoter Từ DNA hệ gen chủng nấm P digitatum PdVN1, tiến hành khuếch đại đoạn gen 5’ laeA (1,33kb) 3’ laeA (1,401) cặp mồi PdlaeA-P1/PdlaeA-P2 PdlaeA-P3/PdlaeA-P4 Sản phẩm PCR lần lƣợt đƣợc cắt gắn vào vector nhị thể pKO2.1.1 vị trí nhận biết enzym giới hạn XbaI HindIII (với đoạn 3’ laeA) vị trí nhận biết enzym SacI SpeI (với đoạn 5’ laeA) sử dụng enzym T4 DNA ligase hãng Thermo Scientific Vector xóa laeA đƣợc đặt tên pKO2ΔPdlaeA Vector nhị thể pKO2ΔPdlaeA đƣợc cắt kiểm tra hai enzym giới hạn EcoRI HindIII Vector phục hồi gen laeA: Vector phục hồi gen laeA vector nhị thể với vùng T-DNA chứa đoạn ORF terminator gen laeA P digitatum Từ DNA hệ gen chủng nấm P digitatum PdVN1, đoạn ORF terminator (từ ba mở đầu tới phần terminator) đƣợc khuếch đại cặp mồi PdlaeA-ORF-F/PdlaeA-T Sản phẩm PCR có kích thƣớc 1,496kb đƣợc cắt gắn vào vector nhị thể pGreen2 [186] vị trí nhận biết enzym giới hạn XhoI XbaI sử dụng enzym T4 DNA ligase Vector phục hồi gen laeA nấm P digitatum đƣợc đặt tên pG-PdlaeA Vector nhị thể pG-PdlaeA đƣợc cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRV 48 2.2.5 Tối ƣu quy trình chuyển gen nấm A niger, P digitatum P chrysogenum thông qua vi khuẩn A tumefaciens 2.2.5.1 Biến nạp vector vào vi khuẩn A tumefaciens AGL1 Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 sử dụng nghiên cứu chủng đƣợc cải biến di truyền từ chủng AGL0 Hệ gen chủng AGL1 chứa plasmid pTiBo542ΔT, bị loại bỏ vùng chứa gen gây khối u tạo điều kiện cho việc phát triển vector nhị thể chứa vùng gen thay mong muốn [96] Các vector dùng cho chuyển gen đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens AGL1 sử dụng phƣơng pháp biến nạp xung điện [179] Chuẩn bị tế bào A tumefaciens AGL1 khả biến: Nuôi vi khuẩn AGL1 dạng khuẩn lạc tƣơi 100 ml môi trƣờng LB lỏng, 28ºC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, khoảng 20 Ly tâm dịch ni vi khuẩn 4000 vòng/phút 10 phút 4ºC Đổ bỏ dịch Phần cặn chứa tế bào vi khuẩn đƣợc rửa lần dung dịch HEPES 100 mM lần dung dịch glycerol 10% Ly tâm lạnh 4ºC, 4000 vòng/phút 10 phút đổ bỏ dịch sau lần rửa Hòa cặn tế bào ml glycerol 10%, sau chia vào ống eppendorf 1,5 ml; ống 50 µl Các ống chứa tế bào A tumefaciens AGL1 khả biến đƣợc bảo quản tủ -30°C sử dụng để biến nạp xung điện Biến nạp vector vào vi khuẩn A tumefaciens AGL1 khả biến: Trộn 0,5 µl plasmid vào ống chứa 50 µl tế bào AGL1 khả biến Dùng pipet hút chuyển hỗn hợp vào cuvette mm tƣơng thích với máy chuyển gen xung điện Bio-Rad Điều chỉnh thông số máy chuyển gen: 2,5 kV, 400 Ω, 25 µF, cuvette mm tƣơng ứng với đối tƣợng sinh vật muốn chuyển gen vào Nhấn nút kích hoạt xung điện Bổ sung 500 µl mơi trƣờng LB lỏng vào cuvette, nhẹ nhàng hút chuyển tất hỗn hợp từ cuvette vào ống eppendorf vô trùng Nuôi lắc ống chứa mẫu 28ºC, 200 vòng/phút giờ, sau ly tâm để thu tế bào cấy trải môi trƣờng thạch LB bổ sung kháng sinh kanamycin (100 mg/l) Tiến hành kiểm tra khuẩn lạc xuất đĩa sau ngày 28ºC PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để xác định khuẩn lạc vi khuẩn AGL1 có mang vector mong muốn 49 2.2.5.2 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens AGL1 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào lồi nấm sợi dùng nghiên cứu đƣợc thực dựa công bố chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens [42, 124] Vi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang plasmid mong muốn đƣợc nuôi lắc qua đêm môi trƣờng LB lỏng chứa kanamycin 100 mg/l, 28ºC, tốc độ lắc 200 vòng/phút Q trình tối ƣu sử dụng vector biểu gen huỳnh quang xanh GFP đỏ DsRed Trộn 0,5 ml dịch vi khuẩn với 4,5 ml mơi trƣờng cảm ứng IM lỏng có bổ sung 200 µM acetosyringone (AS), bọc giấy bạc để tránh ánh sáng ni lắc 28ºC, 200 vòng/phút khoảng đến OD đạt 0,8 Cấy trải hỗn hợp gồm 100 µl dịch vi khuẩn cảm ứng 100 µl dịch bào tử nấm (104, 105 106 bào tử/ml) lên màng giấy cellulose (mã: FT-3-303-085 FT-3-303-090, hãng Sartorius, Đức) đƣợc đặt đĩa môi trƣờng thạch IM chứa AS (50, 100, 150, 150, 200 µM) Đĩa mơi trƣờng IM đồng ni cấy vi khuẩn bào tử nấm đƣợc giữ tối nhiệt độ khác (20, 22, 25 28ºC) nhiệt độ thời gian khác (24, 48, 60 72 giờ) Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển màng giấy cellulose sang môi trƣờng thạch PDA CD bổ sung kháng sinh để chọn lọc khuẩn lạc nấm nhận đƣợc gen mong muốn kháng sinh cefotaxime (300 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn A tumefaciens AGL1 Sau 4-5 ngày ủ nhiệt độ 25 - 28ºC, quan sát thấy khuẩn lạc nấm xuất đĩa mơi trƣờng chọn lọc 2.2.6 Xóa phục hồi gen laeA nấm sợi nghiên cứu Sử dụng quy trình chuyển gen tối ƣu thiết lập từ thí nghiệm trƣớc để tiến hành xóa gen laeA loài nấm sợi nghiên cứu Các vector xóa gen laeA (pKO2ΔAnlaeA, pKO2ΔPclaeA pKO2ΔPdlaeA) tƣơng ứng ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens AGL1 để sử dụng cho chuyển gen Các cấu trúc đƣợc tiến hành chuyển vào chủng tự nhiên để xóa gen laeA 50 Các vector phục hồi gen laeA (pGB-AnlaeA; pPK2-PclaeA pG-PdlaeA) tƣơng ứng ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens AGL1 để sử dụng cho chuyển gen Các cấu trúc đƣợc tiến hành chuyển vào chủng xóa gen laeA để phục hồi gen laeA Đồng thời cấu trúc pGB-AnlaeA pG-PdlaeA tƣơng ứng đƣợc chuyển vào chủng A niger P digitatum tự nhiên để tạo thể biểu mức laeA 2.2.7 Sàng lọc xác nhận thể chuyển gen Các khuẩn lạc nấm xuất riêng rẽ đĩa chuyển gen đƣợc tinh để trở thành chủng khiết, sau tiến hành ni lắc thu hệ sợi tách chiết DNA hệ gen để xác nhận PCR với cặp mồi đặc hiệu Các chủng nấm biểu gen huỳnh quang xanh đỏ đƣợc tiến hành xác nhận phản ứng PCR với hai cặp mồi độc lập: cặp mồi PCR gen kháng kháng sinh (NAT-F/NAT-R HPH-F/HPH-R PgpdA-F/Phleo-R) cặp mồi PCR gen huỳnh quang đỏ DsRed (DsRed-F/DsRed-R) gen huỳnh quang xanh GFP (GFP-F/GFP-R) Đồng thời chủng đƣợc tiến hành làm tiêu để quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang (Carl Zeiss, Đức) Xóa gen laeA nấm sợi A niger, thể đột biến kháng kháng sinh nourseothricin đĩa chuyển gen đƣợc tiến hành nuôi cấy tách chiết DNA kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi AnlaeA-ORF-F/AnlaeA-ORF-R, AnlaeAP5/AnlaeA-ORF-R, AnlaeA-ORF-F/AnlaeA-P6 Với việc phục hồi laeA, chủng phục hồi đƣợc kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu HPH-F/HPH-R AnlaeA-ORF-F/ORF-R Xóa gen laeA nấm sợi P chrysogenum, thể đột biến kháng kháng sinh nourseothricin đƣợc tiến hành PCR cặp mồi độc lập gồm: PclaeA-ORFF/PclaeA-ORF-R, NAT-F/PclaeA-P5 NAT-F/NAT-R Với việc phục hồi gen laeA, chủng phục hồi đƣợc kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu PclaeAORF-F/PclaeA-ORF-R, PgpdA-F/Phleo-R NAT-F/ PclaeA-P5 Xóa gen laeA nấm sợi P digitatum, thể đột biến kháng kháng sinh nourseothricin đƣợc tiến hành PCR xác nhận cặp mồi độc lập gồm: PdlaeA- 51 P5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORF-F/PdlaeA-ORF-R NAT-F/NAT-R Với việc phục hồi gen laeA, chủng phục hồi đƣợc kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu PdlaeA-P5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORF-F/PdlaeA-ORF-R HPH-F/HPH-R Xóa gen pyrG tạo thể đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil nấm sợi P chrysogenum A niger, thể đột biến kháng 5-FOA đƣợc tiến hành kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu PcpyrG-P3/PcpyrG-P5, PcpyrG-P3/PcpyrG-P4 (P chrysogenum) AnpyrG-P3/AnpyrG-ORF-R, AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-ORFR, AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P4 (A niger) Các thể chuyển gen biểu mức laeA nấm sợi P chrysogenum sử dụng marker trợ dƣỡng đƣợc tiến hành xác nhận PCR sử dụng cặp mồi AopyrG-ORF-F/AopyrG-ORF-R 2.2.8 Điều tra vai trò gen laeA loài nấm sợi nghiên cứu Các thể đột biến xóa gen, thể bổ trợ biểu mức gen laeA đƣợc nuôi môi trƣờng khác để kiểm tra khả sinh trƣởng, hình thành bào tử, axit hóa mơi trƣờng, sinh kháng sinh kháng khuẩn, gây hỏng quả… * Điều tra khả sinh trưởng nguồn cacbon nitơ Sử dụng môi trƣờng rắn SM (đối với nấm P digitatum) môi trƣờng CD (đối với nấm P chrysogenum) môi trƣờng MM (đối với nấm A niger) với nguồn cacbon (glucose, lactose, maltose, galactose, sucrose, xylan, tinh bột, cellulose, pectin) nguồn nitơ (nitrat amon) để kiểm tra khả sinh trƣởng chủng đột biến (chủng tự nhiên, chủng xóa, chủng phục hồi) So sánh sinh trƣởng chủng sau điều kiện nuôi cấy * Điều tra khả axit hóa mơi trường Cấy 0,2 ml bào tử nấm (106 bào tử/ml) chủng tự nhiên, chủng đột biến xóa gen, chủng phục hồi chủng biểu mức vào 50 ml môi trƣờng tối thiểu MM PDA, pH 6,5-7 Các bình đƣợc ni lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 25-28ºC 4-5 ngày Dịch nuôi đƣợc loại hệ sợi nấm bào tử nhờ ly tâm Phần dịch sau ly tâm đƣợc kiểm tra pH để đánh giá khả axit hóa mơi trƣờng 52 sinh tổng hợp axit hữu chủng nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần độc lập Đối với chủng nấm A niger, tiến hành nhỏ μl dịch bào tử (106 bào tử/ml) chủng nghiên cứu lên đĩa môi trƣờng tối thiểu MM (loại bỏ NaNO 3) bổ sung 2% bột môi trƣờng Mc Conkey để tạo màu 2% sữa gầy Đĩa đƣợc ủ nhiệt độ 28ºC, khoảng 2-3 ngày Khả axit hóa mơi trƣờng đƣợc đánh giá thơng qua vòng phân giải sữa hình thành đĩa [8] * Điều tra khả sinh kháng sinh kháng khuẩn nấm P chrysogenum Nuôi lắc ml bào tử nấm (106 bào tử/ml) chủng P chrysogenum VTCC F1172 (WT - wild type), chủng bị xóa gen laeA, chủng phục hồi chủng biểu mức 50 ml môi trƣờng kích thích sinh kháng sinh (APM), ngày, 200 vòng/phút 28ºC Ly tâm dịch nuôi để loại bỏ hệ sợi nấm Hút 50 μl dịch sau ly tâm nhỏ vào lỗ thạch đục đĩa môi trƣờng PDA cấy trải vi khuẩn Staphylococcus aureus Giữ đĩa nhiệt độ 4ºC từ 4-6 để kháng sinh khuếch tán, sau ủ đĩa qua đêm 37ºC để vi khuẩn S aureus sinh trƣởng Nhận biết khả sinh kháng sinh kháng khuẩn vòng suốt khơng có vi khuẩn mơi trƣờng xung quanh lỗ thạch nhỏ dịch nuôi nấm So sánh đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn chủng * Điều tra khả gây hỏng sau thu hoạch Điều tra khả gây hỏng sau thu hoạch với nấm P digitatum đƣợc tiến hành theo Zhang cộng (2013) [216, 217] Khả gây hỏng cam đặc tính quan trọng nấm P digitatum Kiểm tra khả gây hỏng chủng P digitatum cam: Đầu tiên, cam đƣợc làm nƣớc cất vơ trùng ethanol 70%, sau tạo vết xâm nhiễm tăm vô trùng Tiến hành lây nhiễm 10 µl dịch bào tử chủng P digitatum đột biến nồng độ 106 bào tử/ml lần lƣợt cam Cam sau lây nhiễm đƣợc giữ hộp kín vơ trùng 25oC Sau 2-6 ngày, quan sát khả gây hỏng chủng nghiên cứu Thí nghiệm lây nhiễm đƣợc tiến hành với 10 quả/chủng lặp lại lần độc lập 53 * Xác định số gen laeA phân tích biểu số gen điều hòa gen laeA real-time PCR DNA cDNA thu đƣợc từ chủng cần nghiên cứu đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 ng/µl Real-time PCR đƣợc sử dụng để xác định số lƣợng gen laeA mức độ biểu số gen đƣợc điều hòa gen laeA gồm gen citA, cbhB, eglA, eglB glaA với cặp mồi đặc hiệu (Phụ lục 3) Các thành phần phản ứng real-time PCR gồm: µl cDNA; µl mồi xi, µl mồi ngƣợc, 10 µl SYBR GREEN qPCR master mix, µl H2O Chu trình nhiệt nhƣ sau: 50°C phút, 95°C 10 phút; 40 chu kỳ 95°C 10 giây, 60°C 30 giây Phản ứng PCR thực hệ thống máy 7500 real-time PCR hãng Applied Biosystem (Mỹ) Gen gpdA mã hóa glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase đƣợc sử dụng làm gen nội chuẩn (reference gene) cho định lƣợng so sánh real-time PCR Phân tích mức độ biểu gen đích thơng qua kết thu đƣợc từ realtime PCR đƣợc thực theo Schmittgen cộng (2008) [157] dựa vào phần mềm tích hợp sẵn hệ thống máy real-time PCR Công thức quy đổi số đƣợc tính nhƣ sau [157]: 54 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT marker gen kháng kháng sinh A niger loài nấm phổ biến nghiên cứu di truyền vi nấm Việc chuyển gen vào loài nấm sợi đƣợc thực thành công từ sớm, ban đầu việc chuyển gen đƣợc thực qua tế bào trần [189] Tuy nhiên việc chuyển gen thơng qua tế bào trần đòi hỏi sử dụng hỗn hợp enzym đắt tiền để loại bỏ thành tế bào nấm quy trình thực yêu cầu nhiều thao tác phức tạp, mà phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đƣợc phát triển thành công cho nấm A niger [100] Đặc biệt chủng A niger N402 sử dụng nghiên cứu chủng chuẩn quốc tế, trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đƣợc thực thành công, nhiên hiệu chuyển gen chƣa đƣợc đề cập chi tiết [19, 43] Trong nghiên cứu này, hiệu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng vector nhị thể pGreen2 [186] chứa marker chọn lọc gen kháng kháng sinh hygromycin đƣợc tiến hành đánh giá (Hình 3.1A) Đầu tiên, chủng nấm A niger N402 đƣợc đánh giá khả mẫn cảm với kháng sinh hygromycin, loại kháng sinh đƣợc sử dụng làm marker chuyển gen loài nấm [135] Kết đánh giá mẫn cảm cho thấy, nồng độ kháng sinh hygromycin 100, 200 300 μg/ml hệ sợi nấm bị ức chế khơng hồn toàn, nhiên bào tử bị ức chế hồn tồn (Hình 3.1B) Với nồng độ kháng sinh hygromycin 300 μg/ml hệ sợi nấm bị ức chế mạnh nên nồng độ đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu chuyển gen Vector nhị thể pGreen2 đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 Quy trình chuyển gen vào A niger đƣợc thực theo công bố trƣớc 55 [19, 43] có thay đổi nhiệt độ đồng nuôi cấy Sau 60 đồng nuôi cấy, màng chuyển gen đƣợc chuyển qua môi trƣờng chọn lọc CD chứa hygromycin (300 μg/ml) cefotaxime (300 μg/ml) Sau 3-5 ngày 28ºC, khuẩn lạc nấm xuất đƣợc cấy qua đĩa môi trƣờng chọn lọc CD chứa kháng sinh hygromycin (300 μg/ml) để chọn lọc Hình 3.1 Chuyển gen vào A niger thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng marker gen kháng hygromycin (A) Cấu trúc vector pGreen2 (B) Khả mẫn cảm kháng sinh hygromycin chủng N402 (C) Kết chuyển gen nồng độ bào tử nhiệt độ đồng nuôi cấy khác 56 (D) Kết sàng lọc chủng nấm chuyển gen môi trƣờng CD chứa hygromycin (E) PCR xác nhận thể chuyển gen WT: A niger N402 M: kb DNA marker Kết chuyển gen cho thấy, với nhiệt độ đồng nuôi cấy 20 22 oC đĩa chuyển gen xuất khuẩn lạc riêng rẽ, nhiệt độ 24oC khuẩn lạc xuất dày khó phân tách thành khuẩn lạc riêng (Hình 3.1 C) Tuy nhiên, tỷ lệ khuẩn lạc kháng lại đƣợc hygromycin chiếm trung bình 34% sàng lọc môi trƣờng CD bổ sung hygromycin (300 μg/ml) (Hình 3.1 D) Đồng thời, chủng kháng hygromycin sau sàng lọc đƣợc kiểm tra PCR với hai cặp mồi đặc hiệu HPH-F/HPH-R GFP-F/GFP-R, kết cho thấy hệ gen chủng đƣợc tích hợp gen kháng hygromycin gen GFP (Hình 3.1E) Số khuẩn lạc xuất đĩa chuyển gen nhƣng khơng kháng hygromycin (dƣơng tính giả) chiếm tỷ lệ cao 66% Ngoài ra, nhận thấy nồng độ kháng sinh hygromycin dùng chuyển gen cao dẫn tới chi phí thực thí nghiệm lớn, nhƣợc điểm cần phải khắc phục Nhƣ vậy, việc chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng marker chọn lọc gen kháng hygromycin tỏ không hiệu với chủng A niger N402 3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao nấm P chrysogenum P digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh Nghiên cứu đƣợc tiến hành hai chủng nấm P chrysogenum VTCCF1172 P digitatum PdVN1 Chủng nấm P digitatum PdVN1 phân lập Việt Nam đƣợc định danh thơng qua đặc điểm hình thái, trình tự vùng ITS rDNA đƣợc đăng ký GenBank với mã số MF527231 (Phụ lục 4) 3.1.2.1 Tạo vector nhị thể dùng cho biểu gen DsRed GFP sử dụng marker kháng kháng sinh Trƣớc tiên, hai chủng nấm P chrysogenum VTCC-F1172 P digitatum PdVN1 đƣợc đánh giá mẫn cảm với ba kháng sinh bao gồm hygromycin, nourseothricin phleomycin đƣợc sử dụng thành công để chuyển gen nhiều loài nấm sợi khác Kết thu đƣợc cho thấy, chủng nấm P chrysogenum VTCC-F1172 bị ức chế hai kháng sinh nourseothricin (ở nồng độ 50 μg/ml) 57 phleomycin (ở nồng độ 200 μg/ml) Đối với chủng nấm P digitatum PdVN1 bị ức chế hoàn toàn ba loại kháng sinh (với kháng sinh hygromycin nourseothricin bị ức chế nồng độ 50 μg/ml, với kháng sinh phleomycin 150 μg/ml) (Phụ lục 5, 6, 7) Các nồng độ kháng sinh ức chế hoàn toàn sinh trƣởng chủng nấm đƣợc sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen vào P chrysogenum P digitatum Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra vector pPK2-Red, pGreen3 pPK2-Red2 cắt với enzym giới hạn (A) Vector pPK2-Red cắt kiểm tra vector enzym StuI; (B) Vector pGreen3 cắt kiểm tra vector enzym KpnI; (C) Vector pPK2-Red2 kết cắt kiểm tra enzym StuI M: kb DNA marker Để kiểm tra tính khả thi ba loại kháng sinh hygromycin, nourseothricin phleomycin dùng chuyển gen nấm P chrysogenum VTCC-F1172 P digitatum PdVN1, ba vector nhị thể đƣợc tạo mang ba cấu trúc gen kháng ba loại kháng sinh dƣới điều hòa kiểm sốt promoter gpdA trpC từ A nidulans Ba vector đƣợc tạo bao gồm: vector pPK2-Red chứa gen kháng 58 hygromycin biểu gen DsRed; vector pGreen3 mang gen kháng nourseothricin biểu gen GFP vector pPK2-Red2 mang gen kháng phleomycin biểu gen DsRed (Hình 3.2) Cấu trúc vector sau tạo đƣợc cắt kiểm tra enzym cắt giới hạn StuI, KpnI StuI tƣơng ứng Kết cắt kiểm tra nhƣ tính tốn lý thuyết, nhƣ ba cấu trúc vector đƣợc tạo thành công Các vector đƣợc biến nạp vào chủng A tumefaciens AGL1 đƣợc xác nhận PCR với cặp mồi đặc hiệu (Phụ lục 30) 3.1.2.2 Tối ưu quy trình chuyển gen nấm P chrysogenum P digitatum thông qua vi khuẩn A tumefaciens Phƣơng pháp ATMT đƣợc thực thành cơng nhiều lồi nấm sợi, có lồi nấm P digitatum gây hỏng có múi sau thu hoạch Tuy nhiên hiệu chuyển gen chủng P digitatum Pd01 đạt đƣợc 60 thể chuyển gen/106 bào tử [199] Nhƣ hiệu chuyển gen loài nấm cần phải cải tiến Năm 2008, toàn hệ gen nấm P chrysogenum đƣợc giải trình tự, điều gợi mở nhiều hƣớng nghiên cứu loài nấm [193] Để thực nghiên cứu cải biến di truyền nấm P chrysogenum nhƣ biểu protein/enzym, nghiên cứu chức gen thơng qua xóa gen việc xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen hiệu cao loài nấm cần thiết Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp chuyển gen vào chủng P digitatum PdVN1 sử dụng hygromycin nourseothricin cho chọn lọc thể chuyển gen đƣợc cải tiến Để thiết lập đƣợc quy trình chuyển gen hiệu cao nấm P chrysogenum, chủng nấm VTCC-F1172 đƣợc tiến hành chuyển gen sử dụng vector pGreen3 mang gen kháng nourseothricin biểu gen GFP dựa quy trình tối ƣu thiết lập cho nấm P digitatum PdVN1 Kết nghiên cứu cho thấy, thay đổi số điều kiện chuyển gen ảnh hƣởng lớn tới hiệu chuyển gen chủng P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 gồm: nồng độ bào tử nấm, thời gian đồng nuôi cấy, nhiệt độ đồng nuôi cấy nồng độ acetosyringon (AS) Kết nghiên cứu phù hợp với công bố trƣớc yếu tố ảnh hƣởng tới trình chuyển gen 59 ATMT vào nhiều loài nấm khác [43, 114, 214] Hợp chất phenolic AS cần thiết để kích hoạt hiểu gen vir cần thiết cho trình vận chuyển tích hợp T-DNA vào hệ gen nấm [32, 114] Nồng độ AS thay đổi từ 50-200 μM làm tăng đáng kể hiệu chuyển gen Ngoài ra, nồng độ bào tử, thời gian, nhiệt độ đồng nuôi cấy ảnh hƣởng tới hiệu chuyển gen hai loài nấm Theo nghiên cứu trƣớc đây, nhiệt độ đồng nuôi cấy sử dụng phƣơng pháp ATMT cho loại nấm thƣờng dao động từ 22-25oC [43, 114, 124] Kết nghiên cứu dải nhiệt độ chuyển gen nấm P digitatum rộng hơn, từ 20-28oC Tuy nhiên, nấm P chrysogenum thực chuyển gen dải nhiệt độ từ 20-25oC Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện thích hợp cho chuyển gen vào chủng P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 nồng độ AS 200 μM, nồng độ bào tử 106 bào tử/ml, nhiệt độ đồng nuôi cấy 25oC (đối với nấm P digitatum) 22oC (đối với nấm P chrysogenum), thời gian đồng nuôi cấy 72 (đối với nấm P digitatum) 60 (đối với nấm P chrysogenum) (Hình 3.3 Phụ lục 8) 60 Hình 3.3 Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P chrysogenum P digitatum Ở nấm P digitatum, với điều kiện chuyển gen thích hợp bao gồm nồng độ bào tử 106 bào tử/ml, nhiệt độ đồng nuôi cấy 25°C, thời gian đồng nuôi cấy 72 nồng độ AS 200 μM, hiệu suất chuyển gen cao, trung bình đạt 1240 ± 165 thể chuyển gen Hiệu chuyển gen với quy trình thiết lập cao 20 lần so với công bố trƣớc chủng Pd01 Wang Li (2008) Các tác giả sử dụng chủng Pd01 với thời gian đồng nuôi cấy 48 cho nghiên cứu chuyển gen [199] Nhƣ vậy, khác biệt chủng nghiên cứu, việc tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 72 làm tăng hiệu chuyển gen nấm P digitatum Ngoài ra, kết nghiên cứu cho thấy loại màng khác đƣợc sử dụng chuyển gen bao gồm giấy lọc cellulose (mã số: FT-3-303-085 FT-3-303-090, Sartorius) Miracloth (Calbiochem) dẫn đến hiệu chuyển gen khác Với phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens tối ƣu, thu đƣợc 1240 ± 165 thể chuyển gen 106 bào tử với màng giấy lọc, nhƣng có 600 ± 79 thể chuyển gen 106 bào tử với màng Miracloth (Phụ lục 9) Hơn nữa, nghiên cứu tiến hành đánh giá hiệu chuyển gen vào chủng PdVN1 thông qua vi khuẩn A tumefaciens với loại màng giấy lọc khác (Double Ring Qualitative Filter Paper, Grade: FAST 101, CAT No: 99-191-110) từ GE Healthcare (Illinois, Mỹ) thu đƣợc 20-30 thể chuyển gen 106 bào tử Nhƣ loại màng đƣợc sử dụng cho chuyển gen P digitatum ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu chuyển gen Trƣớc đây, chƣa có công bố đề cập tới việc ảnh hƣởng loại màng tới hiệu suất trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Để đánh giá hiệu chuyển gen quy trình chuyển gen thiết lập chủng khác loài P digitatum, nghiên cứu sử dụng chủng khác Việt Nam P digitatum N11 Chủng nấm đƣợc phân lập từ vùng trồng cam tỉnh Tuyên Quang phía bắc Việt Nam đƣợc cung cấp Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chủng N11 đƣợc kiểm tra khả gây hỏng cam kết cho thấy chủng có khả lây nhiễm gây hỏng cam (Phụ lục 10A) Quan trọng hơn, kết nghiên cứu 61 chứng minh quy trình thiết lập cho hiệu chuyển gen cao chủng N11 Hiệu chuyển gen chủng N11 đạt 1037 ± 76 thể chuyển gen 106 bào tử (Phụ lục 10B, C, D) Nhƣ vậy, quy trình chuyển gen thiết lập cho hiệu cao với chủng P digitatum khác Với nấm P chrysogenum, kết nghiên cứu rằng, với điều kiện chuyển gen bao gồm nhiệt độ đồng nuôi cấy 22°C, thời gian đồng nuôi cấy 60 giờ, nồng độ bào tử 106 bào tử/ml nồng độ AS 200 μM, hiệu suất chuyển gen cao, trung bình đạt 5090 ± 96 thể chuyển gen/106 bào tử So với quy trình chuyển gen vào nấm P chrysogenum cơng bố, quy trình chuyển gen nghiên cứu thiết lập có thay đổi tồn thơng số quan trọng gồm nồng độ bào tử, nhiệt độ thời gian đồng nuôi cấy nhƣ loại màng sử dụng cho chuyển gen Bởi vậy, hiệu chuyển gen tăng gấp 10 lần so với công bố trƣớc chủng nấm P chrysogenum DS17690 [42] Nhƣ nghiên cứu thiết lập đƣợc quy trình chuyển gen hiệu cao cho chủng nấm P digitatum PdVN1 chủng P chrysogenum VTCCF1172 (Hình 3.3) 3.1.2.3 Biểu thành cơng gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed xanh GFP nấm P digitatum P chrysogenum Với loài nấm gây bệnh, việc nghiên cứu tạo chủng nấm mơ hình chun biệt cho nghiên cứu chế xâm nhiễm nhƣ gây bệnh đƣợc nhà khoa học quan tâm Một cách thức tiếp cận tạo chủng nấm biểu loại protein thị, protein huỳnh quang đƣợc sử dụng phổ biến Gen DsRed GFP mã hóa protein huỳnh quang đỏ xanh đƣợc biểu bốn loài nấm Leptosphaeria maculans, L biglobosa, Oculimacula yallundae O acuformis nhằm mục đích nghiên cứu xâm nhiễm tƣơng tác nấm bệnh vật chủ [53] Trong nghiên cứu này, nhằm thiết lập chủng P digitatum PdVN1 nhƣ mơ hình nghiên cứu q trình xâm nhiễm nấm bệnh có múi, hai gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ xanh DsRed GFP đƣợc biểu P digitatum PdVN1 62 Hình 3.4 Biểu gen huỳnh quang DsRed GFP P digitatum PdVN1 (A) Sáu thể chuyển gen DsRed (R1-R6) (B) sáu thể chuyển gen GFP (G1-G6) đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang Biểu gen DsRed, GFP nấm P digitatum PdVN1 cách sử dụng vector nhị thể pPK2-Red pGreen3 Các thể chuyển gen đƣợc chọn lọc môi trƣờng PDA chứa hygromycin/nourseothricin (50 μg/ml) quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, kết cho thấy tất thể chuyển gen thu đƣợc phát tín hiệu huỳnh quang rõ nét (Hình 3.4) Xác nhận PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu HPH-F/HPH-R, DsRed-F/DsRed-R, GFP-F/GFP-R NAT-F/NAT-R (Phụ lục 3) chứng minh T-DNA chủng nấm kiểm tra mang gen DsRed/GFP gen kháng hygromycin/nourseothricin (Phụ lục 11) Nhƣ vậy, gen DsRed GFP đƣợc biểu thành công chủng nấm P digitatum PdVN1 Xét mặt biểu tín hiệu dƣới kính hiển vi huỳnh quang, chủng nấm biểu gen DsRed GFP cho tín hiệu rõ nét, đặc điểm quan trọng để sử dụng chủng nghiên cứu tƣơng tác với vật chủ Tƣơng tự chủng nấm P chrysogenum VTCC-F1172 chuyển gen GFP, năm thể chuyển gen GFP (từ Pc-G1 tới Pc-G5) đƣợc tiến hành PCR kiểm tra xác nhận 63 hai cặp mồi GFP-F/GFP-R NAT-F/NAT-R Kết PCR cho thấy gen GFP gen kháng nourseothricin đƣợc tích hợp gen thể chuyển gen kiểm tra Đồng thời, kết soi tiêu hệ sợi dƣới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy gen GFP đƣợc biểu thành công chủng nấm VTCC-F1172 thơng qua tín hiệu huỳnh quang xanh thu đƣợc (Hình 3.5) Điều chứng minh hệ thống chuyển gen thiết lập nấm P chrysogenum cho hiệu biểu gen tốt Tuy gen GFP đƣợc biểu nấm P chrysogenum nhờ chuyển gen vào tế bào trần [14, 93], nhƣng nghiên cứu này, gen GFP đƣợc biểu thành công nấm P chrysogenum phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Nhƣ vậy, nghiên cứu chứng minh hồn tồn sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens cho biểu protein tái tổ hợp nấm P chrysogenum Hình 3.5 Xác nhận biểu gen GFP P chrysogenum VTCC-F1172 Pc-G1 - Pc-G5: Năm thể chuyển gen GFP kết xác nhận PCR sử dụng cặp mồi NAT-F/NAT-R GFP-F/GFP-R Vector pGreen3 đƣợc sử dụng cho mẫu dƣơng (+) M: kb DNA marker 64 Đặc biệt nghiên cứu này, gen kháng phleomycin đƣợc chứng minh marker hiệu cho chuyển gen biểu gen nấm P chrysogenum P digitatum Vector pPK2-Red2 đƣợc sử dụng cho chuyển gen vào chủng nấm P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 theo quy trình tối ƣu Kết chuyển gen chủng nấm PdVN1 cho 1133 ± 124 thể chuyển gen/106 bào tử cao 18 lần so với công bố Wang Li (2008) [199], chủng nấm VTCC-F1172 đạt 4646 ± 325 thể chuyển gen/106 bào tử cao lần so với công bố de Boer cộng (2013) [42] Một số thể chuyển gen đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên để tiến hành kiểm tra PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, kết PCR chứng minh gen kháng phleomycin gen DsRed đƣợc tích hợp vào hệ gen nấm (Phụ lục 12, 13) Đồng thời, thể chuyển gen đƣợc tiến hành làm tiêu quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, kết cho thấy tất thể chuyển gen phát huỳnh quang màu đỏ rõ nét (Hình 3.6) Hình 3.6 Biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker gen kháng phleomycin P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 (A) P digitatum PdVN1 (B) P chrysogenum VTCC-F1172 Từ kết chuyển gen vào hai chủng P digitatum PdVN1 P chrysogenum VTCC-F1172 sử dụng vector pPK2-Red2 cho thấy, gen kháng 65 phleomycin marker hiệu cho biểu gen nấm P digitatum P chrysogenum Gen kháng phleomycin chƣa đƣợc công bố dùng cho chuyển gen nấm P digitatum đƣợc công bố khơng thích hợp cho chuyển gen vào nấm P chrysogenum [42], nhƣng nghiên cứu chứng minh với quy trình chuyển gen tối ƣu, gen kháng phleomycin marker hiệu cho chuyển gen vào hai chủng nấm Đây marker có nhiều triển vọng cho nghiên cứu biểu gen, xóa gen hai loài nấm sợi Ngoài ra, nghiên cứu tối ƣu quy trình chuyển gen vào hai chủng PdVN1 VTCC-F1172 thu đƣợc chủng đột biến chèn T-DNA q trình chuyển gen chúng đƣợc sử dụng để sàng lọc đột biến liên quan tới thay đổi kiểu hình, khơng giảm gây hỏng thay đổi sinh tổng hợp kháng sinh Trong trình chuyển gen DsRed vào chủng P digitatum PdVN1 thu đƣợc thể đột biến trắng P digitatum R12 Chủng đột biến hình thành hệ sợi nấm màu trắng khơng có cấu trúc sinh sản vơ tính nhƣ cuống sinh bào tử Đặc biệt chủng hoàn toàn khả gây hỏng cam sau thu hoạch (Phụ lục 14) Trong chuyển gen GFP vào chủng P chrysogenum VTCC-F1172 thu đƣợc ba thể đột biến có kiểu hình thay đổi khác biệt so với chủng tự nhiên gồm chủng F1172-XN, F1172-T F1172-V Chủng đột biến F1172-XN sinh trƣởng hình thành sợi nấm màu xanh vàng nhạt, cấu trúc sinh bào tử bị biến đổi Chủng đột biến F1172-T có hệ sợi nấm màu trắng, chủng đột biến F1172-V hình thành hệ sợi màu vàng nhạt, chủng đột biến khơng hình thành cấu trúc sinh sản vơ tính nhƣ cuống sinh bào tử Đặc biệt hai chủng đột biến F1172-V F1172-T bị giảm khả sinh kháng sinh kháng vi khuẩn kiểm định S aureus (Phụ lục 15) Bƣớc đầu nhận định trình chuyển gen DsRed, GFP, gen chuyển nằm vùng T-DNA đƣợc chèn ngẫu nhiên vào gen liên quan tới biệt hóa hình thái, khả gây hỏng cam, khả sinh kháng sinh chủng nấm dẫn tới bất hoạt gen Điều mở hƣớng nghiên cứu tiếp 66 theo nhằm điều tra chi tiết vai trò gen bị sai hỏng thể đột biến Một cách thức đƣợc sử dụng để xác định gen bị hỏng chèn TDNA kỹ thuật TAIL-PCR [118, 199] 3.1.2.4 Sử dụng chủng chuyển gen DsRed GFP cho nghiên cứu xâm nhiễm nấm P digitatum vào có múi Protein huỳnh quang đỏ DsRed protein huỳnh quang xanh GFP đƣợc sử dụng để trực quan hóa nhiều tƣơng tác khác q trình xâm nhiễm nấm vật chủ [33, 53, 68] Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng mang gen mã hóa protein huỳnh quang xanh đỏ P digitatum PdVN1 có khả nhiễm làm hỏng cam (Hình 3.7) Tuy nhiên, tín hiệu huỳnh quang DsRed bị can thiệp màu đỏ lớp vỏ cam Do đó, chủng nấm biểu gen DsRed khó để quan sát xâm nhiễm (Hình 3.7A) Ngƣợc lại, tín hiệu huỳnh quang GFP rõ ràng cho việc quan sát xâm nhiễm nấm lên cam (Hình 3.7B) Vì vậy, GFP protein huỳnh quang hiệu việc nghiên cứu trình xâm nhiễm nấm P digitatum PdVN1 có múi Hình 3.7 Sự xâm nhiễm nấm P digitatum PdVN1 mang gen DsRed GFP cam dƣới kính hiển vi huỳnh quang (A) Chủng nấm xâm nhiễm mang gen DsRed (B) Chủng nấm xâm nhiễm mang gen GFP 67 3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum Hiện nay, việc chuyển gen sử dụng marker gen trợ dƣỡng đƣợc chứng minh hiệu nhiều loài nấm sợi Sử dụng marker trợ dƣỡng có ƣu điểm an tồn giảm chi phí q trình chuyển gen không cần sử dụng chất kháng sinh Hiện chƣa có cơng bố đề cập tới việc thiết lập hệ thống chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens với marker gen pyrG cho nấm sợi A niger P chrysogenum Gen pyrG liên quan đến trình sinh tổng hợp uridine/uracil cần thiết cho sống nấm Trong hệ gen A niger P chrysogenum, gen pyrG có nhất, thuận lợi cho việc loại bỏ gen để tạo thể đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil Hơn nữa, theo kết đánh giá hiệu việc chuyển gen sử dụng marker chọn lọc gen kháng hygromycin tỏ không hiệu với chủng A niger N402 Điều đòi hỏi cần phải phát triển hệ thống chuyển gen hiệu hơn, khắc phục đƣợc nhƣợc điểm phƣơng pháp chuyển gen dùng kháng sinh chọn lọc Trong nghiên cứu này, nấm P digitatum không nghiên cứu tạo hệ thống chuyển gen trợ dƣỡng pyrG lồi nấm gây hỏng Các nghiên cứu tập trung vào điều tra vai trò gen liên quan tới khả gây hỏng mà tiến hành xóa gen pyrG ảnh hƣởng tới khả sinh trƣởng dẫn tới khó xác định đƣợc vai trò gen điều tra liên quan tới khả gây hỏng 3.2.1 Tạo thành công chủng A niger N402 P chrysogenum VTCCF1172 đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil 3.2.1.1 Tạo vector xóa gen pyrG A niger P chrysogenum Gen pyrG mã hóa enzym OMP decarboxylase tham gia vào trình sinh tổng hợp uridine/uracil, hợp chất quan trọng trình sinh trƣởng phát triển nấm sợi Các chủng đột biến hỏng gen pyrG khơng có khả tổng hợp uridine/uracil [160] Vector xóa gen pyrG A niger P chrysogenum đƣợc thể Hình 3.8 68 Hình 3.8 Cấu trúc xóa gen pyrG A niger P chrysogenum (A) Vector xóa gen pyrG A niger (B) Vector xóa gen pyrG P chrysogenum Để xóa gen pyrG nấm sợi A niger, vector nhị thể với vùng T-DNA mang gen pyrG bị loại bỏ phần ORF đƣợc tạo Cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc tạo dựa cấu trúc vector pKO2.0.1 Gen pyrG nguyên gốc sau đƣợc khuếch đại cặp mồi AnpyrG-P1/AnpyrG-P2 đƣợc tiến hành xử lý với enzym XbaI Sản phẩm sau cắt đƣợc nối vào vector pKO2.0.1 đƣợc cắt hai enzym EcoRV XbaI để tạo vector pKO2AnpyrG Vector pKO2AnpyrG đƣợc cắt bỏ đoạn 564 bp khung đọc mở enzym giới hạn BamHI EcoRV để tạo thành vector xóa pKO2AnpyrG Cấu trúc xóa gen pyrG sau đƣợc xác nhận cắt kiểm tra với enzym giới hạn XhoI (có trình tự nhận biết hai đầu gen pyrG) Kết điện di gel agarose 0,8% cho thấy kích thƣớc sản phẩm thu đƣợc từ vector xóa 1,79 kb, nhỏ 564 bp so với kích thƣớc đoạn 2,35 kb cắt từ vector mang gen pyrG ngun gốc, nhƣ tính tốn lý thuyết (Hình 3.8 Phụ lục 16) Nhƣ cấu trúc xóa gen pyrG đƣợc tạo thành cơng Tƣơng tự, để xóa gen pyrG P chrysogenum, gen pyrG chủng P chrysogenum VTCC-F1172 sau đƣợc khuếch đại cặp mồi PcpyrG-delF/PcpyrG-del-R đƣợc cắt với enzym XbaI Sản phẩm sau cắt đƣợc nối vào vector pKO2.0.1 đƣợc cắt enzym EcoRV XbaI để tạo vector pKO2PcpyrG Vector pKO2PcpyrG đƣợc cắt enzym StuI để loại bỏ đoạn 0,999 kb gen pyrG Vector đƣợc đặt tên pKO2ΔPcpyrG đƣợc xác nhận cắt kiểm tra với enzym EcoRI EcoRV Kết điện di cho thấy kích thƣớc sản phẩm thu 69 đƣợc nhƣ tính tốn lý thuyết (Hình 3.8 Phụ lục 17) Nhƣ vậy, cấu trúc xóa gen pyrG P chrysogenum đƣợc tạo thành cơng 3.2.1.2 Xóa gen pyrG A niger P chrysogenum sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Để xóa gen pyrG hệ gen A niger P chrysogenum, vector xóa pyrG (pKO2AnpyrG pKO2ΔPcpyrG) đƣợc tiến hành chuyển vào chủng A tumefaciens AGL1 phƣơng pháp xung điện Các khuẩn lạc xuất môi trƣờng chọn lọc đƣợc xác nhận PCR với cặp mồi đặc hiệu (Phụ lục 30) Quy trình xóa gen đƣợc thực dựa quy trình xóa gen pyrG A oryzae [123] với điều chỉnh số thông số cho phù hợp với A niger P chrysogenum Các thông số thay đổi bao gồm: nhiệt độ đồng nuôi cấy 22oC, kéo dài 60 giờ, mơi trƣờng chọn lọc CD có bổ sung 5-FOA, 0,1% uridine 0,1% uracil Cấu trúc xóa gen pyrG mang T-DNA gồm đoạn 5’, ORF (đã bị cắt ngắn) 3’ gen pyrG nối liền kề đƣợc chuyển vào A niger P chrysogenum phƣơng pháp ATMT Sự trao đổi chéo theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng TDNA locus gen pyrG dẫn đến việc xóa bỏ gen pyrG Sơ đồ trao đổi chéo xóa gen pyrG A niger đƣợc mơ tả cụ thể Hình 3.9A 70 Hình 3.9 Xác nhận chủng xóa gen pyrG A niger N402 (A) Sơ đồ trao đổi chéo vị trí cặp mồi dùng để xác nhận chủng xóa gen (B) Kiểm tra khả khuyết dƣỡng uridine/uracil kháng 5-FOA chủng nấm chuyển gen (C) PCR xác nhận xóa gen pyrG Đối chứng âm sử dụng nƣớc cất vô trùng WT: sử dụng DNA chủng N402 M: kb DNA marker Sau ngày, môi trƣờng chọn lọc CD pH 5,5 + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2% 5-FOA, số khuẩn lạc kháng 5-FOA xuất Các khuẩn lạc nấm kháng 5-FOA (Chủng M1, M2, M3, M4, M5 M6) đƣợc cấy chuyển đồng thời sang ba môi trƣờng CD; CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil + 0,2% 5-FOA sử dụng chủng tự nhiên A niger N402 (WT) làm đối 71 chứng Kết cho thấy, chủng chuyển gen kháng 5-FOA thu đƣợc sinh trƣởng môi trƣờng tối thiểu mà sinh trƣởng phát triển có bổ sung thêm uridine/uracil (Hình 3.9B) Để khẳng định xác chủng kháng 5-FOA thu đƣợc có phải chủng đột biến xóa gen pyrG hay khơng, chủng nêu đƣợc tiến hành tách chiết DNA hệ gen kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu AnpyrG-P3/AnpyrGORF-R (Phụ lục 3) Do mồi AnpyrG-P3 gắn vào vùng ORF bị loại bỏ nên sản phẩm PCR thu đƣợc băng DNA với chủng tự nhiên 0,73 kb, chủng xóa gen pyrG khơng xuất băng DNA Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng M1, M2 M3 chủng đột biến xóa gen pyrG Các chủng M4, M5, M6 kháng 5-FOA khuyết dƣỡng uridine/uracil nhƣng gen pyrG nguyên vẹn giống với chủng tự nhiên (Hình 3.9C) Có thể chủng M4, M5, M6 trình chuyển gen, T-DNA chèn ngẫu nhiên làm hỏng gen liên quan đến q trình sinh tổng hợp uridine/uracil Ngồi ra, chủng M1, M2, M3 tiếp tục đƣợc kiểm tra PCR với cặp mồi AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-ORF-R AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P4 (Phụ lục 3) Cặp mồi AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-ORF-R khuếch đại ORF gen pyrG, với chủng tự nhiên cho băng 1,05 kb, chủng đột biến lên băng 0,48 kb Cặp mồi AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P4 đƣợc sử dụng để khẳng định đoạn gen bị xóa nằm locus gen pyrG, mồi AnpyrG-P4 gắn vào vùng 3’ pyrG nằm ngồi trình tự tạo cấu trúc xóa Kết cho thấy, chủng đột biến lên băng 1,52 kb, nhỏ 564 bp so với chủng tự nhiên 2,08 kb (Hình 3.9C) Với kết thu đƣợc cho thấy chủng M1, M2 M3 bị xóa gen pyrG theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng Thực quy trình tƣơng tự để xóa gen pyrG chủng chuẩn quốc tế khác A niger CBS 113.46 Từ kết kiểm tra khả khuyết dƣỡng uridine/uracil, kháng 5-FOA kết PCR với cặp mồi AnpyrG-P3/AnpyrGORF-R, AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-ORF-R AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-P4 (Phụ lục 18) cho thấy xóa thành cơng gen pyrG chủng CBS 113.46 72 Các thí nghiệm xóa gen pyrG chủng (A niger N402 CBS 113.46) đƣợc thực lặp lại lần độc lập Tất thể chuyển gen thu đƣợc đƣợc kiểm tra khả khuyết dƣỡng uridine/uracil xác nhận PCR với cặp mồi AnpyrG-P3/AnpyrG-ORF-R, AnpyrG-ORF-F/AnpyrG-ORF-R AnpyrGORF-F/AnpyrG-P4 Kết thu đƣợc cho thấy, phƣơng pháp chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens với vector nhị thể pKO2AnpyrG cho hiệu xóa gen pyrG nấm sợi A niger đạt tới 50% Các chủng đột biến khuyết dƣỡng uridine/uracil thu đƣợc sử dụng cho nghiên cứu biểu gen loài nấm sợi Trƣớc đây, việc xóa gen pyrG A niger đƣợc thực thành công phƣơng pháp gây đột biến nhờ tia UV xóa gen sử dụng phƣơng pháp chuyển gen tế bào trần [127, 195] Tuy nhiên, việc sử dụng tia UV thƣờng tạo nhiều đột biến vị trí khác nên khó để kiểm soát cấu trúc di truyền thể đột biến xóa gen [102] Xóa gen tế bào trần tốn hóa chất enzym đắt tiền, quy trình thực gồm nhiều bƣớc phức tạp [190] Với kết nghiên cứu đạt đƣợc cho thấy việc xóa gen pyrG sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đơn giản so với hai phƣơng pháp trên, dễ dàng tạo đƣợc đột biến đích theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng với hiệu suất cao Hình 3.10 Khả khuyết dƣỡng uridine/uracil kháng 5-FOA chủng P chrysogenum chuyển gen xóa pyrG Với quy trình tƣơng tự tiến hành xóa thành cơng gen pyrG chủng P chrysogenum VTCC-F1172 Các chủng nấm thu đƣợc sau chuyển gen khuyết dƣỡng uridine/uracil (chỉ có khả sinh trƣởng mơi trƣờng bổ sung uridine/uracil) (Hình 3.10) Đồng thời chủng đƣợc tiến hành nuôi hệ sợi 73 tách chiết DNA hệ gen sau kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu để khẳng định xóa thành cơng gen pyrG P chrysogenum VTCC-F1172 (Phụ lục 19) Gần đây, việc nghiên cứu xóa gen pyrG số loài nấm sợi nhƣ Alternaria alternata A oryzae đƣợc thực thành công [123, 204] Tuy nhiên nay, chƣa có cơng bố thực xóa gen pyrG nấm sợi P chrysogenum Trong nghiên cứu này, gen pyrG đƣợc xóa thành cơng nấm P chrysogenum Chủng nấm xóa gen pyrG đƣợc xác định đối tƣợng cho nghiên cứu nhằm thiết lập hệ thống chuyển gen không sử dụng marker kháng kháng sinh mà đảm bảo hiệu mức tốt 3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil Gen DsRed gen thị huỳnh quang đƣợc sử dụng phổ biến chuyển gen nấm đƣợc biểu thành cơng nhiều lồi nấm khác [54, 71, 97, 120] Các tế bào nhận đƣợc gen DsRed có màu đỏ dƣới kính hiển vi huỳnh quang với bƣớc sóng phù hợp Chính vậy, nghiên cứu gen DsRed đƣợc lựa chọn làm gen thị cho tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger khuyết dƣỡng uridine/uracil sử dụng phƣơng pháp ATMT 3.2.2.1 Tạo vector pEX2A biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker pyrG từ A niger Để tạo vector pEX2A, gen pyrG A niger sau đƣợc khuếch đại cặp mồi AnpyrG-P1/AnpyrG-P2 (Phụ lục 3), đƣợc xử lý với hai enzym XbaI EcoRI Sau tinh sạch, đoạn cắt đƣợc gắn vào khung vector pEX2 [124] đƣợc xử lý trƣớc enzym giới hạn EcoRI SpeI Vector pEX2A sau tạo thành mang cấu trúc biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed với marker gen trợ dƣỡng pyrG từ A niger (Hình 3.11A) Vector pEX2A đƣợc cắt kiểm tra enzym XhoI có trình tự nhận biết nằm gen pyrG A niger (Phụ lục 31) trình tự nhận biết nằm khung vector pEX2 Kết kiểm tra sản phẩm cắt thu đƣợc ba băng có kích thƣớc 1,24 kb; 2,35 kb 8,29 kb (Hình 3.11B) Kết phù hợp với tính toán lý thuyết, nhƣ vector pEX2A đƣợc tạo thành cơng 74 Hình 3.11 Cấu trúc cắt kiểm tra vector pEX2A enzym giới hạn (A) Cấu trúc vector pEX2A (B) Kết cắt kiểm tra pEX2A enzym XhoI 3.2.2.2 Tối ưu quy trình chuyển gen vào A niger P chrysogenum khuyết dưỡng uridine/uracil Chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens phƣơng pháp đơn giản cho hiệu cao, nhiên hiệu chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ nồng độ bào tử, nhiệt độ, thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS)… Với loài, cần quy trình tối ƣu để đạt đƣợc hiệu suất chuyển gen mong muốn Trong nghiên cứu này, dựa quy trình chuyển gen trợ dƣỡng cơng bố loài A oryzae [123], ảnh hƣởng số yếu tố nhƣ nồng độ bào tử, nồng độ uridine/uracil, nồng độ AS, thời gian bổ sung AS tới hiệu chuyển gen vào A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil đƣợc xác định Chủng A tumefaciens AGL1 mang vector pEX2A (Phụ lục 30) đƣợc sử dụng để tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger Chủng A tumefaciens AGL1 mang vector pKO2PcpyrG đƣợc sử dụng để tối ƣu quy trình chuyển gen vào P chrysogenum Trộn 100 µl dịch vi khuẩn đƣợc cảm ứng với 100 µl dịch bào tử Hỗn hợp đƣợc trải màng cellulose đặt môi trƣờng cảm ứng (IM+ 0,02% uridine, IM + 0,02% uracil; IM + 0,01% uridine + 0,01% uracil IM + 0,02% uridine + 0,02% uracil) bổ sung AS (0/100/200/300/400 µM), đồng ni cấy hộp tối 75 20°C/22°C/24°C 60 Sau màng cellulose đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung cefotaxime (300 mg/l) Sau ủ đĩa 5-7 ngày 25-28°C, đĩa môi trƣờng chọn lọc xuất khuẩn lạc nấm chuyển gen Từ kết thu đƣợc cho thấy, nồng độ bào tử cho chuyển gen 106 bào tử/ml, đồng nuôi cấy 22°C môi trƣờng IM bổ sung 0,02% uridine 0,02 % uracil, IM giai đoạn cảm ứng bổ sung 200 µM AS cho hiệu chuyển gen cao A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil (Phụ lục 20) Ở điều kiện A niger, số thể chuyển gen thu đƣợc 2212 ± 336 thể chuyển gen/106 bào tử Sử dụng quy trình chuyển gen tối ƣu tiến hành chuyển gen thành công chủng CBS 113.46 khuyết dƣỡng uridine/uracil Với quy trình trên, hiệu chuyển gen thể vƣợt trội so với công bố trƣớc sử dụng phƣơng pháp chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens nhiều loài nấm sợi nhƣ A awamori (400 thể chuyển gen/106 bào tử), Trichoderma reesei (1020 thể chuyển gen/105 bào tử), A oryzae (1060 thể chuyển gen/106bào tử) [113, 123, 218] Đặc biệt, hiệu chuyển gen quy trình tối ƣu cao nhiều so sánh với hiệu chuyển gen sử dụng marker chọn lọc gen kháng kháng sinh (83 thể chuyển gen/107 bào tử) [100] Việc sử dụng marker pyrG chuyển gen vào A niger đƣợc thực thành công tế bào trần với hiệu 400 khuẩn lạc/107 tế bào trần [195] Quy trình chuyển gen tối ƣu đƣợc thiết lập nghiên cứu cho hiệu cao nhiều so với phƣơng pháp sử dụng tế bào trần [195] Đây nghiên cứu chuyển gen thành công A niger khuyết dƣỡng uridine/uracil sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Trong với P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil, với điều kiện thích hợp nhƣ trên, hiệu chuyển gen đạt 1750 ± 281 thể chuyển gen/106 bào tử Hiệu hệ thống chuyển gen trợ dƣỡng uridine/uracil thiết lập cao so với phƣơng pháp chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh công bố nấm P chrysogenum (đạt 507 thể chuyển gen/106 bào tử) [42] Hiệu hệ thống chuyển gen trợ dƣỡng uridine/uracil nấm P chrysogenum nghiên cứu đƣợc thể so sánh với loài nấm khác sử dụng phƣơng pháp 76 chuyển gen dùng marker chọn lọc gen kháng kháng sinh thu đƣợc 148 thể chuyển gen/107 bào tử loài Kabatiella zeae 60 thể chuyển gen/106 bào tử loài A flavus [65, 173] Gần đây, với phát triển công cụ chỉnh sửa gen, CRISPR/Cas9 trở thành phƣơng pháp đầy hứa hẹn cho kỹ thuật di truyền Một công bố Pohl Carsten cộng sử dụng thành công phƣơng pháp để chỉnh sửa gen nấm sợi P chrysogenum Tuy nhiên, theo nhƣ cơng bố, phƣơng pháp đòi hỏi thực lồi nấm tạo đƣợc tế bào trần, kỹ thuật đòi hỏi nhiều thời gian chi phí [141] Nhƣ vậy, việc chuyển gen vào nấm P chrysogenum sử dụng hệ thống trợ dƣỡng uridine/uracil đơn giản cho hiệu cao P chrysogenum đƣợc sử dụng công nghiệp sản xuất kháng sinh penicillin [178, 203] sản phẩm trao đổi chất bậc có giá trị amylase [50], lipase [13], polyamine oxidase [144], glucose oxidase [89] xanthocillin X [44] Do vậy, việc thiết lập đƣợc hệ thống dùng cho chuyển gen cải biến di truyền P chrysogenum không sử dụng gen kháng kháng sinh bƣớc tiến vƣợt trội hệ thống chuyển gen thiết lập đƣợc đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tái tổ hợp mang tính ứng dụng tƣơng lai Nhƣ vậy, nghiên cứu xây dựng thành công hệ thống chuyển gen hiệu cao sử dụng marker pyrG hai loài nấm A niger P chrysogenum với thông số tối ƣu nồng độ bào tử cho chuyển gen 106 bào tử/ml, đồng nuôi cấy 22°C môi trƣờng IM bổ sung 0,02% uridine 0,02 % uracil, IM giai đoạn cảm ứng bổ sung 200 µM AS, thời gian đồng ni cấy 60 Quy trình tối ƣu cho chuyển gen vào A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil đƣợc thể chi tiết Hình 3.12 77 Hình 3.12 Quy trình chuyển gen hiệu cao cho nấm A niger P chrysogenum khuyết dƣỡng uridine/uracil (A) Quy trình chuyển gen tối ƣu (B) Kết chuyển gen chủng A niger N402, CBS 113.46 P chrysogenum VTCC-F1172 khuyết dƣỡng uridine/uracil Đồng thời nghiên cứu này, khuẩn lạc nấm A niger chuyển gen đƣợc chọn ngẫu nhiên để đánh giá khả biểu gen DsRed Kết cho thấy toàn hệ sợi cấu trúc sinh bào tử chủng lựa chọn phát huỳnh quang tốt (Hình 3.13A) Cùng với việc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang, chủng chuyển gen đƣợc tiến hành kiểm tra PCR với hai cặp mồi AnpyrGP1/AnpyrG-P2 DsRed-F/DsRed-R, kết xuất đoạn DNA gen pyrG DsRed (Hình 3.13B) chứng tỏ hai gen đƣợc chuyển gen thành công vào hệ 78 gen nấm Nhƣ vậy, quy trình chuyển gen tối ƣu vào A niger N402 khuyết dƣỡng uridine/uracil biểu thành công gen huỳnh quang DsRed Điều mở triển vọng cho nghiên cứu biểu enzym protein tái tổ hợp loài nấm sợi tiềm Hình 3.13 Biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed chủng A niger khuyết dƣỡng uridine/uracil (A) Các chủng nấm chuyển gen mơi trƣờng CD dƣới kính hiển vi huỳnh quang (B) Kết PCR cặp mồi AnpyrG-P1/AnpyrG-P2 DsRed-F/DsRed-R M: kb DNA marker 79 3.3 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum 3.3.1 Nghiên cứu vai trò gen laeA A niger Chi nấm Aspergillus đƣợc biết đến với nhiều lồi có khả sản xuất sản phẩm trao đổi thứ cấp, đặc biệt phải kể tới loài A niger với nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ axit gluconic, axit citric, glucoamylase [7, 11, 138] Theo nhà khoa học dự đoán nấm Aspergillus có 266 nhóm gen liên quan tới sinh tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, cụ thể A niger có 81 nhóm gen Gen laeA đóng vai trò quan trọng việc kiểm sốt sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi thứ cấp nhiều loài nấm [24, 26] Ở A nidulans, biểu mức gen laeA làm tăng biểu nhóm gen sinh tổng hợp penicillin, lovastatin hợp chất terrequinone A, xóa gen laeA nhóm gen không biểu [2527, 29] Với nấm A fumigatus, gen laeA điều hòa biểu 13 nhóm gen liên quan tới sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp [139] Ở A niger, vai trò gen laeA với trình sinh axit citric bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu [128], nhiên vai trò khác chƣa đƣợc đề cập Trong nghiên cứu này, số vai trò gen laeA A niger đƣợc làm sáng tỏ thơng qua việc xóa, phục hồi biểu mức gen laeA sử dụng phƣơng pháp ATMT 3.3.1.1 Xóa thành cơng gen laeA A niger * Tạo cấu trúc xóa gen laeA A niger Ở loài nấm A niger, kháng sinh hygromycin loại kháng sinh đƣợc sử dụng làm marker chuyển gen [135] chƣa có cơng bố đề cập tới việc sử dụng kháng sinh nourseothricin Nghiên cứu hƣớng tới việc sử dụng marker gen kháng nourseothricin cho xóa gen A niger Chủng nấm A niger N402 đƣợc tiến hành đánh giá mẫn cảm với kháng sinh nourseothricin nồng độ khác Kết đánh giá mẫn cảm cho thấy, nồng độ kháng sinh nourseothricin 100 200 μg/ml bào tử nấm bị ức chế hoàn toàn Tuy nhiên nồng độ hệ sợi nấm bị ức chế phần so với đối chứng khơng có khác nhiều hai nồng độ (Phụ lục 21) Vì nghiên cứu này, để hạn chế khả 80 mọc chuyển gen, nồng độ kháng sinh nourseothricin 200 μg/ml đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu chuyển gen vào A niger Cấu trúc xóa gen laeA A niger đƣợc thiết kế với vùng T-DNA mang đoạn trình tự 5’ 3’ laeA mà không chứa khung đọc mở (ORF) gen, thay vào trình tự gen kháng kháng sinh nourseothricin dƣới điều khiển promoter gpdA có nguồn gốc từ A nidulans (Hình 3.14A) Quá trình khuếch đại đoạn 5’ laeA (kích thƣớc 1407 bp) 3’ laeA (kích thƣớc 1163 bp) từ DNA hệ gen chủng A niger N402 đƣợc thực PCR sử dụng cặp mồi AnlaeAP1/AnlaeA-P2 AnlaeA-P3/AnlaeA-P4 (Phụ lục 3) Việc cắt nối đoạn 5’ 3’ đƣợc thực enzym cắt giới hạn (Hình 3.14A) enzym T4 DNA ligase Hình 3.14 Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen laeA A niger (A) Sơ đồ tạo cấu trúc xóa laeA (B) Cắt kiểm tra cấu trúc xóa gen laeA enzym EcoRI BamHI M: kb DNA marker 81 Vector xóa gen laeA A niger (pKO2ΔAnlaeA) đƣợc cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRI BamHI cho sản phẩm với kích thƣớc 0,444 kb; 2,567 kb 7,5 kb với tính tốn lý thuyết, chứng tỏ cấu trúc xóa gen laeA A niger đƣợc tạo thành cơng (Hình 3.14B) * Xóa gen laeA A niger phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Vector pKO2ΔAnlaeA đƣợc biến nạp vào A tumefaciens AGL1 phƣơng pháp xung điện (Phụ lục 30) Chủng A tumefaciens AGL1 mang vector pKO2ΔAnlaeA đƣợc sử dụng để chuyển gen vào A niger Khi chuyển cấu trúc xóa gen laeA vào nấm A niger nhờ vi khuẩn A tumefaciens, trao đổi chéo theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng T-DNA locus gen laeA dẫn đến việc xóa bỏ gen laeA (Hình 3.15A) Quy trình chuyển gen vào A niger N402 đƣợc thực theo công bố trƣớc [19, 43] với nhiệt độ đồng nuôi cấy 22ºC 2,5 ngày Sau 2,5 ngày đồng nuôi cấy, màng chuyển gen đƣợc chuyển qua môi trƣờng chọn lọc CD chứa nourseothricin (200 μg/ml) cefotaxime (300 μg/ml) Sau 3-5 ngày 28ºC, khuẩn lạc nấm xuất môi trƣờng chọn lọc Các khuẩn lạc tiếp tục đƣợc sàng lọc lại việc cấy chuyển qua môi trƣờng chọn lọc CD chứa nourseothricin (200 μg/ml) Kết cho thấy, kết chuyển gen xuất hiện tƣợng dƣơng tính giả (khuẩn lạc xuất đĩa chuyển gen nhƣng không sinh trƣởng đƣợc sau chuyển qua môi trƣờng chọn lọc) Kết tƣơng tự với kết chuyển gen vào A niger N402 sử dụng marker gen kháng hygromycin Việc xác nhận xóa thành cơng gen laeA A niger đƣợc kiểm tra PCR sử dụng ba cặp mồi đặc hiệu với vị trí bám mồi đƣợc thể Hình 3.15A Kết PCR cặp mồi AnlaeA-ORF-F/AnlaeA-ORF-R cho thấy chủng xóa gen laeA cho băng với kích thƣớc 1,256 kb nhỏ chủng tự nhiên N402 (1,526 kb) Các chủng đột biến ngẫu nhiên tích hợp cấu trúc xóa laeA vào hệ gen khơng xảy q trình trao đổi chéo, xuất hai băng 1,256 1,526 kb Với cặp mồi AnlaeA-P5/AnlaeA-ORF-R, chủng tự nhiên chủng đột biến ngẫu nhiên lên băng kích thƣớc 0,788 kb cấu trúc gen 82 laeA nguyên gốc, chủng xóa gen hồn tồn khơng thấy băng xuất mồi xuôi AnlaeA-P5 bám khung đọc mở gen laeA mà chủng xóa vùng bị loại bỏ Kết PCR với cặp mồi thứ ba NAT-ORF-F/AnlaeA-P6 cho thấy chủng xóa gen laeA lên băng kích thƣớc 1,834 kb, chủng tự nhiên chủng đột biến ngẫu nhiên hoàn toàn không xuất băng Điều mồi xuôi bám vào khung đọc mở gen NAT mồi ngƣợc AnlaeA-P6 lại bắt cặp với vùng trình tự phía sau vùng 3’ laeA nên có chủng chuyển gen nhận đƣợc cấu trúc vector theo chế trao đổi chéo tƣơng đồng cho sản phẩm PCR có kích thƣớc 1,834 kb (Hình 3.15B) Hình 3.15 Xác nhận xóa gen laeA A niger (A) Sơ đồ trao đổi chéo tƣơng đồng (B) Xác nhận chủng xóa gen laeA PCR với cặp mồi đặc hiệu M: kb DNA marker Nƣớc cất vô trùng đƣợc sử dụng cho mẫu âm Ba chủng xóa gen laeA đƣợc kí hiệu AnΔlaeA-1, AnΔlaeA-2, AnΔlaeA-1 Hai chủng chèn ngẫu nhiên kí hiệu An-E1 An-E2 83 Nhƣ vậy, với kết xác nhận PCR với cặp mồi đặc hiệu nhƣ trên, gen laeA đƣợc xóa thành công theo chế tái tổ hợp tƣơng đồng nấm A niger Tuy nhiên, nghiên cứu nhận thấy việc xóa gen laeA đạt hiệu suất thấp 1,58% Trong q trình chuyển gen vào nấm thơng qua vi khuẩn A tumefaciens, đoạn T-DNA tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nấm, chế tự nhiên q trình Việc xóa gen A niger chế tái tổ hợp tƣơng đồng đƣợc chứng minh gặp nhiều khó khăn tồn gen ku70, ku80 có chức sửa chữa sai hỏng DNA [210] Đồng thời, việc làm giảm hoạt động gen gây vấn đề với việc ổn định toàn hệ gen nấm [210, 213] Chủng N402 đƣợc sử dụng nghiên cứu chủng chuẩn quốc tế, chƣa có tác động tới gen ku70, ku80 gen liên quan, nên hiệu suất xóa gen thấp Do vậy, nghiên cứu bƣớc đầu nghiên cứu nâng cao hiệu suất xóa gen A niger thơng qua việc xóa gen laeA sử dụng hệ thống chuyển gen trợ dƣỡng uridine/uracil Kết nghiên cứu cho thấy, hiệu suất xóa gen laeA đạt trung bình 92% chủng A niger N402 khuyết dƣỡng uridine/uracil 93,58% chủng A niger CBS 113.46 khuyết dƣỡng uridine/uracil (Phụ lục 22, 23 24) 3.3.1.2 Phục hồi biểu mức gen laeA A niger Vector phục hồi gen laeA A niger vector nhị thể chứa toàn khung đọc mở (ORF) dƣới kiểm soát promoter cảm ứng amyB, promoter đƣợc chứng minh điều hòa biểu mạnh gen mong muốn nấm sợi A oryzae [86] Vùng trình tự ORF phần terminator gen laeA đƣợc nối vào vector pEX2B [123] vị trí hai enzym PmlI HindIII để tạo vector pEX2B-AnlaeA Toàn vùng trình tự biểu gen laeA (vùng ORF phần terminator) dƣới kiểm soát promoter amyB đƣợc cắt từ vector pEX2BAnlaeA nối vào vector pGreen2 vị trí hai enzym giới hạn SpeI HindIII Vector pGB-AnlaeA tạo thành đƣợc cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRI có trình tự nhận biết gen kháng hygromycin, trình tự nhận biết promoter amyB trình tự nhận biết khung vector pGreen2 (Quy trình chi tiết đƣợc thể Phụ lục 25) Kết điện di sản phẩm cắt thu đƣợc băng có kích thƣớc 84 8,857 kb, 1,705 kb 1,149 kb, nhƣ tính tốn lý thuyết (Hình 3.16), nhƣ cấu trúc phục hồi gen laeA A niger sử dụng promoter amyB đƣợc tạo thành công Vector pGB-AnlaeA đƣợc biến nạp vào A tumefaciens AGL1 phƣơng pháp xung điện, khuẩn lạc xuất môi trƣờng chọn lọc đƣợc xác nhận PCR với cặp mồi đặc hiệu (Phụ lục 30) Hình 3.16 Cắt kiểm tra vector phục hồi gen laeA A niger M: kb DNA marker Cấu trúc vector phục hồi gen laeA (pGB-AnlaeA) đƣợc tiến hành chuyển vào chủng xóa gen laeA Một số thể chuyển gen ngẫu nhiên thu nhận đƣợc đĩa chuyển gen (Hình 3.17B) đƣợc tiến hành tách DNA hệ gen kiểm tra PCR với hai cặp mồi đặc hiệu (Hình 3.17C, D) Kết kiểm tra cặp mồi HPHF/HPH-R cho thấy chủng phục hồi gen laeA xuất băng có kích thƣớc 1,890 kb tƣơng ứng với kích thƣớc gen kháng kháng sinh hygromycin Với cặp mồi AnlaeA-ORF-F/AnlaeA-ORF-R, chủng phục hồi gen laeA xuất hai băng kích thƣớc 1,256 kb 1,526 kb tƣơng ứng với kích thƣớc khung đọc mở gen laeA chủng xóa chủng tự nhiên Nhƣ vậy, gen laeA đƣợc chuyển trở lại thành công chủng A niger xóa gen 85 Hình 3.17 Xác nhận phục hồi gen laeA A niger (A) Sơ đồ vị trí bám cặp mồi dùng cho xác nhận phục hồi gen laeA (B) Kết chuyển gen phục hồi gen laeA (C, D) Kết PCR kiểm tra M: kb DNA marker Nƣớc cất vô trùng đƣợc sử dụng cho mẫu âm Chủng phục hồi gen laeA đƣợc kí hiệu AnCompB1, An-CompB2 An-CompB3 Để tạo chủng A niger biểu mức gen laeA, cấu trúc pGB-AnlaeA đƣợc tiến hành chuyển vào chủng A niger N402 Các khuẩn lạc xuất đĩa chuyển gen (Hình 3.18B) đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên để kiểm tra PCR với hai cặp mồi HPH-F/HPH-R PamyB-F/PamyB-R Kết PCR cho thấy, cấu trúc vector pGB-AnlaeA đƣợc chuyển vào chủng nấm kiểm tra (Hình 3.18 C, D) Với kết cho thấy tạo đƣợc chủng nấm A niger chuyển gen biểu mức gen laeA Nhƣ vậy, nghiên cứu tạo đƣợc chủng nấm A niger đột biến xóa gen, phục hồi gen biểu mức gen laeA Các chủng nấm đƣợc sử dụng cho nghiên cứu điều tra vai trò gen laeA nấm A niger 86 Hình 3.18 Xác nhận biểu mức gen laeA A niger (A) Sơ đồ vị trí bám cặp mồi dùng cho xác nhận biểu mức gen laeA (B) Kết chuyển gen biểu mức gen laeA (C, D) Kết PCR kiểm tra hai cặp hồi HPH-F/HPH-R PamyB-F/PamyB-R M: kb DNA marker Nƣớc cất vô trùng đƣợc sử dụng cho mẫu âm Chủng biểu mức gen laeA đƣợc kí hiệu AnO1, AnO2 AnO3 3.3.1.3 Vai trò gen laeA nấm sợi A niger * Gen laeA ảnh hưởng đến sinh trưởng hình thành bào tử nguồn cacbon Để đánh giá ảnh hƣởng gen laeA tới khả sử dụng nguồn cacbon, chủng nấm A niger đƣợc tiến hành điều tra khả sinh trƣởng chín nguồn cacbon khác Kết sau ngày cho thấy phần lớn nguồn cacbon (ngoài nguồn cacbon pectin, sucrose, tinh bột cellulose) kích thƣớc khuẩn lạc chủng khơng có khác biệt nhiều (Hình 3.19 Phụ lục 26) 87 Hình 3.19 Sự sinh trƣởng chủng A niger nguồn cacbon Trên nguồn cacbon gồm pectin, sucrose, tinh bột cellulose chủng xóa gen laeA sinh trƣởng yếu so với chủng tự nhiên chủng phục hồi (Hình 3.19) Điều cho thấy, việc gen laeA, việc sinh tổng hợp enzym phân giải pectin, sucrose, tinh bột cellulose bị hạn chế dẫn tới làm giảm khả phân giải nguồn cacbon tƣơng ứng Ở nhiều loài nấm sợi, gen laeA đƣợc chứng minh có liên quan tới việc kiểm soát sinh tổng hợp nhiều loại enzym Cụ thể, việc xóa gen laeA P oxalicum làm giảm khả sinh cellulase [101] Ở T reesei, chủng xóa gen laeA hoàn toàn khả sinh bảy loại cellulase tiêu biểu loài này, yếu tố hỗ trợ phân giải cellulose, β-glucosidases xylanase không đƣợc biểu [6] Tuy nhiên, xét hình thành bào tử nhƣ màu sắc hệ sợi, chủng xóa gen có số đặc điểm khác biệt so với chủng tự nhiên chủng phục hồi Cụ thể, mơi trƣờng có galactose, lactose, tinh bột xylan, chủng xóa gen laeA hình thành bào tử hai chủng lại Đặc biệt bào tử chủng xóa gen nguồn cacbon lactose giảm tới 93,75% nguồn cacbon xylan giảm 70,55% so với chủng tự nhiên (Hình 3.20) Khi quan sát từ mặt sau đĩa môi trƣờng, nguồn cacbon glucose sucrose, khuẩn lạc chủng A.niger xóa gen laeA xuất nhiều sắc tố nhƣ rãnh khía đồng tâm so với hai chủng đƣợc kiểm tra (Phụ lục 26) Trên nấm A nidulans, loài chi với A niger, nhà khoa học phát khác biệt khả hình thành bào tử 88 màu sắc hệ sợi nấm chủng tự nhiên chủng xóa gen laeA [26] Ở nấm A flavus, gen laeA, khả hình thành bào tử số nguồn cacbon định có khác biệt, nhìn chung thể việc giảm hình thành bào tử so với chủng tự nhiên [36] Hiện nay, chƣa có cơng bố đề cập tới vai trò gen laeA A.niger liên quan tới việc hình thành bào tử 89 ... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ... vi nấm Từ lý trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: Nghiên cứu phát triển vector nhị thể ứng dụng cải biến di truyền số loài nấm sợi MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Tạo đƣợc vector nhị thể. .. sử dụng nghiên cứu 36 Bảng 2.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 3.1 Kết xác định số gen laeA chủng A niger 92 biểu mức gen laeA DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Một số đại di n thuộc chi nấm
Ngày đăng: 05/04/2020, 22:12
Xem thêm:
