Nghiên cứu biểu hiện kháng thể kháng thụ thể tăng cường biểu mô egfr trong e coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Lê Thị Kim Xuân NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG THỤ THỂ TĂNG CƢỜNG BIỂU MÔ EGFR TRONG E COLI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ QUANG HUẤN TS TRƢƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI, NĂM 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu biểu kháng thể kháng thụ thể tăng cường biểu mơ EGFR E coli” cơng trình nghiên cứu cá nhân thực dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Lê Quang Huấn TS Trƣơng Quốc Phong Các nội dung nghiên cứu kết đƣợc trình bày luận văn trung thực rõ ràng Học viên Lê Thị Kim Xuân LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Lê Quang Huấn, trƣởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ em suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn TS Trƣơng Quốc Phong, trƣởng phịng thí nghiệm proteomic, trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội tận tình bảo cho em suốt trình làm luận văn Em xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức cho em trình học tập rèn luyện Trong thời gian học tập nghiên cứu nhận đƣợc dạy tận tình đầy trách nhiệm tập thể cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ Tế bào Động Vật, Viện Công nghệ Sinh học, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Cuối cùng, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln quan tâm, cổ vũ cho vững bƣớc đƣờng học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2013 Học viên Lê Thị Kim Xuân DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADCC Antibody - denpendent cellular cytoxicity DNA Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid ribonucleic ATP Acid adenosin triphosphat bp Base pair (cặp base nitơ) CDR Complementarity determining region CISH Chromogenic in situ hybridization dNTP Deoxyribonucleotide DBB Denaturing binding buffer DWB Denaturing wash buffer E coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EGF Epidermal growth factor EGFR Epidermal growth factor receptor ErbB Epidermal growth factor EtBr Ethidium Bromide Fab Fragment antigen binding Fc Fragment crystallizable FISH Fluorescence in situ hybridization HB- EGF Heparin binding epidermal growth factor HER Human epidermal receptor IHC Immunohistochemistry IPTG Isopropyl β- D- 1- Thiogalactopyranoside C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an kDa Kilo Dalton LB Luria Broth mRNA Messeger RNA (ARN thông tin) MAPK mitogen- activated protein kinase P mTOR mammalian target of rapamycin NEB Native elution buffer NPB Native purification buffer NWB Native wash buffer NSCLC Non Small- Cell Carcinoma (ung thƣ phổi tế bào không nhỏ) OD Optical Dentisy PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PI3K Phosphatidylinositol 3- kinase RTK Receptor tyrosine kinase scFv Single chain variable fragment (kháng thể đơn chuỗi) SDS Sodium dodecyl sulphate STAT3 Tín hiệu khẩn cấp TBS Tris-buffered saline TAE Tris acetic acid- EDTA TE Tris EDTA TGF-α Transforming growth factor receptor alpha TIKs Tyrosine kinase TKI Tyrosine kinase inhibitor v/ph Vòng/phút Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng trang Bảng 1: Tình trạng bệnh ung thƣ giới Việt Nam (năm 2008) Bảng 2:5 bệnh ung thƣ thƣờng gặp hai giới (năm 2008) Bảng 3: Khối u ác tính biểu mức kiểu dại kiểu đột biến thụ thể ErbB 10 Các cặp mồi đƣợc sử dụng nghiên cứu chu trình nhiệt tƣơng ứng 21 Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt 22 Thành phần hỗn hợp phản ứng gắn enzyme 25 Gel phân tách 28 Gel cô 29 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình trang Hình 1.1: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ Hình 1.2 : Sự chọn dịng ung thƣ Hình 1.3: Cấu trúc EGFR Hình 1.4: Sự trùng hợp thụ thể EGFR Hình 1.5: Con đƣờng truyền tín hiệu điều khiển hoạt hóa thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu mơ (EGFR) Hình1.6: Những chiến lƣợc nghiên cứu nhằm tìm điều trị đích ung thƣ liên quan đến EGFR Hình1.7: Những phân tử đƣợc xem nhƣ đích điều trị ung liên quan đến EGFR 13 14 Hình 1.8: Cấu trúc kháng thể 15 Hình 3.1: Kết PCR với cặp mồi đặc hiệu antiHER1F/R 33 Hình 3.2: Kết biến nạp plasmid pCR 2.1/antiEGFR vào tế bào khả biến E coli DH5α Hình 3.3: Kết PCR với cặp mồi M13F/R Hình 3.4: Kết tách chiết số dòng plasmid tái tổ hợp pCR 2.1/antiEGFR Hình 3.5: Sản phẩm cắt vector pCR2.1/antiEGFR với hai enzyme hạn chế Hình 3.6: Kết cắt mở vòng vector biểu 35 36 37 38 38 Hình 3.7: Kết biến nạp dịng plasmid tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, GB1/antiEGFR, MBP fusion/antiEGFRvào tế bào E coli DH5α Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 39 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.8: Kết cắt vector tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, pET30a GB1/antiEGFRfusion/antiEGFR 40 enzyme BamH I Xho I Trình tự gen antiEGFR vector pET28 a+ 41 Hình 3.9: Kết biến nạp dòng plasmid tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, pET30a GB1/antiEGFR, 42 MBP fusion/antiEGFRvào tế bào E coli BL21 (DE3) Hình 3.10: Kết biểu protein tái tổ hợp E coli 43 Hình 3.11: Kết Western blot 45 Hình 3.12: Kết kiểm tra độ hịa tan kháng thể tái tổ hợp 46 Hình 3.13: Kết tinh protein tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 47 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan bệnh ung thƣ 1.1.1.Ung thƣ 1.1.1.Ảnh hƣởng bệnh ung thƣ 1.1.2.Nguyên nhân gây ung thƣ 1.2.Thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor) 1.2.1.Đặc điểm EGFR 1.2.2.Chức EGFR 1.2.3.Thụ thể yếu tố tăng trƣởng biểu mô ung thƣ 1.3.Các phƣơng pháp chẩn đốn điều trị ung thƣ biểu mơ 11 1.3.1.Các phƣơng pháp chẩn đoán 11 1.3.2.Phƣơng pháp điều trị 12 1.4.Kháng thể ứng dụng chẩn đoán, điều trị ung thƣ 14 1.4.1.Kháng thể 14 1.4.2.Kháng thể đơn dòng 15 1.4.3.Ứng dụng kháng thể đơn dịng chẩn đốn điều trị ung thƣ 16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1.Vật liệu 18 2.1.1.Sinh phẩm 18 2.1.2.Hóa chất mơi trƣờng 18 2.1.3.Trang thiết bị nghiên cứu 18 2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1.Thiết kế vector biểu 20 2.2.1.1.Phƣơng pháp PCR 21 2.2.1.2.Phƣơng pháp cắt DNA enzyme hạn chế 22 2.2.1.3.Phƣơng pháp điện di gel agarose 22 2.2.1.4.Phƣơng pháp thu DNA từ gel agarose 23 2.2.1.5.Phƣơng pháp tinh DNA 24 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.2.1.6.Phƣơng pháp gắn DNA vào vector biểu 25 2.2.2.Nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp 25 2.2.2.1.Phƣơng pháp biến nạp plasmid vào E coli 25 2.2.2.2.Phƣơng pháp tách plasmid từ vi khuẩn E coli 26 2.2.2.3.Phƣơng pháp biểu 27 2.2.2.4.Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 28 2.2.2.5.Phƣơng pháp Western Blot 29 2.2.2.6.Phƣơng pháp kiểm tra độ hòa tan protein tái tổ hợp 30 2.2.2.7.Phƣơng pháp tinh protein 31 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1.Tạo dịng gen mã hóa kháng thể kháng EGFR 33 3.1.1.Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng thể kháng EGFR (antiEGFR) 33 3.1.2.Kết tạo dòng gen mã hóa kháng thể kháng EGFR 34 3.2.Thiết kế vector biểu kháng thể kháng EGFR 37 3.3.Biểu nhận diện kháng thể tái tổ hợp 41 3.3.1.Biểu kháng thể tái tổ hợp E coli 41 3.3.2.Kết nhận diện kháng thể tái tổ hợp phản ứng WesternBlot 44 3.3.3.Kết kiểm tra độ hòa tan kháng thể tái tổ hợp 45 3.4.Kết tinh kháng thể tái tổ hợp 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ Hình 3.11: Kết Western blot Đƣờng chạy số 1: MBP fusion protein chứa antiEGFR Đƣờng chạy số 2: pET28a TRX fusion protein chứa antiEGFR Đƣờng chạy số 3: His- antiEGFR (trong pET28a +) Đƣờng chạy số 4: pET30a GB1fusion protein chứa antiEGFR Đƣờng chạy số 5: Marker protein Trên màng cellulose xuất vạch màu khác tƣơng ứng với protein gel polyacrylamide Những vạch màu có kích thƣớc khác so sánh với marker tƣơng đƣơng với kích thƣớc protein tái tổ hợp MBP fusion/antiEGFR (66 kDa), pET28 TRX/antiEGFR (46 kDa), pET28a (+)/antiEGFR (30 kDa) pET30a GB1/antiEGFR (36 kDa) Nhƣ khẳng định biểu thành công kháng thể tái tổ hợp kháng EGFR 3.3.3 Kết kiểm tra độ hòa tan kháng thể tái tổ hợp Kiểm tra độ hòa tan protein tái tổ hợp bƣớc quan trọng để lựa chọn phƣơng pháp tinh protein cho phù hợp Protein có tính tan tốt việc tinh đƣợc thuận lợi đơn giản Trong nghiên cứu tiến hành kiểm tra độ hòa tan protein tái tổ hợp với điều kiện nuôi cấy chủng biểu nhƣ sau: 37oC, ni lắc 200 vịng/phút, cảm ứng IPTG nồng độ cuối 0,4 mM, thời gian thu mẫu sau cảm ứng giờ.Tiến hành thu mẫu tế bào sau cảm ứng phá tế bào phƣơng pháp siêu âm dung dịch đệm lysis Dịch siêu âm đƣợc ly Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 45 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ tâm thu phân đoạn để kiểm tra phƣơng pháp điện di protein (Hình 3.12) Hình 3.12: Kết kiểm tra độ hịa tan kháng thể tái tổ hợp M: marker protein TS: protein tổng số C: protein cặn HT: protein dịch hòa tan Đƣờng chạy số 1, 2, 3: pET30a GB1/antiEGFR Đƣờng chạy số 4, 5, 6: pET28a TRX/antiEGFR Đƣờng chạy số 7, 8, 9: pET28a+/antiEGFR Đƣờng chạy số 10, 11, 12: MPB fusion/antiEGFR Kết cho thấy, tùy thuộc vào vector biểu mà lƣợng protein phân đoạn hịa tan thay đổi Protein tái tổ hợp có khả hòa tan vector biểu pET30a GB1, MBP fusion pET28a + Lƣợng protein hòa tan tốt vector biểu pET30a GB1 fusion Trong vector biểu pET28a TRX hầu nhƣ protein tái tổ hợp khơng hịa tan Từ kết lựa chọn phƣơng pháp tinh kháng thể tái tổ hợptheo phƣơng pháp Hybrid sử dụng cột sắc ký Ni-NTA agarose 3.4 Kết tinh kháng thể tái tổ hợp Tinh protein bƣớc quan trọng để thu nhận protein sau xác định trình tự acid amin nhƣ hoạt tính sinh học protein Có nhiều phƣơng pháp tinh khác nhƣ sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion…tuy nhiên, sắc ký lực đƣợc xem phƣơng pháp hiệu Vì phƣơng pháp Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 46 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ dựa vào lực liên kết để thu nhận protein, hiệu tinh cao Từ kết biểu cho thấy tất protein tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, pET30a GB1/antiEGFR, MBP fusion/antiEGFR đƣợc biểu tốt với mức độ biểu cao Hơn protein tái tổ hợp đƣợc tạo chứa trình tự mã hóa cho acid amin histidin (his- tag), điều thuận lợi cho việc sử dụng phƣơng pháp tinh sắc ký lực sử dụng hạt agarose có gắn Ni2+ Sự gắn kết lực đuôi his-tag với Ni2+ giữ lại protein tái tổ hợp, protein khác bị rửa trôi Sau protein tái tổ hợp đƣợc giải hấp thu lại để kiểm tra Lựa chọn protein tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR để tinh sạch, từ kết kiểm tra độ hịa tan cho thấy protein có khả hòa tan tốt so với protein pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR MBP fusion/antiEGFR Tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR đƣợc ni cấy với thể tích lớn mơi trƣờng LB lỏng (50ml) có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 μg/ml),ni lắc 37oC đến OD đạt 0.6 tiến hành cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 0.4 mM, sau cảm ứng thu mẫu Dịch tế bào đƣợc ly tâm 6.000 v/ph 20 phút thu sinh khối Cặn tế bào đƣợc hòa tan đệm DBB, siêu âm phá tế bào tiến hành tinh theo nhƣ phƣơng pháp Hybrib Thu mẫu trƣớc tinh sạch, sau tinh kiểm tra hiệu tinh điện di protein gel polyacrylamide 12.5% (Hình 3.13) Hình 3.13: Kết tinh protein tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR Đƣờng chạy số 1: mẫu trƣớc cảm ứng Đƣờng chạy số 2: mẫu sau cảm ứng (trƣớc tinh sạch) Lê Thị KimĐƣờng Xuân chạy số 3: mẫu sau tinh thu đệm chứa 100 mM Imidazole 47 Đƣờng chạy số 4: mẫu sau tinh thu đệm chứa 250 mM Imidazole Đƣờng chạy số 5: mẫu sau tinh thu đệm chứa 500 mM Imidazole M: marker protein Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ Các mẫu trƣớc cảm ứng, sau cảm ứng tinh lấy mẫu 40 μl, bổ sung đệm SDS sample 5X, biến tính 100oC, sau tiến hành điện di gel polyacrylamide Kết cho thấy mẫu protein tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR sau tinh lại băng nhất, với kích thƣớc ban đầu (36 kDa), khơng cịn lẫn protein khác Protein sau tinh đƣợc thu lại dung dịch giải hấp có chứa nồng độ: Imidazole 100 mM, Imidazole 250 mMvà nồng độ Imidazole 500 mM hầu nhƣ khơng cịn protein tái tổ hợp Nhƣ khẳng định, chúng tơi tinh thành công protein tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR với hiệu tinh tƣơng đối cao Toàn protein tái tổ hợp đƣợc thu lại hoàn tồn từ cột sắc kí lực Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 48 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Thiết kế thành công bốn vector biểu khác mang gen mã hóa kháng thể kháng EGFR là: pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, pET30a GB1/antiEGFR, MBP fusion/antiEGFR - Tạo đƣợc chủng E coliBL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, pET30a GB1/antiEGFR,MBP fusion/antiEGFR biểu thành công kháng thể tái tổ hợp 4vector biểu đƣợc sử dụng, hiệu biểu tƣơng đối cao với điều kiện biểu hiện: + Nhiệt độ: 37oC, ni lắc: 200 vịng/phút + Cảm ứng IPTG nồng độ cuối 0,4 mM + Thời gian thu mẫu sau cảm ứng: - Kháng thể tái tổ hợp đƣợc tinh thành công phƣơng pháp sắc ký lực với Ni2+ hệ biểu pET30a GB1fusion/BL21 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện biểu thu nhậnkháng thể tái tổ hợp - Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học kháng thể tái tổ hợp Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 49 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt: Bộ môn Ung thƣ (2005), Ung thư học đại cương, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Đặng Thị Minh Lụa, Lã Thị Huyền, Lê Quang Huấn (2011) “Nghiên cứu điều kiện biểu gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư vú HER2 E coli”, tạp chí y học Việt Nam, số trang 7-11 PGS TS Nguyễn Bá Đức (2009), Bài giảng ung thư học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, Nhà xuất khoa học tự nhiên cơng nghệ, Hà Nội Lê Đình Sáng (2010), Bệnh học ung thư, Nhà xuất Y học, Hà Nội PSG TS Phạm Văn Ty (2008), Miễn dịch học, Nhà xuất giáo dục Tài liệu tiếng Anh: Barozzi, C., Ravaioli, M., D'Errico, A., Grazi, G L., Poggioli, G., Cavrini, G., Mazziotti, A., and Grigioni, W F (2002) “Relevance of biologic markers in colorectal carcinoma: a comparative study of a broad panel”, Cancer94, 647-657 Burgess, A W., Cho, H S., Eigenbrot, C., Ferguson, K M., Garrett, T P., Leahy, D J., Lemmon, M A., Sliwkowski, M X., Ward, C W., and Yokoyama, S (2003) “An open-and-shut case? Recent insights into the activation of EGF/ErbB receptors”, Molecular cell12, 541-552 Chow, N H., Liu, H S., Lee, E I., Chang, C J., Chan, S H., Cheng, H L., Tzai, T S., and Lin, J S (1997) “Significance of urinary epidermal growth factor and its receptor expression in human bladder cancer”, Anticancer research17, 1293-1296 10 Ciardiello, F., and Tortora, G (2008) “EGFR antagonists in cancer treatment”, The New England journal of medicine358, 1160-1174 11 Ettinger, D S (2006) “Clinical implications of EGFR expression in the development and progression of solid tumors: focus on non-small cell lung Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 50 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ cancer”, The oncologist11, 358-373 12 Fujino, S., Enokibori, T., Tezuka, N., Asada, Y., Inoue, S., Kato, H., and Mori, A (1996) “Comparison of epidermal growth factor receptor levels and other prognostic parameters in non-small cell lung cancer”, Eur J Cancer32A, 2070-2074 13 Graus-Porta, D., Beerli, R R., Daly, J M., and Hynes, N E (1997) “ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling”, The EMBO journal16, 1647-1655 14 Herbst, R S., and Bunn, P A., Jr (2003) “Targeting the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer”, Clin Cancer Res9, 58135824 15 Iyer, R., Thames, H D., Tealer, J R., Mason, K A., and Evans, S C (2004) “Effect of reduced EGFR function on the radiosensitivity and proliferative capacity of mouse jejunal crypt clonogens”, Radiother Oncol72, 283-289 16 Kanematsu, T., Yano, S., Uehara, H., Bando, Y., and Sone, S (2003) “Phosphorylation, but not overexpression, of epidermal growth factor receptor is associated with poor prognosis of non-small cell lung cancer patients”, Oncology research13, 289-298 17 Lin Y., Liu Z., et.al (2004) “Expression of Intracellular Domain of Epidermal Growth Factor Receptor and Generation of Its Monnoclonal Antibody”, Cellular & Molecular Immunology; 1(2):137-141 18 Matar, P., Rojo, F., Cassia, R., Moreno-Bueno, G., Di Cosimo, S., Tabernero, J., Guzman, M., Rodriguez, S., Arribas, J., Palacios, J., and Baselga, J (2004) “Combined epidermal growth factor receptor targeting with the tyrosine kinase inhibitor gefitinib (ZD1839) and the monoclonal antibody cetuximab (IMC-C225): superiority over single-agent receptor targeting”, Clin Cancer Res10, 6487-6501 19 Mendelsohn, J., and Baselga, J (2000) “The EGF receptor family as targets for cancer therapy”, Oncogene19, 6550-6565 20 Olayioye, M A., Neve, R M., Lane, H A., and Hynes, N E (2000) “The Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 51 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer”, The EMBO journal19, 3159-3167 21 Prenzel, N., Fischer, O M., Streit, S., Hart, S., and Ullrich, A (2001) “The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification”, Endocrine-related cancer8, 11-31 22 Rowinsky, E K (2004) “The erbB family: targets for therapeutic development against cancer and therapeutic strategies using monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors”, Annual review of medicine55, 433-457 23 Rowinsky, E K (2001) “Targeting signal transduction The erbB receptor family as a target for therapeutic development againt cancer”, Horizon in Cancer therapeutic: From Bench to Bedside, 2:3-36 24 Rusch, V., Baselga, J., Cordon-Cardo, C., Orazem, J., Zaman, M., Hoda, S., McIntosh, J., Kurie, J., and Dmitrovsky, E (1993) “Differential expression of the epidermal growth factor receptor and its ligands in primary non-small cell lung cancers and adjacent benign lung”, Cancer Research53, 23792385 25 Riely, G J., Politi, K A., Miller, V A., and Pao, W (2006) “Update on epidermal growth factor receptor mutations in non-small cell lung cancer”, Clin Cancer Res12, 7232-7241 26 Salehi E., Farajnia S., Parivar K., Baradaran B., Majidi J., Omidi Y., Saeedi N., (2010) “Recombinant expression and purification of L2 domain of human epidermal growth factor receptor”, African Journal of Biotechnology, 9(33), pp 5292-5296 27 Shigematsu, H., Lin, L., Takahashi, T., Nomura, M., Suzuki, M., Wistuba, II, Fong, K M., Lee, H., Toyooka, S., Shimizu, N., Fujisawa, T., Feng, Z., Roth, J A., Herz, J., Minna, J D., and Gazdar, A F (2005) “Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers”, Journal of the National Cancer Institute97, 339346 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 52 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ 28 Sholl, L M., John Iafrate, A., Chou, Y P., Wu, M T., Goan, Y G., Su, L., Huang, Y T., Christiani, D C., and Chirieac, L R (2007) “Validation of chromogenic in situ hybridization for detection of EGFR copy number amplification in nonsmall cell lung carcinoma”, Mod Pathol20, 1028-1035 29 Sonnweber, B., Dlaska, M., Skvortsov, S., Dirnhofer, S., Schmid, T., and Hilbe, W (2006) “High predictive value of epidermal growth factor receptor phosphorylation but not of EGFRvIII mutation in resected stage I non-small cell lung cancer (NSCLC)”, Journal of clinical pathology59, 255-259 30 Wu, S L., Kim, J., Bandle, R W., Liotta, L., Petricoin, E., and Karger, B L (2006) “Dynamic profiling of the post-translational modifications and interaction partners of epidermal growth factor receptor signaling after stimulation by epidermal growth factor using Extended Range Proteomic Analysis (ERPA)”, Mol Cell Proteomics5, 1610-1627 31 Yang, X.D., Jia, X.C., Corvalan, J.R., Wang, P., and Davis, C.G (2001) “Development of ABX-EGFR,a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody, for cancer therapy”, Crit Rev Oncol Hematol 38, 17-23 32 Zhang, H., A Berezov, et al (2007) "ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies" J Clin Invest 117(8): 2051-8 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 53 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ PHỤ LỤC Kết giải trình tự plasmid tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR, pET28a TRX/antiEGFR, pET30a GB1/antiEGFR, MBP fusion/antiEGFR Kết giải trình tự gen vector tái tổ hợp pET28a+/antiEGFR 16 ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC Met Gly Ser Ser His His His His His His 91 31 AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT ATG GCT AGC ATG ACT Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr 135 45 136 46 GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGC GGA TCC CAG GTG CAA CTG GTT CAG Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 180 60 181 61 AGC GGC GCG GAA GTG AAA AAG CCG GGC GCG TCG GTT AAA GTG AGC Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 225 75 226 76 TGC AAA GCC TCA GGC TAT ACC TTT ACG AGC TAC TGG ATG CAT TGG Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp 270 90 271 91 GTG CGC CAG GCC CCG GGT CAG GGC CTG GAA TGG ATG GGT AAC ATT Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asn Ile 315 105 316 106 TAT CCG GGC AGC GGT GGC ACC AAC TAT GCG GAA AAA TTT AAG AAC Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Asn 360 120 361 121 CGC GTG ACC ATG ACG CGT GAT ACC AGC ATT TCG ACG GCC TAT ATG Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met 405 135 406 136 GAA CTG AGC CGC CTG CGT AGC GAT GAC ACC GCC GTG TAT TAC TGC Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 450 150 451 151 GCG CGC AGT GGC GGT CCG TAT TTT TTC GAT TAC TGG GGC CAG GGT Ala Arg Ser Gly Gly Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 495 165 496 166 ACG CTG GTT ACC GTG AGC TCG GCC GGC GGG GGC GGT TCG GGC GGG Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 540 180 541 181 GGC GGT TCG GAT ATC GTG ATG ACC CAG AGC CCG CTG AGC CTG CCG Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 585 195 586 196 GTG ACC CCA GGC GAA CCG GCG TCG ATT AGC TGC CGC AGC TCG CAG Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 630 210 631 211 AAC ATC GTG CAT AAT AAC GGC ATT ACC TAT CTG GAA TGG TAT CTG Asn Ile Val His Asn Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu 675 225 676 226 CAG AAA CCG GGC CAA AGC CCG CAG CTG TTA ATT TAT AAA GTG AGC Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 720 240 721 241 GAT CGC TTT AGC GGC GTG CCG GAT CGC TTT TCG GGC AGC GGT AGT Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 765 255 766 256 GGC ACC GAT TTT ACG CTG AAA ATT AGC CGC GTG GAA GCG GAG GAT Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 810 270 811 271 GTT GGC GTG TAT TAC TGC TTT CAG GGC AGC CAT ATC CCG CCA ACC Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Pro Thr 855 285 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 90 30 54 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ 856 286 TTT GGC CAG GGC ACC AAA GTG GAA ATT AAA CGC GCC GCG GCT GCA Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ala 900 300 901 301 GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT CTA GGG GGT GGC Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Leu Gly Gly Gly 945 315 946 316 ATG CGC GGC TCG CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA GAT CCG Met Arg Gly Ser Leu Glu His His His His His His End 990 Kết giải trình tự gen vector tái tổ hợp pET28a TRX/antiEGFR GGT GGA CGG GTA CAA TTC CCT CTA GAA CCT TTT TGT TTA ACT TTA Gly Gly Arg Val Gln Phe Pro Leu Glu Pro Phe Cys Leu Thr Leu 46 15 47 16 AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC Arg Arg Arg Tyr Thr Met Gly Ser Ser His His His His His His 91 30 92 31 AGC AGC GGC CTG GTG GCG GCC GGC AGC CAT ATG AGC GAT AAA ATT Ser Ser Gly Leu Val Ala Ala Gly Ser His Met Ser Asp Lys Ile 136 45 137 46 ATT CAC CTG ACT GAC GAC AGT TTT GAC ACG GAT GTA CTC AAA GCG Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala 181 60 182 61 GAC GGG GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG TGG TGC GGT CCG Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro 226 75 227 76 TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CTG GAT GAA ATC GCT GAC GAA TAT Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr 271 90 272 91 CAG GGC AAA CTG ACC GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT CAA AAC CCT Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro 316 105 317 106 GGC ACT GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT CTG CTG Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 361 120 362 121 CTG TTC AAA AAC GGT GAA GTG GCG GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu 406 135 407 136 TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGT Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly 451 150 452 151 TCT GGT TCT GGT GAT GAC GAT GAC AAG GTA CCC CTG GTT CCG CGT Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val Pro Leu Val Pro Arg 496 165 497 166 GGA TCC CAG GTG CAA CTG GTT CAG AGC GGC GCG GAA GTG AAA AAG Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 541 180 542 181 CCG GGC GCG TCG GTT AAA GTG AGC TGC AAA GCC TCA GGC TAT ACC Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 586 195 587 196 TTT ACG AGC TAC TGG ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCG GGT CAG Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 631 210 632 211 GGC CTG GAA TGG ATG GGT AAC ATT TAT CCG GGC AGC GGT GGC ACC Gly Leu Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr 676 225 677 226 AAC TAT GCG GAA AAA TTT AAG AAC CGC GTG ACC ATG ACG CGT GAT Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp 721 240 722 241 ACC AGC ATT TCG ACG GCC TAT ATG GAA CTG AGC CGC CTG CGT AGC Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser 766 255 767 256 GAT GAC ACC GCC GTG TAT TAC TGC GCG CGC AGT GGC GGT CCG TAT Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly Pro Tyr 811 270 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 55 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ 812 271 TTT TTC GAT TAC TGG GGC CAG GGT ACG CTG GTT ACC GTG AGC TCG Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 856 285 857 286 GCC GGC GGG GGC GGT TCG GGC GGG GGC GGT TCG GAT ATC GTG ATG Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 901 300 902 301 ACC CAG AGC CCG CTG AGC CTG CCG GTG ACC CCA GGC GAA CCG GCG Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala 946 315 947 316 TCG ATT AGC TGC CGC AGC TCG CAG AAC ATC GTG CAT AAT AAC GGC Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Asn Asn Gly 991 330 992 331 ATT ACC TAT CTG GAA TGG TAT CTG CAG AAA CCG GGC CAA AGC CCG Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 1036 345 1037 346 CAG CTG TTA ATT TAT AAA GTG AGC GAT CGC TTT AGC GGC GTG CCG Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro 1081 360 1082 361 GAT CGC TTT TCG GGC AGC GGT AGT GGC ACC GAT TTT ACG CTG AAA Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 1126 375 1127 376 ATT AGC CGC GTG GAA GCG GAG GAT GTT GGC GGG TAT TAC TGC TTT Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Gly Tyr Tyr Cys Phe 1171 390 1172 391 CAG GGC AGC CAT ATC CCG CCA ACC TTT GGC CAG GGA CCC AAG TGG Gln Gly Ser His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Pro Lys Trp 1216 405 1217 406 AAA TTA AAT GGC CGC GGG CTG AGA AAA AAA CTC ACT CCA AAA AAG Lys Leu Asn Gly Arg Gly Leu Arg Lys Lys Leu Thr Pro Lys Lys 1261 420 1262 421 GAC TGG AAC CAG GGG GTG GGA TGC AGG TTC CTC GAG TAA Asp Trp Asn Gln Gly Val Gly Cys Arg Phe Leu Glu End 1300 Kết giải trình tự gen vector tái tổ hợp pET30a GB1/antiEGFR 16 ATG CAG TAC AAA CTG ATC CTG AAC GGT AAA ACC Met Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr 92 31 CTG AAA GGT GAA ACC ACC ACC GAA GCT GTT GAC GCT GCT ACC GCG Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala 136 45 137 46 GAA AAA GTT TTC AAA CAG TAC GCT AAC GAC AAC GGT GTT GAC GGT Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly 181 60 182 61 GAA TGG ACC TAC GAC GAC GCT ACC AAA ACC TTC ACC GTT ACC GAA Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 226 75 227 76 GGATCC CAG GTG CAA CTG GTT CAG AGC GGC GCG GAA GTG AAA AAG Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 272 91 CCG GGC GCG TCG GTT AAA GTG AGC TGC AAA GCC TCA GGC TAT ACC Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 316 105 317 106 TTT ACG AGC TAC TGG ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCG GGT CAG Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 361 120 362 121 GGC CTG GAA TGG ATG GGT AAC ATT TAT CCG GGC AGC GGT GGC ACC Gly Leu Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr 406 135 407 136 AAC TAT GCG GAA AAA TTT AAG AAC CGC GTG ACC ATG ACG CGT GAT Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp 451 150 452 151 ACC AGC ATT TCG ACG GCC TAT ATG GAA CTG AGC CGC CTG CGT AGC Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser 496 165 497 GAT GAC ACC GCC GTG TAT TAC TGC GCG CGC AGT GGC GGT CCG TAT 541 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 91 30 271 90 56 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ 166 Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly Pro Tyr 180 542 181 TTT TTC GAT TAC TGG GGC CAG GGT ACG CTG GTT ACC GTG AGC TCG Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 586 195 587 196 GCC GGC GGG GGC GGT TCG GGC GGG GGC GGT TCG GAT ATC GTG ATG Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 631 210 632 211 ACC CAG AGC CCG CTG AGC CTG CCG GTG ACC CCA GGC GAA CCG GCG Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala 676 225 677 226 TCG ATT AGC TGC CGC AGC TCG CAG AAC ATC GTG CAT AAT AAC GGC Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Asn Asn Gly 721 240 722 241 ATT ACC TAT CTG GAA TGG TAT CTG CAG AAA CCG GGC CAA AGC CCG Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 766 255 767 256 CAG CTG TTA ATT TAT AAA GTG AGC GAT CGC TTT AGC GGC GTG CCG Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro 811 270 812 271 GAT CGC TTT TCG GGC AGC GGT AGT GGC ACC GAT TTT ACG CTG AAA Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 856 285 857 286 ATT AGC CGC GTG GAA GCG GAG GAT GTT GGC GTG TAT TAC TGC TTT Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 901 300 902 301 CAG GGC AGC CAT ATC CCG CCA ACC TTT GGC CAG GGC ACC AAA GTG Gln Gly Ser His Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 946 315 947 316 GAA ATT AAA CGC GCC GCG GCT GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 991 330 992 331 GAG GAT CTG AAT CTA AGG GGT GGC ATG CGC GGT TCG CTC GAG CAC Glu Asp Leu Asn Leu Arg Gly Gly Met Arg Gly Ser Leu Glu His 1036 345 1037 346 CAC CAC CAC CAC CAC TGA His His His His His End Kết giải trình tự gen vector tái tổ hợp MBP fusion/antiEGFR 1 ATG GGT TCT TCT CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGT TCT TCT ATG AAA Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser Met Lys 45 15 46 16 ATC GAA GAA GGT AAA CTG GTA ATC TGG ATT AAC GGC GAT AAA GGC Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly 90 30 91 31 TAT AAC GGT CTC GCT GAA GTC GGT AAG AAA TTC GAG AAA GAT ACC Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 135 45 136 46 GGA ATT AAA GTC ACC GTT GAG CAT CCG GAT AAA CTG GAA GAG AAA Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys 180 60 181 61 TTC CCA CAG GTT GCG GCA ACT GGC GAT GGC CCT GAC ATT ATC TTC Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe 225 75 226 76 TGG GCA CAC GAC CGC TTT GGT GGC TAC GCT CAA TCT GGC CTG TTG Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu 270 90 271 91 GCT GAA ATC ACC CCG GAC AAA GCG TTC CAG GAC AAG CTG TAT CCG Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro 315 105 316 106 TTT ACC TGG GAT GCC GTA CGT TAC AAC GGC AAG CTG ATT GCT TAC Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr 360 120 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 57 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Luận văn thạc sĩ 361 121 CCG ATC GCT GTT GAA GCG TTA TCG CTG ATT TAT AAC AAA GAT CTG Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu 405 135 406 136 CTG CCG AAC CCG CCA AAA ACC TGG GAA GAG ATC CCG GCG CTG GAT Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp 450 150 451 151 AAA GAA CTG AAA GCG AAA GGT AAG AGC GCG CTG ATG TTC AAC CTG Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu 495 165 496 166 CAA GAA CCG TAC TTC ACC TGG CCG CTG ATT GCT GCT GAC GGG GGT Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly 540 180 541 181 TAT GCG TTC AAG TAT GAA AAC GGC AAG TAC GAC ATT AAA GAC GTG Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val 585 195 586 196 GGC GTG GAT AAC GCT GGC GCG AAA GCG GGT CTG ACC TTC CTG GTT Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val 630 210 631 211 GAC CTG ATT AAA AAC AAA CAC ATG AAT GCA GAC ACC GAT TAC TCC Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser 675 225 676 226 ATC GCA GAA GCT GCC TTT AAT AAA GGC GAA ACA GCG ATG ACC ATC Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile 720 240 721 241 AAC GGC CCG TGG GCA TGG TCC AAC ATC GAC ACC AGC AAA GTG AAT Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn 765 255 766 256 TAT GGT GTA ACG GTA CTG CCG ACC TTC AAG GGT CAA CCA TCC AAA Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys 810 270 811 271 CCG TTC GTT GGC GTG CTG AGC GCA GGC ATT AAC GCC GGC CCG CCC Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Gly Pro Pro 855 285 856 286 GAA CAA AGA GCT GGC AAC AAG AGT TCC TCG AAA ACT ATC CTG CTG Glu Gln Arg Ala Gly Asn Lys Ser Ser Ser Lys Thr Ile Leu Leu 900 300 901 301 ACT GAC GAA CGT CTT GGA TCC CAG GTG CAA CTG GTT CAG AGC GGC Thr Asp Glu Arg Leu Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 945 315 946 316 GCG GAA GTG AAA AAG CCG GGC GCG TCG GTT AAA GTG AGC TGC AAA Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 990 330 991 331 GCC TCA GGC TAT ACC TTT ACG AGC TAC TGG ATG CAT TGG GTG CGC Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg 1035 345 1036 346 CAG GCC CCG GGT CAG GGC CTG GAA TGG ATG GGT AAC ATT TAT CCG Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro 1080 360 1081 361 GGC AGC GGT GGC ACC AAC TAT GCG GAA AAA TTT AAG AAC CGC GTG Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val 1125 375 1126 376 ACC ATG ACG CGT GAT ACC AGC ATT TCG ACG GCC TAT ATG GAA CTG Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 1170 390 1171 391 AGC CGC CTG CGT AGC GAT GAC ACC GCC GTG TAT TAC TGC GCG CGC Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 1215 405 1216 406 AGT GGC GGT CCG TAT TTT TTC GAT TAC TGG GGC CAG GGT ACG CTG Ser Gly Gly Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 1260 420 1261 421 GTT ACC GTG AGC TCG GCC GGC GGG GGC GGT TCG GGC GGG GGC GGT Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1305 435 1306 436 TCG GAT ATC GTG ATG ACC CAG AGC CCG CTG AGC CTG CCG GTG ACC Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr 1350 450 1351 CCA GGC GAA CCG GCG TCG ATT AGC TGC CGC AGC TCG CAG AAC ATC 1395 Lê Thị Kim Xuân Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 58 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn