NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM TẠI TỈNH CÀ MAU BẰNG NESTED PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM TẠI TỈNH CÀ MAU BẰNG NESTED PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: THIÊN THỊ KIM KỶ Niên khóa: 2008 - 2012 Tháng năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM TẠI TỈNH CÀ MAU BẰNG NESTED PCR Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐÔN THIÊN THỊ KIM KỶ KS HUỲNH ĐĂNG SANG Tháng năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tồn thể thầy truyền đạt kiến thức cho suốt trình học trƣờng PGS.TS Lê Đình Đơn giúp đỡ tơi q trình làm thực tập tốt nghiệp KS Huỳnh Đăng Sang tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tơi q trình thực tập Viện Công nghệ Sinh học Môi trƣờng - Đại học Nơng lâm Thành phố Hồ Chí Minh Chị Lê Tố Trâm (Sở Nông nghiệp Phát triển nơng thơn tỉnh Cà Mau), anh Phạm Kinh Kha (Phó phòng dịch tễ Chi Cục Thú Y Tỉnh Cà Mau), anh Nguyễn Thanh Ngoan (Cán Thú y huyện Cái Nƣớc) giúp đỡ thời gian Cà Mau Các em Hồ Thị Bích Trâm, Phạm Thị Thu Hƣờng, Huỳnh Thanh Trúc lớp Cơng nghệ Sinh học khóa 36 giúp tơi suốt q trình thực tập Bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học khóa 34 chia sẻ tơi vui buồn nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tơi suốt năm qua Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ ngƣời thân gia đình ln chỗ dựa vững cho con, động viên, khuyến khích, tạo điều kiện cho học tập tốt Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012 Sinh viên thực Thiên Thị Kim Kỷ ii TÓM TẮT Vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), nhóm tác nhân gây tổn thất nghiêm trọng cho ngƣời nuôi tôm Tỷ lệ tôm chết nhiễm WSSV lên đến 100% vòng – 10 ngày sau nhiễm Cho đến nay, công tác phòng bệnh biện pháp hiệu để hạn chế thiệt hại bệnh đốm trắng Trong việc thả nuôi tôm giống bệnh điều cần thiết Do đó, cần có quy trình chẩn đốn sớm WSSV tôm giống tôm Để phát triển công tác sản xuất tôm giống bệnh nhƣ hỗ trợ cho cơng tác phòng ngừa dịch bệnh, việc chẩn đốn sớm xác diện WSSV tôm điều quan trọng Trong đề tài này, mẫu tôm sú nghi ngờ nhiễm WSSV đƣợc thu thập huyện Cái Nƣớc Đầm Dơi tỉnh Cà Mau Quy trình phát WSSV mẫu tôm thu thập đƣợc tiến hành kỹ thuật nested PCR Để đánh giá độ nhạy quy trình, chuẩn gốc WSSV – DNA đƣợc xây dựng, xác định số sao, pha loãng từ 108 đến thực PCR Bên cạnh đó, độ đặc hiệu đƣợc xác định so sánh với tơm bị nhiễm IHHNV Kết giải trình tự cho thấy quy trình nested PCR đƣợc khảo sát có khả phát xác WSSV mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập huyện Cái Nƣớc Đầm Dơi Độ nhạy quy trình đạt 103 có độ đặc hiệu cao với WSSV Trong nghiên cứu quy trình nested PCR chẩn đoán diện WSSV đƣợc xây dựng thành cơng ứng dụng cơng tác sản xuất giống bệnh đốm trắng Bộ mẫu tôm nhiễm vi-rút đốm trắng đƣợc thành lập phục vụ cho công tác giảng dạy môn Công nghệ Sinh học nguồn mẫu cho nghiên cứu iii SUMMARY Thesis: “Study to detect white spot syndrome virus on shrimp in Ca Mau province by nested PCR” White spot syndrome virus (WSSV) is an important viral pathogen responsible for severely economic loss to shrimp farmers Mortality rate when infected with WSSV can be up to 100% within - 10 days after infection So far, disease prevention is still the most effective measure to limit damages caused by white spot disease In which the breeding of disease-free shrimp seeds is essential Therefore, there should be a procedure for early diagnosing of WSSV on shrimp seed and mature shrimp For developing disease-free shrimp seed production as well as supporting the disease prevention, early and accurate diagnosis of the presence of WSSV on shrimp is extremely important In this study, the shrimp samples suspected of being infected with WSSV were collected in Cai Nuoc and Dam Doi districts of Ca Mau province The procedure for detecting WSSV on collected shrimp samples was carried out by nested PCR To evaluate the sensitivity of the procedure, WSSV – DNA standard was built to determine number of copies, diluted from 108 to copies and performed PCR In addition, the specificity was well defined when compared with IHHNV-infected shrimp The sequencing results showed that nested PCR procedure surveyed in this study was able to detect accurately WSSV in shrimp samples suspected of being infected with WSSV collected in Cai Nuoc and Dam Doi districts This procedure had the sensitivity of 103 copies and the high specificity with WSSV In this study, the nested PCR procedure for diagnosing the presence of WSSV has been successfully set up and can be applied for white spot disease-free seed shrimp production Moreover, the samples of shrimp infected with WSSV was established to serve for teaching in Department of Biotechnology and to be the sample source for further studies Keywords: diagnosis, detection, nested PCR, white spot syndrome virus iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………………… i TÓM TẮT…………………………………………………………………………… ii SUMMARY………………………………………………………………………… iii MỤC LỤC…………………………………………………………………………… iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………………… vi DANH SÁCH CÁC BẢNG………………………………………………………… vii DANH SÁCH CÁC HÌNH………………………………………………… …… vii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 10 1.3 Nội dung thực 10 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .11 2.1 Tình hình dịch bệnh đốm trắng tôm Việt Nam 11 2.2 Tình hình dịch bệnh đốm trắng tôm tỉnh Cà Mau……………………… …4 2.3 Bệnh đốm trắng tôm 2.3.1.Vi-rút gây bệnh đốm trắng (White spot syndromes virus – WSSV) 2.3.1.1 Đặc điểm hình thái 2.3.1.2 Đặt tính sinh học 2.3.2 Vật chủ mang mầm bệnh .6 2.3.3 Các đƣờng lây truyền 2.3.4 Cơ chế xâm nhập 2.3.5 Triệu chứng bệnh 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán 2.3.7 Phòng bệnh 2.4 Tình hình nghiên cứu phát bệnh đốm trắng tơm .8 2.5 Phƣơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.6 Kỹ thuật nested PCR 10 2.7 Phƣơng pháp phân tích định tính định lƣợng thơ nucleic acid 11 2.7.1 Phƣơng pháp điện di DNA gel .11 v 2.7.2 Phƣơng pháp định lƣợng quang phổ kế 20 2.8 Xác định số mẫu 20 2.9 Giải trình tự DNA tự động .20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu hóa chất 22 3.2.1 Dụng cụ thiết bị .13 3.2.2 Hóa chất vật liệu 13 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu bảo quản mẫu 23 3.3.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA 23 3.3.3 Phƣơng pháp nested PCR xác định tôm nhiễm WSSV .24 3.3.4 Phƣơng pháp tạo chuẩn WSSV - DNA .25 3.3.5 Phƣơng pháp xác định độ nhạy quy trình nested PCR 26 3.3.6 Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu quy trình nested PCR 27 3.3.7.Giải trình tự sản phẩm PCR WSSV đƣợc khuếch đại 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Thành lập mẫu bệnh đốm trắng 19 4.2 Đánh giá quy trình mẫu DNA dƣơng tính với WSSV 20 4.3 Thiết lập quy trình nested PCR có khả phát WSSV thu từ Cà Mau 21 4.4 Xác định độ nhạy quy trình nested PCR 34 4.5 Độ đặc hiệu quy trình nested PCR 35 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2.Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair Ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid HPV Hepatopanceatic parvovirus IMNV Infectiuos meonecrosis virus IHHNV Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus OD Opitical density PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodecyl Sulfate Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borate EDTA TE Tris - EDTA TSV Taura syndrome virus UV Ultraviolet radiation V Volt (đơn vị hiệu điện thế) YHV Yellow head virus WSSV White Spot Syndrome Virus rpm revolutions per minute (số vòng quay phút) vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi xác định WSSV……………………………………… 14 Bàng 3.2 Thành phần phản ứng nested PCR bƣớc 1……………………………… 15 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nested PCR bƣớc 2……………………………… 15 Bảng 3.4 Chƣơng trình nhiệt PCR ………………………………………………… 15 DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Triệu chứng bên ngồi tơm bị bệnh đốm trắng…………………………… Hình 2.2 Nguyên tắc nested PCR……………………………… .10 Hình 3.1 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng mẫu bậc 10…………………….18 Hình 4.1 Tơm nghi ngờ nhiễm WSSV……………………………………………….19 Hình 4.2 Bộ mẫu tơm nghi ngờ nhiễm WSSV ………………………………………19 Hình 4.3 Kiểm tra quy trình nested PCR với mẫu DNA dƣơng tính WSSV……20 Hình 4.4 Kết PCR mẫu tơm thu huyện Đầm Dơi…………………………….21 Hình 4.5 Kết PCR mẫu tơm thu huyện Cái Nƣớc…………………………….22 Hình 4.6 Độ nhạy nested PCR phát WSSV với chuẩn gốc WSSV - DNA…24 Hình 4.7 Kết độ đặc hiệu quy trình nested PCR……………….…………….25 viii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sự phát triển nhanh nghề ni tơm đem lại lợi ích đáng kể mặt kinh tế; với sản lƣợng năm 2011 482,2 nghìn tấn, chiếm 11,6% tổng sản lƣợng thủy sản tồn quốc (Theo thơng tin từ Tổng Cục Thống kê năm 2011) Tuy nhiên nghề nuôi tôm đƣợc thâm canh hóa dịch bệnh xảy ngày nhiều bệnh vi-rút gây nhƣ bệnh đốm trắng (WSSV), hội chứng Taura (TSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mơ (IHHNV), bệnh gan tụy (HPV), bệnh còi (MBV), bệnh hoại tử cơ/đục (IMNV) Theo quan Quốc tế Dịch bệnh Động vật (năm 1995), WSSV vi-rút gây bệnh nghiêm trọng cho nghề ni tơm, tác nhân có khả lây nhanh, có hệ ký chủ rộng (Bonilla, 2008), tỉ lệ tơm chết bị nhiễm bệnh lên đến 80 – 100% sau – 10 ngày nhiễm (Lightner, 1996) Theo thống kê Chi cục Thú y tỉnh Cà Mau năm 2011, diện tích ni tơm đạt 296.592 (tôm công nghiệp 3.398 ha, tôm quảng canh cải tiến 10.015 ha), chiếm 1/4 sản lƣợng tơm ni nƣớc Diện tích tơm ni cơng nghiệp bị bệnh 538,85 (đốm trắng 86,33 ha, hoại tử gan tụy 452,53 ha) Năm nay, tình hình khơng khả quan hơn, tính đến tháng 03 năm 2012, đem khoảng 200 mẫu tôm đƣợc xét nghiệm kết có 60% mẫu nhiễm vi-rút gây bệnh đốm trắng, lại bệnh gan tụy số bệnh khác (www.vietlinh.com.vn) Hiện chƣa có thuốc đặc trị bệnh WSSV tơm nên cơng tác phòng ngừa tổng hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản xâm nhập sinh vật mang mầm bệnh vào ao nuôi sử dụng tôm giống bệnh đƣợc khuyến cáo nhƣ biện pháp an toàn sinh học (Bonilla, 2008) Do cần có phƣơng pháp phát sớm diện vi-rút gây bệnh đàn tôm giống trƣớc thả nuôi ao nuôi tôm công nghiệp nhằm hạn chế nguy bùng phát dịch bệnh Các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống nhƣ quan sát dấu hiệu bệnh hay phƣơng pháp mô bệnh học khơng cho phép phát sớm xác tác nhân gây bệnh Nhiều phƣơng pháp phân tử nhƣ lai in situ, western blot, PCR, nested PCR đƣợc phát triển nhằm khắc phục nhƣợc điểm (Trần Việt Tiên Bƣớc 5: Ly tâm 14000 rpm phút Loại bỏ dịch gắn lại cột vào tube Bƣớc 6: Thêm 700 µl Membrane Wash Solution (đã thêm ethanol) Ly tâm 14000 rpm phút loại bỏ dịch chảy qua gắn cột vào tube Bƣớc7: Lặp lại bƣớc với 500 µl Membrane Wash Solution Thực ly tâm 14000 rpm phút Bƣớc 8: Loại bỏ dịch chảy qua ly tâm lại cột phút, mở nắp để làm bay lƣợng ethanol dƣ Bƣớc 9: Cẩn thận chuyển cột vào tube 1,5 Bƣớc 10: Thêm 50 µl nƣớc khơng có Nuclease vào cột, ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 14000 rpm phút Loại bỏ cột bảo quản 4o C hay 20oC Sản phẩm PCR tinh đƣợc điện di gel agarose 1% đo OD để kiểm tra độ tinh Tỷ số OD260nm/OD280 nằm khoảng 1,6 - 1,8 (Sritunyalucksana ctv, 2006) Nếu kết điện di xuất băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thƣớc trùng với kích thƣớc đích lấy sản phẩm tiến hành đo OD Sau có kết đo OD, tiến hành xác định số chuẩn WSSV – DNA để đánh giá độ nhạy quy trình theo cơng thức sau: Số = (số lƣợng DNA x6,022x1023) / (chiều dài mẫu x1x109x650) Với: Số lƣợng DNA : số lƣợng DNA sau OD Chiều dài mẫu: chiều dài sản phẩm khuếch đại Số Avogadro: 6,022x1023 phân tử / mol bp ncó trọng lƣợng 650 gram x109 để chuyển đổi ng 3.3.5 Phƣơng pháp xác định độ nhạy quy trình nested PCR Chuẩn gốc WSSV – DNA sau xác định đƣợc nồng độ (số sao/µl) đƣợc tiến hành pha lỗng theo hệ số 10 Dùng micropipette hút µl chuẩn gốc WSSV – DNA cho vào µl TE 1X (Tris EDTA), tiến hành trộn mẫu máy vortex, ly tâm nhẹ, sau hút 1µl mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ly tâm chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn µl TE 1X, trộn mẫu vortex ly tâm Quá trình lặp lại, cuối 26 ta thu đƣợc dãy chuẩn WSSV – DNA với nồng độ giảm dần từ 108 đến 100 sao/µl (hình 3.1) Chuẩn WSSV – DNA đƣợc sử dụng nhƣ khuôn DNA để thực nested PCR (thực phản ứng với cặp mồi 146F1/146R1 146F2/146R2) Sau đó, 10 µl sản phẩm PCR với cặp mồi 146F2/146R2 đƣợc điện di gel agarose 1,5%, hiệu điện 80 V 35 phút Độ nhạy quy trình nested PCR đƣợc xác định số cho băng DNA có độ sáng thấp Hình 3.1 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng mẫu bậc 10 3.3.6 Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu quy trình nested PCR Mẫu tơm xác định nhiễm WSSV IHHNV đƣợc sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu Mẫu tơm đƣợc ly trích theo DNA thực khuếch đại với cặp mồi 146F1/146R1 146F2/146R2 Sản phẩm khuếch đại đƣợc điện di gel agarose 1,5% , hiệu điện 80 V 35 phút Dựa vào kết để xác định độ đặc hiệu mồi quy trình 3.3.7 Giải trình tự sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại Sau thực phản ứng PCR với cặp mồi 146R1/146F1, 15 µl sản phẩm khuếch đại mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập từ huyện Đầm Dơi đƣợc giải trình tự chiều với cặp mồi 146F1/146R1 Công ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, quận 7, TP Hồ Chí Minh) Kết giải trình tự đƣợc xem xử lý phần mềm BioEdit để có đƣợc trình tự xác Trình tự DNA đƣợc so sánh với với trình tự khác đƣợc cơng bố ngân hàng gen NCBI chƣơng trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) để xác định mức độ tƣơng đồng khẳng định sản phẩm khuếch đại trình tự WSSV 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thành lập mẫu bệnh đốm trắng Theo chi cục thú y tỉnh Cà Mau, huyện Cái Nƣớc Đầm Dơi hai huyện chịu thiệt hại nặng dịch bệnh đốm trắng tháng cuối năm 2011 đầu năm 2012 Với mục tiêu thu thập đƣợc mẫu tôm nhiễm WSSV, công tác thu thập mẫu thực địa đƣợc tiến hành huyện Mƣời mẫu tôm sú nghi ngờ nhiễm WSSV đƣợc thu thập từ ao ni tơm cơng nghiệp Tơm thu thập có biểu bên rõ bệnh đốm trắng nhƣ: bỏ ăn, bơi gần bờ, số tôm đỏ thân xuất đốm trắng vỏ giáp đầu ngực, đứt râu, đen mang Các mẫu tôm thu thập huyện Cái Nƣớc Đầm Dơi đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để xây dựng quy trình nested PCR phát WSSV Từ kết phân tích với quy trình nested PCR đƣợc phát triển nghiên cứu cho thấy 10 mẫu tôm thu thập nhiễm WSSV Các mẫu tôm đƣợc giữ lại để thành lập mẫu bệnh Việc thành lập mẫu tơm nhiễm WSSV có ý nghĩa quan trọng công tác giảng dạy môn bệnh học thủy sản Bộ môn Công Nghệ Sinh Học nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu Hình 4.1 Tôm nghi ngờ nhiễm WSSV với đốm trắng xuất vỏ giáp đầu ngực Ảnh chụp tôm nghi ngờ nhiễm WSSV huyện Cái Nước, tỉnh Cà Mau, tháng 02/2012 28 Hình 4.2 Bảo quản mẫu tơm nghi ngờ nhiễm WSSV 4.2 Đánh giá quy trình nested PCR Lo ctv (1996) với mẫu DNA dƣơng tính với WSSV Năm 1996, Lo ctv thiết kế cặp mồi để phát diện WSSV mẫu tôm sú thu thập Đài Loan, Trung Quốc Với mục tiêu kiểm tra khả hoạt động cặp mồi Lo thiết kế với WSSV gây bệnh tôm Việt Nam, mẫu DNA dƣơng tính với WSSV đƣợc thực nested PCR với cặp mồi 146F1/146R1 146F2/146R2 Hình 4.3 Kiểm tra quy trình nested PCR với mẫu DNA dƣơng tính WSSV Giếng 1, 2, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi 146F1/146R1; giếng 4, mẫu đối chứng âm; giếng 6, 7, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi 146F2/146R2; giếng thang DNA 1000 bp Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 35 phút 29 Trên sở nghiên cứu Lo ctv (1996), kích thƣớc DNA WSSV đƣợc khuếch đại bƣớc (với cặp mồi 146F1, 146R1) 1447 bp bƣớc (với cặp mồi 146F2, 146R2) 941 bp Kết thực nested PCR với mẫu dƣơng tính cho thấy cặp mồi mà Lo ctv thiết kế phát đƣợc WSSV gây bệnh tơm Việt Nam Kích thƣớc sản phẩm với cặp mồi bên (146 F1/146 R1) khoảng 1447 bp kích thƣớc sản phẩm khuếch đại cặp mồi bên (146F2/146R2) 941 bp (hình 4.3) Điều cho thấy cặp mồi sử dụng hoạt động hiệu quả, sử dụng cặp mồi để xây dựng quy trình nested PCR nhằm phát WSSV gây bệnh Cà Mau nhƣ Việt Nam 4.3 Thiết lập quy trình nested PCR có khả phát WSSV đƣợc thu thập từ tỉnh Cà Mau Các mẫu tôm thu thập huyện Đầm Dơi Cái Nƣớc đƣợc sử dụng để thiết lập quy trình nested PCR DNA đƣợc ly trích theo phƣơng pháp shock nhiệt sử dụng NaOH-SDS Kiatpathomchai ctv (2001) Màng tế bào, màng nhân sau bị phá giải phóng DNA vào dung dịch ly trích Bƣớc ly tâm giúp lắng tụ mảnh vỡ tế bào, DNA nằm dịch phía Dịch đƣợc sử dụng trực tiếp để thực nested PCR Mặc dù DNA ly trích có độ tinh khơng cao nhƣng phƣơng pháp ly trích DNA đơn giản, tốn thời gian hóa chất Kết phản ứng cho thấy trình khuếch đại diễn tốt xuất băng sản phẩm PCR có độ sáng cao (hình 4.4 hình 4.5) Nhƣ vậy, phƣơng pháp ly trích DNA quy trình nested PCR đƣợc phát triển nghiên cứu đáng tin cậy 30 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm khuếch đại thực nested PCR với mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập huyện Đầm Dơi Giếng 9: đối chứng dương; giếng 15: đối chứng âm; giếng 2, 3, 4, 5, sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146F1/146R1; giếng 10, 11, 12, 13, 14, sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146F2/146 R2; giếng 8: thang DNA 1000 bp Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 35 phút Sản phẩm khuếch đại mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập huyện Đầm Dơi (hình 4.4) Sau thực khuếch đại bƣớc (với cặp mồi bên ngồi 146F1, 146R1) có mẫu (ở giếng 2, 3, 4) xuất băng sáng, kích thƣớc với đối chứng dƣơng (giếng 1) mẫu (ở giếng 6) khơng thấy băng (có thể sản phẩm khuyếch đại khơng xuất băng điện di) Tuy nhiên, lấy sản phẩm PCR khuếch đại bƣớc dùng làm khuôn DNA để thực PCR bƣớc (với cặp mồi bên 146F2, 146R2) tất mẫu có băng Điều chứng tỏ, sản phẩm PCR bƣớc đƣợc tạo nhƣng nên khơng xuất băng 31 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm khuếch đại thực nested PCR với mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập huyện Cái Nƣớc Giếng 9: đối chứng dương; giếng 15: đối chứng âm; giếng 2, 3, 4, 5, sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146 F1 146 R1; giếng 10, 11, 12, 13, 14, sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146 F2 146 R2; giếng 8: thang DNA 1000 bp Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 35 phút Sản phẩm khuếch đại mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập huyện Cái Nƣớc (hình 4.5) Khi đƣợc khuếch đại bƣớc (với cặp mồi bên ngồi 146F1, 146R1) khơng thấy băng (giếng 2, 3, 4, 5, 7) Tuy nhiên chạy bƣớc (với cặp mồi bên 146F2, 146R2) tất mẫu thu huyện Cái Nƣớc tỉnh Cà Mau có băng sáng Trong nghiên cứu này, thực PCR cặp mồi bên 146R1/146F1 với 10 mẫu thu thập có đến mẫu khơng xuất băng, có mẫu xuất băng quan sát kết điện di Nguyên nhân có khác biệt diện nhiều hay WSSV mẫu tôm thu thập Khi thực với cặp mồi bên 146F2/146R2 có băng Điều cho thấy dựa vào kết thực PCR với 146R1/146F1 để kết luận dƣơng tính hay âm tính với WSSV chƣa xác Kết luận dƣơng tính hay âm tính phải dựa vào kết thực với mồi 146F2/146R2 Năm 2009, Trần Việt Tiên Đặng Thị Hoàng Oanh phát triển quy trình mutiplex PCR phát đồng thời WSSV, IHHNV Để đánh giá diện WSSV, tác giả sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 Đây hạn chế quy trình tác giả Việc dựa vào kết khuếch đại cặp mồi 146F1/146R1 để kết luận âm tính hay dƣơng tính khơng xác trƣờng hợp hiện WSSV tôm thấp 32 Ở giếng 9, 10, 11, 12 (hình 4.4) giếng 9, 10, 11, 12, 13, 14 (hình 4.5) lƣợng sản phẩm khuếch đại nhiều nên điện di xuất vệt dài Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), lƣợng DNA khn dƣ thừa ảnh hƣởng xấu đến q trình khuếch đại, lƣợng DNA khn q cao có khuynh hƣớng tạo lƣợng lớn sản phẩm đƣợc kéo dài từ đoạn mồi sản phẩm nằm đoạn mồi Do vậy, muốn loại bỏ sản phẩm không đặc hiệu này, cần cho hàm lƣợng ADN vừa đủ q trình khuếch đại Thí nghiệm thực loại trừ số nguyên nhân tạp nhiễm DNA ngoại lai, dƣơng tính giả Để giải vấn đề lỗi chạy PCR phản ứng PCR cần có đối chứng sau: đối chứng âm nƣớc để kiểm soát trƣờng hợp tạp nhiễm, đối chứng dƣơng DNA vật chủ để chắn acid nucleic mẫu đƣợc khuếch đại mồi không đặc hiệu hệ gen vật chủ chứng tỏ phản ứng PCR có mạch khn đặc hiệu với mồi (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) Tất 10 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV xuất băng bƣớc (với cặp mồi 146F2/146R2) Điều cho thấy, phản ứng sử dụng đoạn mồi phù hợp để khuếch đại đƣợc đoạn gen WSSV Vì vậy, quy trình đƣợc ứng dụng vào việc phát WSSV Bên cạnh quy trình cho phép loại bỏ trƣờng hợp âm tính giả thông qua việc thực nested PCR với cặp mồi 146 F2/146 R2 Để khẳng định xác tơm bị bệnh WSSV, tiến hành lấy mẫu tôm huyện Đầm Dơi đem giải trình tự Kết giải trình tự WSSV sau đƣợc xử lý phần mềm BioEdit Kết đƣợc đăng ký NCBI với số GenBank JX564899 > JX564899 GGTACTTAATCCCGCATTAAGTTCTACCAACTTTCCCCGAATCAGTCGTAAGAAATTAAACCC CGAGTAAAGAAAAAAGAATTCCCACAAAAAGTGGGGAAAAAAGGAAAACCCCCAATTGAA AATGACTGATACTCACTGCTTCTTCAAGAAAAAAAAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGAT ATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCAC ACTTTTACTCCCTCAGATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTC TCCATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTA CGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTA GCGAATGGACTGAAATGAGAATGAATTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTC GCCCTCTCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAA TAATGCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACG CCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAAC GAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGA ACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTA TCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACC AAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGT AGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAG AAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAAT 33 GTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGGGAGAT ATATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTACCTATTCTTC CTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGT AACTGATGCCCCCCCCAAGGATATATAAAAAGATCCCCCACGTTATTTGGAAAAACCTTACC CCCCCCTTAAATTAAAAAAAATTCCACCTTATTTGGTGGTAAAAACATTCCCCCCCCATAAAG TACTACTACTCGCATATC Phân tích trình tự sở liệu NCBI cho thấy vùng gen WSSV thu huyện Đầm Dơi tỉnh Cà Mau có trình tự tƣơng đồng cao (99%) so với cơng bố trình tự gen WSSV có GenBank AF332093.1, AF369029.2, AF361753.1, AF440570.1, U50923.1 (xem phần phụ lục 1) 4.4 Xác định độ nhạy phƣơng pháp nested PCR Trong nghiên cứu này, chuẩn gốc WSSV - DNA đƣợc xây dựng dựa nghiên cứu Sritunyalucksana ctv (2006) Nồng độ chuẩn gốc đƣợc định lƣợng phƣơng pháp đo OD Chuẩn gốc WSSV - DNA đƣợc xác định có nồng độ 1,12x109 /µl Sau pha lỗng để tạo dãy chuẩn có nồng độ từ 108 đến sao/µl, chuẩn WSSV - DNA đƣợc sử dụng nhƣ khn DNA để thực nested PCR Hình 4.6 Độ nhạy quy trình nested PCR phát WSSV với chuẩn gốc WSSV - DNA Giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 tương ứng với số sao/µl 108, 107, 106 , 105, 104, 103, 102 , 101, 1; giếng 11: đối chứng âm, giếng 1: thang DNA 1000 bp Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 35 phút Kết xác định độ nhạy (hình 4.7) cho thấy độ nhạy quy trình nested PCR đạt 103 Theo nghiên cứu Sritunyalucksana ctv (2006) xây dựng 34 chuẩn WSSV – DNA đánh giá độ nhạy quy trình Lo ctv (1996) phát triển Kết xác định độ nhạy mức 102 Trong đó, nghiên cứu phát đƣợc 103 chạy nested PCR Nguyên nhân enzym hoạt động yếu hay thao tác pha loãng mẫu chƣa Tuy nhiên, quan sát mắt thƣờng để khẳng định số chƣa xác 4.5 Độ đặc hiệu quy trình nested PCR để phát WSSV Cà Mau Để đánh giá độ đặc hiệu quy trình, thực ly trích mẫu tơm kiểm tra dƣơng tính với WSSV mẫu tơm kiểm tra dƣơng tính với IHHNV (bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mô) Tiến hành khuếch đại mẫu tôm nhiễm bệnh với cặp mồi 146F1, 146R1 146F2, 146R2 Hình 4.7 Kết điện di độ đặc hiệu quy trình.Giếng 1: thang 1000 bp; giếng 2: đối chứng dương; giếng 3: mẫu tôm nhiễm WSSV; Giếng 4: mẫu tôm nhiễm IHHNV; giếng 5: đối chứng âm Điện di với gel agarose 1,5% hiệu điện 80 V 35 phút Kết từ hình 4.8 cho thấy băng xuất mẫu nhiễm WSSV, mẫu IHHNV không thấy xuất băng Điều cho thấy quy trình đặc hiệu để chẩn đốn WSSV tơm mức độ tin cậy qui trình PCR phát WSSV cao (khắc phục đƣợc trƣờng hợp âm tính giả) 35 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thu đƣợc 10 mẫu tôm nghi nhiễm WSSV tỉnh Cà Mau (5 mẫu huyện Đầm Dơi mẫu huyện Cái Nƣớc) Quy trình nested PCR vừa đƣợc thiết lập phát tôm nhiễm WSSV tƣơng ứng với kết đƣợc xác định kit Công ty Việt Á Thiết lập đƣợc quy trình có khả phát 10 mẫu nhiễm WSSV Cà Mau Trình tự WSSV tỉnh Cà Mau có tƣơng đồng cao (99%) so với trình tự đƣợc cơng bố giới Quy trình nested PCR xác định độ nhạy với WSSV 103 Quy trình có độ đặc hiệu cao với WSSV 5.2 Đề nghị Đánh giá quy trình với mẫu nhiễm WSSV tỉnh khác Tối ƣu hóa quy trình nhằm rút ngắn thời gian phản ứng gia tăng độ nhạy Sử dụng quy trình để kiểm tra phát virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm giống, bố mẹ, tôm thịt 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Báo cáo hội thảo tơm sú Hải Phòng, ngày 28 – 29/ 2004 Tổng quan bệnh virus đốm trắng tơm he (Penaeus) Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004 Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng 1997 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Nguyễn Văn Hảo, 1995, Bệnh tôm- số hiểu biết cần thiết biện pháp phòng trị, Nhà xuất Nơng nghiệp Nguyễn Văn Hảo 2004 Một số bệnh thường gặp tôm sú (Penaeus monodon) – phương pháp chẩn đốn biện pháp phòng trị Nhà xuất Nơng nghiệp Nguyễn Thị Tuyết Hoa 2011 Quy trình nested PCR phát vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV) nội giáp xác mƣời chân Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 17a1-8 Trần Thị Việt Ngân 2002 Hỏi đáp kỹ thuật nuôi tôm sú Nhà xuất Nông nghiệp Trần Thị Minh Tâm 1999 Bệnh thường gặp tơm phương pháp chẩn đốn phòng trị Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội Bùi Quang Tề 2003 Bệnh tôm nuôi biện pháp phòng trị Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Văn Thanh 2007 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục 11 Trần Việt Tiên, Trần Thị Mỹ Duyên Đặng Thị Hoàng Oanh 2008 Phát triển quy trình MRT – PCR phát GAV (Gill-associated virus) beta-actin tơm sú Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ :176-180 12 Trần Việt Tiên Đặng Thị Hồng Oanh 2009 Phát triển quy trình mPCR phát đồng thời white spot syndrome virus, infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus tôm sú (Penaeus monodon) sử dụng gen β-actin làm nội chuẩn Kỷ yếu Hội Nghị Khoa Học Thủy Sản Toàn Quốc năm 2009, 197 - 201 13 Thông tƣ 83/2011/TT-BNNPTNT Danh mục bệnh thủy sản phải công bố dịch Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn ban hành, năm 2011 14 Phạm Hùng Vân 2002 Cẩm nang kỹ thuật PCR RT-PCR phát tác nhân virus thường gây bệnh tôm sú Penaeus monodon Công ty Thƣơng mại Dịch vụ Nam Khoa 15 Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học  Tài liệu nƣớc 16 Bonilla E.C.M, Sanz V.A., Wille M, Sorgeloos P and Pensaert M.B 2008 A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus Journal of Fish Diseases, 31, - 18 17 Kiatpathomchai W, Boonsaeng V, Tassanakajon A, Wongteerasupaya C, Jitrapakdee S and Panyim Sakol 2001 A non-stop, single-tube, semi-nested PCR technique for grading 37 the severity of white spot syndrome virus infection in Penaeus monodon Diseases of Aquatic Oraganisms 47:235-239 18 Lightner D.V., 1996, A handbook of Pathology and Diagnostic Procedures of diseases of Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA 19 Lo, C.F., Leu, J.H., Ho, C.H., Chen, C.H., Peng, S.E., Chen, Y.T.,Chou, C.M., Yeh, P.Y., Huang, C.J., Chou, H.Y.,Wang, C.H., Kou,G.H 1996 Detection of baculovirus associated with white spotsyndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction Diseases of Aquatic Oraganisms 25: 133–141 20 Martínez J.G.S, Guzmán G.A and Humberto Mejía-Ruíz 2007 White Spot Syndrome Virus in cultured shrimp: A review 2007.Aquaculture Research 38: 1339 – 1354 21 McPherson M.J Moller S G 2001 PCR The United States of America 22 Nunan L M and Donald V.Lightner 2011 Optimized PCR assay for detection of white spot syndrome virus (WSSV) Journal of Virological Methods 171: 318–321 23 Sritunyalucksana K., Srisala J., McColl K., Nielsen L and Timothy W Flegel 2006 Comparison of PCR testing methods for white spot syndrome virus (WSSV) infections in penaeid shrimp Aquaculture 255: 95–104 24 Peng S.E., Lo C.F., Ho C.H., Chang C.F., Kou G.H., 1998 Detection of white spot baculovirus (WSBV) in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, using polymerase chain reaction Aquaculture 164 - 1998 253–262  Tài liệu internet 25 Hoàng Diệu - Hồng Nhung, Cà Mau: Ni tơm trƣớc biến đổi khí hậu, 2012, http://www.vietlinh.com.vn/lobby/aquaculture_news_show.asp?ID=14566, 01/07/2012 26 Đ.T.Chánh - Hồng Mạnh, Tơm tiếp tục chết hàng loạt, 2012, http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/45/83/93499/tom-tiep-tuc-chet-hang-loat.aspx, 05/07/2012 27 Văn Dũng - Lệ Thuỷ,Tìm hiểu bệnh đốm trắng tôm sú, 2010, http://www.agroviet.gov.vn/pages/news_detail.aspx?NewsId=10999, 23/02/2012 28 Báo cáo: Kết thực kế hoạch sản xuất ngƣ – lâm – nông nghiệp phát triển nông thôn tỉnh Cà Mau năm 2011 phƣơng hƣớng nhiệm vụ năm 2011, http://sonnptnt.camau.gov.vn/#details/702/1, 20/03/2012 29 Staroscik A., 2004, http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html, 15/05/2012 30 Tổng cục thống kê, 2011, Tình hình kinh tế-xã hội 12 tháng năm 2011, http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=413&thangtk=12/2011, 15/06/2012 31 Ngọc Tú, nhiều hộ lao đao dịch đốm trắng tơm, http://www.baomoi.com/Home/SucKhoe/vovnews.vn/Nhieu-ho-lao-dao-vi-dich-domtrang-o-tom/4172947.epi, 17/ 03/ 2012 32 Việt Dũng, tôm chết hàng loạt Cà Mau, http://khoahocthuysan.org/index.php/vi/news/Dich-benh-thuy-san/Tom-nuoi-chet-hangloat-o-Ca-Mau-92/, 08/06/2012 38 PHỤ LỤC Phụ lục Kết Alignment trình tự phần mềm BioEdit 39 Phụ lục 1(tt) Kết Alignment trình tự phần mềm BioEdit 40 ... TRÊN TÔM TẠI TỈNH CÀ MAU BẰNG NESTED PCR Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐƠN THI N THỊ KIM KỶ KS HUỲNH ĐĂNG SANG Tháng năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu... khuyến khích, tạo điều kiện cho học tập tốt Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012 Sinh viên thực Thi n Thị Kim Kỷ ii TÓM TẮT Vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), nhóm tác nhân gây tổn thất nghiêm trọng... nhiễm Cho đến nay, cơng tác phòng bệnh biện pháp hiệu để hạn chế thi t hại bệnh đốm trắng Trong việc thả ni tơm giống bệnh điều cần thi t Do đó, cần có quy trình chẩn đốn sớm WSSV tơm giống tơm