Luận án đã đóng góp trong việc đưa ra quy trình tách chiết và tinh sạch ricin tại Việt Nam dựa trên phương pháp kết tủa bằng muối trung tính kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. Đã sàng lọc được 03 dòng aptamer đặc hiệu với ricin trong đó aptamer Ar5.9 có ái lực cao nhất với ricin, giá trị Kd= 0,83 nM. Đã phát triển được 02 phương pháp phân tích ricin sử dụng aptamer đặc hiệu ricin và quy trình chế tạo bộ kít phát hiện ricin bằng phương pháp realtime PCR, bước đầu ứng dụng bộ kít phân tích ricin trong các mẫu nước.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CƠNG NGHỆ APTAMER LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CƠNG NGHỆ APTAMER Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS Lê Quang Huấn PGS TS Nguyễn Đình Thắng HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu nào, liệu tham khảo trích dẫn đầy đủ Hà Nội, ngày 08 tháng 11 năm 2020 Tác giả luận án Ngô Ngọc Trung LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Quang Huấn, PGS.TS Nguyễn Đình Thắng định hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn em thực nội dung luận án Em xin chân thành cảm ơn cán phịng Cơng nghệ tế bào động vật/ Viện Công nghệ Sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Bộ mơn Hóa sinh Sinh học phân tử, Khoa Sinh học/ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi dành thời gian cho em q trình thực hồn thành luận án Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình cán bộ, đồng nghiệp Viện Hóa học Mơi trường qn sự/ Bộ Tư lệnh Hóa học có chia sẻ, động viên năm em thực luận án Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè động viên giúp đỡ trình nghiên cứu thực luận án Hà Nội, tháng 11 năm 2020 Nghiên cứu sinh Ngô Ngọc Trung MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt i Danh mục bảng iii Danh mục hình v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 RICIN 1.1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu 1.1.2 Cấu trúc phân tử chế tác động ricin 1.1.2.1 Cấu trúc phân tử ricin 1.1.2.2 Cơ chế tác động ricin 1.1.3 Độc tính ứng dụng ricin 1.1.3.1 Độc tính ricin 1.1.3.2 Ứng dụng y học 1.1.3.3 Ứng dụng quân 10 1.1.4 Các phương pháp tách chiết tinh ricin 11 1.1.4.1 Các phương pháp tách chiết ricin 11 1.1.4.2 Các phương pháp tinh ricin 11 1.1.5 Tình hình nghiên cứu ricin ngồi nước 12 1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu ricin giới 12 1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ricin Việt Nam 13 1.1.6 Các phương pháp phát ricin 13 1.1.6.1 Phương pháp miễn dịch đánh dấu phóng xạ (RIA) 13 1.1.6.2 Phương pháp sử dụng cảm biến sinh học 14 1.1.6.3 Phương pháp sắc ký miễn dịch 15 1.1.6.4 Phương pháp ELISA 16 1.1.6.5 Phương pháp PCR, RT-PCR I-PCR 17 1.1.6.6 Một số phương pháp khác 20 1.2 APTAMER VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN RICIN 21 1.2.1 Giới thiệu aptamer 21 1.2.2 Các quy trình thu nhận aptamer 23 1.2.2.1 Quy trình SELEX 23 1.2.2.2 Quy trình SELEX sử dụng màng lọc nitrocellulose 24 1.2.2.3 Quy trình SELEX sử dụng sắc ký lực hạt từ 24 1.2.3 Các phương pháp xác định lực aptamer với phân tử đích 25 1.2.4 Nghiên cứu tương tác aptamer ricin 26 1.2.5 Thư viện aptamer sử dụng sàng lọc ricin 27 1.2.6 Tình hình nghiên cứu aptamer ngồi nước 28 1.2.6.1 Các nghiên cứu aptamer phát kháng nguyên 28 1.2.6.2 Các nghiên cứu aptamer phát ricin 29 1.2.7 Thành phần nguyên lý hoạt động số kít phát ricin 30 1.2.7.1 Bộ kít phát ricin theo phương pháp ELISA 30 1.2.7.2 Bộ kít phát ricin theo phương pháp real-time PCR 32 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU VÀ HÓA CHẤT 34 2.2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 34 2.2.2 Các hóa chất 35 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.3.1 Phương pháp tách chiết tinh ricin 35 2.3.1.1 Tách chiết ricin từ hạt Thầu Dầu 35 2.3.1.2 Tinh ricin sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel 36 2.3.2 Các phương pháp xác định ricin 36 2.3.2.1 Xác định hàm lượng protein 36 2.3.2.2 Xác định độ tinh ricin phương pháp điện di 36 2.3.2.3 Phân tích khối phổ xác định ricin (LC-MS/MS) 36 2.3.2.4 Phương pháp sắc ký miễn dịch phát ricin 37 2.3.2.5 Xác định hàm lượng ricin tương đối dựa test phát nhanh 38 2.3.2.6 Kiểm tra có mặt ricin phương pháp Western blot 38 2.3.3 Phương pháp SELEX cải tiến sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 40 2.3.3.1 Chuẩn bị thư viện ssDNA thứ cấp 41 2.3.3.2 Gắn kết aptamer Q sepharose fast flow 41 2.3.3.3 Rửa, giải hấp thu sản phẩm 42 2.3.4 Các phương pháp sử dụng để chọn lọc aptamer 43 2.3.4.1 Phương pháp khuếch đại gen PCR 44 2.3.4.2 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng 45 2.3.4.3 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α 45 2.3.4.4 Chọn dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp 46 2.3.4.5 Phương pháp giải trình tự axit nucleic tự động 47 2.3.4.6 Phương pháp điện di gel agarose 47 2.3.4.7 Phương pháp tính giá trị số phân ly K d 47 2.3.4.8 Dự đốn cấu hình khơng gian aptamer 48 2.3.5 Phương pháp chọn dòng aptamer Enzyme – Limked Aptamer Assay (ELAA) 2.3.6 Xác định ricin phương pháp Enzyme - Linked Aptamer Assay (ELAA) 48 49 2.3.7 Xác định ricin phương pháp Real-time PCR 50 2.3.7.1 Xây dựng mối tương quan ricin với aptamer Ar5.9 51 2.3.7.2 Phương pháp real-time PCR để phát aptamer Ar5.9 51 2.3.8 Thẩm định phù hợp phương pháp 51 2.3.8.1 Giới hạn phát (LOD) 52 2.3.8.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 52 2.3.8.3 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu 52 2.3.8.4 Xác định độ xác, độ không đảm bảo đo 53 2.3.8.5 Độ ổn định phương pháp 56 2.3.9 Phương pháp lấy mẫu nước 57 2.3.10 Phương pháp thống kê xử lý kết thí nghiệm 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 58 3.1 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU 58 3.1.1 Tách chiết protein tổng số từ hạt Thầu Dầu 58 3.1.2 Kết tinh ricin 60 3.1.2.1 Tinh ricin sắc ký trao đổi ion 60 3.1.2.2 Tinh ricin sắc ký lọc gel 62 3.1.3 Kết xác định ricin sắc ký khối phổ LC- MS/MS 66 3.2 NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU RICIN 70 3.2.1 Chuẩn bị thư viện TV40 70 3.2.2 Nhân aptamer sợi đơn (ssADN) từ thư viện TV40 phản ứng PCR mồi lệch, cặp ApF2/ApR2 73 3.2.3 Sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 71 3.2.4 Kết tách dịng giải trình tự nucleotide aptamer 72 3.2.5 Xác định giá trị Kd cho aptamer đặc hiệu ricin 76 3.2.6 Xác định tính đặc hiệu aptamer Ar5.9 83 3.3 KẾT QUẢ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN RICIN 3.3.1 Phát triển phương pháp phát ricin Aptamer Ar5.9 dựa nguyên lý ELAA 86 86 3.3.1.1 Khảo sát thành phần phản ứng ELAA 86 3.3.1.2 Xây dựng đường chuẩn ricin aptamer Ar5.9 87 3.3.1.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 89 3.3.1.4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp ELAA 90 3.3.1.5 Xác định khả phản ứng chéo phương pháp ELAA 93 3.3.1.6 Xác định độ xác phương pháp 94 3.3.1.7 Xác định độ thu hồi độ không đảm bảo đo phương pháp 96 3.3.1.8 Xác định độ ổn định phương pháp theo thời gian 97 3.3.2 Phát triển phương pháp phát ricin Aptamer Ar5.9 dựa kỹ 99 thuật real-time PCR 3.3.2.1 Kết kiểm tra phản ứng real-time PCR với aptamer Ar5.9 3.3.2.2 Kết xác định nhiệt độ tối ưu tách aptamer Ar5.9 từ phức hợp kháng thể đơn dòng - ricin - Aptamer Ar5.9 99 100 3.3.2.3 Khảo sát số thành phần phản ứng real-time PCR 101 3.3.2.4 Xây dựng đường chuẩn ricin - aptamer Ar5.9 105 3.3.2.5 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 107 3.3.2.6 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp 108 3.3.2.7 Xác định khả phản ứng chéo phương pháp real-time PCR 109 3.3.2.8 Xác định độ xác phương pháp 110 3.3.2.9 Xác định độ thu hồi độ không đảm bảo đo phương pháp 112 3.3.2.10 Xác định độ ổn định phương pháp theo thời gian 113 3.3.3 Đánh giá, so sánh 02 phương pháp phát ricin 115 3.3.4 Nghiên cứu sản xuất kít phát ricin mẫu nước 116 3.3.4.1 Xây dựng quy trình sản xuất kít phát ricin phương pháp realtime PCR kết hợp aptamer Ar5.9 116 3.3.4.2 Đặc tính kỹ thuật kít 118 3.3.4.3 Quy trình phân tích 119 3.3.4.4 Kết thực hành sử dụng phát ricin trường 120 3.3.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến độ xác kít 124 3.3.5.1 Ảnh hưởng số kim loại nặng 124 3.3.5.2 Ảnh hưởng số loại ion vô 125 3.3.5.3Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN 129 ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumine -Albumin huyết bò CDC Centers of Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát ngăn ngừa bệnh dịch) NBCW Nuclear - Biology - Chemistry weapons - Vũ khí Hóa sinh hạt nhân PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Real - time Polymerase Chain Reaction ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay RIP Ribosome Inhibiting Protein -Protein ức chế ribosome RTA Ricin Toxin chain A - Chuỗi A độc tố ricin RTB Ricin Toxin chain B - Chuỗi B độc tố ricin RIA Radioimmunoassay - Miễn dịch đánh dấu phóng xạ NATO North Atlantic Treaty Organization (Tổ chức Hiệp ước Bắc Đại Tây Dương) SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment 2-ME 2-Mercaptoethanol ssADN Sợi đơn ADN ELAA Enzym - Linked Aptamer Assay LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng SD Độ lệch chuẩn kDa Kilo Dalton LC-MS/MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao i 58 Hamula C.L.A., Zhang H., Li F., Wang Z., Le X.C, Li X-F (2006), “Selection and analytical applications of aptamers”, Trends in Analytical Chemistry 25(7), pp 681–691 59 He X., Brandon D.L., Chen G., Keon T.M, Carter J.M (2007), “Detection of Castor Contamination by Real-Time Polymerase Chain Reaction”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, pp 545-550 60 He X., Carter J., Brandon D.L., Cheng L.W., McKeon T.A (2007), “Application of a Real Time Polymerase Chain Reaction Method to Detect Castor Toxin Contamination in Fluid Milk and Eggs”, J Agric Food Chem 55(17), pp 6897-6902 61 He X., McMahon S., Thomas A., Keon T.M, Brandon D.L (2010), “Development of a novel Immuno-PCR Assay for Detection of ricin in Ground Beef, Liquid Chicken Egg, and Milk”, Journal of Food Protection 73(4), pp.695-700 62 Hu J., Kim J., Easley C.J (2015), “Quantifying aptamer - protein binding via thermos fluorometric analysis” Analytical methods 7(17), pp 7358-7362 63 Ishiguro M., Matori Y., Tanabe S., Kawase Y., Sekine I., Sakakibara R (1992), “Biochemical studies on oral toxicity of ricin V: The role of lectin activity in the intestial absorption of ricin”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 40(5), pp 1216-1220 64 IUCN (1972), Convention on the Prohibition of the Development, Production and Stockpiling of Bacteriological (Biological) and Toxin Weapons and on their Destruction (London Version) 65 Jang H.Y, Kim J.H (1993), “Isolation and Biochemical of Ricin from Ricinus communis”, Korea Biochem Journal 26(1), pp 98-104 66 Jasheway K., Pruet J., Anslyn E.V., Robertus J.D (2011), “Structure-Based Design of Ricin Inhibitors”, Toxins (Basel) 3(10), pp 1233-1248 67 Jolliffe N.A., Ceriotti A., Frigerio L., Roberts L.M (2003), “The position of the proricin vacuolar targeting signal is functionally important” Plant Molecular Biology 51(5), pp.631-641 136 68 Jorge A Aguado C., Penner G (2008), “Fluorescence polarization based displacement assay for the determination of small molecules with aptamers”, Analysis Chemistry 80, pp 8853–8855 69 Keefe A.D, Cload S.T (2008), “SELEX with modified nucleotides”, Current Opinion in Chemical Biology 12(4), pp.448-456 70 Keague M.M., Giamberardino A., DeRosa M.C (2011), “Chapter 2: Advances in Aptamer-based Biosensors for Food Safety”, Environmental Biosensors, pp 1742 71 Kikuchi T., Ohnuma T., Holland J.F., Spitler L.E (1992), “Penetration of antimelanoma immunotoxin into multicellular tumor spheroids and cell kill effects”, Cancer Immunology Immunotherapy 35, pp 302-306 72 Kinson M.H (1988), The poisoner’s Handboook, Loompanics Unlimited: Port Townsend, WA, USA 73 Koja N., Shibata T., Mochida K (1980), “Enzyme - link Immunoassay of ricin”, Toxicon 18(56), pp 611-618 74 Kortepeter M.G., Parker G.W (1999), “Potential biological weapons threats”, Emerging Infectious Diseases 5(4), pp 523–527 75 Kulbachinskiy A.V (2006), “Method for Selection of Aptamers to Protein Targets”, Biochemistry (Moscow) 72(13), pp 1505-1518 76 Kumar O., Sugendran K., Pant S C., Vijayaraghavan R (2004), “Effect of Ricin on Some Biochemical, Haematological, and Histopathological Variables in Mice”, Defence Science Journal 54(4), pp 493-502 77 Kumar O., Nashikkar A.B., Jayaraj R., Vijayaraghavan R., Prakash A.O (2004), “Purification and Biochemical Characterisation of Ricin from Castor Seeds”, Defence Science Journal 54(3), pp 345-351 78 Laemmli U.K (1970), “Clevage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4”, Nature 227(5259), pp 680-685 137 79 Lamont E.A., He L., Warriner K., Labuzab T.P., Sreevatsan S (2011), “A single DNA aptamer functions as a biosensor for ricin”, Analyst 136, pp 3884 3892 80 Ler S.G., Lee F.K., Gopalakrishnakone P (2006), “Trends in detection of warfare agents: Detection methods for ricin, Staphylococcal enterotoxin B and T-2 toxin”, Journal of Chromatography A 1133(12), pp 1-12 81 Ligler F.S., Taitt C.R., Shriver-Lake L.C., Sapsford K.E., Shubin Y., Golden J.P (2003) “Array biosensor for detection of toxins”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 377(3), pp 469-477 82 Lind K., Kubista M (2005), “Develop and evaluation of three real-time immuno PCR assemblages for quantification of PSA”, Journal of Immunological methods 304, pp.107-116 83 Liu C.W., Huang C.C., Chang H.T (2009), “High selective DNA-based sensor for lead(II) and mercury(II) ions”, Analytical Chemisry 81, pp 2383-2387 84 Liu Q., Zhan J., Chen X., Zheng S (2006), “Ricin A chain reaches the endoplasmic reticulum after endocytosis”, Biochemical and Biophysical Research Communications 343, pp 857–863 85 Lord J.M (1985), “Synthesis and intracellular transport and storage of the lectin protein precursors in endosperm from castor bean” European Journal of Biochemistry 146, pp 403-409 86 Lord J.M, Harley S.M (1985), “Ricinus communis agglutinin B chain contains a fucosylated oligosaccharide side chain not present on ricin B chain”, FEBS Letters, 189(1), pp 72-76 87 Lord J.M., Roberts L.M., Robertus J.D (1994), “Ricin: structure, mode of action, and some current applications”, The FASEB Journal 8(2), pp 201-208 88 Lubelli C., Chatgilialoglu A., Bolognesi A., Strocchi P., Colombatti M., Stirpe F (2006), “Detection of ricin and other ribosome –inactivating proteins by an immune-polymerase chain reaction assay”, Analytical Biochemistry 355(1), pp 102-109 138 89 Mahmood T., Yang P.C (2012), “Western Blot: Technique, theory, and trouble shooting” North American Journal of Medical Sciences, 4(9), pp 429–434 90 Marimuthu C., Tang T-H., Tominaga J., Soo-Choon Tan S-C., Gopinath S.C.B (2012), “Single-stranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation” Analyst 137, pp 1307-1315 91 Marshall K.A., Ellington A.D (2000), “In vitro selection of RNA aptamers” Method in Enzymeology 318, pp.19-214 92 Mayer G., Hover T (2009), In Vitro Selection of ssDNA Aptamers Using Biotinylated Target Proteins, Nucleic Axít and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, V535ª Humana Press, a part of Springer Science Business 93 Melchior W B., Tolleson W.H (2010) “A functional quantitative polymerase chain reaction assay for ricin, Shiga toxin, and related ribosome-inactivating proteins”, Analytical Biochemistry, 396(2), pp 204–211 94 Mendonsa S., Bowser M.T (2004), “In vitro selection of high-affinity DNA ligands for human IgE using capillary electrophoresis” Analytical Chemistry (76)18, pp 5387–5392 95 Mlsna D., Monzingo A.F., Katzin B.J., Ernst S., Robertus J.D (1993), “The structure recombinant ricin A chain at 2.3A0”, Protein Science 2(3), pp 429-435 96 Montfort W., Villafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin B., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Jon D Robertus J.D (1987), “The three-dimensional structure of ricin at 2.8A”, The Journal of Biological Chemistry 262(11), pp 53985403 97 Musshoff F., Madea B (2009), “Ricin poisoning and forensic toxicology”, Drug Testing Analysis 1(4), pp 184–191 98 Niazi J.H., Lee S.J., Kim Y.S., M.B (2008), “ssDNA aptamers that selectively bind oxytetracycline”, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16(3), pp 1254–1261 99 Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R (2007), “ Detecting antigens by quantitative immune-PCR”, Nature Protocols 2, pp 1918-1930 139 100 Olsnes S (2004), “The history of ricin, abrin and related toxins”, Toxicon 44(4), pp 361–370 101 Olsnes S., Kozlov J.V (2001), “Ricin”, Toxicon 39(11), pp 1723–1728 102 Patel M., Dutta A., Huang H (2011), “A selective adenosine sensor derived from a triplex DNA aptamer”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 400(9), pp 3035-3040 103 Plotz C.M., Singer J.M (1956), “The latex fixation test I Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis”, The American Journal of Medicine 21(6), pp 888–892 104 Pristoupil T.I., Kramlová M., Stĕrbíková J (1969), “On the mechanism of adsorption of proteins to nitrocellulose in membrane chromatography”, Journal of Chromatography 42, pp 367-375 105 Qian J., Lou X., Zhang Y., Xiao Y, Soh H.T (2009), “Generation of high specific aptamers via micromagnetic selection”, Analysis of Chemistry 81(13), pp 5490–5495 106 Ramesh C.Gupta (2015), Handbook of Toxicology of Chemical warfare Agents, 2st Edition, 21st, USA 107 Rodda T (2013), Rapid Detection of Ricin in liquid foods using SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy, Master Thesis submitted to the faculty of the graduate school of the university of Minnesota, USA 108 Rutenber E., Katzin BJ, Ernst S., Collins E., Mlsna D., Ready M, Robertus J.D (1991), “The crystallographic refinement of Ricin at 2.5A resolution”, Proteins Structure Function and Bioinformatics 10(3), pp 240-250 109 Rutenber E , Robertus J.D (1991), “The structure of ricin B chain at 2.5A0 resolution”, Proteins 10(3), pp 260-269 110 Sampson T (2003), “Aptamers and SELEX: the technology” World Patent Information 25(2), pp.123–129 111 Sano T., Smith C.L., Cantor C.R (1992), “Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates”, Science 258, pp 140 120-122 112 Schep L.J., Temple W.A., Butt G., Beasley D.M.G (2009), “Ricin as a weapon of mass terror - Separating fact from fiction”, Environmental International Journal 35(8), pp 1267-1271 113 Schuătze T., Wilhelm B., Greiner N., Braun H, Peter F., Moărl M., Erdmann V.A., Lehrach H., Konthur Z., Menger M., Arndt P.F (2011), “Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing”, PLOS one 6(12), e 29604 114 Sehgal P., Khan M., Kumar O., Vijayaraghavan R (2010), “Purification, characterization and toxicity profile of ricin isoforms from castor beans”, Food and Chemical Toxicology 48, pp 3171–3176 115 Shyu H.F., Chiao D.J., Hwan-Wun Liu H.W, Tang S.S (2004), “Monoclonal Antibody-Based Enzyme Immunoassay for Detection of Ricin”, Hybridoma and Hybridomics 21(1), pp 67-73 116 Shyu R.H., Shyu H.F., Liu H.W, Tang S.S (2002), “Colloidal gold – based Immunochromatographyic assay for detection of ricin”, Toxicon 40(3), pp 255-268 117 Song K.M., Lee S., Ban C (2012), “Aptamer and their biological aplications”, Sensors 12(1), pp 612-631 118 Song S., Liang Z., Zhang J., Wang L., Li G., Fan C (2009), “Goldnanoparticle-based multicolor nanobeacons for sequence-specific DNA analysis”, Angewandte Chemie International Edition, 48(46), pp.8670-8674 119 Spitler L.E., del Rio M., Khentigan A., Wedel N.I., Brophy N.A., Miller L.L., Harkonen W.S., Rosendorf L.L., Lee H.M., Mischak R.P., Kawahata R.T., Stoudemire J.B., Fradkin L.B., Bautista E.E., Scannon P.J (1987) “Therapy of patients with malignant melanoma using a monoclonal antimelanoma antibody ricin A chain immunotoxin” Cancer research 47, pp 1717-1723 120 Tang J., Xie J., Shao N., Yan Y (2006) “The DNA aptamers that specifically recognize ricin toxin are selected by two in vitro selection methods”, Electrophoresis 27, pp 1303 – 1311 141 121 Thomas T.S., Lin T.T.S., Steven S., Li L (1980), “Purification and Physicochemical Properties of Ricins and Agglutinins from Ricinus comminus”, European Journal of Biochemistry 105(3), pp 453-459 122 Tregear J.W., Roberts L.M (1992), “The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin lectin genes and pseudogenes three”, Plant Molecular Biology 18, pp 515-525 123 Tuerk C, Gold L (1990), “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase”, Science 249, pp 505-510 124 Tyagi N., Rathore S., Ghosh P (2013), “Efficacy of Liposomal Monensin on the Enhancement of the Antitumour Activity of Liposomal Ricin in Human Epidermoid Carcinoma (KB) Cells”, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 75(1), pp.16-22 125 Tyagi “Potential N., Tyagi therapeutic M., Pachauri applications of M., plant Ghosh toxin-ricin P.C (2015) in cancer: challenges and advances” Tumor Biology 36, pp 8239-8246 126 Tyagi N., Tyagi M., Pachauri M., Ghosh P.C (2015), “Potential therapeutic applications of plant toxin-ricin in caner: challenges and advances”, Tumor Biology 36(11), pp 8239–8246 127 Wadkins R.M., Golden J.P., Pritsiolas L.M., Ligler F.S (1998), “Detection of Multiple Toxin agents using a planar array immunosensor”, Biosensor and Bioelectronics 13(34), pp 407-415 128 Wang B., Guo C., Chen G., Park B., Xu B (2012), " Following aptamer–ricin specific binding by single molecule recognition and force spectroscopy measurements”, Chemistry Communication 48, pp 1644–1646 129 Wang J., Yang Y., Zhou L., Wang J., Jiang Y., Hu K., Sun X., Hou Y., Zhu Z., Guo Z., Ding Y., Yang R (2009), ‘Simultaneous Detection of Five Biothreat Agents in Powder Samples by a Multiplexed Suspension Immunopharmacology and Immunotoxicology 31(3), pp 417-427 142 Array”, 130 Wang R.E., Zhang Y., Cai J., Cai W., Gao T (2011), “Aptamer - based Fluorescent Biosensors”, Current Medicinal Chemistry 18(27), pp 4175-4184 131 Wang X., Dong P., He P., Fang Y (2010), “A solid-state electrochemiluminescence sensing platform for detection of adenosine based on ferrocene-labeled structure-switching signaling aptamer” Analytica Chimica Acta 658(2), pp.128–132 132 William H (2004), “Other biologic toxin bioweapons: ricin, staphylococcal enterotoxin B, and trichothecene mycotoxins”, Dermatologic Clinic 3(22), pp 257262 133 Wu J., Wang Y., Jia P., Wang C., Hao Y., Peng H., Wei W, Li H (2011), “Immunochromatography detection of ricin in environmental and biological samples”, Nano Biomedicine and Engineering 3(3), pp 169-173 134 Woo B.H., Lee J.T., Lee K.C (1988), “Purification of Sepharose-Unbinding Ricin from Castor Beans (Ricinus communis) by Hydroxyapatite Chromatography”, Protein Expression and Purification 13, pp 150-154 135 Worbs S., Skiba M., Soderstrom M, Rapinoja M.L., Zeleny R., Russmann H., Schimmel H., Vanninen P., Fredrilsson S.A., Dorner B.G (2015), “Characterization of Ricin and R.communis Agglutinin Reference materials” Toxins 7, pp 4906-4934 136 Xu H., Wang Y., Huang X., Li Y., Zhang H., Zhong X (2012), “Hg2+ mediated aggregation of gold nanoparticles for colorimetric screening of biothiols” Analyst 137, pp 924–931 137 Xu J.P., Song Z.G., Fang Y., Mei J., Jia L., Qin A.J., Sun J.Z., Ji J., B.Z (2010), “Label-free fluorescence detection of mercury(II) and glutathione based on Hg2+-DNA complexes stimulating aggregation-induced emission of a tetraphenylethene derivative.”, The Analyst 135(11), pp.3002-3007 138 Xu W., Lu Y (2010), “Label-free fluorescent aptamer sensor based on regulation of malachite green fluorescence”, Analytical Chemistry 82, pp 574–578 143 139 Xu Z., Morita K., Sato Y., Dai Q., Nishizawa S., Teramae N (2009), “Labelfree aptamer-based sensor using abasic site-containing DNA and a nucleobasespecific fluorescent ligand”, Chemical Communication 42, pp 6445–6447 140 Yadov G.S, Kumar V., Aggarwal N.K (2016), Aptamers, Biotechnological Application of a next Generation Tool, Spinger Nature Singapore Pte Ltd 141 Yin H.Q., Jia M.X., Yang S., Wang S.Q., Zhang J.G (2012) “A nanoparticlebased bio-barcode assay for ultrasensitive detection of ricin toxin”, Toxicon 59, pp 12-16 142 Yue J., Zhang L., Yang Z (2009), “Detection of ricin toxin in water using immunoassays”, Journal of Environmental Analytical Chemistry 89(12), pp 821–833 143 Zheng J., Zhao C., Tian G., He L (2017), “Rapid screening for toxin on letter papers using surface enhanced Raman spectroscopy”, Talana 162, pp 552-557 144 www.aoac.org 145 website: ebi.ac.uk 146 http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold 147 http://tetracore.com 144 PHỤ LỤC Hình 1: Lấy mẫu nước Sơng Đà/ Hịa Bình Hình 2: Lấy mẫu nước Hồ Tây/ Hà Nội Hình 3: Chuẩn bị mẫu phịng thí nghiệm Hình 4: Hệ thống ELISA sử dụng để tiến hành thí nghiệm ELAA Hình 5: Máy PCR sử dụng để tiến hành thí nghiệm sàng lọc aptamer Hình 6: Máy real-time PCR sử dụng để tiến hành thí nghiệm phát triển phương pháp chế tạo kít phát ricin Hình 7: Xe trinh sát thực lấy mẫu phân tích trường Hình 8: Máy real-time PCR xe trinh sát Hình 9: Máy ly tâm tủ lưu mẫu xe Hình 10: Box an tồn cấp 2, cấp xe Hình 11: Bộ kít phát ricin phương pháp real-time PCR ... nghiên cứu phương pháp kít phát ricin vấn đề cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu phát triển kít phát độc tố ricin dựa công nghệ aptamer? ?? nhằm phát đinh... aptamer phát kháng nguyên 28 1.2.6.2 Các nghiên cứu aptamer phát ricin 29 1.2.7 Thành phần nguyên lý hoạt động số kít phát ricin 30 1.2.7.1 Bộ kít phát ricin theo phương pháp ELISA 30 1.2.7.2 Bộ kít. .. QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CƠNG NGHỆ APTAMER Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 LUẬN ÁN