Khảo sát ứng dụng protein sao và tế bào streptococcus suis trong phương pháp elisa và kháng thể của chúng trong chẩn đoán

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VPĐD TỔ CHỨC CENTRE FOR TROPICAL MEDICINE OXFORD UNIVERSITY CLINICAL RESEARCH UNIT-HCMC BÁO CÁO NGHIỆM THU Khảo sát ứng dụng protein SAO tế bào Streptococcus suis phương pháp ELISA kháng thể chúng chẩn đoán CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS NGÔ THỊ HOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2015 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Khảo sát ứng dụng protein SAO tế bào Streptococcus suis phương pháp ELISA kháng thể chúng chẩn đoán CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) TS Ngô Thị Hoa CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/ 2015 i Báo cáo nghiệm thu Tên đề tài: Khảo sát ứng dụng protein SAO tế bào Streptococcus suis phương pháp ELISA kháng thể chúng chẩn đốn Chủ nhiệm đề tài: TS Ngơ Thị Hoa Cơ quan chủ trì: VPĐD Centre for Tropical Medicine – Oxford University Clinical Research Unit (CTM-OUCRU) Thời gian thực đề tài: 2/2013- 8/2015 (bao gồm tháng gia hạn nghỉ sinh) Kinh phí duyệt: 650.000.000 đồng (Sáu trăm năm mươi triệu đồng chẵn) Kinh phí cấp: 585.000.000 đồng Kinh phí sử dụng: 633.728.882 đồng Mục tiêu: Mục tiêu tổng quát: Xây dựng quy trình ELISA khảo sát khả dùng kháng thể đặc hiệu kháng S suis nhằm ứng dụng sàng lọc huyết chẩn đoán Mục tiêu cụ thể: Khảo sát phát triển quy trình ELISA dùng protein SAO nhằm ứng dụng khảo sát huyết học Khảo sát khả dùng tế bào SS2 kháng nguyên để phát triển phương pháp ELISA nhằm ứng dụng khảo sát huyết học Khảo sát khả ứng dụng kháng thể kháng với toàn tế bào với protein SAO S suis phân lập đặc hiệu S suis đĩa thạch Nội dung thực tương ứng với mục tiêu cụ thể: Khảo sát tính phổ biến biến thể gen thư viện chủng nhằm sử dụng protein biến thể phổ biến quy trình ELISA Xác định độ nhạy đặc hiệu quy trình ELISA dùng protein SAO Tạo kháng thể kháng tế bào SS2 ii Sử dụng kháng thể khảo sát khả ứng dụng phân lập tế bào S suis đĩa thạch Nội dung thực chi tiết STT Nội Công việc dự kiến Cơng việc hồn thành Giai đoạn dung Khảo sát phát triển quy trình ELISA dùng protein SAO nhằm ứng dụng khảo sát huyết học 1A Xác định mồi đặc hiệu khảo sát tính phổ 1B - Xác định mồi đặc hiệu cho gen -I biến gen - Xác định tỉ lệ phân bố chủng phân lập từ gen tập hợp 232 người heo (~200 chủng vi khuẩn phân lập từ chủng) người Khuếch đại tạo dòng - Khuếch đại tạo dịng thành đoạn gen mã hóa cho cơng gen mã hóa cho protein protein SAO SAO dịng tế bào E coli -I Kiểm tra kết tạo dịng gen phương pháp giải trình tự 1C Biểu vượt mức protein SAO tinh - Biểu tinh protein -I SAO (với độ tinh >90%) cột Ni+ 1D Tiêm protein SAO tinh - Thu nhận kháng huyết vào thỏ trắng New kháng với protein SAO từ Zealand để tạo kháng thỏ thể đa dòng -I kháng protein SAO 1E Xây dựng quy trình - Quy trình ELISA gián tiếp ELISA đánh giá độ thực đĩa 96 giếng đặc hiệu độ costar với nồng độ protein SAO -I &II iii nhạy kháng thể đa dòng kháng protein 1ug/giếng - Kháng thể thỏ kháng protein SAO có độ đặc hiệu (100%) SAO độ nhạy tối thiểu độ pha loãng 16000 1F Đánh giá tính ứng dụng - Xác định độ nhạy của thử nghiệm ELISA phương pháp ELISA dựa khảo sát huyết protein SAO 90% độ đặc bệnh nhân (20 hiệu 95% -II mẫu dương tính 20 mẫu âm tính) Khảo sát khả dùng tế bào SS2 kháng nguyên để phát triển phương pháp ELISA nhằm ứng dụng khảo sát huyết học 2A Tiêm toàn tế bào SS2 vào thỏ trắng New - Thu nhận kháng huyết -I thỏ kháng toàn tế bào SS2 Zealand tạo kháng thể đa dòng kháng toàn tế bào S suis 2B Đánh giá độ đặc hiệu - Quy trình ELISA gián tiếp độ nhạy kháng thể thực đĩa 96 giếng đa dòng từ thỏ kháng costar với nồng độ tế bào S suis toàn tế bào S suis 1ug/giếng -I - Kháng thể thỏ kháng toàn tế bào S suis có độ đặc hiệu (100%) độ nhạy tối thiểu độ pha loãng 8000 2C Tối ưu hóa phương pháp ELISA – tế bào dùng tế bào - Giá trị ngưỡng phát (cut -II off) kháng - Qui trình ELISA hồn chỉnh nguyên huyết với thông số kỹ thuật khả iv người bệnh người ứng dụng qui trình khỏe (20 cặp) Khảo sát khả ứng dụng kháng thể với toàn tế bào với protein SAO S suis phân lập đặc hiệu S suis đĩa thạch 10 3A Tinh kháng thể Kháng thể tinh kháng với II protein SAO toàn tế bào S suis týp huyết 11 3B Khảo sát ứng dụng Kết luận tính ứng dụng kháng II loại kháng thể thể phân lập S suis môi trường thạch Qui trình ứng dụng bao gồm nồng phân lập SS2 độ kháng thể phương pháp phân lập đính kèm Báo cáo nghiệm thu cấp Báo cáo nghiệm thu, hồ sơ 8/2015 sở nghiệm thu cấp sở Báo cáo nghiệm thu cấp Báo cáo nghiệm thu sản 9/2015 thành phố phẩm khác đề tài v Khảo sát ứng dụng protein SAO tế bào Streptococcus suis phương pháp ELISA kháng thể chúng chẩn đốn Tóm tắt Protein bề mặt (Surface antigen one, SAO) protein diện bề mặt tế bào vi khuẩn Streptococcus suis, tác nhân quan trọng gây viêm màng não mủ người Việt Nam Một phiên protein SAO tạo dòng, biểu vượt mức tế bào E coli BL21(DE3)pLysS tinh dựa đặc tính lực với Nickel aminoacid Histidine Protein sử dụng làm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch sản xuất kháng thể đa dòng đặc hiệu thỏ trắng New Zealand Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể huyết thỏ trình gây miễn dịch với protein SAO phản ứng ELISA cho thấy protein SAO có tiềm sinh miễn dịch cao Huyết thỏ dùng để phát triển phương pháp ELISA kiểu mẫu nhằm phát kháng thể kháng S suis khảo sát khả sử dụng phân lập S suis cho mục đích ứng dụng thực tế Kết nghiên cứu cho thấy protein SAO thu nhận có độ tinh cao (>90%), huyết thỏ chứa kháng thể với độ đặc hiệu tuyệt đối (100%) có hiệu giá kháng thể tốt độ pha loãng >16000 Khảo sát sử dụng kháng nguyên SAO protein phát kháng thể huyết bệnh nhân, nhiễm S suis nhiễm tác nhân khác S suis, cho thấy qui trình ELISA có độ đặc cao (95%) độ nhạy tốt (90%) Phương pháp phân lập định danh sử dụng huyết thỏ chứa kháng thể kháng toàn tế bào S suis cho thấy độ nhạy đặc hiệu cao (100%) Tuy nhiên để đánh giá khả ứng dụng thực tế, cần phải thử nghiệm với cỡ mẫu lớn cho phương pháp ELISA khả ứng dụng kháng thể kháng SAO chẩn đoán phân lập vi Investigation the application of SAO protein and whole cell Streptococcus suis in ELISA and their polyclonal antibody in diagnosis Summary Surface antigen one (SAO) is the surfaced-expressed protein from the major important zoonotic pathogen, Streptococcus suis, which is the most common cause of bacterial memningitis in Vietnam The recombinant SAO-M variant protein was cloned and overexpressed in E coli BL21(DE3)pLysS cells and purified by binding affinity to Nickel of the His-tag in protein C terminal Purified SAO-M protein and whole cell S suis are employed as individual antigens to raise specific antibodies in two separate lots of three New Zealand white rabbits These SAO antibodies are planed for employment in development of prototype ELISA for sero-surveillance, while the whole cell antibody will be investigated for its application in isolation of S suis in culture The purity of SAOM protein was high (>90%) post gel –purification The antibody against SAO-M protein increased from the 1st to the 3rd injection indicating that SAO- M protein is antigenic The SAO-M antisera showed high specificity (100%) and sensitivity (with titer of over 16000) in ELISA prototype Using ELISA prototype to detect for the presence of antibody against S suis in serum samples collected from patients infected with S suis and with non S suis pathogens showed the high specificity (95%) and sensitivity (90%) to S suis The absolute sensitivity and specificity (100%) were also obtained in isolation of S suis from agar plate containing the antisera against whole cell S suis Their potential successful application will need to be investigated and validated with larger sample set vii MỤC LỤC Danh mục viết tắt xi Danh mục bảng xii Danh mục đồ thị xiii Danh mục hình xiii I Tổng quan 1.1 Tổng quan chung 1.2 Tổng quan đề tài 1.2.1 Nhiễm S suis Việt Nam 1.2.2 Những nghiên cứu thử thách tình hình nhiễm S suis Việt Nam 1.2.3 Các phương pháp chẩn đoán phân lập S suis 1.2.4 Protein SAO- đặc điểm vai trò miễn dịch 11 II A Nội dung nghiên cứu 13 Phần 1: Nội dung 13 2.1 Khảo sát phát triển quy trình ELISA dùng protein SAO nhằm ứng dụng khảo sát huyết học 13 2.1.1 Xác định cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại đoạn gen khảo sát tính phổ biến gen biến thể chúng chủng phân lập từ người heo (1A) 13 2.1.2 Khuyếch đại tạo dòng đoạn gen protein SAO vào vector biểu (1B) 14 2.1.3 Biểu vượt trội tinh protein SAO (1C) 16 2.1.4 Tiêm protein tinh vào thỏ nhằm tạo kháng thể kháng protein SAOM thỏ, thu nhận huyết định kì, phát triển quy trình ELISA (1D) 18 viii Đánh giá độ nhạy đặc hiệu kháng thể phương pháp 2.1.5 ELISA (1E) 20 Đánh giá tính ứng dụng thử nghiệm ELISA khảo sát huyết 2.1.6 bệnh nhân (20 mẫu dương tính 20 mẫu âm tính) (1F) 21 B Phần 2: 22 2.2 Nội dung 2: Khảo sát khả dùng tế bào SS2 kháng nguyên để phát triển phương pháp ELISA nhằm ứng dụng khảo sát huyết học ứng dụng kháng thể chúng chuẩn đoán 22 2.2.1 Tạo kháng thể đa dòng kháng protein tế bào S suis (2A) 22 2.2.2 Đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy kháng thể đa dòng phương pháp ELISA (2B) 23 Tối ưu hóa phương pháp ELISA –kháng nguyên tế bào S suis 2.2.3 huyết người bệnh người khỏe (20 cặp) (2C) 25 Nội dung 3: Khảo sát khả ứng dụng kháng thể kháng với 2.3 toàn tế bào với protein SAOM S suis phân lập đặc hiệu S suis đĩa thạch 26 2.3.1 Tinh kháng thể (3A) 26 2.3.2 Khảo sát ứng dụng loại kháng thể môi trường thạch phân lập SS2 (3B) 28 III Kết thảo luận 31 A Phần 1: Nội dung 31 3.1 Khảo sát phát triển quy trình ELISA dùng protein SAO nhằm ứng dụng khảo sát huyết học 31 3.1.1 Sự phân bố gen tập hợp chủng S suis phân lập từ người heo (1A) 31 3.1.2 Tạo dòng giải trình tự plasmid pET30 mang đoạn gen (1B) 32 3.1.3 Biểu vượt mức thu nhận protein hòa tan SAOM tinh (1C) 35 ix 98 99 100 101 102 103 104 105 106 Báo cáo Poster Hội nghị bệnh Truyền nhiễm toàn quốc, Đà Lạt 4-5/09/2015 Tiêu đề: KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEIN CỦA STREPTOCOCCUS SUIS TRONG PHƯƠNG PHÁP ELISA ĐỂ KHÁO SÁT HUYẾT THANH HỌC Tác giả: Trần Thị Bích Chiêu, Võ Thị Minh Hoa, Nguyễn Đức Trung, Huỳnh Ngân Hà Ngô Thị Hoa Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford TP HCM, 764 Võ Văn Kiệt, Phường 1, Quận 5, TP HCM, Tel: +84-8-39241761 Email: hoant@oucru.org Từ khố: Streptococcus suis, Protein bề mặt, protein SAO, ELISA Tóm tắt Mở đầu Vi khuẩn Streptococcus suis tác nhân quan trọng hàng đầu gây viêm màng não cấp Việt Nam Một yếu tố nguy nhiễm S suis người xác định tiếp xúc với heo thịt heo Thơng tin tình trạng mang trùng nhiễm không triệu chứng báo cáo Châu Âu Mỹ, nhiên thông tin tương tự không báo cáo Việt Nam, nước đứng thứ ba danh sách nước có số ca nhiễm liên cầu khuẩn hàng đầu giới Dữ liệu chưa tồn chưa có phương pháp khào sát thích hợp Protein SAO báo cáo protein bề mặt S suis có khả gây đáp ứng miễn dịch mơ hình động vật Mục tiêu Chúng tơi tiến hành tạo dòng biến thể phổ biến gen SAO biểu vượt mức protein nhằm ứng dụng qui trình thử nghiệm miễn dịch liên kết (ELISA) kiểu mẫu Độ nhạy độ đặc hiệu ELISA kiểu mẫu xác định nhằm đánh giá khả ứng dụng Kết Gen Sao M xác định biến thể phổ biến (84,4%) tập hợp thư viện chủng S suis phân lập từ người heo Việt Nam Nồng độ tới ưu protein SAO-M biều vượt mức dùng ELISA kiểu mẫu 1ug/ml với kháng thể kháng SAO thu nhận từ qui trình tạo kháng thể thỏ Độ nhạy đặc hiệu qui trình ELISA kiễu mẫu xác định 95% thử nghiệm sử dụng 20 huyết bệnh nhân xác định nhiễm với S suis 20 huyết nhiễm với tác nhân khác S suis Kết luận SAO protein có khả sử dụng kháng nguyên thử nghiệm ELISA cho mục đích khảo sát huyết học 107 Đào tạo thạc sĩ (01) 108 109 Đào tạo cử nhân (kết không đăng ký) 110 111 112