Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue

Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG và IgM đặc hiệu virus Dengue luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue CẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue CẢNH HUYỀN TRANG Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2020 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Cảnh Huyền Trang Đề tài luận văn: Nghiên cứu phát triển que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: CB170124 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 30 tháng 10 năm 2020 với nội dung sau: Sửa đổi số thuật ngữ Sửa lỗi tả, in ấn Bổ sung trích dẫn hình ảnh phần tổng quan Sửa đổi cách trình bày tài liệu tham khảo Bổ sung số lượng mẫu thử phản ứng chéo Bổ sung cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu que thử Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm 2020 Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Bản luận văn nghiên cứu tơi với hỗ trợ Phịng thí nghiệm kỹ thuật Protein - Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Bách khoa Hà Nội Các kết nghiên cứu luận văn hoàn tồn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Học viên Cảnh Huyền Trang LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, Trưởng phịng thí nghiệm Proteomics ln tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn sinh viên, học viên làm việc phòng thí nghiệm Proteomics, đặc biệt bạn Trần Vân Trang, K61 - Công nghệ sinh học, giúp đỡ đồng hành tơi q trình thực nghiên cứu Kinh phí để thực nghiên cứu hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu tạo que thử nhanh phát virus Dengue ứng dụng phát tác nhân gây bệnh sốt xuất huyết”, mã số B2020-BKA-08 Bộ Giáo dục Đào tạo tài trợ Tôi xin chân thành cảm ơn Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán Khoa Kiểm định Hóa lý – Viện Kiểm định Vắc xin Sinh phẩm y tế tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình người thân ủng hộ, động viên, tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Người viết báo cáo Cảnh Huyền Trang TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: “Nghiên cứu phát triển que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue” Tác giả luận văn: Cảnh Huyền Trang Khóa: 2017B Người hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong Từ khóa (Keyword): Nội dung tóm tắt: a) Lý chọn đề tài: Bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) bệnh nhiễm virus dengue cấp tính muỗi Aedes aegypti (thường gọi muỗi vằn) truyền SXHD bệnh ghi nhận có từ kỷ 18, số ca bệnh có xu hướng liên tục tăng lên vòng 50 năm gần Hiện chưa có vắc xin giúp phịng (ngừa) bệnh SXHD cách hiệu quả, chưa có thuốc hay phương pháp điều trị mang tính đặc hiệu bệnh SXHD Theo Tổ chức y tế giới (WHO), bệnh lưu hành 128 quốc gia, 3,9 tỷ người sống vùng nguy mắc bệnh, hang năm có khoảng 390 triệu người nhiễm bệnh Bệnh có xu hướng phổ biến nước nhiệt đới cận nhiệt đới, coi nguyên nhân hang đầu dẫn đến tình trạng nhập viện, tử vong khu vực Bệnh SXHD có mặt hầu hết tỉnh/thành phố Việt Nam, tính từ đầu năm 2020 đến ngày 15 tháng năm 2020, nước ghi nhận 65.046 trường hợp mắc SXHD, có trường hợp tử vong Bệnh nguy hiểm với nguy tử vong cao khơng phát sớm, xác xử lý kịp thời Hiện việc chẩn đoán virus Dengue thực nhiều phương pháp như: phương pháp nuôi cấy, phân lập virus; phương pháp huyết học (ELISA-NS1 phát kháng nguyên NS1; Mac-ELISA phát kháng thể); kỹ thuật sinh học phân tử (Nested RT-PCR; Real-time RT-PCR) Tuy nhiên phương pháp bộc lộ nhiều hạn chế thời gian phân tích kéo dài, cho kết chậm, không phù hợp việc chẩn đốn điều trị, chủ yếu phục vụ cơng tác giám sát dịch tễ; mặt khác đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, nhân viên thực cần phải đào tạo giá thành phân tích cao Trong bệnh SXHD xuất nơi, từ thành phố lớn đến vùng nông thôn Việc xét nghiệm cần thực nhiều sở kể sở có hệ thống trang thiết bị cịn thơ sơ, kỹ thuật cao hồn tồn khơng phù hợp Thực tế nay, sở xét nghiệm có nhu cầu sử dụng que thử nhanh, nhiên hoàn toàn phải nhập sinh phẩm Việc nhập dẫn đến số vấn đề không chủ động nguồn sinh phẩm, giá thành cao Do đó, việc phát triển que thử nhanh phát virus Dengue cách đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị chuyên dụng, với độ nhạy, độ đặc hiệu cao đặc biệt từ nguồn gen virus Việt Nam đề tài thực có ý nghĩa khoa học thực tiễn Chính vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phát triển que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue” b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu - Mục đích: Tinh protein NS1 tái tổ hợp có hoạt tính, xác định điều kiện thích hợp để chế tạo que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue xác định đặc tính que thử - Đối tượng: Đối tượng nghiên cứu đề tài que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue - Phạm vi: quy mơ phịng thí nghiệm c) Tóm tắt đọng nội dung đóng góp tác giả - Tinh protein NS1 tái tổ hợp kiểm tra đặc tính protein NS1 tái tổ hợp - Nghiên cứu tối ưu điều kiện tạo cộng hợp kháng nguyên (protein NS1 tái tổ hợp) hạt nano vàng - Nghiên cứu tối ưu điều kiện phun kháng thể kháng IgG kháng thể kháng IgM lên màng lai - Nghiên cứu xác định đặc tính que thử d) Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp vi sinh: + Phương pháp nuôi cấy giữ giống vi sinh vật + Phương pháp tạo tế bào khả biến + Phương pháp biến nạp vào E coli + Phương pháp biểu protein NS1 tái tổ hợp vi khuẩn E coli - Phương pháp hóa sinh: + Phương pháp điện di SDS-PAGE + Phương pháp tách chiết protein + Phương pháp tinh protein + Phương pháp Dot Blot + Phương pháp ELISA - Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch e) Kết luận - Tinh protein NS1 tái tổ hợp có hoạt tính với hiệu suất thu hồi sau đổi đệm đạt 93,2% - Tối ưu điều kiện chế tạo que thử, bao gồm: + Điều kiện tạo cộng hợp: kích thước hạt vàng: 15 nm; hàm lượng NS1 tạo cộng hợp: µg/miếng cộng hợp; pH tạo cộng hợp: pH = 9; nhiệt độ tạo cộng hợp: 4°C; thời gian tạo cộng hợp: 30 phút; nhiệt độ sấy miếng cộng hợp: 37°C; thời gian sấy miếng cộng hợp: 30 phút + Điều kiện cố định kháng thể kháng IgG IgM lên màng lai: hàm lượng kháng thể kháng IgM cố định lên màng lai: 0,5 µg/que; nhiệt độ xử lý màng lai: 37°C; thời gian sấy màng lai: 30 phút; đệm cố định kháng thể lên màng lai: IB (2% Sucrose/20 mM SB - Xác định số đặc tính que thử, bao gồm: độ lặp lại (đạt yêu cầu); phản ứng chéo (không phản ứng với virus cúm, sởi gây triệu chứng lâm sàng giống Dengue); độ nhạy (87%); độ đặc hiệu (100%); thể tích mẫu huyết cần tải lên que thử (10 µl) MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Bệnh sốt xuất huyết Dengue .3 1.1.1 Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) 1.1.2 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết Dengue giới 1.1.3 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết Châu Á – Thái Bình Dương 1.1.4 Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết diễn Việt Nam 1.2 Virus Dengue 10 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc virus Dengue 10 1.2.2 Đặc điểm di truyền virus Dengue 11 1.2.3 Đặc điểm protein NS1 13 1.2.4 Quá trình nhân lên virus tế bào 14 1.2.5 Protein NS1 – dấu ấn sinh học cho chẩn đoán sớm sốt xuất huyết 15 1.3 Một số phƣơng pháp chẩn đoán sốt xuất huyết 16 1.3.1 Phương pháp phân lập virus 17 1.3.2 Phương pháp chẩn đoán dựa phát axít nucleic 18 1.3.3 Phương pháp chẩn đoán qua xét nghiệm huyết 18 1.4 Que thử 21 1.4.1 Nguyên lý que thử 21 1.4.2 Đặc tính thành phần que thử 22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu 25 i 2.1.1 Hóa chất kháng thể 25 2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp vi sinh 27 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 29 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng nguyên – hạt nano vàng 33 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cố định kháng thể lên màng nitrocellulose 35 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Kết tinh kháng nguyên - protein tái tổ hợp NS1 37 3.1.1 Tinh kháng nguyên NS1 tái tổ hợp 37 3.1.2 Kết đổi đệm tái cuộn gấp NS1 38 3.1.3 Kiểm tra NS1 tái tổ hợp với kháng thể đơn dòng thương mại kháng NS1 40 3.1.4 Kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu protein NS1 tái tổ hợp tinh với IgM huyết dương tính với virus Dengue 41 3.2 Kết nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng nguyên – hạt nano vàng 42 3.2.1 Kích thước hạt vàng 42 3.2.2 Hàm lượng kháng thể tạo cộng hợp 43 3.2.3 pH tạo cộng hợp 44 3.2.4 Nhiệt độ tạo cộng hợp 45 3.2.5 Thời gian tạo cộng hợp 46 3.2.6 Nhiệt độ sấy miếng cộng hợp 47 ii hoàn toàn tín hiệu vạch rõ nét, chọn chúng tơi lựa chọn thời gian sấy màng 30 phút cho nghiên cứu 10 phút 40 phút 20 phút 50 phút 30 phút 60 phút Hình 19 Xác định thời gian thích hợp sấy màng lai 3.3.4 Đệm cố định kháng thể lên màng lai Đệm cố định kháng thể thành phần có vai trị quan trọng que thử Thành phần nồng độ chất đệm cố định kháng thể ảnh hƣởng đến dòng mao dẫn đặc biệt độ bền kháng thể đƣợc cố định trình bảo quản Thơng thƣờng que thử đƣợc bảo quản 4℃ nhiệt độ phịng, đó, độ bền kháng thể yếu tố quan trọng Trong nghiên cứu này, loại đệm cố định kháng thể khác đƣợc sử dụng để đánh giá lựa chọn hệ đệm phù hợp Năm hệ đệm bao gồm: Tên đệm Thành phần IB1 2% Trehalose/20mM SB IB2 2% Sucrose/20mM SB IB3 1% BSA/20mM SB IB4 IB5 2%Trehalose/2%Sucrose/SB 20mM SB 20mM Kết cho thấy đệm IB3 cho tƣợng âm tính giả, hệ đệm cịn lại, có vạch màu hồng xuất vị trí vạch kiểm tra, nhiên hệ đệm 51 IB2 tín hiệu vạch xuất rõ nét nhất, chúng tơi lựa chọn đệm IB2 có thành phần 2% Sucrose/20mM SB đệm sử dụng để cố định kháng thể lên màng lai IB (+) (-) IB (+) (-) IB (+) (-) IB (+) (-) IB (+) (-) Hình 20 Xác định hệ đệm thích hợp cố định kháng thể lên màng lai 3.4 Kết nghiên cứu điều kiện thích hợp cố định kháng thể kháng IgG lên màng nitrocellulose Do kháng thể kháng IgG IgM kháng thể thƣơng mại có nồng độ chất tƣơng tự nhau, chúng tơi sử dụng điều kiện thích hợp cố định kháng thể kháng IgM ngƣời lên màng cho kháng thể kháng IgG ngƣời, bao gồm: - Hàm lƣợng kháng thể IgG cố định lên màng: 0,5 µg/que Nhiệt độ sấy màng: 37°C Thời gian sấy màng: 30 phút Đệm cố định kháng thể lên màng: IB2 (có thành phần 2% Sucrose/20mM SB) (+) (-) Hình 21 Kết thử nghiệm mẫu huyết dương tính IgG virus Dengue 52 3.5 Kết chế tạo que thử Sau xác định đƣợc điều kiện thích hợp tạo cộng hợp cố định kháng thể lên màng, tiến hành chế tạo que thử vạch bao gồm vạch kiểm tra vạch đối chứng, thử nghiệm que thử mẫu huyết dƣơng tính âm tính với IgG IgM virus Dengue, kết cho thấy que thử hoạt động tốt, cho kết dƣơng tính với huyết dƣơng tính với IgG IgM kết âm tính với huyết âm tính Hình 22 Kết thử nghiệm que thử vạch mẫu huyết dương tính âm tính với IgG IgM virus Dengue 3.6 Kết nghiên cứu đặc tính que thử 3.6.1 Phản ứng chéo Chúng tiến hành thử nghiệm với huyết thu đƣợc từ tác nhân virus gây triệu chứng lâm sàng (sốt, phát ban) giống với sốt xuất huyết gồm: mẫu huyết bệnh nhân nhiễm virus cúm mẫu huyết bệnh nhân nhiễm virus sởi Kết cho thấy khơng có mẫu huyết dƣơng tính với que thử phát IgG IgM virus Dengue 53 Hình 23 Kết nghiên cứu phản ứng chéo 3.6.2 Khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu Độ nhạy độ đặc hiệu phản ánh mức độ xác que thử Độ nhạy tiến tới 100% âm tính giả tiến đến Độ đặc hiệu tiến đến 100% dƣơng tính giả tiến đến Âm tính giả thấp độ nhạy cao Và ngƣợc lại, dƣơng tính giả thấp độ đặc hiệu cao Cơng thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu: Độ nhạy = số trƣờng hợp dƣơng tính thật/(số trƣờng hợp dƣơng tính thật + số trƣờng hợp âm tính giả) Độ đặc hiệu = số trƣờng hợp âm tính thật/(số trƣờng hợp âm tính thật + số trƣờng hợp dƣơng tính giả) Do mẫu huyết dƣơng tính với IgG IgM chúng tơi thu thập đƣợc (chỉ có mẫu, hình ảnh thử que vạch cho kết dƣơng tính với IgG IgG (Hình 3.21), để khảo sát độ nhay, độ đặc hiệu que thử này, sử dụng 30 mẫu huyết dƣơng tính 30 mẫu huyết âm tính với IgM virus Dengue Kết khảo sát đƣợc liệt kê bảng sau: 54 Kết Huyết (+) Mẫu dƣơng tính thật 26 Mẫu âm tính giả Huyết (-) Mẫu âm tính thật 30 Mẫu dƣơng tính giả Đánh giá kết quả: - Độ nhạy (SE) = 26/(26+0) x 100 = 87% - Độ đặc hiệu (SP) = 30/(30+0) x 100 = 100% Hình 24 Kết khảo sát độ nhạy que thử 55 Hình 25 Kết khảo sát độ đặc hiệu que thử 3.6.3 Khảo sát độ lặp lại Trong điều kiện phịng thí nghiệm, thử nghiệm 10 que thử mẫu huyết dƣơng tính 10 que thử mẫu huyết âm tính, kết cho thấy 100% mẫu dƣơng tính đƣợc thử nghiệm cho kết dƣơng tính, 100% mẫu âm tính đƣợc thử nghiệm cho kết âm tính, tín hiệu vạch kiểm tra vạch đối chứng que thử mẫu có tƣơng đồng 56 Hình 26 Kết khảo sát với 10 que thử mẫu âm tính (n=10) Hình 27 Kết khảo sát với 10 que thử mẫu dương tính (n=10) 3.6.4 Khảo sát thể tích huyết tải lên que thử Từ kết ELISA, tiến hành chọn mẫu huyết dƣơng tính có tín hiệu OD thấp mẫu huyết dƣơng tính có tín hiệu OD cao để thực khảo sát Với mẫu huyết thanh, tải lần lƣợt thể tích sau lên que thử: 0,5 µl; µl; µl 10 µl Kết cho thấy thể tích 10 µl huyết cho 57 tín hiệu vạch rõ nét nhất, chúng tơi lựa chọn thể tích 10 µl thể tích huyết tải lên que thử 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl µl µl µl µl µl µl 10 µl 10 µl 10 µl Hình 28 Kết khảo sát thể tích huyết tải lên que thử với mẫu huyết dương tính có tín hiệu OD (ELISA) thấp 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl µl µl µl µl µl µl µl µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 0,5 µl Hình 29 Kết khảo sát thể tích huyết tải lên que thử với mẫu huyết dương tính có tín hiệu OD (ELISA) cao 58 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc, đƣa số kết luận nhƣ sau: - Đã tinh đƣợc protein NS1 tái tổ hợp có hoạt tính với hiệu suất thu hồi sau đổi đệm 93,2%; có khả phản ứng với IgG IgM tự nhiên huyết bệnh nhân dƣơng tính với virus Dengue - Tối ƣu đƣợc điều kiện chế tạo que thử, bao gồm: + Điều kiện tạo cộng hợp: kích thƣớc hạt vàng: 15 nm; hàm lƣợng NS1 tạo cộng hợp: µg/miếng cộng hợp; pH tạo cộng hợp: pH = 9; nhiệt độ tạo cộng hợp: 4°C; thời gian tạo cộng hợp: 30 phút; nhiệt độ sấy miếng cộng hợp: 37°C; thời gian sấy miếng cộng hợp: 30 phút + Điều kiện cố định kháng thể kháng IgG IgM lên màng lai: hàm lƣợng kháng thể kháng IgM cố định lên màng lai: 0,5 µg/que; nhiệt độ xử lý màng lai: 37°C; thời gian sấy màng lai: 30 phút; đệm cố định kháng thể lên màng lai: IB2 (2% Sucrose/20 mM SB - Xác định đƣợc số đặc tính que thử, bao gồm: độ lặp lại (đạt yêu cầu); phản ứng chéo (không phản ứng với virus cúm, sởi gây triệu chứng lâm sàng giống Dengue); độ nhạy (87%); độ đặc hiệu (100%); thể tích mẫu huyết cần tải lên que thử (10 µl) KIẾN NGHỊ Đề tài thành công bƣớc đầu để phát triển sản xuất thƣơng mại hóa sản phẩm nghiên cứu, giúp cho Việt Nam có đƣợc sinh phẩm chẩn đoán nhanh nhiễm virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết Để hoàn thiện sản phẩm, đề tài cần phải tiếp tục số nghiên cứu: - Tăng độ nhậy que thử - Khảo sát nhiệt độ bảo quản thời hạn bảo quản que thử - Đánh giá thử nghiệm que thử với cỡ mẫu lớn - Thử nghiệm phản ứng chéo với chủng virus Flaviridae khác nhƣ: Chikungunya; West nile, Viêm não Nhật Bản virus Zika - Phát triển thành sinh phẩm thƣơng mại 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Bộ Y Tế, (2011), Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết dengue Ban hành kèm theo Quyết định số 458/QĐ-BYT ngày 16 tháng 02 năm 2011 Bộ trƣởng Bộ Y tế [2] Cục y tế dự phịng (2020), Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết biện pháp phòng chống trọng tâm [3] Đỗ Quang Hà, Trần Văn Tiến (1984) “Dịch dengue xuất huyết tai Việt Nam từ 1975-1983” Tạp chí Y học Việt Nam, số 28-40 [4] Đỗ Quang Hà, Vũ Thị Quế Hƣơng, Huỳnh Thị Kim Loan cộng (1996), “Dịch Dengue xuất huyết 1995 tỉnh phía Nam”, Chuyên đề sốt xuất huyết viêm não, trang 33-40 [5] Lê Xuân Hải, Hiểu sử dụng hợp lý xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán sốt xuất huyết (Sốt Dengue), Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng [6] Bé P.V H.T Mỹ (2009), Xét nghiệm ELISA phát kháng nguyên NS1 chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh 13(1): pp 249-355 [7] Nghiên cứu tổng hợp hạt nano vàng khảo sát khả gắn kết với kháng thể kháng vi khuẩn E.Coli Tạp chí phát triển KH&CN, tập 16, Số T3-2013 Tài liệu tham khảo tiếng Anh [8] A.Muller David Paul R Young (2013), "The flavivirus NS1 protein: molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker", Antiviral research 98(2), tr 192-208 [9] Akey David cộng (2014), "Flavivirus NS1 structures reveal surfaces for associations with membranes and the immune system" 343(6173), tr 881-885 [10] Alcon Sophie cộng (2002), "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Specific to Dengue Virus Type Nonstructural Protein NS1 Reveals Circulation of the Antigen in the Blood during the Acute Phase of Disease in Patients Experiencing Primary or Secondary Infections", Journal of Clinical Microbiology 40(2), tr 376-381 60 [11] Ana C Alcalá cộng (2017), "The dengue virus non-structural protein (NS1) is secreted from infected mosquito cells via a non-classical caveolin-1-dependent pathway", Virology Journal 98(8), tr 2088-2099 [12] Bäck Tuiskunen Anne Åke Lundkvist (2013), "Dengue viruses – an overview", Infect Ecol Epidemiol [13] Bharaj Preeti cộng (2008), "Concurrent infections by all four dengue virus serotypes during an outbreak of dengue in 2006 in Delhi, India", Virology journal 5(1), tr [14] Blacksell D Stuart cộng (2011), "Evaluation of Six Commercial Point-of-Care Tests for Diagnosis of Acute Dengue Infections: the Need for Combining NS1 Antigen and IgM/IgG Antibody Detection To Achieve Acceptable Levels of Accuracy", Clin Vaccine Immunol [15] Byk LA Andrea Gamarnik (2016), "Properties and functions of the dengue virus capsid protein", Annual review of virology 3, tr 263-281 [16] Chambers J Thomas cộng (1990), "Flavivirus genome organization, expression, and replication", Annual review of microbiology 44(1), tr 649-688 [17] Chambers J Thomas, David W McCourt Charles M Rice (1989), "Yellow fever virus proteins NS2A, NS213, and NS4B: Identification and partial N-terminal amino acid sequence analysis", Virology Journal 169(1), tr 100-109 [18] Chappell KJ cộng (2008), "West Nile Virus NS2B/NS3 protease as an antiviral target", Current medicinal chemistry 15(27), tr 27712784 [19] Chow L Hsu S T (1989), "MAC-ELISA for the detection of IgM antibodies to dengue type I virus (rapid diagnosis of dengue type I virus infection)", Zhonghua Min Guo Wei Sheng Wu Ji Mian Yi Xue Za Zhi 22(4), tr 278-85 [20] Dutra Rocha Nina cộng (2009), "The Laboratorial Diagnosis of Dengue: Applications and Implications", Journal Global Infectious Diseases 1(1), tr 38-44 61 [21] Faustino Andre cộng (2019), "Structural and Functional Properties of the Capsid Protein of Dengue and Related Flavivirus", International journal of molecular sciences 20(16), tr 3870 [22] Fry R Scott cộng (2011), "The diagnostic sensitivity of dengue rapid test assays is significantly enhanced by using a combined antigen and antibody testing approach", PLoS Negl Trop Dis 5(6), tr e1199 [23] Gebhard Leopoldo, Claudia V Filomatori Andrea V Gamarnik (2011), "Functional RNA elements in the dengue virus genome", Journual Viruses 3(9), tr 1739-1756 [24] Guabiraba Rodrigo Bernhard Ryffel (2014), "Dengue virus infection: current concepts in immune mechanisms and lessons from murine models" 141(2), tr 143-156 [25] Gurukumar KR cộng (2009), "Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses", Virology Journal [26] Hsieh Szu-Chia cộng (2014), "Highly conserved residues in the helical domain of dengue virus type precursor membrane protein are involved in assembly, precursor membrane (prM) protein cleavage, and entry", Journal of Biological Chemistry 289(48), tr 33149-33160 [27] Leung Y Jason cộng (2008), "Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly", Journal of virology 82(10), tr 4731-4741 [28] Meng Fanchi cộng (2015), "Unstructural biology of the dengue virus proteins", The FEBS journal 282(17), tr 3368-3394 [29] Murrell Sarah, Suh-Chin Wu Michael Butler (2011), "Review of dengue virus and the development of a vaccine", Biotechnology advances 29(2), tr 239-247 [30] Mustafaz ColM.S Lt cộng (2015), "Discovery of fifth serotype of dengue virus (DENV-5): A new public health dilemma in dengue control", Medical journal armed forces India 71(1), tr 67-70 [31] Nemésio Henrique, Francis Palomares-Jerez José Villalaín (2012), "NS4A and NS4B proteins from dengue virus: membranotropic regions", Biochimica et Biophysica Acta -Biomembranes 1818(11), tr 2818-2830 62 [32] Perera Rushika Richard J Kuhn (2008), "Structural Proteomics of Dengue Virus", Curr Opin Microbiol 4(11), tr 369-377 [33] Ramirez Romel Ramirez Ludert E Juan (2019), "The dengue virus nonstructural protein (NS1) is secreted from mosquito cells in association with the intracellular cholesterol transporter chaperone caveolin complex", Journal of virology 93(4) [34] Rushika Perera Richard J Kuhn (2008), "Structural proteomics of dengue virus", Current opinion in microbiology 11(4), tr 369-377 [35] Scaturro Pietro cộng (2015), "Dengue virus non-structural protein modulates infectious particle production via interaction with the structural proteins" 11(11), tr e1005277 [36] Sun Zhihao cộng (2018), "Development of a colloidal goldbased immunochromatographic strip for rapid detection of H7N9 influenza viruses" 9, tr 2069 [37] Suzuki Keita cộng (2019), "Evaluation of novel rapid detection kits for dengue virus NS1 antigen in Dhaka, Bangladesh, in 2017", Virology Journal 102(2019) [38] World Health Organization (2009), Dengue guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control, World Health Organization [39] World Health Organization (2012), Global strategy for dengue preventionand control 2012-2020 [40] Xie Xuping cộng (2013), "Membrane topology and function of dengue virus NS2A protein", Journal of virology 87(8), tr 4609-4622 [41] Kassim FM, Izati MN, TgRogayah, Apandi YM, Saat Z, Use of dengue NS1 antigen for early diagnostics of dengue virus infection Southeast Asian J Trop Med Public Health 2011; 42(3): 562-569 [42] Deubel, V., et al., Identification of dengue sequences by genomic amplification: rapid diagnosis of dengue virus serotypes in peripheral blood J Virol Methods, 1990 30(1): p 41-54 [43] Lanciotti, R.S., et al., Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction JClin Microbiol, 1992 30(3): p 545-51 63 [44] Wang SM and Sekaran SD Early Diagnosis of Dengue Infection Using a Commercial Dengue Duo Rapid Test Kit for the Detection of NS1, IgM and IgG Am J Trop Med Hyg 2010; 83(3): 690-695 [45] Vaughn, D.W., et al., Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity J Infect Dis, 2000 181(1): p.2-9 [46] WHO, (2014), Comprehensive Guidelines for Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever: Revised and Expanded Edition WHO Regional Office for South East Asia [47] Kassim, F.M., et al (2011), Use of Dengue NS1 antigen for early diagnostic of dengue virus infection Southeast Asian J Trop Med Public Health 42 (3): PP 562-569 [48] World Health Organization - Report of the meeting of the WHO/VMI Workshop on Dengue modeling, World Health Organization, Geneva, Switzerland, 2011, pp 14 [49] Brady OJ, Gething PW, Bhatt S, Messina JP, Brownstein JS, Hoen AG et al Refining the global spatial limits of dengue virus transmission by evidencebased consensus PLoS Negl Trop Dis 2012; 6:e1760 doi:10.1371/journal.pntd.0001760 [50] Gubler DJ Dengue/dengue haemorrhagic fever: history and current status Novartis Found Symp 2006; 277:3-16 [51] Gubler D Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever Clin Microbiol Rev 1998; 11(3):480–496 [52] Gubler DJ Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever: Its History and Resurgence as a Global Public Health Problem In: Gubler DJ, Kuno G, editors Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever London: CAB International; 1997 pp 1–22 [53] WHO (2014), A global brief on vecto-borne diseases [54] WHO (2012), Global strategy for dengue prevention and control 20122020 [55] WHO (2014), Comprehensive Guidelines for Prevention and control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever: Revised and Expanded Edition WHO regional Office for South East Asia 64 [56] World Health Organization(2009) Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control (new edition), 147 pages [57] Arima Y et al Epidemiological update on the dengue situation in the Western Pacific Region, 2012 Western Pacific Surveillance and Response Journal, 2015 Trang web [58] Cục Y tế Dự phịng, ngày 26/06/2017 Thơng tin tình hình hoạt động chống dịch bệnh sốt xuất huyết http://vncdc.gov.vn/vi/tin-tuc-trong- nuoc/2203/thong-tin-tinh-hinh-va-hoat-dong-phong-chong-dich-benh-sot-xuathuyet [59] Bộ Y Tế (2020), Triển khai công tác phòng, chống dịch bệnh sốt xuất huyết địa bàn Hà Nội năm 2020, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật thành phố Hà Nội, truy cập ngày 20-06-2020, trang web http://ytdphanoi.gov.vn/1066n/trien-khai-cong-tac-phong-chong-dich-benh-sotxuat-huyet-tren-dia-ban-ha-noi-nam-2020.html [60] Cục Y tế dự phòng (2020), Tăng cường phòng chống sốt xuất huyết, truy cập ngày 20-9-2020, trang web http://vncdc.gov.vn/vi/tin-tuc-trongnuoc/14057/tang-cuong-phong-chong-sot-xuat-huyet [61] Girish Khera, Scientific Animations, A 3d medical animation still shot of a dengue virus with cross section showing structural components trang web http://www.scientificanimations.com [62] Bộ Y tế (2017), Thơng tin tình hình hoạt động phòng chống dịch bệnh sốt xuất huyết, trang web https://moh.gov.vn/web/dich-benh/thong-tin-chung//asset_publisher/3hfjhpWJ5jW5/content/thong-tin-tinh-hinh-va-hoat-ong-phongchong-dich-benh-sot-xuat-huyet [63] Vinmec International Hospital, Muỗi Aedes gây sốt xuất huyết, trang web https://www.vinmec.com/vi/tin-tuc/thong-tin-suc-khoe/muoi-aedes-gay-sotxuat-huyet-dot-nguoi-manh-nhat-luc-sang-som-va-chieu-toi 65 ... tạo que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue xác định đặc tính que thử - Đối tượng: Đối tượng nghiên cứu đề tài que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue - Phạm... Tinh xác định đặc tính protein NS1 tái tổ hợp  Xác định điều kiện thích hợp chế tạo que thử nhanh phát đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue  Xác định đặc tính que thử Nội dung nghiên cứu. .. nhạy, độ đặc hiệu cao đề tài thực có ý nghĩa khoa học thực tiễn Chính vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phát triển que thử nhanh xác định đồng thời IgG IgM đặc hiệu virus Dengue? ??