Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein bcla của vỏ bào tử vi khuẩn bacillus anthracis

Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học bách khoa hà nội Phùng Huyền nhung Nghiên cứu tách dòng biểu gen mà hóa protein BclA vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis Luận văn thạc sỹ khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn Trương Quốc Phong H NI, 2012 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT aa Amp APS BclA bp BSA CLR CTD DNA dNTP EF EDTA EtBr IPTG kb kDa LB LBA LF OD PA PCR PCKB RNA SDS SDSPAGE TBE TE TEMED trx amino acid = axit amin Ampicillin Amonium persunphate Bacillus collagen like protein of anthracis Base pairs = cặp bazơ nitơ Bovine serum albumin collagen - like region C-teminal Domain Deoxyribonucleotide acid = axit deoxyribonucleotit 2’-deroxyribonucleotit 5’-triphosphate Edema Factor Ethylen diamin tetra acetic acid Ethedium bromide Isopropylthio-β-D-galactosidase Kilo base Kilo dalton Luria-betani medium Mơi trường LB có bổ sung ampicillin Lethal Factor Optimal density = mật độ quang học Protective Antigen Polymerase chain reaction = phản ứng trùng hợp chuỗi Phòng chống khủng bố Ribonucleotide acid = axit ribonucleotit Sodium dodecyl sulphate Điện di gel polyacrylamit có chứa SDS Tris-Borate- EDTA Tris - EDTA N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine Gen mã hóa thioredoxin A E coli thiết kế sẵn plasmid pET32a(+) TrxBclA Protein tái tổ hợp lai thioredoxin BclA tổng hợp tế bào E coli Thioredoxin mã hóa gen trx, BclA mã hóa gen BclA VKSH Vũ khí sinh học X-Gal 5- bromo- chloro-3- Indol--D-galactopyranoside Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Mở đầu Vũ khí sinh học (VKSH) công cụ hữu hiệu cho bọn khủng bố giới tính nguy hiểm mức độ hủy diệt mạnh chúng Việc sản xuất chế phẩm sinh học không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có khả sản xuất số lượng lớn với đầu tư dung cụ không nhiều, giá thành rẻ nhiều so với loại vũ khí khác Do vậy, bọn khủng bố dễ dàng sản xuất sử dụng loại vũ khí sinh học Thực tế cho thấy hàng loạt vụ khủng bố đà xảy giới năm gần có liên quan đến sử dụng vũ sinh học Trong chương trình VKSH vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis l tác nhân sinh học thường đựơc sử dụng nhiều vì: trực khuẩn B anthracis tồn tự nhiên dạng bào tử thời gian 10 năm, chúng có khả chịu nhiệt lên đến 160oC phút 100oC 10 Ng­êi cã thĨ bÞ nnhiƠm bƯnh than qua đường: qua da, đường tiêu hoá đường hô hấp Bào tử B anthracis bị hít vào qua mũi chúng có khả tới phế nang để gây bệnh than thể hô hấp cư trú phế bào phế nang, qua hƯ thèng m¹ch b¹ch hut chun tíi h¹ch lympho cđa trung thất Tại đó, vi khuẩn gây bệnh than sinh trưởng xâm nhập theo đường máu gây nhiễm khuẩn huyết nhiễm khuẩn nhiều nơi thể gây tỷ lệ tử vong cao Trước đây, việc xác định B anthracis phòng thí nghiệm chủ yếu dựa vào hình thái học đặc điểm sinh học Sau đó, B anthracis phát thông qua DNA kỹ thuật nhân bội PCR, kỹ thuật có khả phát nhanh so với phương pháp hình thái học đặc điểm sinh hóa học Kỹ thuật PCR có tính chọn lọc mức độ xác cao Tuy nhiên, kỹ thuật PCR đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng; thao tác phức tạp đòi hỏi cán chuyên môn có tay nghề vững vàng Do yêu cầu đấu tranh phòng chống khđng bè b»ng vị khÝ sinh häc, viƯc ph¸t hiƯn nhanh 10 - 15 sù cã mỈt cđa tác nhân gây bệnh nguy hiểm B anthracis yếu tố quan trọng cần thiết để giúp Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung quan chức phòng chống khủng bố sinh học ngăn ngừa ngăn chặn kịp thời tác nhân sinh học nguy hiểm đặc biệt vi khuẩn B anthracis Do vậy, để đạt tới mục tiêu chế tạo công cụ, phương tiện phát nhanh bào tử B anthracis đà chọn phương án chế tạo sinh phẩm thử nhanh dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch cho phép phát trực tiếp bào tử thông qua protein đặc trưng vỏ chúng Kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu vỏ bào tử B anthracis thành phần quan träng cđa bé sinh phÈm Protein BclA lµ mét protein nằm bề mặt vỏ bào tử B anthracis xem thị sinh học, kháng nguyên sở để tạo kháng thể đơn, đa dòng kháng protein vỏ bào tử B anthracis Do tiến hành thực đề tài Nghiên cứu tách dòng biểu gen m· hãa protein BclA cđa vá bµo tư vi khuẩn B anthracis góp phần tạo nguyên liệu cần thiết cho phát triển sinh phẩm dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch Nội dung đề tài: + Thiết kế vector tách dòng vector biểu hiƯn mang gen m· hãa cho protein vïng CTD cđa BclA bề mặt bào tử vi khuẩn B anthracis + Biểu protein BclA tái tổ hợp chủng E coli BL21 + Tinh định lượng protein BclA tái tổ hợp thu Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Chương I Tổng quan tài liệu I Tình hình chung vấn đề vi sinh vật nguy hiĨm HiƯn nay, theo thèng kª cã trªn 200 loại vi khuẩn, virus độc tố gây hại cho người qua đường thực phẩm có khoảng 50 loại có nguồn gốc vi sinh vật đà nghiên cøu, liƯt kª danh mơc vị khÝ sinh häc dùng để công khủng bố sinh học chiến tranh sinh học Các tác nhân chủ yếu chủng vi sinh vật gây bệnh có độc tố với độc lực mạnh, gây nguy hiểm cho người động vật, gây thảm hoạ chết hàng loạt Các tác nhân lây nhiễm qua nhiều đường: lây nhiễm trực tiếp qua da, vết thương, hô hấp, tiêu hoá ; phát tán nhanh diện rộng xa thông qua môi trường nước, không khí, chøa th­, b­u phÈm gưi qua nhiỊu qc gia Các tác nhân sử dụng với nhiều dạng: bột, dịch, dạng phun, dùng động vật mang bệnh, cho vào vũ khí (bom, đạn rocket, tên lửa chứa mầm bệnh, độc tố ) 1.1 Lịch sử Khủng bố sinh học từ xa xưa đà sử dụng trong chiến tranh La Mà cổ đại chất thải sử dụng để công kẻ thù [3] Đây trường hợp khủng bố sinh học giới tiếp tục vào kỷ 14 bệnh dịch hạch sử dụng để công vào thành phố kẻ thù với hy vọng họ sợ hÃi mà sơ tán đến nơi khác để tiêu diệt lực lượng bảo vệ mà không cần phải công Việc sử dụng bệnh dịch hạch vũ khí thời điểm cho thÊy sù thiÕu kiĨm so¸t vị khÝ sinh häc bên có chứa nguồn vũ khí Y tế thời điểm khả ngăn ngừa dịch bệnh từ người sống sót từ trận chiến trở có mang mầm bệnh người, dẫn đến dịch bệnh lan rộng không khu vực kẻ thù mà ảnh hưởng tới người dân sống vùng xung quanh Do sử dụng vũ khí sinh học lại biện pháp, phương tiện kỹ thuật y tế cần thiết để bảo vệ khu vực nên dịch bệnh phổ biến bệnh dịch hạch đà lây lan nhanh chóng Châu Âu, giết chết phần lớn dân số châu lục Các nạn nhân khủng bố sinh học thực tế trở thành nguồn lây truyền bệnh y học thời không đủ kỹ thuật, phương tiện để ngăn chặn hậu khủng bố sinh học gây ra.[7] Luận văn cao häc Phïng HuyÒn Nhung Theo thêi gian, chiÕn tranh sinh học ngày trở nên phức tạp Các quốc gia bắt đầu phát triển vũ khí có hiệu cao khả gây nhiễm khuẩn Một biện pháp tăng cường vũ khí sinh học sử dụng bệnh than Hiệu ban đầu sử dụng bệnh than đà kiểm soát cho nạn nhân sử dụng với lượng lớn Điều đà khiến cho bệnh than lựa chọn để trở thành loại vũ khí vận chuyển dễ dàng, khả sát thương cao, dễ dàng phát tán Ngoài ra, có nhiều chủng vi khuẩn than tìm thấy khắp giới nên chúng dễ dàng lựa chọn vũ khí sinh học từ năm đầu kỷ 19 Một đặc điểm bệnh than để lựa chọn làm vũ khí sinh học khả lây lan nhanh cộng đồng Tuy nhiên bệnh than lây nhiễm người với người Thế kỷ 20 Khi chiÕn tranh thÕ giíi thø nhÊt nỉ ra, bƯnh than dùng để gây bệnh cho động vật nhiên hiệu không cao Ngay sau Chiến tranh giới thứ bắt đầu, Đức đà phát động chiến dịch phá hoại sinh học Mỹ, Nga, Rumania Pháp [4] Mỹ phát triển vũ khí sinh học vào năm 1942 Tổng thống Franklin D Roosevelt đặt George W Merck phụ trách đưa phương hướng phát triển cho vũ khí sinh học[8] Các chương trình kéo dài năm 1969 đến tổng thống Richard Nixon đóng cửa tất chương trình liên quan đến sử dụng vũ khí sinh học quân ®éi Mü [4] Tỉng thèng Mü Richard Nixon tuyªn bè sách ông chiến tranh sinh học họp báo vào ngày 25/11/1969 : Vũ khí sinh học gây hậu lớn, đoán trước có khả kiểm soát Chúng tạo dịch bệnh toàn cầu ảnh hưởng đến sức khỏe hệ tương lai Do Mỹ đà định phá hủy toàn kho dự trữ tác nhân sinh học hạn chế chương trình nghiên cứu sinh học tương lai, bên cạnh trọng biện pháp phòng thủ vaccine thiết bị dò Ngày 10 tháng năm 1972, tổng thống Nixon đà thức đưa Công uớc Vũ khí sinh học Thượng viện Mỹ phê chuẩn Vào năm 1972, cảnh sát Chicago đà bắt giữ hai sinh viên đại học Allen Schwander Stephan Pera, người đà lên kế hoạch đầu độc nguồn nước thành phố vi khuẩn thương hàn Từ đó, nỗ lực để sử dụng chiến tranh sinh học thể rõ ràng tổ chức cực Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung đoan Năm 1984, Dallas, Oregon, Rajneeshe đà kiểm soát bầu cử địa phương cách phát tán vi khuẩn Salmonella typhimurium Cuộc công làm 751 người bị ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng nhiên trường hợp bị tử vong Đây vụ công khủng bố sinh học Mỹ kỷ 20.[26] Vào tháng năm 1993 nhóm tôn giáo Aum Shinrikyo đà phát tán vi khuẩn gây bệnh than ga tầu điện ngầm Tokyo trường hợp bị nhiễm vi khuẩn trớ trêu thay nhóm đà sử dụng vaccine ngừa bệnh than để phát tán Tuy nhiên bào tử thu từ công cho thấy chóng gièng víi mét chđng vaccine ngõa bƯnh than ë ®éng vËt t¹i thêi ®iĨm ®ã ThÕ kû 21 Trong tháng tháng 10 năm 2001, nhóm khủng bố Al-Qaeda đà chuyển thư chứa trực khuẩn bệnh than tới bưu điện, quan công quyền truyền thông Mỹ làm chết người gây hoảng loạn dư luận Tác nhân sinh học Căn vào mức độ ảnh hưởng , nhân tố dùng khủng bố sinh học chia làm ba nhóm A, B, C Nhãm A: Bao gåm c¸c vi sinh vật độc tố có nguy cao an ninh công cộng quốc gia Chúng dễ dàng lây lan lây truyền từ ng­êi sang ng­êi dÉn ®Õn tØ lƯ tư vong cao khả tác động đến sức khỏe cộng đồng Nó gây nên hoảng loạn cộng đồng, phá vỡ ổn định xà hội yêu cầu biện pháp đặc biệt cho bảo vệ sức khỏe cộng đồng Một số tác nhân nhóm A như: Vi khuÈn Francisella tularensis: BÖnh sèt tularemia hay “sèt thá” vi khuẩn gây Đây vi khuẩn Gram âm, hiếu khí Bệnh không lây từ người sang người mà tiếp xúc với lông thú, qua hô hấp, uống nước nhiễm khuẩn qua vết côn trùng cắn Vi khuẩn Francisella tularensis dễ lây nhiễm, với lượng nhỏ gây bệnh Nếu F tularensis sử dụng làm vũ khí chiến tranh chúng phát tán không khí Những người hít phải không khí bị nhiễm khuẩn thường bị viêm đường hô hấp Vi Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung khuẩn sử dụng làm vũ khí sinh học đặc điểm dễ lây trun vµ dƠ sư dơng [5] Vi khn Bacillus anthracis: Bệnh than bệnh nhiễm khuẩn cấp tính từ động vật mà chủ yếu động vật ăn cỏ lây sang ng­êi trùc khuÈn than Bacillus anthracis g©y ra, biểu lâm sàng người hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc toàn thân nặng với tỉ lệ tử vong cao Vi khuẩn than thuộc nhóm Gram dương, hình gậy, sinh bào tử, có sức đề kháng cao với nhân tố vật lý hóa học Vi khuẩn than gây bệnh cho động vật hoang dà động vật nhai lại Con người bị nhiễm mắc bệnh tiếp xúc với gia súc mắc bệnh hay với lượng lớn bào tử B anthracis phát huy độc lực cao xâm nhập vào thể qua đường hô hấp Bệnh than không lây từ người sang người đà có vaccine Bệnh than phát sớm điều trị kháng sinh [5,9,13] Virus gây bệnh đậu mùa: Bệnh đậu mùa gây DNA virus Variola majora Nã dƠ dµng lan trun khÝ qun vµ cã tØ lƯ tư vong rÊt cao (20 – 40%) BƯnh đậu mùa đà diệt trừ từ năm 1970, nhờ chương trình vaccine toàn giới Tuy nhiên, vài chủng virus tồn phòng thÝ nghiƯm ë Nga vµ Mü Mét sè tin r»ng sau sụp đổ liên bang Soviet, số chủng bệnh đậu mùa cất giữ số quốc gia Mặc dù người sinh trước năm 1970 tiêm vaccine phòng bệnh đậu mùa theo chương trình WHO, vaccine có hiệu lực khoảng từ năm [5] Bệnh đậu mùa vũ khí sinh học nguy hiểm lây lan tự nhiên cao theo đường lây nhiễm Vi khuẩn Clostridium botulinum: Là vi khuẩn Gram dương Emile van Ermengem phân lập vào năm 1895, sản sinh độc tố botulin (độc tố gây chết làm suy hô hấp) Độc lực botulin cao, chØ cÇn microgam hay phÇn triƯu gam ®· cã thĨ lµm chÕt mét ng­êi, mét giät chÊt độc làm chết trăm ngàn người Nếu quy trình chế biến bảo quản không tốt chế biến thực phẩm (nhất đồ hộp), thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn Phương pháp làm sôi kết hợp với điều áp diệt vi khn Bµo tư cđa vi khn nµy Ln văn cao học Phùng Huyền Nhung không phát triển đồ hộp có hàm lượng đường cao mật ong, siro có khả phát triển vào đường tiêu hóa trẻ sơ sinh Vi khuẩn Yersinia pestis: Bệnh dịch hạch gây trực khuẩn Gram âm Yersinia pestis Bệnh dịch hạch đà gây đại dịch có sức tàn phá lịch sư, lµm 20 – 30 triƯu ca tư vong kỷ 14 Các loài gặm nhấm thường lµ vËt chđ cđa bƯnh nµy vµ bƯnh nµy trun sang người qua vết cắn bọ chét Bệnh có lịch sử sử dụng làm chiến tranh sinh học nhiều quốc gia coi mối đe dọa chủng có tự nhiên có khả tồn thời gian dài vật chủ Vũ khí đe dọa đến từ chủ yếu bệnh truyền nhiễm thể phổi (lây nhiễm qua hô hấp) [25] Đây bệnh dịch gây Cái chết đen Châu Âu thời trung cổ Virus sèt xuÊt huyÕt Ebola: vius nµy thuéc gièng Ebolavirus, hä Filoviridea g©y bƯnh víi tû lƯ tư vong cao khả gây suy nhược đa quan làm máu trầm trọng Bệnh lây nhiễm tiếp xúc với dịch tiết động vật bị nhiễm thể người bị nhiễm Bệnh chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, bệnh nhân chết cần phải hỏa táng Đây vũ khí sinh học nguy hiểm nhÊt v× bƯnh xt hiƯn nhanh, tØ lƯ tư vong cao.[5] Nhóm B: nhóm quan tâm thứ hai chúng tương đối dễ lây lan, dẫn tới tỉ lệ bệnh trung bình tỉ lệ tử vong thấp Nhóm B bao gồm tác nhân như: vi khuẩn Brucella, sèt Q, Staphylococcal enterotoxin B, viªm n·o virus, mầm bệnh thức ăn nước uống, Nhóm C: tác nhân nghiên cứu thiết kế để lây lan hàng loạt tương lai bới chúng có sẵn, dễ tạo lây lan có khả mắc bệnh cao, tỉ lệ tư vong cịng nh­ møc ¶nh h­ëng tíi søc kháe nghiêm trọng Nhóm gồm tác nhân như: Nipah virus, Hantavirus, SARS, Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Bảng 1: Đặc tính số tác nhân sinh häc th­êng lùa chän lµm vị khÝ sinh häc: Stt Tác nhân Phương thức phát tán Khả Mức lây truyền độ độc Chỉ lây Bào tử dạng bột khí Anthrax (bệnh than) truyền thể Cao dung qua da Cholera (bệnh tả) Trong thực phẩm khÝ Nhanh dung Cao Pneumonic Plague Cht hc khÝ dung (bệnh dịch hạch) Nhanh Cao Tularemia khí dung Không Trung bình Q fever (Bệnh sốt Q) Trong thực phẩm khí Không dung Thấp Tấn công trực tiếp Có khí dung Cao số tip Ebola virus Smallpox (bƯnh ®Ëu KhÝ dung mïa) Nhanh Cao Botulin toxin Trong thùc phÈm hc khÝ Kh«ng dung Cao Ricin toxin Trong thùc phÈm khí Không dung Cao 10 Dengue fever virus Mosquito bome ThÊp Nhanh T×nh h×nh an ninh thÕ giíi thêi gian gần có biến động lớn đặc biệt xảy vụ khủng bố quốc tế có quy mô toàn cầu có sử Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung 5'3' Frame ggactaggacttccagcaggactatatgcatttaactccggtgggatttctttagattta G L G L P A G L Y A F N S G G I S L D L ggaattaatgatccagtaccatttaatactgttggatctcagtttggtacagcaatttct G I N D P V P F N T V G S Q F G T A I S caattagatgctgatactttcgtaattagtgaaactggattctataaaattactgttatc Q L D A D T F V I S E T G F Y K I T V I gctaatactgcaacagcaagtgtattaggaggtcttacaatccaagtgaatggagtacct A N T A T A S V L G G L T I Q V N G V P gtaccaggtactggatcaagtttgatttcactcggagcacctatcgttattcaagcaatt V P G T G S S L I S L G A P I V I Q A I acgcaaattacgacaactccatcattagttgaagtaattgttacagggcttggactatca T Q I T T T P S L V E V I V T G L G L S ctagctcttggcacgagtgcatccattattattgaaaaagttgct L A L G T S A S I I I E K V A Kiểm tra đoạn gen giải trình tự với đoạn gen mà hóa vùng CTD protein BclA Genbank NCBI: Kết giải trình tự cho thấy gen tách dòng mà hóa cho vùng CTD protein BclA chøa 405 nucleotid m· hãa cho protein chøa 135 acid amin với trọng lượng phân tử khoảng 14,8 kDa Trình tự gen tương đồng 100% so với trình tự gen đà công bố ngân hàng gen 50 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung 3.8 Biểu gen mà hóa đoạn CTD protein BclA tế bào E coli BL21 Để tiến hành biểu hiƯn gen BclA, chóng t«i lùa chän chđng biĨu hiƯn E coli BL21 Đây chủng đột biến khả tổng hợp hai proteinase quan trọng, giúp cho protein tái tổ hợp không bị phân cắt proteinase Tế bào E coli BL21 chứa đột biến lon protease (mét protease néi bµo) vµ omp T protease (mét protease ngoại bào) không khả thuỷ phân protein Như vậy, protein nội bào ngoại bào E coli BL21 không bị phân cắt protease Ngoài đặc điểm DNA hệ gen E coli BL21 cã chøa gen m· ho¸ cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7, đưa vào hệ gen E coli BL21 đặt điều khiển promotor lac T7 RNA polymerase enzyme hoạt động mạnh, có khả chép hoàn toàn trình tự DNA đặt kiểm soát T7 promotor Chính nhờ cải biến mà E coli BL21 đà trở thành vật chủ hữu hiệu việc biểu gen ngoại lai, đặc biệt gen đưa vào hệ vector pET Quá trình biểu trình xảy chế tác động chất cảm ứng IPTG lên promoter hoạt động dẫn tới dịch mà tổng hợp protein ngoại lai Trong trình này, chất cảm ứng ®ãng vai trß rÊt quan träng viƯc ®iỊu hßa trình biểu gen ngoại lai Khuẩn lạc E coli BL21 mang plasmid pET32a(+) mang đoạn gen mà hóa vùng CTD protein BclA cấy sang ml m«i tr­êng LB láng cã bỉ sung Ampicillin víi nång độ 100 àg/ml, nuôi lắc qua đêm nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút Sau đó, ml dịch nuôi cấy qua đêm chuyển sang 100 ml môi trường LB có bổ sung Ampicillin nuôi tiếp 37oC, 200 vòng/phút OD đạt từ 0,5 0,8 Bổ sung IPTG nồng độ 500 àM Dịch tế bào tiếp tục nuôi cấy điều kiện 25oC, 200 vòng/phút; tế bào sau cảm ứng thu ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Sau đó, tế bào hòa 10 ml nước khử ion vô trùng Lấy 200 àl hỗn hợp tế bào trộn với đệm phá mẫu protein tỉ lệ 1: 1, mẫu xử lý nhiệt độ 100oC 10 phút; lấy àl mẫu điện di gel polyacrylamide biến tính 12,5% (kết hình 11) 51 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung kDa 116 66 45 35 Trx-BclA ~ 34kDa 25 Trx 18 14 H×nh 11: KÕt điện di kiểm tra thời gian nuôi cấy cảm øng IPTG chđng biĨu hiƯn E Coli BL21 mang vector tái tổ hợp pET32-BclA 1: Đối chứng 2: Dòng tế bào cảm ứng 3: Dòng tế bào cảm ứng 4: Dòng tế bào cảm ứng 5: Dòng tế bào cảm ứng 6: Dòng tế bào cảm øng ë giê 7: Thang protein chuÈn (Fermentas) 8: Dòng tế bào E Coli BL21 mang vector pET32a(+) Từ kết hình 11 ta thấy đường chạy từ số đến số dòng mang gen ngoại lai đà sinh tổng hợp protein có kích thước khoảng 35 kDa, dòng tế bào E coli BL21 chøa vector pET32a(+) kh«ng mang gen chØ tổng hợp protein Trx có kích thước khoảng 20 kDa Kết cho thấy đà có protein ngoại lai tiết đường chạy số băng protein tái tổ hợp đậm sau thời gian cảm ứng IPTG Kích thước protein tái tổ hợp khoảng 35 kDa kích thước protein Trx S-tag kho¶ng 20 kDa nh­ vËy kÝch th­íc protein BclA lại khoảng xấp xỉ 15 kDa tương ứng với trọng lượng protein BclA tính toán theo lý thuyết Kết khẳng định vai trò promoter T7 có vector lượng protein tái tổ hợp tạo chiÕm tØ lƯ kh¸ lín so víi protein cđa tÕ bµo Nh­ vËy gen m· hãa vïng CTD cđa protein BclA biểu 52 Luận văn cao học Phùng Hun Nhung hiƯn tèt E coli BL21 d­íi sù điều khiển promoter T7 cảm ứng IPTG 3.9 ¶nh h­ëng cđa IPTG ®Õn møc ®é biĨu hiƯn protein tái tổ hợp Để biểu gen thành công tế bào chủ, vector biểu phải có promoter mạnh để hỗ trợ trình sinh tổng hợp protein mang gen kháng kháng sinh để tồn tế bào chủ áp lực chọn lọc kháng sinh Tính bền vững plasmid phụ thuộc vào đặc tÝnh di trun cđa tÕ bµo chđ vµ gen n»m plasmid mà phụ thuộc điều kiện nuôi cấy Chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng định khả biểu protein ngoại lai Tuy nhiên, việc sử dụng IPTG cần có giới hạn, nồng độ IPTG cao ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển tế bào Việc xác định nồng độ IPTG tối ưu cho trình biểu gen ngoại lai công việc cần thiết có ý nghĩa thiết thực cho trình sản xuất quy mô lớn sau Để kiểm tra nồng ®é IPTG tèi ­u cho viƯc biĨu hiƯn, nhãm nghiªn cứu bổ sung IPTG theo nồng độ: 50 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM, 300 µM, 400 àM Sau tiến hành thu mẫu sau nuôi cấy, dịch nuôi cấy ly tâm 5000 vòng/phút phút Tủa tế bào thu hòa vào 100 àl nước khử ion vô trùng, sau tiếp tục bổ sung 30 àl dung dịch đệm phá mẫu protein Tiến hành xử lý mẫu 100oC 10 phút để phá vỡ tế bào làm biến tính protein Mẫu protein điện di gel polyacrylamid 12,5% có SDS Kết điện di hình 12: 53 Luận văn cao học kDa Phïng HuyÒn Nhung 116 66 45 35 Trx-BclA ~ 34Kda Trx ~ 20Kda 25 18 14 Hình 12: Kết điện di thử nghiệm nồng độ chất cảm ứng IPTG biểu protein BclA tái tổ hợp gel polyacrylamid – SDS 12,5% 1: Thang protein chuÈn 2: Đối chứng 0h 3: Nồng độ IPTG 50àM 4: Nồng độ IPTG 100àM 5: Nồng độ IPTG 150àM 6: Nồng độ IPTG 200 àM 7: Nồng ®é IPTG ë 300 µM 8: Nång ®é IPTG ë 400 àM 9: Dòng tế bào chưa cảm ứng So sánh đường chạy thấy đường chạy 3, 4, 5, 6, 7, có băng protein đậm xuất với kích thước tương ứng khoảng 35 kDa sau giê c¶m øng b»ng IPTG so với đường chạy đối chứng lúc trước cảm ứng IPTG, điều chứng tỏ đà có protein ngoại lai tiết Và từ đường chạy số đến đường chạy số băng protein tái tổ hợp đậm, nồng độ IPTG tối ưu cho trình cảm ứng 150 àM 54 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung 3.10 Kiểm tra protein tái tổ hợp pha protein tan không tan Các protein tái tổ hợp tổng hợp tế bào dạng tan dạng thể vùi Việc biết xác protein tái tổ hợp tiết tế bào dạng giúp cho trình tinh protein tái tổ hợp dễ dàng đặt kết tốt Do tiến hành thí nghiệm kiểm tra dạng protein tái tổ hợp tiết E coli BL21 Hút 1ml dịch nuôi cấy tế bào E coli BL21 đà chèn plasmid tái tổ hợp cảm ứng IPTG nồng độ 150 àM sau cho vào ống eppendorf 1,5 Các ống eppendorf để ë -72oC giê, sau ®ã sèc nhiƯt ë 65oC phút ly tâm 5000 vòng/phút phút để thu dịch cặn tế bào Bổ sung nước khử ion vô trùng đệm phá mẫu Protein vào ống cặn dịch thu được, tiến hành xử lý nhiệt độ 100oC 10 phút sau đem điện di Kết điện di biến tính protein sau: 55 Luận văn cao học Phùng HuyÒn Nhung kDa 116 66 Trx-BclA ~ 34Kda 45 35 Trx ~ 20Kda 25 18 14 Hình 13: Kết điện di kiểm tra pha tan không tan protein BclA tái tổ hợp E coli BL21 sau cảm ứng IPTG gel polyacrylamid 12,5% 1: Dịch protein tổng số thu lóc giê 2: DÞch protein tỉng sè kiĨm tra pha tan dòng số 3: Dịch protein tổng số kiểm tra pha không tan dòng số 4: DÞch protein tỉng sè kiĨm tra pha tan dòng số 5: Dịch protein tổng số kiểm tra pha không tan dòng số 6: Chủng E coli BL21 mang vector pET32 biĨu hiƯn protein Trx đối chứng 7: Thang protein chuẩn (Fementas) Trên hình 13 ảnh điện di ta thấy đường chạy số 2, số dịch protein tổng số thu pha tan dòng khuẩn lạc số dòng khuẩn lạc số sau cảm ứng hai đường chạy xuất băng protein đậm trọng lượng khoảng 35 kDa so với marker đường chạy đối chứng lúc Băng protein có khối lượng tương đương với khối lượng protein tái tổ hợp Trong đường chạy số 3, số protein thu pha không tan dòng khuẩn lạc số số sau cảm ứng hai đường chạy không thấy xuất băng protein có khối lượng khoảng 35 kDa Như protein tái tổ hợp đà tiết tế bào dạng tan Từ kết lựa chọn phương án tinh protein BclA tái tổ hợp phù hợp 56 Luận văn cao häc Phïng Hun Nhung 3.11 Tinh s¹ch protein BclA Cã nhiều phương pháp để tinh protein sắc ký lọc gel, sắc ký lực, sắc ký lỏng cao áp Tuy nhiên, sắc ký lực phương pháp thường sử dụng để tinh protein tái tổ hợp Phương pháp tinh cột HisTrap dựa vào liên kết lực ion Ni2+ với vòng Imidazole Histidin Khi acid amine Histidin gần liên kết chúng với ion Niken mạnh Protein tái tổ hợp gen mà hoá có ®u«i Histag víi acid amine Histidin n»m kỊ liên kết đặc hiệu với ion Ni2+ Các phân tử protein khác tế bào tổng hợp đuôi Histag không gắn vào ion Ni2+ Mặt khác ion Ni2+ cột lại liên kết với hạt Sepharose phức cua nên protein tái tổ hợp không bị rửa trôi đệm rửa protein khác Protein tái tổ hợp giữ lại cột tách cho qua dung dịch đệm có pH thích hợp Việc sử dụng đuôi His-tag giai đoạn tinh protein tái tổ hợp có nhiều lợi ích Với kích thước nhỏ, trình tự acid amin không gây đáp ứng miễn dịch đưa protein tái tổ hợp vào thể Vì vậy, không cần thiết loại bỏ đuôi His-tag sau tinh Sự tương tác đuôi His-tag với ion Ni2+ không phụ thuộc vào cấu trúc bậc bốn nó, nên trình tinh dễ dàng điều kiện protein bị biến tính Hình 14 Mô hình liên kết acid amine Histidine với ion Ni2+ Sau nghiên cứu điều kiện tối ưu cho viƯc sinh tỉng hỵp protein vïng CTD cđa BclA vi khuẩn E coli BL21, tiến hành nuôi cấy cảm ứng lượng lớn tế bào E coli BL21 mang plasmid pET32a(+) cã mang gen mong muèn nh»m thu protein tổng số để tiến hành tinh qua cột sắc ký lực Các dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp pET32a -BclA nuôi cấy môi 57 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung trường LB có bổ sung Amp 37oC qua đêm Sau đó, tế bào làm tươi cách cấy chuyển % từ dịch huyền phù sang môi trường LB + Amp OD600 nm đạt khoảng 0,6 - 0,8 tiến hành cảm ứng IPTG nồng độ 150 àM nuôi cấy nhiệt độ 25oC Sau cảm ứng tiến hành ly tâm thu tế bào từ dịch nuôi cấy, sau phá tế bào siêu âm Dịch chứa protein tổng số thu lại sau ly tâm chứa protein vùng CTD pha tan đưa lên cột sắc ký lực HisTrap Căn vào biểu đồ bước sóng 280 nm trình tinh protein máy tính tiến hành thu mẫu protein sau qua cột sắc ký lùc HisTrap, mÉu sau cho protein tỉng sè lªn cột, protein không đặc hiệu rửa trôi khỏi cột đệm rửa thu lại để điện di kiểm tra hiệu suất gắn protein tái tổ hợp qua cột lực Sau cột rửa với thể tích 10 lần thể tích cột đến pha cân Protein tái tổ hợp bám cột ®Èy khái cét b»ng Imidazol nång ®é 400 mM Protein tái tổ hợp thu lại phân đoạn từ đến 7, phân đoạn ml sau phân đoạn từ đến ®iƯn di kiĨm tra trªn gel polyacrylamid biÕn tÝnh 12,5% Kết thể hình 15: kDa 116 66 45 35 Trx-BclA ~ 34Kda Hình 15: Kết điện di kiểm tra phân đoạn tinh protein BclA qua cột ¸i lùc HisTrap Niken 1: Protein tỉng sè tr­íc qua cét 2: Protein rưa tr«i qua cét – 7: Protein tái tổ hợp sau tinh qua cột HisTrap Niken 8: Thang protein chuẩn (Fermentas) 58 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Trên điện di đồ hình 15 cho thấy đường chạy số đến số tương ứng với phân đoạn thu protein từ đến có băng protein có khối lượng khoảng gần 35 kDa Băng protein đường chạy tương đương với băng protein đoạn CTD đường chạy số không thấy xuất phần protein bị rửa trôi qua cột (đường chạy 2) Như protein tái tổ hợp đà thu lại hoàn toàn tinh thành công Hình 16: Đường chuẩn phương trình tuyến tính để định lượng protein tái tổ hợp phương pháp Brardford Dựa vào đường chuẩn giá trị OD đo nồng độ nhóm nghiên cứu tính lượng protein tinh 0,336 mg/ml Lượng protein tái tổ hợp thu đủ hàm lượng mức độ tinh để gây đáp ứng miễn dịch nghiên cứu 59 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung Chương VI Kết luận kiến nghị Kết luận: Từ kết nghiên cứu thu được, đưa mét sè kÕt luËn nh­ sau: T¸ch chiÕt thành công DNA hệ gen vi khuẩn B anthracis Đà thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen mà hóa vùng CTD protein BclA bề mặt vỏ bào tử vi khuẩn B anthracis Đà tách dòng tạo thành công cấu trúc biểu pET32a-bclA tái tổ hợp mang gen mà hóa cho protein vùng CTD BclA bề mặt bào tử B anthracis Đà biểu thành công mảnh protein tái tổ hợp vùng CTD protein BclA chủng vi khuÈn B anthracis chñng E coli BL21 Đà tinh protein BclA tái tổ hợp kỹ thuật sắc ký lực HisTrap niken protein BclA tái tổ hợp đà định lượng phương pháp Bradford với hàm lượng 0,33 mg/ml KIếN NGHị: Protein tái tổ hợp BclA sau tinh định lượng nên sử dụng để gây miễn dịch chuột thỏ để tạo kháng thể đa dòng Sử dụng kháng thể đa dòng kháng vùng CTD BclA tái tổ hợp kiểm tra tính lực phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể kỹ thuật Western blot, sắc ký miễn dịch dòng bên kỹ thuật ELISA protein tái tổ hợp protein tự nhiên vỏ bào tử B anthracis trước tiến hành tạo kháng thể đơn dòng Trước tiến hành gây đáp ứng miễn dịch để tạo kháng thể đơn dòng kháng vùng CTD protein BclA tái tổ hợp protein nên cắt bỏ đuôi Trx tinh lại trước tiến hành gây đáp ứng miễn dịch chuột để tạo kháng thể đơn dòng kháng vùng CTD protein BclA bề mặt bào tử B anthracis 60 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung V tài liệu tham khảo I Tài liệu tiếng Việt Trần DZũ, Nguyễn Nhiều, Phạm Văn Nông, Đỗ Dương Thái, Lê Đình Tiềm, Nguyễn Phùng TiÕn (1972), Kü tht xÐt nghiƯm Vi sinh vËt vµ ký sinh trïng, p 115 – 116 II Tµi liƯu tiÕng Anh Alex R Hoffmaster, Jacques Ravel, David A Rasko, Gail D Chapman, Michael D Chute, Chung K Marston, Barun K De, Claudio T Sacchi, Collette Fitzgerald, Leonard W Mayer,Mar tin C J Maiden, Fergus G Priest, Margaret Barker, Lingxia Jiang, Regina Z Cer, Jennifer Rilstone, Scott N Peterson, Robbin S Weyant, Darrell R Galloway, Timothy D Read, Tanja Popovic, Claire M Fraser (2004), “Identification of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax”, Proc Natl Acad Sci USA, Vol 101, p 8449–8454 Brian M Thompson, Dr George C Stewart, Thesis Supervisor (2008), Amino – terminal sequences of the Bacillus anthracis exosporium proteins BclA and BclB important for localization and attachment to the spore surface, p – 59 Bridget C Geogory, David M Waag, (1997), Military Medicine: Medical aspects of biological warfare, Office of the Surgeon General, Department of the Army, p 221 – 241 Cunha B, (2002), “Anthracis, tularemia, plague, ebola or smallpox as of bioterrorism: recoginition in the emergency room”, Clin Microbiol Infect, Vol 8, p 489 – 503 Caroline Redmond, Leslie W J Baillie, Stephen Hibbs, Arthur J G Moir and Anne Moir (2004), Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis , Microbiology, Vol 150, p 355 – 363 Christopher Steichen, Ping Chen, John F Kearney, Charles L Turnbough (2002), “Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of 61 Luận văn cao häc Phïng HuyÒn Nhung the Bacillus anthracis Exosporium”, Journal of Bacteriology, Mar.2003, p 1093 – 1910 Edward M Eitzen, Ernest T Takafuji (1997), “ Historical Overview of Biological Warfare”, Military Medicine: Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare, Office of the Surgeon General, Department of the Army Elin Gursky, Thomas V Inglesby, Tara O’Toole, (2003) “Anthracis 2001: observations on the medical and public health response”, Biosecur Bioterror, p 97 – 110 10 James M Daubenspeck, Huadong Zeng, Ping Chen, Shengli Dong, Christopher T Steichen, N Rama Krishna, David G Pritchard, and Charles L Turnbough, Jr (2004), “Novel Oligosaccharide Side Chains of the Collagenlike Region of BclA, the Major Glycoprotein of the Bacillus anthracis Exosporium”, The Journal of Biological Chemistry, Vol 27, p 30945 – 30953 11 Jeremy A Boydston, Ping Chen, Christopher T Steichen, and Charles L Turnbough, Jr, (2005), “Orientation within the Exosporium and Structural Stability of the Collagen-Like Glycoprotein BclA of Bacillus anthracis”, Journal of bacteriology, p 5310 – 5317 12 Joanna Kubler-Kielb, Evgeny Vinogradov, Haijing Hu, Stephen H Leppla, John B Robbins and Rachel Schneerson (2008), “Saccharides cross-reactive with Bacillus anthracis spore glycoprotein as an anthrax vaccine component”, PNAS, Vol 105, p 8709 – 8712 13 Katie A Edwards ,Harriet A Clancy,Antje J Baeumner (2005), Bacillus anthracis: toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods, Anlal Bioanal Chem , Vol 384, p 73 – 84 14 Lashanda N Waller, Michael J Stump, Karen F Fox, William M Harley, Alvin Fox, George C Stewart, and Mona Shahgholi (2005), Identification of a Second Collagen-Like Glycoprotein Produced by Bacillus anthracis and Demonstration of Associated Spore-Specific Sugars, Journal of bacteriology, p 45924597 62 Luận văn cao học Phùng Huyền Nhung 15 Melissa K Swiecki, Mark W Lisanby, Fengyu Shu,Charles L Turnbough, Jr and John F Kearney, (2006), Monoclonal Antibodies for Bacillus anthracis Spore Detection and Functional Analyses of Spore Germination and Outgrowth, The Journal of Immunology, Vo176, p 6076 – 6084 16 Patricia Sylvestre, Evelyne Couture-Tosi and Michele Mock (2002), “Polymorphism in the Collagen-Like Region of the Bacillus anthracis BclA Protein Leads to Variation in Exosporium Filament Length”, Journal of bacteriology, Mar.2003, p 1555 - 1563 17 Rebecca Giorno, Joel Bozue, Christopher Cote, Theresa Wenzel, Krishna S Moody, Michael Mallozzi,, Matthew Ryan, Rong Wang, Ryszard Zielke, Janine R Maddock, Arthur Friedlander, Susan Welkos, Adam Driks (2006), “Morphogenesis of the Bacillus anthracis Spore”, Journal of bacteriology, Feb 2007, p 691 – 750 18 Sanghamitra Mukhopadhyay, Arya Akmal, Andrew C Stewart, Ru-ching Hsia, and Timothy D Read (2009), “Identification of Bacillus anthracis Spore Component Antigens Conserved across Diverse Bacillus cereus sensu lato Strains”, Molecular & Cellular Proteomics, Vol 8, p 1174 – 1191 19 Stephen Endicott, Edward Hagerman, World War Two Origins, Chapter 2, in The United States and Biological Warfare, p 27 20 Steven M Block (2001), “The growing threat of biological weapons”, American Scientist, Vol.89, p 28 21 Stephane RÐty, Sylvie Salamitou, Ignacio G Verdugo, David J.S Hulmes, Francoise L Hegarat, Richard Chaby, Anita L Bentley, (2005), “The Crystal Structure of the Bacillus anthracis Spore Surface Protein BclA Shows Remarkable Similarity to Mammalian Proteins”, The journal of biological chemistry, Vol.280, p 43073 – 43078 22 Suesbery, N.S.; Wouds, (1999) "Anthrax toxins.", Cell Mol Life Sci , Vol 55, p 1599-1609 23.Timothy D Read, Scott N Peterson, Nicolas Tourasse, Les W Baillie, Ian T Paulsen, Karen E Nelson, Hervé Tettelin, Derrick E Fouts, Jonathan A 63 Luận văn cao học Phùng HuyÒn Nhung Eisen, Steven R Gill, Erik K Holtzapple, Ole Andreas Okstad, Erlendur Helgason, Jennifer Rilstone, Martin Wu, James F Kolonay, Maureen J Beanan, Robert J Dodson, Lauren M Brinkac, Michelle Gwinn, Robert T DeBoy, Ramana Madpu, Sean C Daugherty, A Scott Durkin, Daniel H Haft, William C Nelson, Jeremy D Peterson, Mihai Pop, Hoda M Khouri, Diana Radune, Jonathan L Benton, Yasmin Mahamoud, Lingxia Jiang, Ioana R Hance, Janice F Weidman, Kristi J Berry, Roger D Plaut, Alex M Wolf, Kisha L Watkins, William C Nierman, Alyson Hazen, Robin Cline, Caroline Redmond, Joanne E Thwaite, Owen White, Steven L Salzberg, Brendan Thomason, Arthur M Friedlander, Theresa M Koehler, Philip C Hanna, Anne-Brit Kolsto, Claire M Fraser, (2003), “The genome sequence of Bacillus anthracis Ames andcomparison to closely related bacteria”, Nature, Vol 423, p 81–86 24 Tomasz A Leski, Clayton C Caswell, Marcin Pawlowski, David J Klineke, Janusz M Bujnicki, Sean J Hart, Slawomir Lukomski, (2009), “Identification and Classification of bcl FingerprintingBacillus anthracis Detection and Group Organisms and Their Application in Genes and Proteins of Bacillus cereus”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 75, p 7163 – 7172 25 Trupti N Brahmbhatt, Brian K Janes, E Scott Stibitz, Stephen C Darnell, Patrick Sanz, Susan B Rasmussen,1 and Alison D O’Brien1 (2007), “Bacillus anthracis Exosporium Protein BclA Affects Spore Germination, Interaction with Extracellular Matrix Proteins, and Hydrophobicity”, Infection and Immunity, Vol 75, p 5233 – 5239 26 Wheelis Mark, Lajos Rãzsa, Malcolm Dando (2006), Deadly Cultures: Biological Weapons Since 1945, Harvard University Press, p 284 – 293, 301 – 303 64 ... mặt vỏ bào tử B anthracis xem thị sinh học, kháng nguyên sở để tạo kháng thể đơn, đa dòng kháng protein vỏ bào tử B anthracis Do tiến hành thực đề tài Nghiên cứu tách dòng biểu hiƯn gen m· hãa protein. .. bào tử B anthracis mỏng kết cấu chắn Ngoài lớp áo bào tử B anthracis bao bọc lớp vỏ bào tử Bào tử B anthracis BclA Lớp vỏ bảo tử Lớp áo bảo tử Lõi bào tử Hình 3: Cấu tạo lớp vá bµo tư B anthracis. .. vỏ bào tử B anthracis thÊy r»ng nã chøa Ýt nhÊt 12 lo¹i protein chÝnh Một protein bật số đặt tên BclA (Bacillus collagen like protein of anthracis) mà hóa gen bclA [3] BclA có tính glycosyl hóa