Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 Tách dịng, thiết kế vector chuyển gen GmEXP1 vào thuốc Nicotinana tabacum Lò Thanh Sơn1, Hồ Mạnh Tường2, Lê Văn Sơn2, Nguyễn Vũ Thanh Thanh3, Chu Hoàng Mậu3,* Trường Đại học Tây Bắc Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đại học Thái Nguyên Nhận ngày 08 tháng năm 2013 Chỉnh sửa ngày 22 tháng năm 2013; chấp nhận đăng ngày 05 tháng năm 2013 Tóm tắt: Expansin có vai trị quan trọng pha giãn thành tế bào miền sinh trưởng hệ rễ đậu tương Hai vùng chức (DPBB Pollen allerg) xác định cho protein expansin có khả tác động phá vỡ liên kết phi hoá trị polysaccharide với vi sợi cellulose giúp thành tế bào dễ dàng giãn nở (cả chiều ngang chiều dọc) tác động sức trương nước Hoạt động gen GmEXP1 (xác định protein expansin) liên quan đến kéo dài rễ đậu tương, làm tăng cường khả chịu hạn đậu tương Trong báo này, chúng tơi trình bày kết việc thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1 lai với đoạn mã hoá peptide c-myc KDEL, điều khiển CaMV35S promoter; chuyển cấu trúc vào thuốc mơ hình (Nicotinana tabacum) nhờ A.tumefaciens Phân tích có mặt gen 44 dịng thuốc tái sinh lựa chọn ngẫu nhiên PCR cho thấy 32/44 dịng thuốc chuyển có mang gen GmEXP1, cấu trúc sử dụng để chuyển gen vào trồng quan tâm Từ khoá: Expansin, Glycine max, GmEXP1, kéo dài rễ, giãn thành tế bào Mở đầu∗ địa phương Cùng với tăng trưởng loại lương thực ngơ, lúa, khoai, sắn đậu đỗ khác đậu tương trồng đa trọng phát triển Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) có vai trị quan trọng người nhiều lĩnh vực như: cung cấp dinh dưỡng, làm thực phẩm cho người, làm thức ăn cho gia súc, cải tạo sử dụng bền lâu nguồn tài nguyên đất Cây đậu tương số trồng có giá trị kinh tế cao phù hợp với nhiều Đậu tương trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc nhóm chịu hạn Sự biến đổi khí hậu, tình trạng hạn hán xảy liên tục kéo dài khó khăn lớn cho sản xuất đậu tương nhiều địa phương, đặc biệt nơi có địa hình đất canh tác dốc, địi hỏi phải cải thiện tính di truyền _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT: 84-913383289 E-mail: chuhoangmau@tnu.edu.vn 44 L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 thích nghi với hạn hán để tạo giống suất cao ổn định phù hợp với vùng miền Vì vậy, cơng tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày quan tâm nghiên cứu [1] Hai chế chủ yếu liên quan đến khả chịu hạn thực vật điều chỉnh áp suất thẩm thấu phát triển mạnh rễ Bộ rễ phận quan trọng thực nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho hoạt động sống phát triển thể thực vật Cơ chế chịu hạn liên quan mật thiết với phát triển rễ Cơ thể thực vật thích ứng với hạn cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vươn tới lớp đất sâu để hút nước dễ dàng hơn, đồng thời hệ thống rễ phát triển mở rộng theo bề ngang thích ứng tốt với việc tìm kiếm dinh dưỡng khống nước lòng đất [2] Kaspar et al đánh giá 105 giống đậu tương điều kiện khô hạn nhận thấy, đậu tương khơng tưới nước rễ có chiều dài hẳn đậu tương tưới nước, nhà khoa học nhận thấy mối tương quan chặt chẽ nhiều tính trạng rễ trọng lượng khơ, chiều dài tổng số, cấu trúc số lượng rễ giống chịu hạn Các tính trạng thường dùng tiêu quan trọng để đánh giá nhận dạng giống đậu tương có tính chịu hạn [3] Expansin họ protein tác động việc kéo giãn thành tế bào thực vật coi protein chủ yếu ảnh hưởng đến mở rộng tế bào thực vật Hầu hết thực nghiệm cho thấy rằng, mô chứa tế bào sinh trưởng, expansins biến đổi tính chất vật lý vách tế bào cách nới lỏng liên kết hydro, nới lỏng liên kết phi hoá trị vi sợi cellulose làm lỏng lẻo mạng lưới polymer [4] Vi sợi 45 cellulose kết nối với polysaccharide Những polysaccharide thực liên kết vào bề mặt vi sợi cellulose liên kết với Protein expansin phá vỡ liên kết polysaccharide bề mặt vi sợi phá vỡ liên kết polysaccharide Dưới áp lực học phát sinh từ sức trương nước, khoảng cách vi sợi thành tế bào dễ dàng đẩy giãn khoảng cách theo chiều ngang chiều dọc (Hình 1.) Expansin di chuyển dễ dàng vi sợi cellulose thành tế bào tiếp xúc với điểm kết dính polymer Điều tạo thuận lợi cho pha giãn (tăng trưởng) tế bào dễ dàng thực [5] Hình Mơ tả hoạt động protein expansin tác động giãn thành tế bào thực vật Nhiều nghiên cứu rằng, sản phẩm phiên mã gen GmEXP1 có nhiều tế bào biểu bì lớp tế bào miền sinh trưởng rễ cọc rễ bên, vùng trưởng thành [6] Qua thấy vai trò quan trọng expansin việc phát triển kéo dài hệ rễ đậu tương Expansin chia thành ba phân họ α, β γ-expansin dựa mối quan hệ nguồn gốc chúng [4, 7] Lee đtg (2003) nghiên 46 L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 cứu phân lập gen expansin (EXP1) từ mARN đậu tương với kích thước 1089bp [8] Năm 2011, Lee đtg nghiên cứu biểu gen expansin liên quan đến việc kéo dài rễ đậu tương Khi phân tích RNA Northern blot cho thấy gen GmEXP1 biểu mạnh rễ, đặc biệt q trình hình thành rễ rễ phụ, mức độ biểu gen GmEXP1 mạnh khoảng thời gian hạt nảy mầm từ ngày đến ngày tuổi giai đoạn kéo dài rễ Biểu gen GmEXP1 làm tăng phát triển rễ chính, rễ bên [8] Các kết nghiên cứu cho thấy gen GmEXP1 đóng vai trò quan trọng việc phát triển rễ nhiều thực vật đậu tương, cà chua, Arabidopsis [5] Trong số giống đậu tương thu thập Sơn La, so sánh thực nghiệm phân nhóm lựa chọn giống đậu tương Sơn La (SL1) có hệ rễ phát triển mạnh Gen GmEXP1 phân lập từ SL1 cách phiên mã ngược tạo cDNA với khuôn mẫu mRNA tương ứng Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 lai với đoạn mã hoá peptide c-myc KDEL điều khiển promoter CaMV35S Cấu trúc thiết kế có chứa trình tự mã hố đoạn peptide c-myc dấu hiệu để phát protein Western blot với kháng thể kháng c-myc nhằm phân tích biểu gen GmEXP1 chuyển gen phục vụ mục đích cải thiện khả chịu hạn đậu tương Vật liệu phương pháp Vật liệu Giống đậu tương địa phương Sơn La (SL1) có hệ rễ phát triển tốt sử dụng làm vật liệu phân lập gen GmEXP1 Vector pRTRA 7/3, vector pCB301, chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58, thuốc N tabacum K326 phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam cung cấp Các nghiên cứu tiến hành phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam Phương pháp Từ thơng tin trình tự gen GmEXP1 đậu tương công bố Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AF516879, chúng tơi thiết kế cặp mồi đặc hiệu để phân lập đoạn mã hố protein gen GmEXP1 với kích thước ước tính khoảng 768 bp Trình tự nucleotide cặp mồi đặc hiệu sau: Bảng Trình tự cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmEXP1 Ký hiệu Trình tự mồi (5’ - 3’) SoyExp_F CATGCCATGGATGGGCAAAATCATGCTTGT SoyExp_R ATTTGCGGCCGCTTAGAACTGAACTGGGCTAGA Gen GmEXP1 phân lập từ miền sinh trưởng rễ đậu tương theo sơ đồ Hình 2: RNA tổng số tách chiết Trizol Reagent KIT; cDNA tổng hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis KIT; gen GmEXP1 khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu kỳ nhiệt: 940C/4 phút - (940C/45 giây - 560C/30 giây 720C/60 giây)30 - 720C/10 phút Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0.8%; gel theo Gene JETTM Gel Extraction KIT; gắn gen đích vào vector T4 ligase; L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 47 Hình Phân lập gen GmEXP1 từ giống đậu tương địa phương SL1 Để chuyển gen GmEXP1 vào thực vật kiểm tra biểu sản phẩm protein, thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang promoter CaMV35S cấu trúc gen đích gồm có thành phần sau: GmEXP1_cmyc_KDEL_polyA Trong đó, CaMV35S (promoter từ virus khảm súp lơ - hoạt động tất mô tế bào thực vật), c-myc, KDEL polyA nhận từ vector trung gian pRTRA7/3 Dưới sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp trên: Hình Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen GmEXP1 48 L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α sốc nhiệt (420C phút 30 giây) Vi khuẩn mang vector tái tổ hợp chọn lọc môi trường kháng sinh chọn lọc (carbenicilin, kanamycin) Các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp chọn lọc colony-PCR, nuôi cấy môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc phù hợp để thu sinh khối Plasmid tái tổ hợp thu nhận cách tách chiết theo phương pháp tách dòng phân tử [9] Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 phương pháp xung điện (2,5 kV, 25 µF, 200 Ω) Những vi khuẩn mang cấu trúc gen tái tổ hợp nhân lên mơi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin với sinh khối lớn dùng để nhiễm thuốc mơ hình (phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens) Nuôi cấy chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens môi trường kháng sinh chọn lọc kanamycin rifamycin 48 tiếng, sau ni phục hồi môi trường không kháng sinh đo OD600nm = 0.7 Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn, hồ tan mơi trường 1/2MS bổ sung Acetosyringon (AS) để chuẩn bị biến nạp Các mảnh thuốc N.tabacum kích thước × 1cm ngâm dịch huyền phù tế bào vi khuẩn 10 phút, sau tái sinh mơi trường đa chồi MS bổ sung BAP Những chồi phát triển tốt (2 - 3cm) cắt chuyển sang môi trường rễ RM Khi hồn thiện hình thái chuyển giá thể, trồng nhà lưới Kết thảo luận Phân lập gen GmEXP1 từ giống đậu tương địa phương SL1 Từ giống đậu tương SL1, tách chiết RNA tổng số từ miền sinh trưởng rễ; tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên (random hexamer primer) Gen GmEXP1 phân lập phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 1.) Sản phẩm gel gen gắn vào vector tách dòng pBT_2705bp biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α để nhân dòng gen phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 Cắt gen đích từ vector tách dịng pBT Gen GmEXP1 từ vector tách dòng pBT cắt hai loại enzyme hạn chế NotI NcoI cho hai phân đoạn DNA có kích cỡ khoảng 0.77 kb 2.7kb Trong đó, phân đoạn DNA 0.77kb đoạn gen đích (GmEXP1) cần thu nhận Việc sử dụng cặp enzyme hạn chế đảm bảo cho gen đích gắn thuận chiều với promoter vector tái tổ hợp Điện di sản phẩm cắt hạn chế gel agrose, băng có kích thước khoảng 0.77kb thơi gel để thu nhận gen GmEXP1 phục vụ cho thiết kế vector tái tổ hợp Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3 Vector pRTRA 7/3 chứa đoạn tín hiệu cần thiết cho việc biểu kiểm tra gen đích (GmEXP1) tế bào thực vật gồm: promoter CaMV35S khởi động phiên mã tất tế bào mơ thể thực vật; trình tự oligonucleotide xác định chuỗi peptide c-myc để phục vụ phản ứng western blot; đoạn KDEL polyA ổn định cấu trúc phân tử mRNA tạo tế bào Sử dụng cặp enzyme NcoI NotI cắt vector pRTRA 7/3 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0.9kb 3.3kb Trong phân đoạn 3.3kb đoạn mang trình tự cần thu nhận để thiết kế vector tái tổ hợp Điện di sản phẩm cắt hạn chế gel agrose, băng có kích thước khoảng 3.3kb L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 gel để thu nhận plasmid mở vịng mang trình tự cần thiết phục vụ cho thiết kế vector tái tổ hợp Gắn gen GmEXP1 vào vector mở vịng pRTRA 7/3 Sản phẩm thơi gel Gen GmEXP1 gắn vào vector pRTRA 7/3 mở vòng nhờ phản ứng ligation xúc tác enzyme T4 ligase tạo cấu trúc vector tái tổ hợp mang gen chuyển Vector tái tổ hợp biến nạp sốc nhiệt vào tế bào khả biến E.coli DH5α để nhân dịng gen mơi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicilin Năm khuẩn lạc chọn đưa vào môi trường nuôi cấy LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicilin để thu sinh khối, tách plasmid M ~ kb - 49 Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào vector pCB301 Thu nhận cấu trúc mang gen GmEXP1 Sử dụng enzyme cắt hạn chế HindIII xử lý vector tái tổ hợp pRTRA_GmEXP1 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 1.6kb 2.3kb Trong phân đoạn 1.6kb cấu trúc chứa gen đích (GmEXP1) cần thu nhận gồm: CaMV35S_GmEXP1_c-myc_KDEL_polyA Điện di sản phẩm cắt hạn chế gel agrose thu hai băng tính tốn lý thuyết Băng có kích thước khoảng 1.6kb thơi gel để thu nhận cassette chứa gen GmEXP1 phục vụ cho việc thiết kế vector tái tổ hợp Cắt mở vòng vector chuyển gen pCB301 + kb 0.75 kb Hình Kết PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang gen GmEXP1 agrose 0.8% Thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyEXP1F/SoyEXP1R để kiểm tra có mặt gen GmEXP1 plasmid dòng vi khuẩn Kết Hình cho thấy, ba dịng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp chứa gen chuyển (pRTRA_GmEXP1) Vector tái tổ hợp dùng để thu nhận cấu trúc mang gen đích thiết kế vector chuyển gen vào thực vật Sử dụng enzyme HindIII xử lý vector chuyển gen pCB301 nhận hai phân đoạn DNA với kích thước 5.502bp 60bp, phân đoạn thứ phân đoạn đích cần thu nhận thơi gel để thiết kế vector tái tổ hợp Tạo vector tái tổ hợp mang cấu trúc mang gen đích Sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc có trình tự CaMV35S_GmEXP1_c-myc_KDEL_polyA vào plasmid pCB301 mở vòng Do hai cấu trúc xử lý loại enzyme giới hạn (HindIII) tạo đầu dính giống nên việc gắn đoạn nạp vào vector mở vịng xảy hai khả gắn xuôi gắn ngược Tuy nhiên, hai cấu trúc xuôi ngược, gen GmEXP1 khởi động phiên mã CaMV35S có khả tạo sản phẩm phiên mã mang theo sau trình tự cmyc_KDEL_polyA Vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coli DH5α sốc 50 L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 nhiệt để nhân dòng Vi khuẩn sau biến nạp nuôi môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin Thực PCR-colony khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu (SoyEXP1F/SoyEXP1R) để tìm dịng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp, kết thể Hình kb 0.5 kb Hình Kiểm tra kết Colony gen GmEXP1 dòng vi khuẩn agrose 0.8% Các dòng vi khuẩn dương tính (dịng 1, 2, 3, 5, 6) nuôi cấy môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin thu sinh khối tách plasmid tái tổ hợp Đây cấu trúc vector cần thiết kế: pCB301_CaMV35S_GmEXP1_cmyc_KDEL_polyA để chuyển gen biểu tế bào thực vật Biến nạp vector tái tổ hợp mang gen chuyển vào Agrobacterium tumefaciens CV58 Cấu trúc vector thiết kế biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens CV58 kỹ thuật điện xung Vi khuẩn A.tumefaciens sau biến nạp nuôi cấy môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin Lựa chọn khuẩn lạc tốt, phát triển đồng chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin nuôi cấy để thu sinh khối, tách plasmid Tiến hành kiểm tra có mặt gen GmEXP1 plasmid dòng vi khuẩn tương ứng PCR với cặp mồi SoyEXP1F/SoyEXP1R Kết kiểm tra (Hình 6.) cho thấy, dòng khuẩn lạc 1, 3, dương tính, nghĩa mang gen đích GmEXP1 kb 0.5 kb Hình Kiểm tra kết PCR phát plasmid mang gen GmEXP1 agrose 0.8% Các dòng vi khuẩn A.tumefaciens có plasmid tái tổ hợp chứa gen GmEXP1 giữ chủng, sử dụng để biến nạp vào thực vật Sơ phân tích chuyển gen Chuyển gen vào thuốc mơ hình (N tabacum K326) Kết chuyển gen vào thuốc mơ hình N tabacum thể Bảng L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 51 Bảng Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào thuốc mơ hình N tabacum Stt Tổng Số mẫu biến nạp 30 30 40 100 Số mẫu tạo chồi 30 29 38 97 Số chồi môi trường rễ Số giá thể 88 87 102 277 74 75 93 242 Phân tích thuốc chuyển gen Tiến hành thu mẫu 44 thuốc tái sinh, tách chiết tinh DNA, thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (SoyEXP1F/SoyEXP1R) để kiểm tra có mặt gen GmEXP1 Kết kiểm tra cho thấy có 32/44 tái sinh dương tính với phản ứng PCR Như thấy, q trình chuyển gen thực thành công đưa cấu trúc GmEXP1 vào thuốc mơ hình nhờ vi khuẩn A tumefaciens kb 0.5 kb Hình Kết PCR phát số dòng thuốc mang gen GmEXP1 agrose 0.8% Các thuốc dương tính với phản ứng PCR tiếp tục chăm sóc để kiểm tra biểu gen GmEXP1 Western Blot phân tích hệ sau chúng để kết luận di truyền cấu trúc gen chuyển Kết luận Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pCB301 mang promoter CaMV35S cấu trúc chứa gen đích (GmEXP1_cmyc_KDEL_polyA) xác định protein expansin kéo giãn thành tế bào Thực chuyển thành công cấu trúc vào mô thuốc N.tabacum K326, tái sinh thành hoàn chỉnh Kiểm tra có mặt gen chuyển thuốc tái sinh cho thấy 32/44 dòng mang gen GmEXP1 Qua thấy, gen GmEXP1 vector tái tổ hợp thiết kế sử dụng để chuyển vào trồng quan tâm nhằm cải thiện khả chịu hạn phát triển mạnh hệ rễ Tài liệu tham khảo [1] Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011) Gen đặc tính chịu hạn đậu tương Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 52 [2] [3] [4] [5] L.T Sơn nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 44-52 Le DT, Nishiyama R, Watanabe Y, Mochida K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, and Tran LS (2011) Genom-Wide Expression Proling of Soybean Root and Shoot Tissues under Dehydration Stress DNA Research 18: 17 - 29 Kaspar TC, Taylor HM and Shibles RM (1984) Taproot elongation rates of Soybean cultivars in the glasshouse and their relation to field rooting depth Crop Sci 24: 916 - 920 Brummall DA, Harpester MH, Civello PM, Palys JM, Bennett AB, and Dunsmuir P (1999) Modification of Expansin Protein Abundance in Tomato Fruit Alters Softening and Cell Wall Polymer Metabolism during Ripening Plant Cell 11: 2203 - 2216 Cosgrove DJ (2000) Loosening of plant cell walls by expansins Nature 407: 321 - 326 [6] [7] [8] [9] Lucca P, Ye X, Potrykus I (2001) Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent Mol Breed 7: 43- 49 Li Y, Catherine P Darley, Veronica Ongaro, Andrew Fleming, Ori Schipper, Sandra L Baldauf, and Simon J McQueen-Mason (2002) Plant expansins are a complex multigene family with an ancient evolutionary origine Plant Physiol 128: 854 - 864 Lee DK, Ahn JH, Song SK, Choi YD, Lee JS (2003) Expression of an Expansin gene is correlated with root elongation in soybean Plant Physiol 131: 985 - 977 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Cloning, Designing Vector and Transgenic GmEXP1 Structure in to Nicotinana Tabacum Lò Thanh Sơn1, Hồ Mạnh Tường2, Lê Văn Sơn2, Nguyễn Vũ Thanh Thanh3, Chu Hoàng Mậu3 Taybac University Institute of Biotechnology (IBT)- Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Thainguyen University Abstract: Expansin have an important role in the relaxation phase of cell growth in the domain of soybean root systems Two functional regions (DPBB and Pollen allerg) determined as a protein expansin likely impact break the link between non - chemotherapy with micro fiber polysaccharides cellulose cell walls easily help dilation (both horizontally and vertically) under health impacts of water policy GmEXP1 activity of genes (identified expansin protein) related to the prolonged soybean roots, enhances drought tolerance of soybean plants In this paper, we present the results of the design vector carrying the gene structure GmEXP1 was crossed with a snippet of C- myc and KDEL peptide, under the control of CaMV35S promoter; tranfered into plant leaf pieces (Nicotinana tabacum) throughout A.tumefaciens The results have showed that the presence of gene in 44 tobacco lines were test by PCR The PCR showed that 32/44 tobacco lines carrying gene transferred GmEXP1, so this structure can be used to transfer gene into interes crops Keywords: Expansin, Glycine max, GmEXP1, prolonged root cell walls stretch ... tái tổ hợp chứa gen GmEXP1 giữ chủng, sử dụng để biến nạp vào thực vật Sơ phân tích chuyển gen Chuyển gen vào thuốc mơ hình (N tabacum K326) Kết chuyển gen vào thuốc mơ hình N tabacum thể Bảng... plasmid mở vịng mang trình tự cần thiết phục vụ cho thiết kế vector tái tổ hợp Gắn gen GmEXP1 vào vector mở vịng pRTRA 7/3 Sản phẩm thơi gel Gen GmEXP1 gắn vào vector pRTRA 7/3 mở vòng nhờ phản... DH5α để nhân dòng gen phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 Cắt gen đích từ vector tách dịng pBT Gen GmEXP1 từ vector tách dòng pBT cắt hai loại enzyme hạn chế