Tách dòng và đồng biểu hiện gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ GP5ecto vùng ngoại bào và m của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 Tách dịng đồng biểu gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ GP5ecto (vùng ngoại bào) M virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Nguyễn Thị Minh Hằng1,2,*, Hồ Thị Thương1, Nguyễn Thu Giang1, Phạm Bích Ngọc1, Nguyễn Trung Nam1, Chu Hồng Hà1 Viện Công nghệ sinh học, Viên Hàn lâm KH CN Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp, Thị trấn Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 09 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) loại bệnh truyền nhiễm phổ biến chăn nuôi lợn, virus PRRS (PRSSV) gây Protein GP5 (ORF5) glycoprotein vỏ ngoài, bao gồm vùng ngoại bào (ectodomain) vùng nội bào (endodomain) Protein M (ORF6) protein cấu trúc bảo thủ virus khơng bị glycosyl hóa Protein GP5 M liên kết chặt chẽ với cầu disulfit giúp cho việc lắp ráp lây nhiễm virus Sự biểu đồng thời protein GP5 M phát triển phản ứng miễn dịch mạnh Trong nghiên cứu này, hai đoạn gen mã hóa cho protein GP5ecto (vùng ngoại bào) M chủng virus PRRS (VN07196) khuếch đại riêng lẻ Hai đoạn gen sau ghép nối với kỹ thuật PCR lồng sử dụng căp mồi đặc hiệu; gắn kết với promoter 35S, Histag Cmyc, ELP; nhân dòng vector pRTRA thiết kế vào cấu trúc vetor chuyển gen thực vật pCB301 Protein tái tổ hợp GP5ecto-M gắn kết ELP biểu thành công thuốc N benthamiana công nghệ biểu gen tạm thời, tối ưu tinh protein GP5ecto-M phương pháp mITC cho thấy tinh thành công loại protein Đây sở khoa học quan trọng để tiến hành biểu tạm thời tinh kháng nguyên GP5ecto-M quy mô lớn nhằm mục đích nghiên cứu tính sinh miễn dịch động vật sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng chống PRRSV Từ khóa: Biểu tạm thời, đồng biểu hiện, protein GP5ectodomain-M, PRRSV, tinh protein Mở đầu  ngành chăn nuôi nhiều quốc gia giới, có Việt Nam, virus PRRS (PRSSV) gây PRRSV thuộc loại Arterivirus, họ Arteriviridae Nodovirales.Genome PRSSVlà sợi sRNA đơn, dương, dài 15 000 bp [1] với khung đọc mở (ORFs): 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7 ORF1a, ORF1b mã hố RNA polymerase Trong đó, GP2-3-4 mã hoá protein chức GP5 (ORF5) mã hoá glycoprotein vỏ ngoài, bao Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) gọi bệnh “lợn tai xanh” loại bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phổ biến _ * Tác giả liên hệ ĐT.: 84-983797705 Email: ntminhhang@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4588 150 N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 gồm vùng ngoại bào (ectodomain) vùng nội bào (endodomain).M (ORF6 ) mã hoá protein màng, N (ORF7) mã hoá protein cấu trúc nucleocapsid Protein GP5 M hai protein liên kết màng PRRSV, liên kết chặt chẽ với cầu disulfit giúp cho việc lắp ráp lây nhiễm virus tế bào vật chủ [2, 3] Protein M protein cấu trúc bảo thủ virus khơng bị glycosyl hóa GP5 M dùng để thiết kế vacxin tiểu đơn vị chống lại xâm nhiễm PRRSV Một số nghiên cứu gần Việt Nam thành công việc biểu đơn lẻ hai loại protein công nghệ biểu gen tạm thời biểu GP5 [4], biểu thành công protein M phương pháp biểu tạm thời thực vật [5] Một số hướng nghiên cứu phát triển loại vacxin chống PRRSV khác triển khai tạo vaccine DNA đồng biểu GP5 M vacxin DNA [6, 7] Sự biểu đồng thời protein GP5 M phát triển phản ứng miễn dịch mạnh hơn, đặc biệt kháng thể trung hòa PRRSV heterodimer GP5/M bảo vệ miễn dịch chống lại nhiễm PRRSV [7]và virus truyền bệnh giả dại (pseudorabies) biểu GP5 [8], adenovirus biểu GP5/M [9], pseudotype baculovirus biểu GP5/M [10], virus đậu mùa biểu GP5/M [11] thuốc biểu GP5 [12] Để tiếp cận khả này, nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen tái tổ hợp mang hai gen mã hoá protein GP5ecto (vùng ngoại bào) M chủng virus PRRS (VN07196) để biểu đồng thời hai gen thực vật công nghệ biểu gen tạm thời, tinh protein tái tổ hợp làm sở cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng ngừa PRRSV Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng Chủng vi khuẩn: Chủng E coli DH5α sử dụng để nhân chọn dòng gen Chủng A tumefaciens C58C1 mang yếu tố phiên mã FUS3 sử dụng để đồng biểu tạm thời với vector đích mang gen biểu protein tái tổ hợp kiểm soát promoter 35S, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp Các vector plasmid vật liệu thực vật: Trình tự 100xELP vector pRTRA tổng hợp mô tả Scheller đồng tác giả (2006) [13] Vector pRTRA-35S-H5100xELP [14] (Hoang P.T., 2012) thiết kế từ vector gốc pRTRA 35S-TBAG-100xELP Floss đồng tác giả (2010a) [15] Vector chuyển gen pCB301-Kan (dựa vào pCB301 Xiang đồng tác giả, 1999) [16]; Plasmid mang gen GP5ectoM virus PRRS chủng Việt Nam (VN07196) thuốc N benthamiana Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu nêu Bảng Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu STT Tên mồi I Mồi dùng khuếch đại gen GP5ecto có gắn thêm vị trí cắt enzyme giới hạn NcoI pspOMI GP5ecto- NcoI-F AGCCATGGCTTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGC GP5ecto- pspOMI-R CCGGGCCCCACTGCCCAGTCAAATTTTTGTGCC Mồi dùng khuếch đại gen M có gắn thêm vị trí cắt enzyme giới hạn pspOM BamHI M-pspOMI-F TGGGGCCCGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCA M-BamHI-R AGGGATCCTTTGGCATATTTAACAAGGTTTAC II 151 Trình tự (5’-3’) 152 N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 IV Mồi dùng khuếch đại gen GP5ecto-M có gắn thêm vị trí cắt enzyme giới hạn NcoI BamHI GP5ecto-NcoI-F AGCCATGGCTTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGC M-BamHI-R AGGGATCCTTTGGCATATTTAACAAGGTTTAC Mồi dùng giải trình tự gen GP5ecto-M vector pRTRA 35S-SQF 35STerm III CACTGACGTAAGGGATGACGC CTGGGAACTACTCACACA u 2.2 Phương pháp Nhân dòng gen mã hoá protein GP5ecto, M, GP5ecto-M virus PRRS Đoạn gen GP5ecto đoạn gen M khuếch đại PCR sử dụng khuôn plasmid pGEM-PRRS (VN07196) với hai cặp mồi tương ứng (bảng 1) Thành phần phản ứng PCR: 50 μl hỗn hợp, gồm 0,3 μM primers, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, μl đệm 10X Pwo SuperYield PC 20 ng khn Chu trình PCR: 94oC/3 phút; 32 chu kỳ lặp lại bước 94oC/30 giây, 55oC/50 giây, 72oC/1 phút; 72oC/10 phút, sản phẩm giữ 4oC, điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Sản phẩm PCR nhân gen GP5ectovà gen M thu được xử lý để ghép nối với bằng kỹ thuật PCR lồng sử dụng cặp mồi tương ứng (bảng 1), nhằm thu phân đoạn DNA tái tổ hợp GP5ecto-M Đoạn gen mã hoá protein GP5ecto-M thu plasmid pRTRA 35S-TBAG-100xELP tinh phân cắt NcoI BamHI Sau đó, phân đoạn GP5ecto-M ghép nối vào vector pRTRA tạo plasmid tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào E coli DH5α, chọn dịng khuẩn lạc mơi trường có bổ sung kháng sinh Plasmid tách chiết giải trình tự sử dụng cặp mồi đặc hiệu bảng Các trình tự nucleotide phân tích phần mềm BioEdit 7.0 Lasergen (DNAstarinc, Madison, WI, USA) Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen GP5ecto-M PRRSV phục vụ chuyển gen Vector pRTRA tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ecto-M vector pCB301 phân cắt HindIII, sản phẩm cắt (GP5ecto-M/ELP) ghép nối vào khung vector pCB301 biến nạp vào tế bào E coli DH5α Tiến hành chọn dòng khuẩn lạc mơi trường thạch LB có 50 mg/l kanamycin colony-PCR Plasmid tái tổ hợp pCB301-GP5ecto-M/ELP cắt kiểm tra enzyme NcoI BamHI, sau biến nạp vào A tumefaciens C58C1 phương pháp xung điện để phục vụ cho thí nghiệm biểu tạm thời protein thực vật Biểu tạm thời protein tái tổ hợp mô thuốc N benthamiana Khuẩn lạc chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pCB301GP5ecto-M/ELP chủng mang vector chứa gen mã hóa cho protein Hc-pro hỗ trợ biểu gen thực vật ni mơi trường YEB có bổ sung kháng sinh chọn lọc (50 µg/ml Cabernicilon 50 µg/ml, Rifamicin 100 µg/ml Kanamicin) Vi khuẩn ni lắc 200 rpm/phút, 16-18 28oC Tiếp tục nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đến thể tích cần thiết có OD600 đạt 0,5-1 Khuẩn thu nhận ly tâm 5000 rpm/phút, 15 phút 4oC Cặn khuẩn chủng hòa tan đệm MES (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH 5,6) có giá trị OD600 đạt 0,8-1 trộn với theo tỷ lệ 1:1 Dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp vào thuốc phương pháp hút chân không thời gian 1,5 phút, 27 inches, atm Các thuốc sau biến nạp tiếp tục ni chăm sóc buồng sinh trưởng có điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm phù hợp Lá thuốc thu hoạch sau ngày biến nạp bảo quản -80 oC để tách chiết protein [5] Kiểm tra biểu protein GP5ecto-M phản ứng Western blot Mẫu thuốc nghiền thành bột mịn, hoà tan đệm mẫu SDS (50 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0,1% (w/v) Bromophenolblue, 10% (v/v) Glycerol, pH 6,8,), biến tính mẫu 95oC N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 153 polyethersulfone (PES) 0,22 µm 4oC, thu dịch chiết trước xử lý Dịch chiết làm ấm đến nhiệt độ phòng lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm, màng rửa lần NaCl 2M để loại protein lẫn Nước Milipore-Q lạnh chuyển qua màng lọc để thu hồi protein mục tiêu gắn ELP 10 phút, điện di 100V, 20mA giờ; 10-30 µg protein sau phân tách điện di SDS-PAGE (10% polyacrylamide), sau chuyển lên màng nitrocellulose máy chuyển màng Fast blotter (Thermoscientific) 25V, 1.3A 20 phút Blocking màng sữa tách béo 5% giờ, màng tiếp tục ủ với kháng thể qua đêm, ủ màng với kháng thể anti-mouse IgG cộng hợp HRP Phát có mặt protein GP5ecto-M dung dịch màu có chứa chất DAB (Diaminobenzidine) 15 phút Tinh protein GP5ecto-M Tối ưu nồng độ PEG trình tinh sạch: PEG (polyethylene glycol) sử dụng nhằm kết tủa protein tạp không làm protein mục tiêu Nghiền 10g nitơ lỏng, bổ sung 60ml Tris-HCl 50 mM (pH8.0) lạnh, ly tâm 13.000 rpm, 30 phút, 4oC Bổ sung PEG dải nồng độ (2% - 12%) vào 2ml dịch chiết thực vật Ly tâm 13.000 v/p, 30 phút, 4oC Dung dịch biến tính kiểm tra Westen blot Tinh protein GP5ecto-M tái tổ hợp có gắn ELP phương pháp mITC (Membranebased inverse transition cycling): Nghiền nhỏ 100g tươi nitơ lỏng, bổ sung 200 ml Tris-HCl 50 mM (pH8.0) lạnh, ly tâm 25000 v/p 30 phút 4oC, bổ sung NaCl đến nồng độ 2M Ly tâm 25.000 v/p 30 phút, 4oC Dung dịch đưa qua màng Kết thảo luận 3.1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M gắn kết Elastin like-polypeptide (GP5ecto-M-ELP) Đoạn gen mã hóa GP5 vùng ectodomain gen mã hóa protein M khuếch đại riêng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng Sau ghép nối tạo thành đoạn gen GP5ecto-M phản ứng PCR lồng sử dụng cặp mồi GP5ecto-NcoI- F M-BamHI-R (bảng 1) Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR cho thấy thu phân đoạn DNA theo tính tốn lý thuyết GP5 vùng ngoại bào 208 bp, M 546 bp GP5ecto-M 754 (Hình 1: A, B) Chọn dịng tế bào E coli colony-PCR (Hình 1: C) thu đoạn DNA có kích thước khoảng gần 1000 bp (988 bp) Kết phù hợp với tính bao gồm gen mã hóa protein GP5ecto - M (754 bp) m đoạn promoter (234 bp) n g GP5ecto Marker Marker GP5ecto-M M (Kb) (bp) (bp) (Kb) (bp) 1.5 754 0.5 546 208 0.25 (A) (B) (C) Hình PCR nhân gen mã hóa protein GP5ecto, M GP5ecto-M, (A): PCR nhân hai gen mã hóa protein GP5ecto M PRRSV; (B): PCR nhân gen mã hóa protein GP5ecto-M; (C): Colony-PCR chọn dịng tế bào E.coli mang plasmid chứa GP5ecto-M cặp mồi 35S-F M-BamHI-R; M: marker1 kb; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; 1-10: Sản phẩm PCR chứa gen mã hóa protein GP5ecto-M 154 N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn NcoII pspOMI (Hình 2: A) thu phân đoạn DNA có kích thước khoảng 5051 bp 754 bp Kích thước phân đoạn trùng với kích thước tính toán lý thuyết vector pRTRA 35S-100xELP 5109 bp gen GP5ecto-M 754 bp Như vậy, khẳng định nhân dòng GP5ecto-M vector pRTRA35S100xELP thành công M (A) 3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M gắn kết ELP Plasmid pRTRA-35S-GP5ecto-M-HistagCmyc-100xELP vector pCB301 xử lý enzyme HindIII Kết điên di sản phẩm cắt plasmid thu phân đoạn DNA gồm cassette 35S-GP5ecto-M-Histag-Cmyc100xELP có kích thước khoảng 3,2 kb, khung vector pCB301 mở vịng có kích thước khoảng 5,5 kb Khung vector pCB301 ghép nối với cassette 35S-GP5ecto-M-Histag-Cmyc100xELP tạo vector chuyển gen pCB301-35SGP5ecto-M-Histag-Cmyc-100xELP Kiểm tra vector chuyển gen mang cassette biểu enzyme giới hạn HindIII (Hình 3:A) thu hai phân đoạn DNA theo theo tính tốn lý thuyết vector pCB301 mở vòng (5508 bp) cassette biểu (3214 bp) Để chọn lọc dòng khuẩn mang vector chuyển gen có cassette đảo chiều (chiều biểu gen GP5ecto-M ngược chiều với chiều biểu gen kháng kháng sinh), plasmid cho kết dương tính (đúng kích thước theo tính tốn lý thuyết) sau cắt với enzyme HindIII xử lý với NcoI Kết xử lý plasmid tái tổ hợp với NcoI (Hình 3:B) cho thấy thu hai phân đoạn DNA theo kích thước tính tốn lý thuyết tương ứng 4876 bp 3589 bp (cassette đảo chiều) 7029 bp 1586 bp (cassette xi chiều) (B) Hình Sản phẩm cắt pTRA 35S-GP5ecto-MHistag-Cmyc-100xELP NcoI pspOMI (A) sơ đồ cấu trúc vector tách dòng mang gen mã hoá protein GP5ecto-M gắn kết ELP (B) Plasmid pRTRA-35S-GP5ecto-M-HistagCmyc-100xELP giải trình tự với mồi 35SSQF/35Sterm cho thấy tách dịng gắn kết thành cơng gen mã hóa protein GP5ecto-M PRRSV với promoter 35S, Elastin likepolypeptide (ELP), Cmyc His-tag (Hình 2: B) (B) N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 (C) Hình Kết thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M gắn kết ELP; (A): Điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn HindIII; M: Marker kb; 1,2: Sản phẩm cắt plasmid pCB30135S-GP5ecto-M-Histag-Cmyc-100xELP; (B): Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn NcoI; (C): Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-35S-GP5ecto-MHistag-Cmyc-100xELP Dòng khuẩn mang vector chuyển gen có cassette đảo chiều dùng để biến nạp vào A tumefacines phục vụ cho thí nghiêm biểu tạm thời Như vậy, vector chuyển gen pCB301-GP5ecto-M-100xELP thiết kế thành cơng, có sơ đồ thiết kế hình 3: C Vector chuyển gen pCB301 mang cassette biểu 35S-GP5ecto-M-Histag-Cmyc100xELP đảo chiều thiết kế thành công Vector tái tổ hợp sử dụng để biến nạp vào chủng A tumefaciens 3.3 Biểu tạm thời tinh protein GP5ecto-M PRRSV thuốc N benthamiana Sử dụng chủng A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pCB301 mang casstte 35S-GP5ectoM-Histag-Cmyc-100xELP để biểu protein GP5ecto-M mô thuốc phương pháp biểu tạm thời (được mô tả Mục 2.2 Phương pháp) Tinh protein GP5ecto-M phương pháp mITC 155 Trong trình tinh protein, PEG sử dụng để loại bỏ số protein thực vật Tuy nhiên, nồng độ PEG cần phải tối ưu nhằm loại bỏ protein tạp dịch chiết thực vật mà không làm protein mục tiêu Ở nồng độ nghiên cứu cho thấy kết tủa protein tạp dịch chiết thuốc tăng lên rõ rệt tăng nồng độ PEG từ - 10% (Hình 4: A) Ở nồng độ PEG 10% kết tủa protein lắng cặn nhiều nhất.Phát protein đích lai miễn dịch (Hình 4: B),cho thấy tất nồng độ thu protein mục tiêu GP5ecto-M Tuy nhiên, công thức không bổ sung PEG vàở nồng độ PEG 2% xuất băng mục tiêu mờ, cho thấy nồng độ tinh protein GP5ecto-M lẫn nhiều protein tạp dẫn đến hạn chế việc phát protein mục tiêu Ở nồng độ 8%, thu băng vạch đậm nét nhất, chứng tỏ nồng độ protein tinh thu nhiều Khi tăng nồng độ PEG từ 8% đến 10% băng vạch nhạt dần, protein mục tiêu bị dần Như vậy, nồng độ PEG cao, protein mục tiêu bị kết tủa protein tạp Do đó, nồng độ PEG tiếp tục tăng đến giới hạn làm protein mục tiêu Vì vậy, PEG 8% lựa chọn sử dụng bổ sung vào dịch chiết thực vật trình tinh protein GP5ecto-M phương pháp mITC Dịch chiết thực vật bổ sung PEG 8%, tinh theo phương pháp mITC,kiểm tra protein GP5ecto-M Western blot (Hình 4: C) gồm mẫu: dịch chiết thô trước xử lý, dịch chảy qua màng sau cho qua màng dịch chiết thô, dung dịch sau rửa protein sau tinh tách rửa khỏi màng, cho thấyở giếng chứa dịch thô giếng protein sau tinh xuất băng màu nâu có kích thước khoảng 71 kDa không xuất giếng chứa dịch chảy qua mang dịch rửa màng Điều chứng tỏ protein đích có gắn ELP có dịch thơ giữ lại màng Kiểm tra độ tinh protein GP5ecto-M sử dụng PEG 8% SDS-PAGE, nhuộm Coomassie blue (Hình 4: C) thu băng vạch protein đậm nét, không lẫn protein tạp 156 N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 f Hình Kết biểu tinh protein GP5ecto-M, tối ưu PEG cho trình tinh (A): Dịch chiết thực vật (2ml) có bổ sung PEG nồng độ (0 -10%) sau ly tâm; (B): Kết Western blot phát protein GP5ecto-M sau sử dụng PEG nồng độ 0-10%; (C): Tinh protein đích lai miễn dịch: M:marker protein; R: dịch chiết thô trước xử lý; FL: dịch chảy qua màng sau đưa dịch thô qua màng; W: Dung dịch sau rửa; P: Protein đích; (D): Kiểm tra tinh protein nồng độ PEG 8% SDS-PAGE, M: Marker protein; 1: protein tinh Từ kết thu cho thấy biểu tinh sạchthành công protein GP5ectoM.Như vậy, nồng độ PEG phù hợp cho tinh protein GP5ecto-5 phương pháp mITC 8% Kết luận Vector chuyển gen tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ecto-M chủng PRRSV gây bệnh lợn tai xanh Việt Nam (VN07196) thiết kế Đã biểu tinh thành công protein GP5ecto-M thuốc công nghệ biểu gen tạm thờinhằm phục vụ sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống lại PRRSV Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thường xun phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học: “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc N benthamiana phương pháp agroinfiltration” Các thí nghiệm tiến hành có sử dụng trang thiết bị phịng cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tài liệu tham khảo [1] Meulenberg JM, Peter Sen-Den Besten A, Kluyver EP, Moormann RJM, Schaaper WMM, Wensvoort G, Characterization of proteins encoded by ORFs to of Lelystad virus Virology 206(2000) 155 [2] Dea S, Gagnon CA, Mardassi H, Pirzadeh B, Rogan D, Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145 (2000) 659 [3] Mardassi H, Massie B, Dea S Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs to of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virology 221 (1996) 98 [4] Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Chu Thị Kim Hoàng, Phạm Thị Vân, Phạm Bích Ngọc, Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Nghiên cứu biểu tạm thời kháng nguyên GP5 virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc (Nicotiana benthamiana) phương pháp agro-infiltration Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 31, (1) (2015) [5] Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà,Biểu tinh protein M virus prrs gây bệnh lợn tai xanh công nghệ biểu tạm thời thuốc Nicotinana benthamiana Công nghệ sinh học 15 (3), Chấp nhận đăng (2017) N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 [6] Hou YH, Chen J, Tong G Z, Tian Z J, Zhou YJ, Li GX, Li X, Peng J M, An T Q, Yang H, A recombinant plasmid co-expressing swine ubiquitin and the GP5 encoding-gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces protective immunity in piglets Vaccine 26 (2008) 143 [7] Jiang Y, Xiao S, Fang L, Yu X, Song Y, Niu C, Chen H, DNA vaccines co-expressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) display enhanced immunogenicity Vaccine 24 (2006b) 2869 [8] Qiu HJ, Tian ZJ, Tong GZ, Zhou YJ, Ni JQ, Luo YZ, Cai XH, Protective immunity induced by a recombinant pseudorabies virus expressing the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in piglets Vet Immunol Immunopathol 106 (2005) 309 [9] Jiang W, Jiang P, Li Y, Tang J, Wang X, Ma S, Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice Vet Immunol Immunopathol 113 (2006a) 169 [10] Wang S, Fang L, Fan H, Jiang Y, Pan Y, Luo R, Zhao Q, Chen H, Xiao S, Construction and immunogenicity of pseudotype baculovirus expressing GP5 and M protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Vaccine 25 (2007) 8220 [11] Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P, Co-expressing GP5 and M proteins under different [12] [13] [14] [15] [16] 157 promoters in recombinant modified vaccinia virus ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Virus Genes 35 (2007) 585 Chia MY, Hsiao SH, Chan HT, Do YY, Huang PL, Chang HW, Tsai YC, Lin CM, Pang VF, Jeng CR, Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant Vet Immunol Immunopathol 135 (2010) 234 Scheller J, Leps M, and Conrad U, Forcing singlechain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptids Plant Biotechnology Journal (2006) 243 Phan HT, ELPylated avian flu vaccines from plants: Improvement of expression and development of a new purification strategy Dissertation, IPK, Gatersleben, Germany (2012) Floss D M, Mockey M, Zanello G, Brosson D, Diogon M, Frutos R, Bruel T, Rodrigues V, Garzon E, Chevaleyre C, Berri M, Salmon H, Conrad U, Dedieu L, Expression and immunogenicity of the mycobacterial Ag85B/ESAT-6 antigens produced in transgenic plants by elastin-like peptide fusion strategy J Biomed Biotechnol (2010a) Xiang C, Han P, Lutziger I, Wang K, and Oliver D, A mini binary vector series for plant transformation Plant Mol Biol 40 (1999) 711 Cloning and Co-expression of Genes Encoding two Types of GP5ecto envelope (Ectodomain) and M Antigens of Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Nguyen Thi Minh Hang1,2, Ho Thi Thuong1, Nguyen Thu Giang1, Pham Bich Ngoc1, Nguyen Trung Nam2, Chu Hoang Ha1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam College of Forestry Biotechnology, VNUF, Xuan Mai, Chuong My, Hanoi, Vietnam Abstract: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) is a common infectious disease in the pig farming, caused by the PRRS virus GP5 protein (ORF5) encodes the outer skin 158 N.T.M Hằng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 150-158 glycoprotein, including the extracellular (ectodomain) and endothelium(endodomain) GP5 and M proteins are tightly bound together by disulfide bridges to assemble and infect the virus Co-expression of GP5 and M proteins can develop a stronger immune response In this study, the two genes encoding for the GP5ecto (ectodomain) and M proteinsof the PRRSV strain (VN07196) were amplified individually, which were then nestedtogether using PCR technique Using specific 35S, Histag and Cmyc promoters, ELPs, clones in the pRTRA vector and designed into the pCB301 plant transformation vector The ELP-binding GP5ecto-M binding protein was successfully expressedin the tobacco leaves of N benthamiana by transient expression, optimal and purified gene expression technology of GP5ecto-M by the mITC method Succeeded this protein This is an important scientific basis for the large-scale transient expression and purification of GP5ecto-M antigens for the purpose of studying the immunogenicity in animals and the production of PRRSV subunit vaccine Keywords: Transient expression, co-expression, protein GP5ectodomain-M, PRRSV, protein purification  ... protein GP5ecto, M GP5ecto- M, (A): PCR nhân hai gen m? ? hóa protein GP5ecto M PRRSV; (B): PCR nhân gen m? ? hóa protein GP5ecto- M; (C): Colony-PCR chọn dòng tế bào E.coli mang plasmid chứa GP5ecto- M cặp... m? ?ng Kết thảo luận 3.1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen m? ? hóa kháng nguyên GP5ecto- M gắn kết Elastin like-polypeptide (GP5ecto- M- ELP) Đoạn gen m? ? hóa GP5 vùng ectodomain gen. .. tái tổ hợp mang hai gen m? ? hoá protein GP5ecto (vùng ngoại bào) M chủng virus PRRS (VN07196) để biểu đồng thời hai gen thực vật công nghệ biểu gen t? ?m thời, tinh protein tái tổ hợp l? ?m sở cho việc