Nghiên cứu phát triển kháng thể đơn dòng dạng khảm chuột người kháng cd20

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG DẠNG KHẢM CHUỘT – NGƯỜI KHÁNG CD20 Mã số: YD01/15-17 Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phòng CNSH Y dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Võ Nguyễn Thanh Thảo Cán tham gia: TS Nguyễn Đăng Quân CN Mai Duyên Huyền Tiên Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH SÁCH HÌNH ii DANH SÁCH BẢNG iii TÓM TẮT iv PHẦN THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu protein CD20 2.2 Giới thiệu kháng thể kháng CD20 2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 2.4 Giới thiệu phương pháp tạo kháng thể dạng khảm chuột-người kháng CD20 11 III VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu 12 3.1.1 Gene mã hóa kháng thể kháng CD20 12 3.1.2 Vector 12 3.1.3 Các cặp mồi sử dụng đề tài 13 3.1.4 Chủng vi sinh vật 14 3.1.5 Dòng tế bào CHO-DG44 14 3.2 Phương pháp 14 3.2.1 Phương pháp tạo dịng vector mang gene mã hóa chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể kháng CD20 14 3.2.2 Phương pháp chuyển nạp vector dòng tế bào CHO-DG44 16 3.2.2.1 Khảo sát nồng độ G418 phù hợp sử dụng sàng lọc tế bào CHO-DG44 mang vector mục tiêu 16 3.2.2.2 Phương pháp chuyển nạp vector tạm thời dòng tế bào CHO-DG44 16 3.2.2.3 Phương pháp chuyển nạp vector lâu dài dòng tế bào CHO-DG44 17 3.2.3 Phương pháp định lượng kháng thể Elisa 18 3.2.4 Phương pháp tủa miễn dịch immunoprecipitation 19 3.2.5 Phương pháp SDS/PAGE/Western Blot 19 3.2.6 Phương pháp pha loãng tới hạn (limited dilution) 19 3.2.7 Phương pháp tinh kháng thể 20 3.2.7 Phương pháp flow cytometry (FACS) 20 3.2.8 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học kháng thể kháng CD20 20 IV KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 21 4.1 Tạo dòng vector mang gene biểu chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể đơn dòng kháng CD20 21 4.2 Biểu tạm thời kháng thể kháng CD20 từ tế bào CHO-DG44 25 4.3 Tạo quần thể tế bào CHO-DG44 biểu ổn định kháng thể kháng CD20 26 4.3.1 Khảo sát nồng độ G418 thích hợp để chọn lọc quần thể tế bào CHO-DG44 26 4.3.2 Chọn lọc quần thể tế bào CHO-DG44 chuyển nạp ổn định cặp vector mã hóa kháng thể kháng CD20 27 4.3.3 Nâng cao khả tiết kháng thể quần thể tế bào chuyển nạp ổn định 29 4.4 Sàng lọc dòng đơn tế bào CHO-DG44 biểu ổn định KTĐD kháng CD20 31 4.4.1 Chọn lọc dòng đơn tế bào CHO-DG44 biểu KTĐD kháng CD20 31 4.4.2 Thích ứng dịng tế đơn tế bào CHO-DG44 môi trường không huyết 32 4.5 Biểu tinh KTĐD kháng CD20 35 4.6 Đánh giá hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 37 4.6.1 Khả gắn KTĐD lên bề mặt tế bào ung thư Raji B biểu CD20 37 4.6.2 Khả gây chết tế bào ung thư Raji B biểu CD20 39 4.7 Thảo luận 40 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 45 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CD20 Classification Determiant type 20 CHO Chinese Hamster Ovary cell NHL non-Hodgkin’s lymphoma RA Rheumatoid arithitis CLL Chronic lymphocytic leukemia MEM Mimimum Essential Medium NHS Normal Human Serum FDM Fc:FcR dependent mechanism ADCC Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity CDC Complement dependent cytotoxicity PCD Programed cell death MTX Methotrexate HT Hypoxanthine and Thymidine DHFR Dihydrofolate Reductase LDH Lactate dehydrogenase i DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Cấu trúc CD20 epitop số kháng thể kháng CD20 Hình Các hệ kháng thể kháng CD20 người Hình Các chế tác động kháng thể kháng CD20 Hình PCR khuẩn lạc chọn dòng E.coli mang vector tái tổ hợp (A) Cặp vector pcDNA3.3_LC pOptivec_HC, (B) Cặp vector pcDNA3.3_HC pOptivec_LC 22 Hình Kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng cắt enzyme NcoI (A) Cặp vector pcDNA3.3_LC pOptivec_HC, (B) Cặp vector pcDNA3.3_HC pOptivec_LC 24 Hình Đánh giá biểu tạm thời kháng thể kháng CD20 tế bào CHODG44 phân tích SDS-PAGE/WB biến tính (A) khơng biến tính (B) 26 Hình Khảo sát nồng độ kháng sinh G418 sử dụng sàng lọc tế bào CHO-DG44 27 Hình Quần thể tế bào chuyển nạp CHO-DG44 môi trường sàng lọc 28 Hình Kiểm tra biểu kháng thể kháng CD20 nuôi môi trường sàng lọc phân tích SDS-PAGE/WB biến tính (A) khơng biến tính (B) 29 Hình 10 Khả tiết kháng thể kháng CD20 quần thể CHO-DG44 mang cặp vector (A) cặp vector (B) nhiều nồng độ Methotrexate (MTX) khác 30 Hình 11 Khả tiết KTĐD kháng CD20 23 dòng tế bào đơn CHO-DH44 32 Hình 12 Sàng lọc dòng tế bào đơn tiết kháng thể kháng CD20 (A) Hình dạng tế bào mơi trường MEM mơi trường CD-optiCHO, (B) Phân tích protein dịch ni cấy tế bào SDS-PAGE/ nhuộm bạc, (C) SDS-PAGE/WB 33 Hình 13 So sánh lượng KTĐD kháng CD20 dịng tế bào đơn ni môi trường MEM (A), môi trường CD-optiCHO (B) 34 Hình 14 Sắc ký đồ tinh KTĐD kháng CD20 35 Hình 15 Đánh giá đặc tính KTĐD kháng CD20 sau tinh 37 Hình 16 Đánh giá khả gắn KTĐD kháng CD20- FITC vào tế bào Raji B tế bào K562 38 Hình 17 Đánh giá hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 thông qua chế ADCC 40 ii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Các loại kháng thể kháng CD20 hệ 10 Bảng Thông tin cặp mồi 13 Bảng Kích thước vạch vector thực phản ứng cắt với NcoI 23 iii TÓM TẮT Rituximab, kháng thể đơn dòng (KTĐD) kháng CD20, thuốc sử dụng điều trị bệnh ung thư liên uan đến tế bào B bệnh viêm khớp dạng thấp Đây thuốc đặc trị nhập kh u có giá thành cao nhu cầu sử dụng thuốc Việt Nam lớn Do nghiên cứu phát triển thuốc tương đương sinh học với Rituximab cần thiết để đáp ứng nhu cầu thực tế Nghiên cứu thực nhằm tạo KTĐD kháng CD20 có hoạt tính gây chết tế bào ung thư máu Chúng chuyển nạp cặp vector mang gene mã hoá chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể Rituximab vào tế bào CHO-DG44 để tạo uần thể tế bào biểu KTĐD kháng CD20, từ chọn dịng tế bào đơn biểu ổn định KTĐD kháng CD20 KTĐD kháng CD20 tinh từ dịch nuôi cấy tế bào phương pháp sắc ký lực Phân tích SDS PAGE Western blot cho thấy KTĐD tạo có cấu trúc Thử nghiệm nhuộm miễn dịch huỳnh uang cho thấy KTĐD kháng CD20 gắn lên bề mặt dòng tế bào ung thư máu Raji B biểu CD20 Đánh giá khả giết tế bào ung thư máu Raji B thông ua chế gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) cho thấy KTĐD kháng CD20 có khả gây chết 27% tế bào ung thư Hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 nồng độ µg/mL nghiên cứu tương đương 54,3% hoạt tính thuốc gốc Rituximab thử nghiệm in vitro Tóm lại, chúng tơi tạo KTĐD kháng CD20 có hoạt tính sinh học, có triển vọng phát triển thành nguyên liệu tương đương sinh học với biệt dược Rituximab iv PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu phát triển kháng thể đơn dòng dạng khảm chuột-người kháng CD20 (Mã số: YD01/15-17) Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Y dược Đơn vị phối hợp chính: Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Võ Nguyễn Thanh Thảo Cán tham gia thực hiện: TS Nguyễn Đăng Quân, CN Mai Duyên Huyền Tiên Thời gian thực hiện: 30 tháng (Từ tháng 02/2015 đến 07/2017) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 600.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: - Năm 2015: 250,000,000 VNĐ - Năm 2016: 200,000,000 VNĐ - Năm 2017: 150,000,000 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: Mục tiêu tổng uát: Tạo kháng thể dạng khảm kháng CD20 người có hoạt tính sinh học tương đương với sản ph m thuốc Rituxan (Roche), cụ thể nhận biết kháng nguyên CD20 tế bào B gây chết tế bào B mục tiêu Mục tiêu cụ thể: - Giai đoạn (02/2015 – 03/2016): Tạo dòng tế bào CHO-DG44 có khả biểu kháng thể dạng khảm kháng CD20 ổn định - Giai đoạn (04/2016 – 8/2017): Thu nhận thử nghiệm hoạt tính kháng thể dạng khảm kháng CD20 Các nội dung công việc thực so với đăng ký STT Nội dung đăng ký - Nội dung 1: Tạo plasmid biểu kháng thể dạng khảm kháng CD20 người Thời gian (bắt đầu – kết thúc) 10 tháng (3/2015 – 12/2015) Thực TS Phạm Thị Kim Trâm ThS Nguyễn Phương Thảo TS Nguyễn Quân - Nội dung 2: Tạo dịng tế bào CHODG44 có khả tạo kháng thể dạng khảm kháng CD20 người 15 tháng (1/2016 – 4/2017) tháng - Nội dung 3: Thu nhận, tinh xác định đặc tính kháng thể dạng khảm kháng CD20 - Nội dụng 4: Kiểm tra hoạt tính kháng thể dạng khảm kháng CD20 (khả kích hoạt đường gây độc tế bào CDC ADCC) (5/2017 – 12/2018) tháng (01/2018 – 6/2018) Đánh giá Thị Đạt Đăng TS Phạm Thị Kim Trâm ThS Nguyễn Phương Thảo Thị TS Nguyễn Đăng Quân TS Võ Nguyễn Thanh Thảo TS Võ Nguyễn Thanh Thảo TS Nguyễn Đăng Quân CN Mai Duyên Huyền Tiên TS Võ Nguyễn Thanh Thảo TS Nguyễn Đăng Quân CN Mai Duyên Huyền Tiên Đạt Đạt Đạt 4.5 Biểu tinh KTĐD kháng CD20 x 105 tế bào CHO-DG44 dịng 6G8 ni cấy theo mẻ 30 mL môi trường CD-optiCHO, 37o C, 5% CO2 Sau ngày nuôi cấy, dịch nuôi cấy tế bào thu nhận tinh kháng thể sắc ký lực Kháng thể kháng CD20 môi trường nuôi cấy CD-optiCHO tinh phương pháp sắc ký lực với máy FPLC Akta, GE-Healthcare sử dụng cột hiTrap rProtein A FF mL Quá trình tinh bao gồm bước chính, nạp mẫu, loại bỏ protein không gắn với protein A cột cuối thu protein mục tiêu (kháng thể) dung dịch giải Khi tốc độ dịng ua cột mL/phút hiệu suất tinh đạt từ 20 – 30%, ngược lại, giảm tốc độ dòng chảy 0,5 mL/phút hiệu suất tinh tăng lên từ 32 – 56%, cho thấy tốc độ dòng chảy ảnh hư ng đến hiệu suất tinh KTĐD kháng CD20 Hiệu suất tinh kháng thể tính dựa lượng kháng thể thu sau uy trình tinh so với lượng kháng thể đầu vào trước tinh Phân tích ELISA định hàm lượng KTĐD kháng CD20 mẫu dịch nuôi cấy tế bào trước tinh 15 – 20 µg/mL (kết khơng trình bày) Hình 14 thể sắc ký đồ trình tinh KTĐD với peak protein giai đoạn thơi giải Hình 14 Sắc ký đồ tinh KTĐD kháng CD20 35 Các mẫu trước tinh (I: input), mẫu protein không gắn cột (FT: flow through), mẫu protein sau tinh (E: elute) kiểm tra, phân tích mức độ tinh đặc tính kháng thể phương pháp nhuộm bạc Western-blot Kết cho thấy KTĐD kháng CD20 tinh thành công từ dịch ni cấy dịng tế bào 6G8, protein tạp có mẫu trước tinh bị loại bỏ Trong điện di biến tính, mẫu protein sau tinh thể thành 02 vạch protein kích thước 55 kDa 25 kDa tương ứng với chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể (Hình 15-bên trái) Trong điện di khơng biến tính, mẫu protein sau tinh (mẫu E) thể thành 01 vạch protein có kích thước khoảng 180 kDa tương ứng với kháng thể hoàn chỉnh gồm 02 chuỗi nặng 02 chuỗi nhẹ (Hình 15 - bên phải) Kết cho thấy KTĐD dịng tế bào CHO-DG44 6G8 tiết có cấu trúc Ngồi ra, chúng tơi tiến hành phân tích, đánh giá độ tinh KTĐD kháng CD20 sau tinh với phần mềm Imaglab – Biorad, kết uả cho thấy độ tinh KTĐD kháng CD20 90,6% trường hợp biến tính trường hợp khơng biến tính 91,8% Như vậy, chúng tơi tinh thành công kháng thể kháng CD20 với cấu trúc độ tinh 90% 36 Hình 15 Đánh giá đặc tính kháng thể KTĐD kháng CD20 sau tinh 4.6 Đánh giá hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 4.6.1 Khả gắn KTĐD lên bề mặt tế bào ung thư Raji B biểu CD20 Hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 định phần khả gắn lên bề mặt tế bào biểu CD20 Do đó, bước đầu xác định hoạt tính sinh học KTĐD tạo đề tài, đánh giá khả gắn lên dịng tế bào ung thư Raji B Chúng đánh dấu KTĐD kháng CD20 tinh với fluoresin 37 (FITC) kit FuoroTag FITC Conjugation Kit (Sigma) Kháng thể thu nhận sau phản ứng gắn đạt tỉ lệ F/A 2,3 phù hợp với khuyến cáo kit Thực quy trình nhuộm miễn dịch huỳnh quang sử dụng KTĐD kháng CD20 đánh dấu FITC tế bào Raji B tế bào đối chứng âm K562 (dòng tế bào ung thư máu dịng tuỷ mạn tính) khơng biểu CD20, phân tích flow cytometry máy FASC BD Aria III Kết Hình 16 cho thấy kháng thể kháng CD20 đánh dấu FITC (FITC-CD20) có khả gắn vào lên tế bào biểu CD20 Raji B theo khuynh độ nồng độ Khi tăng dần nồng độ kháng thể từ 1µg/mL đến 20µg/mL tỉ lệ tế bào RajiB đánh dấu kháng thể tăng dần từ 23,1% đến 63,2% Với dòng tế bào đối chứng K562, kết cho thấy KTĐD kháng CD20 gắn không đáng kể lên bề mặt tế bào nồng độ cao 20 µg/mL Như vậy, phạm vi thí nghiệm này, thấy KTĐD kháng CD20 mà tạo có khả gắn chuyên biệt với tế bào biểu phân tử mục tiêu CD20 Hình 16 Đánh giá khả gắn KTĐD kháng CD20-FITC vào tế bào Raji B tế bào K562 38 4.6.2 Khả gây chết chế bào ung thư Raji B biểu CD20 Hoạt tính sinh học quan trọng KTĐD kháng CD20 khả gây chết tế bào ung thư biểu CD20 Chúng tơi thực thí nghiệm đánh giá khả gây chết tế bào ung thư Raji B thông qua chế gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), dựa lượng enzyme lactate dehydrogenase (LDH) phóng thích sử dụng kit Cytotox (Promega) Tế bào bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi người (PBMC) dùng làm tế bào thực thi gây độc cho tế bào ung thư Raji B Kết đánh giá hoạt tính kháng thể theo nồng độ kháng thể cho thấy, tỉ lệ E:T 10:1, kháng thể kháng CD20 có khả cảm ứng tế bào thực thi PBMC gây ly giải tế bào mục tiêu Raji B 50 : mức thấp (Hình 17A), tác động tăng lên rõ rệt tăng tỉ lệ E:T kháng thể kháng CD20 tạo kháng thể gốc Rituximab Tỷ lệ tế bào Raji B bị ly giải tăng dần đạt cao 27,02% tăng lượng KTĐD sử dụng từ 0,01 µg/mL đến µg/mL Khi tăng lượng KTĐD lên 10 µg/mL, tỷ lệ tế bào Raji B bị ly giải không tăng thêm cho thấy µg/mL nồng độ gây độc tối đa KTĐD kháng CD20 thử nghiệm Với Rituximab chu n, nồng độ 0,01 µg/mL 0,1 µg/mL Rituximab có hoạt tính gây độc tế bào Raji B tương đương KTĐD kháng CD20 tạo Tuy nhiên, nồng độ µg/mL Rituximab cho hoạt tính gây độc tế bào vượt trội, đạt tỷ lệ tế bào Raji B ly giải 49,74% Tương tự với KTĐD kháng CD20, hoạt tính gây độc tế bào Rituximab không tăng lên tăng lượng kháng thể sử dụng lên 10 µg/mL (Hình 17B) Như vậy, hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 nghiên cứu tương đương 54,3% hoạt tính thuốc gốc Rituximab nồng độ sử dụng µg/mL thử nghiệm in vitro 39 Hình 17 Đánh giá hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 thông qua chế ADCC 4.7 Thảo luận Kháng thể dạng khảm kháng CD20 (Rituximab) có tên biệt dược Rituxan® (Roche) thuốc thức định sử dụng điều trị bệnh ung thư liên uan đến tế bào B bệnh ung thư Lympho không thuộc dạng Hodgkin (non-Hodgkin’s lymphoma – NHL), bệnh viêm thấp khớp (rheumatoid arthritis – RA) leukemia mạn tính (chronic lymphocytic leukemia – CLL) trị có nhu cầu sử dụng cao phạm vi toàn cầu Rituximab thuốc đặc Việt Nam hết quyền Nguồn thuốc hoàn toàn nhập từ nước ngoài, việc tự sản xuất Rituximab Việt Nam việc làm cần thiết có tính ứng dụng cao Bên cạnh đó, nghiên cứu phát triển sản ph m thuốc tương đương sinh học, kháng thể dạng khảm kháng CD20 tương đương sinh học với Rituxan, ý hướng nghiên cứu Việt Nam Trong đề tài này, tận dụng thời gian bảo hộ uyền Rituximab hết hạn, nghiên cứu tạo kháng thể dạng khảm chuột-người kháng CD20 dựa trình tự gene kháng thể công bố nhằm tạo dạng thuốc tương đương sinh học với Rituximab Hệ thống biểu kháng thể sử dụng đề tài dòng tế bào CHO-GD44, 40 dòng tế bào chấp thuận sử dụng sản xuất protein tái tổ hợp dùng trị liệu, bên cạnh dòng tế bào NS0 Sp2 (Jayapal cộng sự, 2007) Chúng thành công việc tạo uần thể tế bào CHO-DG44 chuyển nạp ổn định cặp vector biểu chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể kháng CD20 chọn lọc dòng tế bào 6G8 biểu KTĐD kháng CD20 với suất đạt 15 – 20 µg/mL điều kiện nuôi cấy tĩnh theo mẻ nhỏ 20 - 30 mL Trong năm gần đây, cải tiến môi trường nuôi tế bào kết hợp với chất bổ trợ giúp công nghệ sản xuất kháng thể kéo dài thời gian ni cấy, tăng mật độ tế bào, lượng kháng thể tăng gấp 10 lần so với trước đây, đạt từ 1-5 g/L (Renate cộng sự, 2016) Năng suất biểu KTĐD nghiên cứu hạn chế thực quy mô nhỏ, cần phải tiếp tục nghiên cứu để tăng quy mô tối ưu hóa điều kiện biểu KTĐD dịng tế bào CHO-DG44 Kháng thể kháng CD20 tinh hệ thống sắc ký lực qua cột Protein A với hiệu suất thu hồi chưa cao, đạt khoảng 56% Nguyên nhân phần kháng thể tiết từ tế bào dạng chuỗi nặng chuỗi nhẹ tự do, không lắp ráp thành kháng thể hoàn chỉnh Các phân tử chuỗi nặng chuỗi nhẹ tự phát ELISA với kháng thể đặc hiệu Rituximab tinh sắc ký lực với cột protein A dẫn đến kết tính hiệu suất tinh kháng thể thấp Điều thể kết SDS-PAGE Western-blot cho thấy chuỗi nặng chuỗi nhẹ dạng tự KTĐD diện nhiều mẫu protein không gắn cột (Hình 15) KTĐD kháng CD20 sau tinh có cấu trúc gồm 02 chuỗi nặng 02 chuỗi nhẹ đạt độ tinh tốt 90% theo kết phân tích hình ảnh SDS-PAGE nhuộm bạc Tuy nhiên, độ tinh KTĐD nghiên cứu chưa đáp ứng yêu cầu sử dụng làm thuốc, trình tinh cần trải qua nhiều giai đoạn tinh sắc ký lực (affinity chromatography), tinh trao đổi ion (ion exchange chromatogarphy) trình loại bỏ/ bất hoạt virus, thành phần khác có mẫu nhằm đảm bảo kháng thể tinh nhất, đảm bảo ổn định hoạt tính sinh học 41 KTĐD kháng CD20 chúng tơi có hoạt tính gây chết tế bào ung thư tương đương 54,3% hoạt tính kháng thể chu n Rituximab nồng độ µg/ml thử nghiệm ADCC in vitro Dù hoạt tính có thấp kháng thể gốc Rituximab, kết khả quan cho thấy KTĐD kháng CD20 tạo có hoạt tính sinh học Một vấn đề cần quan tâm thuốc tương đương sinh học so với thuốc gốc việc đảm bảo tương đương cấu trúc, đặc tính lý hóa chức sinh học Việc sử dụng hệ thống tế bào để biểu protein tái tổ hợp gây biến đổi sau dịch mã phức tạp, ảnh hư ng đến tính tan, tính ổn định, dược động học, chức sinh học phân tử protein Các nghiên cứu chứng minh rằng, glycosyl hóa vị trí khác vùng Fc ảnh hư ng đến hoạt tính kháng thể chế CDC ADCC Quá trình galactosylation nhân tố ảnh hư ng đến chế CDC làm tăng khả gắn kháng thể vào C1q (Jan Visser cộng sự, 2013) Nghiên cứu Miyosi cộng cho thấy trình alpha,6fucosylated kháng thể giúp tăng khả gắn kháng thể vào FcγRIIIa, từ làm tăng tác động chúng chế gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể, ADCC (Miyosi cộng sự, 1999) Thêm vào đó, khử nhóm amine (deamidation), oxy hóa, hình thành cầu nối disufide làm ảnh hư ng đến khả gắn kháng nguyên kháng thể Các yếu tố định b i hệ thống biểu hiện, điều kiện nuôi cấy, điều kiện bảo quản trình xử lý kháng thể sau biểu Kháng thể kháng CD20 tạo có khả gắn chuyên biệt với CD20 biểu bề mặt tế bào Raji B cảm ứng gây độc tế bào Raji B thông ua đường gây độc phụ thuộc kháng thể - ADCC đạt 27% nồng độ µg/mL Tuy nhiên, hiệu gây độc tế bào ung thư KTĐD kháng CD20 tạo nghiện cứu 54,3% so với hiệu gây độc thuốc gốc Rituximab nồng độ Chúng sử dụng hệ thống tế bào ứng dụng để sản xuất Rituximab thương mại tế bào CHO vấn đề hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 thấp hệ thống biểu loại trừ Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chưa thực khảo sát tối ưu hố điều kiện ni cấy tế bào biểu KTĐD, điều kiện bảo quản KTĐD, chưa thực tinh hoàn toàn kháng thể Đây nguyên nhân làm cho KTĐD 42 kháng CD20 chưa đạt hoạt tính tương đương Rituximab chu n Ngồi ra, cần phải tiếp tục thực nhiều phân tích chi tiết cấu trúc sơ cấp, thứ cấp, biến đổi xảy sau dịch mã, tính nhất, tính ổn định, KTĐD kháng CD20 trước tạo nguyên liệu tương đương sinh học với Rituximab V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài thành cơng việc tạo dịng, biểu tinh kháng thể đơn dòng kháng CD20 dạng khảm chuột-người với trình tự mã hóa cho chuỗi nặng chuỗi nhẹ xác 100% so với trình tự gốc uyền số US 7381560 B2 (D.R Anderson cộng sự, 1998) Nhóm thực tiến hành sàng lọc 03 dịng tế bào đơn (2C10, 5D2, 6G8), dịng 6G8 dịng có tiềm ứng dụng nhờ khả tiết kháng thể kháng CD20 cao, ổn định, tăng sinh nhanh Kháng thể kháng CD20 sau tinh có cấu trúc đầy đủ gồm chuỗi nặng chuỗi nhẹ có độ tinh 90%, hiệu suất thu hồi đạt 56% Kháng thể có khả gắn đặc hiệu với tế bào biểu CD20 có khả gây chết 27% tế bào ung thư máu in vitro thông qua đường gây độc tế bào phụ thuốc kháng thể ADCC Hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 tạo đề tài tương đương 54,3% hoạt tính sinh học kháng thể gốc Rituximab 5.2 Kiến nghị Đề tài thực mức s đạt số kết uả khả uan, tiền đề quan trọng để nhóm nghiên cứu phát triển sản ph m thuốc tương đương sinh học, góp phần giảm chi phí tài cho người bệnh Tuy nhiên, để đưa kết vào ứng dụng thực tế, đề tài cần đầu tư nghiên cứu cách chi tiết, bản, uy mô lớn nhằm đáp ứng với điều kiện thuốc tương đương sinh học Một số nội dung đề nghị thực tiếp: 43 - Tối ưu hóa điều kiện ni cấy tế bào biểu KTĐD, điều kiện bảo quản KTĐD, thực tinh hồn tồn KTĐD - Phân tích, so sánh đặc tính lý hóa (trình tự, cấu trúc, ), hoạt tính sinh học KTĐD kháng CD20 hướng đến ứng dụng làm thuốc tương đương sinh học so với biệt dược gốc Rituxan® (Roche) - Kiểm tra độ an tồn thuốc tương đương sinh học so với biệt dược gốc Rituxan® (Roche) mơ hình chuột - Xây dựng, hồn thiện uy trình ni cấy, biểu hiện, tinh KTĐD kháng CD20 uy mô bán công nghiệp 44 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ STT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học dự kiến đạt Sản phẩm đạt Dạng tan, độ tinh Kháng thể đơn dịng >90%, có cấu trúc đúng, dạng khảm kháng nhận biết CD20 CD20 người có khả gây ly giải tế bào CD20+ Dạng tan, độ tinh >90%, có cấu trúc đúng, có khả gắn chuyên biệt với protein Cd20, có khả gây ly giải tế bào Raji B/CD20+ Dòng tế bào CHODG44 có khả tiết kháng thể đơn dòng dạng khảm kháng CD20 Tiết ổn định kháng thể dạng khảm mhCD20Ab với suất đạt 100 mg/L Các đặc tính tế bào trì ua nhiều lần cấy truyền ua bảo uản đông lạnh 03 dịng tế bào đơn 2C10, 5D2, 6G8 có khả tiết ổn định kháng thể KTĐD kháng CD20, dịng 6G8 có khả tiết 15 ~ 20 mg/L KTĐD kháng CD20 Quy trình tạo kháng thể dạng khảm tế bào động vật CHO-DG44 Rõ ràng, đầy đủ bước kỹ thuật 01 uy trình tạo kháng thể dạng khảm tế bào động vật 01 thảo báo Một báo đăng tạp chí chuyên ngành nước Tên báo: “Tạo đánh giá hoạt tính gây chết tế bào ung thư máu kháng thể đơn dòng kháng CD20” gửi phản biện tham gia Hội nghị CNSH Toàn quốc – Hà Nội 2018 45 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Tiến Đạt, Phạm Xuân Dũng Nguyễn Chấn Hùng (2005) Lymphơm khơng Hodgkin ngồi hạch nguyên phát người lớn: Ch n đoán điều trị Y học TP Hồ Chí Minh, 9, 189 - 192 Lê Thanh Tú, Võ Thị Thanh Trúc, Trần Quốc Tuấn, Phạm Q Trọng Nguyễn Tấn Bình (2011) Đánh giá hiệu CHOP+Rituximab so với CHOP đơn bệnh nhân trẻ tuổi Lymphôm lan tỏa tế bào to, CD20(+), tổng kết 06 năm BV truyền máu huyết học TP HCM Y học TP Hồ Chí Minh, 15, 195 - 202 Nguyễn Thị Thu, Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Võ Thị C m Hoa, Dương Văn Động, Bùi Văn Cường Nguyễn Thị Khánh Giang (2013) Điều chế kiểm tra chất lượng kháng thể đơn dịng gắn đồng vị phóng xạ 131I-rituximab dùng điều trị U Lympho ác tính khơng Hodgkin Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 29, 51-58 Tài liệu tiếng Anh Alduaj, W and Illidge, T M (2011) The future of anti-CD20 monoclonal antibodies: are we making progress? Blood, 117, 2993-3001 Anderson, D R., Hanna, N., Newman, R.S., Reff, M E and Rastetter, W H (2008) Administering a chimeric anti-CD20 antibody; hybridomas; monoclonal antibodies Google Patents Beers, S A., Chan, C H., French, R R., Cragg, M S and Glennie, M J (2010) CD20 as a target for therapeutic type I and II monoclonal antibodies Semin Hematol, 47, 107-14 Chan, H T., Hughes, D., French, R R., Tutt, A L., Walshe, C A., Teeling, J L., Glennie, M J and Cragg, M S (2003) CD20-induced lymphoma cell death is independent of both caspases and its redistribution into triton X-100 insoluble membrane rafts Cancer Res, 63, 5480-9 Coiffier, B., Lepretre, S., Pedersen, L M., Gadeberg, O., Fredriksen, H., Van Oers, M H et al (2008) Safety and efficacy of ofatumumab, a fully human monoclonal antiCD20 antibody, in patients with relapsed or refractory B-cell chronic lymphocytic leukemia: a phase 1-2 study Blood, 111, 1094-100 Cragg, M S (2011) CD20 antibodies: doing the time warp Blood, 118, 219-20 46 Cragg, M S., Bayne, M C., Illidge, T M., Valerius, T., Johnson, P W and Glennie, M J (2004) Apparent modulation of CD20 by rituximab: an alternative explanation Blood, 103, 3989-90; author reply 3990-1 Cragg, M S and Glennie, M J (2004) Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents Blood, 103, 2738-43 Cragg, M S., Walshe, C A., Ivanow, A A O and Glennie, M J (2005) The biology of CD20 and its potential as a target for mAb therapy Curr Dir Autoimmun, 8, 14074 10 Dorvignit, D., Palacios, J L., Merino, M., Hermandez, T., Sosa, K., Casaco, A et al (2012) Expression and biological characteriztion of an anti-CD20 biosimilar candidate antibody mAbs, 4:4,488-496 11 Glennie, M J., French, R R., Cragg, M S and Taylor, R P (2007) Mechanisms of killing by anti-CD20 monoclonal antibodies Mol Immunol, 44, 3823-37 12 Herter, S., Herting, F., Mundigl, O., Waldhauer, I., Weinzierl, I., Weinzierl, T et al (2013) Preclinical activity of the type II CD20 antibody GA101 (obinutuzumab) compared with rituximab and ofatumumab in vitro and in xenograft models Mol Cancer Ther, 12, 2031-42 13 Klein, C., Lammens, A., Schfer, W., Georges, G., Schwaiger, M., Mossner, E et al (2013) Epitope interactions of monoclonal antibodies targeting CD20 and their relationship to functional properties MAbs, 5, 22-33 14 Kunert, R and Reinhart, D (2016) Advances in recombinant antibody manufacturing Appl Microbio Biotechnol, 100, 3451-3461 15 Li, B., Zhang, X., Shi, S., Zhao, L., Zhang, D., Qian, W et al (2010) Construction and characterization of a bispecific anti-CD20 antibody with potent antitumor activity against B-cell lymphoma Cancer Res, 70, 6293-302 16 Mclaughlin, P., Grillo-Loper, A J., Link, B K., Levy, R., Crucman, M S, Williams, M E et al (1998) Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment program J Clin Oncol, 16, 2825-33 17 Miyoshi, E., Noda, K., Yamaguchi, Y., Inoue, S., Ikeda, Y., Wang, W., et al (1999) The alpha-6-fucosyltransferase gene and its biological significance Biochim Biophys Acta, 1,9-20 47 18 Mossner, E., Brunker, P., Moser, S., Puntener, U., Schmidt, C., Herter, S et al (2010) Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cellmediated B-cell cytotoxicity Blood, 115, 4393-402 19 Nadler, L M., Ritz, J., Griffin, J D., Todd, R F., Reinherz, E L and Schlossman, S L (1981a) Diagnosis and treatment of human leukemias and lymphomas utilizing monoclonal antibodies Prog Hematol, 12, 187-225 20 Nadler, L M., Ritz, J., Hardy, R., Pesando, J M., Schlossman, S F and Stashenko, P (1981b) A unique cell surface antigen identifying lymphoid malignancies of B cell origin J Clin Invest, 67, 134-40 21 Niederfellner, G., Lammens, A., Mundigl, O., Georges, G., Schaefer, W., Schwaiger, M et el (2011) Epitope characterization and crystal structure of GA101 provide insights into the molecular basis for type I/II distinction of CD20 antibodies Blood, 118, 358-67 22 Reff, M E., Carner, K., Chambers, K S., Chinn, P C Leonard, J E., Raab, R et al (1994) Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20 Blood, 83, 435-45 23 Robak, T and Robak, E et al (2011) New anti-CD20 monoclonal antibodies for the treatment of B-cell lymphoid malignancies BioDrugs, 25, 13-25 24 Shimoyama, M., Minato, K., Tobinai, K., Nagai, M and Hirose, M (1983) Monoclonal antibody studies in B(non-T)-cell malignancies J Clin Oncol, 13, 47788 25 Teelling, J L., French, R R., Cragg, M S., Van Den Brakel, J., Pluyter, M., Huang, H et al (2004) Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas Blood, 104, 1793-800 26 Teeling, J L., Mackus, W J Wiegman, L J., Van Den Brakel, J H., Beers, S A French, R R et al (2006) The biological activity of human CD20 monoclonal antibodies is linked to unique epitopes on CD20 J Immunol, 177, 362-71 27 Visser, J., Feuerstein, I., Stangler, T., Schmiederer, T., Fritsch, C and Schiestl, M (2013) Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar Rituximan GP2013 and originator Rituximab BioDrugs, 27,495-507 28 Wang, Y., Feng, J., Huang, Y., Gu, X., Sun, Y., Li, Y et al (2007) The design, construction and function of a new chimeric anti-CD20 antibody J Biotechnol, 129, 726-31 48 29 Weiner, G J (2010) Rituximab: mechanism of action Semin Hematol, 47(2),115-123 30 Winiarska, M., Glodkowska-Mrowka, E., Bil, J and Golab, J (2011) Molecular mechanisms of the antitumor effects of anti-CD20 antibodies Front Biosci (Landmark Ed), 16, 277-306 31 Wishart, D S., Knox, C., Guo, A C., Cheng, D., Shrivastava, S., Tzur, D et al (2008) DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets Nucleic Acids Res, 36, D901-6 32 Zelenetz, A D (2003) A clinical and scientific overview of tositumomab and iodine I 131 tositumomab Semin Oncol, 30, 22-30 33 Zhou, X., Hu, W and Qin, X (2008) The role of complement in the mechanism of action of Rituximab for B-cell lymphoma: Implications for therapy The Oncologist, 13,954-966 ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Đơn vị chủ trì thực Chủ nhiệm đề tài ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách Phịng QLKH-HTQT ………, ngày tháng năm 20 Giám đốc 49