Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ KHÁNG THỂ DỊCH THỂ KHÁNG
Mycobacterium tuberculosis ỡ CỘNG ĐỒNG
NGƯỜI VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN
Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hồ Minh Lý
Cơ quan chủ trì đẻ tài: Viên Vệ sinh dịch tế trung ương
6686 04/12/2007
Trang 2Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ KHÁNG THỂ DỊCH THỂ KHÁNG
Mycobacterium tuberculosis ỡ CỘNG ĐỒNG NGƯỜI VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN
Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hỏ Minh Lý
Co quan chi tri dé tai: Vien Ve sinh dịch tế trung ương Cap quan Iy: Bo Y té
Ma so dé tai (nếu có) :
Thời gian thực hiện : tir thang 1/2002 đến tháng 12/2004 Tổng kinh phí thực hiện để tài: 141 triệu đồng
Trong đó, kinh phíSNKH : I4l triệu đồng
Trang 31 Tên để tà: “Nghiên cứu mức độ kháng thể dịch thể kháng Mycobacterium tuberculosis 6 cong déng người Việt nam và một số yếu tố liên quan”
Chủ nhiệm đẻ tài: PGS.TS Hồ Minh Lý
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ sinh dịch tế trung ương
Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế Thư ký đề tài : Phó chủ nhiệm để tài Danh sách những người thực hiện chính : a ee ee
TT Ho va ten Chức danh Nơi cơng tác 1 Hồng Thuỷ Long GSTS Viện Vệ sinh Dịch tế TW 2 Phạm Ngọc Đính PGS.TS Viện Vệ sinh Dịch tế TW 3 HồMinhlý PGS.TS Viện Vệ sinh Dịch tế TW 4 Đặng Đức Phú GS.TS Viện Vệ sinh Dịch tế TW 3 _ Đặng Đức Anh TS.CN Viện Vệ sinh Dịch tế TW 6 Khương AnhTuấn ThsBS Viện CL & CS, Bộ Y tế
7 Nguyễn Vân Anh Ths.CN 'Viện Vệ sinh Dịch tế TW
Trang 4AIDS BNLP CDC DOTS ELISA HIV LAM LP MS oD PCR PPD
BANG CHU CAI VIET TAT
Acid Fast Bacilus (Trực khuẩn kháng côn, axit) Acquired Immunodeficiency Syndrome (Hi chimg thiểu hụt miễn địch mắc phải)
Bệnh nhân lao phổi
Centre for Diseasc Control (Trung tâm kiểm soát bệnh)
Direct Observe Treatmenfs (Điều trị có giám sát trực tiếp) Enzyme Linked Immuno- Sorbent Assay (K¥ thuat miéa địch gắn men) Human Immuoodeficiency Virus (Virut gây thiếu hụt miễn dịch người) Kháng nguyên Lipoarabinomannan Lao phổi Mã số
Optical Density (Mật độ quang học)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuối polymeraza)
Purified Derivative Protein (Protein chiết xuất tinh khiết)
TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới
Trang 5MỤC LỤC
Trang
PHAN A TOM TAT CAC KET QUA NOIBAT CUA DE TAL 1
PHANB NOL DUNG BAO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ
TÀI CẤP BỘ
ĐẶT VẤN ĐỀ 6
1 TONG QUAN 9
1.1 Tinh hình bệnh lao hiện nay 9 1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới 9 1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt nam 10 1.2 Yếu tố nguy cơ và tình hình nhiễm, mắc bệnh lao 1
12.1 Yếutốnguy cơ ut
1.2.2 Tình hình nhiễm và mắc lao 15
1.3 Vikhuda Mycobacterium 15
14 — Miễn địch học bệnh lao 16
1.4.1 Miễn dịch qua trung gian tế bào 16 1.4.2 Miễn dịch dịch thể trong bệnh lao 17 1.4.3 Kỹ thuật huyết thanh học chẩn đoán bệnh lao 1 1.5 Khéng aguyén M tuberculosis siêu nghiên sử dụng trong chẩn 19
đoáu huyết thanh học sàng lọc bệnh lao
16 _ Chuẩn hoá kỹ thugt ELISA sir dyog khang aguyéa M tuberculosis 21 siêu nghiễn trong chẩn đoán bệnh lao
61 Nông độ kháng nguyên tối ưu 2L
Trang 61.63 Tính ổn định của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiền 2
2 VAT LIEU VA PHUGNG PHAP 23
2.1 — Đốitượng nghiên cứu 23
2.1.1 Nhémegng déng khoé maah ”%
2.1.2 Nhóm bệnh nhân lao 2
2.2 Vật liệu nghiên cứu 23
2.3 — Phương pháp nghiên cứu 25
2.3.1 Phương pháp chế kháng nguyêu siêu nghiễn tir M.tuberculasis 25
2.32 Quy trình thực hiện ELISA sử dụng kháng nguyên |Z‡ubercdosis 25 siêu nghiễn
2.3.3 Quy trình thực hiện ELISA sử dụng KIT của hãng Lionex (Aah) — 26
2.3.4 Phương pháp tiêm trong da (Phản ứng Mantoux) % 2.3.5 Phương pháp PCR xác định trực tiếp ADN của M tuberculosis 26
trong bệnh phẩm đờm
2.4 — Phương pháp xử lý số liệu 27
3 KET QUA NGHIENCUU 28
3.1 — Mức độ kháng thể dịchthể kháng đạc hiệu M tuberculosis tong — 28 huyết thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu
3.1.1 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu của nhóm 28 cộng đồng đâu cư khoẻ mạnh bình thường,
3.1.2 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu của nhóm bộ — 29 đội
3.1.3 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu với + M tuberculosis cia bab abaa lao phổi mới
3.1.4 - So sánh mức độ kháng thể IgG đặc hiệu của các nhóm cộng đổng — 33 nghiên cứu
Trang 73.2 Mốiliên quan giữa mức độ kháng thể IgG và IgM đặc hiệu 38 M tuberculosis với một số yếu tố địch tễ học
3.2.1 Yếu tố địa lý 38
3.2.2 Yếu tố tuổi: Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đạc hiệu — 41 của đối tượng nghiên cứu theo tuổi
3⁄2 _ Điều kiện sinh hoạt xã hội và mức độ kháng thể IgG và JgM huyết — 42 thanh đặc hiệu của các nhóm cộng đồng
3.2.4 Phâu tích mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu ở — 44 nhóm bộ đội học viêu theo kết quả phẫu ứng Manioux
3.3 Bước đầu xác định và theo đối nhóm đối tượng khoẻ mạnh có đấp — 46 (tag ELISA đương tính với IgG hoac IgM
4 BÀN LUẬN 49
4.1 Mức do lu banh cita IgG, IgM va IgA khdng M tuberculosis 50 trong huyết thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu
4.2 Mối liên quan giữa mức độ kháng thể IgG, [gM huyết thanh đặc 56 hiệu khéag M tuberculosis siêu nghiên với một số yếu tố dịch tế
học
4.3 Bước đầu xác định và theo dõi nhóm đối tượng khoẻ mạnh có đáp 60 ứng ELISA dương tính với IgG và/hoặc IgM nhằm phát hiện sớm
và quản lý nguồn lây
KẾT LUẬN a
Trang 8PHAN A
Trang 91 KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1.1 Đóng góp mới của đẻ tài +
- Để tài nghiên cứu là công trình đâu tiên đánh giá mức độ kháng thể IgG, IgM và IgA huyết thanh kháng dic higu khéag aguyéa Mtubercwosis cla mot sO nhóm cộng đồng người khoẻ mạnh và bệnh nhân lao phổi méi bằng phương pháp miễn địch gắn men (ELISA) sử dụng kháng nguyên siêu nghiển chiết xuất từ Maubercslasis và bước đầu xác định được mối liên quan của một số yếu tố địch tế học đối với mức độ kháng thể IgG huyết thanh đặc hiệu #Z‡zberczlasis của cộng đồng
- Thông qua kết quả thu được, đề tài đã để xuất phương pháp có tính khả th, góp phân đánh giá tình hình nhiễm lao trong cộng đồng dàn cư bằng các chỉ số globulin miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên lao và chẩn đoán sàng lọc bệnh
nhận lao
a, Hiệu quả và đào tạo,
- Để tài nghiên cứu cung cấp tài liệu và số liệu có thể dùng để tham khảo trong đo tạo và nghiên cứu vẻ tình hình mắc, nhiễm lao ö cộng đồng, các yếu tố nguy cơ liên quan đến mức độ nhiễm lao ở cộng đồng
- Để tài nghiên cứu và kết quả đạt được là nội dung của 01 luận vã tốt nghiệp đại học đã bảo vệ thành công và sẽ là nội dung cơ bản cho 01 luận ẩn tiến sỹ
b, Hiệu quả về kinh tế và xã hội
- Để tài đã đánh giá được mức độ kháng thể IgG, IgM và IgA huyết thanh đặc higu Mruberculosis & cong đồng người khoẻ mạnh bình thường và bệnh nhân lao, xác định được mối liên quan với một số yếu tố dịch tễ học, đóng góp cho việc hoạch định chiến lược phòng ngừa và kiểm soát tình hình nhiễm, rắc lao trong cộng đồng, trong đó có phát hiện sớm, kiểm soát hiệu quả trường hợp
Trang 101.2 Kết quả cụ thể
- 90% cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường có mức độ kháng thể dịch thể ngưỡng bình thường (giá trị OD trung bình < 0,45, là giá trị ngưỡng được xác định cho cộng đồng Việt nam khi sử dụng hệ thống ELISA và kháng nguyên siêu nghiên chiết xuất từ jZ#uberculosiz), thấp hơn có Ý nghĩa thống kê (p<0,001)so với của nhóm bệnh nhân lao phổi
- Trong số các nhóm cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường được nghiên cứu, nhóm bộ đội biên phòng có mức độ IgG và/ hoặc IgM huyết thanh kháng đặc higu M tuberculosis cao hon cé ¥ aghia thống kế cả vẻ giá trị OD trung bình và tỷ lệ đáp ứng dương tính
- Bước đầu xác định được mối liên quan trực tiếp giữa độ tuổi và điều kiện sinh hoạt xã hội với mức độ nhiễm lao của cộng đồng,
1.3 Đánh giá thực hiện đẻ
duyệt
a Tiến độ : thực hiện đúng theo tiếu độ dự kiếu trong kế hoạch thực hiện để ¡ đối chiếu với đẻ cương nghiên cứu đã được phê cương
6 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu: Do kinh phí hạn hẹp (được cấp 141 triệu trong tổng số 300 triệu để nghị) nên mục tiêu nghiên cứu thứ ba mới thực hiện được một phần
© Một phần nội dung nghiêu cứu đã được đãng tải trong tạp chí Y học Thực tành nãm 2003; Kết quả nghiên cứu đã được báo cáo tại Hội nghị Khoa học Miễn địch học năm 2005 do Bộ Y tế kết hợp Viện Y học quân sự 103 tổ chức
d Tổng kinh phí cần thiết thực hiện đề tài : 300 triệu; được cấp 141 triệu đồng "Tất cả thuộc kinh phí sự nghiệp khoa học do Bộ Y tế cấp Kinh phí được sử dụng, đúng myc dich và đã được thanh quyết toán đầy đù, đúng thời hạn Do khuôn khổ kinh phí cấp cho dé tài, không có trang thiết bị nào có giá trị trên 3000 USD
Trang 111.4 Ý kiến đề xuất
- Để xuất về tài chính : Do đề tài có tính chất nghiên cứu trêu cộng đồng rộng và lớn về không gian cũng như số lượng, nên phâu kinh phí được cấp đã không đủ để thực hiệu tất cả nội dung dự định Để nghị rút kinh nghiệm để xét và cấp đủ kinh phí thực hiện các để tài nghiêu cứu
- Để xuất về quản lý khoa học công nghệ: Để nghị được phép sử dụng hệ thống ELISA với kháng nguyêu siêu nghiển trong chấn đoáu sàng lọc nhiễm lao ở cộng,
Trang 12PHAN B
NOI DUNG BAO CAO CHI TIET
Trang 13DAT VAN DE
Mycobacteriwn tuberculosis (a một trong những tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn có tính đặc thù cao Ước tính hiện có khoảng rnột phần ba dân số thế giới bị nhiễm lao Hàng nãm có khoảng từ 8 đến 12 triệu trường hợp nhiễm lao tiến triểu thành bị mmắc lao hoạt động Số từ vong trung bình hàng mâm do lao là 3 triệu người, chiếm khoảng 7% tổng số từ vong do tất cả các nguyên nhân và chiếm 26% tổng số từ vong gây ra bởi các bệnh có thể phòng được trêu toàn cầu (50, 63)
Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG), Việt nam là một trong [Ũ nước có số bệnh nhân lao cao nhất ờ Châu Á và đứng thứ LÍ trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất trên thế giới (3) Chương trình phòng chống lao quốc gia đã có nhiều cố gắng để kiểm soát và hạn chế bệnh lao bằng nhiều biện pháp khác nhau như tuyên truyền, giáo dục cộng đồng nhằm làm tăng nhận thức của người dân với việc phát hiệu sớm khả năng mắc lao, điều tr lao miễn phí, giám sắt theo dõi điều trị trực tiếp, vv G tuyến trung ương chúng ta đã phát triển được các kỹ thuật chẩn đoán hiện đại như nuôi cấy sử dụng hệ thống đo phóng xạ BACTEC, kỹ thuật PCR (polymeras chain ceaction) phát hiện vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm bing +khuyếch đại trình tự axit aucleic đặc hiệu của chúng Tuy vậy ở tuyến dưới, việc xác định bệnh vẫn phụ thuộc chủ yếu vào các triệu chứng lâm sàng và soi kính tìm vi khuẩn kháng côn kháng toan (AEB) trực tiếp từ bệnh phẩm của bệnh nhân Hơn nữa, việc chẩn đoán sàng lọc ở cộng đồng vẫn chỉ dựa trên phản ứng Mantoux và chụp X-quang (XQ) phim nhỏ, các phương pháp này đẻu có độ chính xác không cao, dẫn đến việc xác định nguồn lây muộn, nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng
tang và tỷ lệ mắc bệnh tăng
Để làm giảm tỷ lệ mắc cũng như tỷ lệ từ vong do bệnh lao, một trong những biện
Trang 14(DOTS) Nhiéu ahém nghiên cứu trên thể giới dang cố gắng phát triển các kỹ thuật phát hiện, chẩn đoán sớm bệnh lao dựa trên các kỹ thuật sinh học phân từ để +khuyếch đại về mật số lượng cấu trúc di truyền đặc hiệu Song đối với cộng đồng, để sàng lọc, khảo sát để phát hiện sóm các nguồn lây tiêm tàng chưa được phát hiện hoặc các đối tượng nhiễm lao và có nguy cơ mắc lao cao, kỹ thuật có thể áp dụng phải là kỹ thuật có thể triển khai đại trà, thao tác đơn giản, giá thành rẻ mà kết quả có thể tia cậy, một kỹ thuật như vậy cho đến nay vẫn chưa được thống nhất
Đối với bệnh lao, miễu dich qua trung gian tế bào có vai trò quau trọng trong phòng, vệ, còn miễn dịch dịch thể chỉ có ý ngứa liên quan đến tiến tiển bệnh ý (3) Nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc xác định mức độ kháng thể kháng đặc hiệu kháng nguyên vì khuẩn lao có thể đóng vai trò quan trọng trong chấu đoáu sàng lọc bệnh lao đồng thời cung cấp thông tỉa có giá trị về tình trạng đáp ứng rniễn dịch địch thể đặc hiệu của vật chủ đối với tác nhân gây bệnh lao (16,39,52-53)
Trong hơn rnột thập kỷ qua nhiều loại kháng nguyên từ vì khuẩn thuộc nhóm 4#, tubercrlosts đã được tách chiết và nghiên cứu sử dụng, Đại đa số đều gây phản ứng, chéo với kháng nguyên của Mycobacterium khde hoặc các vì khuẩn khác ở mức độ qào đó (39) Tuy nhiên người ta đã nhận ra có rnối tương quan trực tiếp giữa nồng độ kháng thể kháng các kháng nguyên này trong co thể bệnh nhâu với rnức độ biểu hiện bệnh vẻ lâm sàng, hình ảnh XQ và mức độ phát táu vi khuẩu ở bệnh nhân lao phổi Đồng thời người ta cũng tìm thấy sự khác nhau ý nghĩa giữa nồng độ kháng thể đặc hiệu trong cơ thể bệnh nhâu với nồng độ kháng thể đặc hiệu trong cơ thể người khoẻ mạnh (4,5,7,L6,39,52)
Tuy nhiên nhu cầu đồi hồi cần có một nghiên cứu thực hiện trên một cộng đồng lớn
để nghiên cứu tình trạng nhiễm lao của cộng đồng thông qua các chỉ số miễn địch địch thể ở nước ngoài cũng như trong nước Để tài:” Nghiên cứu tình trạng đáp ứng
miễn dịch dịch thể kháng Mpcobacterbion tưbercilasis Ö một số nhóm cộng đồng
người việt nam và một số yếu tổ nguy cơ liên quan” sừ dụng kháng nguyên
Trang 15người Việt nam và bước đầu đánh giá sự liên quan giữa mức độ đáp ứng miễn địch dich thể với các yếu tố nguy cơ liên quan dịch tễ học nhằm góp phần kiểm soát các trường hợp nhiễm bệnh, phát hiệu sớm trường hợp mác bệnh, hạu chế sự lan truyền của các chùng lao khác nhau, đặc biệt là các chủng vi khuẩn kháng thuốc giữa các +hu vực địa lý khác nhau
Mục tiêu của để tài:
1 Đánh giá mức độ lưu hành kháng thể TgG, IgM kháng đặc hiệu 8# tabercuiasi> trong huyết thanh của ruột số nhóm cộng đồng
2 Xác định mốt liên quau giữa mức độ đáp ứng miễn dịch địch thể với một số yếu tổ địch tế học
Trang 161 TONG QUAN
1.1 Tình hình bệnh lao hiện nay
1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới
Bệnh lao là bệnh đã được biết từ hàng ngàn uãm trước công nguyên và được coi là bệnh hiểm nghèo, không thể chữa khỏi Bệnh lưu hành trêu toàn thế giới nhưng mãi đến năm 882 khi Robeq Koch tìm ra trực khuẩn lao và rnột loạt thuốc chống lao được bắt đầu đưa vào sử dụng từ thập niên 40 của thế kỷ 20, rối làm cho bệnh lao giảm đi ö nhiều nước
Cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, điều kiện vệ sinh phòng bệnh ngày càng, tốt hơn cũng như những tiến bộ trong điều tự đã làm cho người ta hy vọng rằng bệnh lao có thể phòng và điều trị được như các bệnh nhiễm khuẩn thông thường khác Chính vì vậy vào những năm 70, 80 người ta đã bàu đến vấn để thanh toán bệnh lao
vào cuối thế kỷ 20 Nhưng đến những uâm đầu thập kỷ 90, cùng với quá tảnh phát triển của đại địch HIV/AIDS, bệnh lao không những không thuyên giảm mà còn gia tăng ở nhiều nước kể cả các nước phát tiểu Theo thống kê của TCYTTG vào nâm 1994, trong số 18 triệu người bị nhiễm HIV trêu toàn thế giới thì có tối 5,6 triệu người bị lao Đến nãm 1997, TCYTTG thơng báo tồn thế giới có khoảng 1.87 tỷ người nhiễm lao, chiếm 32% dân số thế giới, trong số đó có tới 16,2 triệu trường hợp mic lao (26) Mỗi nâm có 8 triệu người mắc lao mới Hơn 95% số trường hợp mắc lao nằm ở các nước có thu nhập thấp và 80% ö 22 nước có tỉ lệ mic lao cao nhất bao gồm L0 nước thuộc châu Á: Ấn độ, Indonexia, Banglades, Thái lan, Myanrna, TRìng, quốc, Việt nam, Philipiu và Camphuchia Đến nâm 1998, TCYTTG đã phải cảnh
báo: “Bệnh lao đang de dọa toàn cầu” (45)
Từ khi HIV/AIDS trở thành đại dich lan tràn kháp thế giới thì tình hình bệnh lao trở nên càng trầm trọng Theo TCYTTG nam 1996, ước tính có tới 9,6 triệu người đồng nhiễm lao/ HIV trêu toàu cầu trong đó vùng cận sa mạc Saham chiếm 6,6 triệu, Nam Á 222 triệu người (64) ao đã trở thành một bệnh nhiễm trùng cơ hội phổ biếu nhất
Trang 1768.4% người nhiễm HIV, ở Thái lan 52%, Myanma 82% (26) Va tir nam 1993 tất cả các thể lao đã được coi là một trong các tiêu chuẩn chẩu đoán quan trọng trong bảng phân loại chẩn đoán AIDS của trung tâm kiểm soát bệnh dich My (CDC) va TCYTTG (64)
1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt nam
Nhiều đợt điều tra, giám sắt qui mnô đã được Việu lao và Bệnh phổi phối hợp với địa phương thực hiệu liên tục trong gầu 20 nãm (1957- 75) cho thấy tỉ lệ nhiễm lao chung là 40,3%, tỉ lệ rnấc lao trên X-quang là 2,5% (3) Cho tới những năm 80 của thế kỷ 20 công tác phòng chống lao Việt am đã đạt được những kết quả to lớn Nam 1995, trong bối cảnh chung toàn cầu, tình hình dịch tễ bệnh lao có những biến
động xấu di, bệnh lao trở lại là mot trong những bệnh nguy hiểm hàng đâu đối với thế giới và Việt am trở thành một nước có tỷ lệ bệnh lao ö mức irung bình cao trong khu vực và ở rnức irung bình trên thế giới (26)
Theo số liệu thống kê của TCYTTG năm 1999, thì nguy cơ nhiễm lao của nước ta hàng năm là 1,7% (26) Theo ước tính của Viện lao và Bệnh phổi trung ương phối hợp với TCYTTG năm 2000, bệnh nhân lao mới ö mọi thể là 145.000 (tỷ lệ là 189/100.000 daa), trong đó 65.000 bệnh nhân lao phổi soi AEB dương tính (tỷ lệ 85/100.000 dia), tang 10% so véi nam 1999 (3)
Trong giai đoạn 1997-2002, chương trình Chống lao quốc gia đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, đạt tỷ lệ 82% số bệnh nhân ước tính Số bệnh nhân lao Việt am chiếm 12% tổng số bệnh nhân lao các thể và L5% số bệnh nhân lao phổi mới AEB dương tính của Khu vực Tây Thái bình dương (50) Số liệu ước tính âm 2004 của chương trình chống lao quốc gia cho thấy hàng năm trong cả nước xuất hiệu khoảng 154.000 bệnh nhân lao các thể, trong đó có 69.000 trường hợp lao phổi AEB dương tính và tổng số bệnh nhân lao hiện rrắc tại một thời điểm là 232.000 trường hợp với tỷ lệ từ vong 25,1/I00.000 Tỷ lệ lao trẻ em khoảng 60- 61/100.000 trẻ (8)
Trang 18
ca HTV dương tính trên toàn quốc (1) Tỷ lệ HTV dương tính trong số bệnh nhân lao nam 2002 trêu cả nước được xác định khoảng 3,2%, trong đồ có 10 tỉnh lớn hơn 3 (hành phố Hỏ Chí Minh:9,4%, Hải phòng là 11,8%, Bình dương là 14% và An giang: 4.8%) (8)
Tình hình bệnh lao kháng thuốc cũng là vấu để cần quan tâm do là một trong những, yếu tố gây gia tầng tỷ lệ mắc lao trong cộng đỏng Nam 1996, điều tra kháng thuốc toda quốc lầu thứ nhất cho thấy tỷ lệ kháng thuốc chung của Việt uam là 32,5%, tỷ lệ kháng đa thuốc là 2,3% Số liệu điều tra tình hình kháng thuốc toàn quốc lần thứ hai năm 2002 cho thấy 3% bệnh nhân mới và 23,5% bệnh nhân cũ đã kháng đa thuốc Tại đồng bằng sông Hồng, tỷ lệ bệnh nhâu lao rnới kháng đa thuốc bước đầu xác định lên đến 5,5% (8)
1.2 Yếu tố nguy cơ và tình hình nhiễm, mắc bệnh lao
12.1 Yếu tố nguy cỡ
Bệnh lao có thể phát triển sau khi đối tượng hít phải các hạt khí dung chứa vị khuẩn lao do bệnh nhân lao ho hoặc hất xì hơi bắn ra Bệnh lao chỉ phát triển ở một nhóm đối tượng nhất định, những người có hệ thống miễu dịch không đối kháng nổi với tình trạng nhiễm lao bau đầu Bệnh có thể phát triển sau hàng tuần kể từ lúc nhiễm tiên phát vi khuẩn lao, hoặc có thể tồn tại ở thể ẩu hàng nãm trước khi phát bệnh Trẻ em, trẻ vị thành niên và đối tượng có hệ thống miễn địch thiếu hụt như bệnh
nhân AIDS, bệnh nhân đang điều trị hoặc bệnh nhân ghép mô đang được điều trị chống phản ứng thải ghép) là nhóm có nguy cơ cao phát triển bệnh sau nhiễm, Ở bệnh nhân lao phổi, bệnh có thể phát triển chậm hoặc nhanh, và phát triển tối đa
Ở những nước công nghiệp phát triển, tỷ lệ mắc bệnh lao giảm đáng kể trong
khoảng thời gian từ 1700 đến 1940, trước khi phát triển thuốc chống lao Yếu tố có vai ted liêu quan trực tiếp nhất bao gồm chế độ dinh dưỡng và sinh hoạt được cải thiện, sữa được vô trùng và sự cách ly với nguồn gây nhiễm là bệnh nhân lao trong, các cơ sở điều dưỡng Sau khi thuốc chống lao được phát hiệu và đưa vào sử dụng, tÝ lệ mắc và chết do lao giảm nhanh hơn Ở Mỹ, nãm 1953-1983, tỷ lệ mắc hàng nãm
Trang 19giảm khoảng 8% Từ năm 985 đến 1992, tỷ lệ này lại tăng trở lại 20% Hình ảnh tương tự cũng được nhân thấy ở nhiều nước phát triển khác Yếu tố liêu quan lúc này là sự gia tăng địch tế học nhiễm HTV, gia tầng cộng đồng nhập cư từ các nước trong vùng dich, gia tăng cộng đồng sống lang thang, nghiệu hút và đặc biệt nhất là sự giảm sút hiệu quả hoạt động của hệ thống y tế cộng đồng trong phòng chống lao ở
những nước này
Tịch tễ học bệnh lao bị ảnh hưởng bồi hai yếu tố quan trọng Yếu tố thứ nhất là sự tiếp xúc với nguồn vi khuẩn lao trong môi trường Yếu tố nguy cơ đối với nhiễm lao thường liên quan đến sự tiếp xúc với bệnh nhân Ở Mỹ, yếu tố nguy cơ quan trọng, trong nhiễm lao là sống chung cùng với bệnh nhân trong rnột nhà, dân nhập cư từ vùng dịch (châu A, châu Mỹ La-tinh), tiếp xúc với bệnh nhân chưa điều trị trong các
cơ sở công cộng
‘Yeu tố nguy cơ thứ hai liên quan đến tính nhạy cảm đối với bệnh của cá thể sau khi bị nhiễm Có nhiều tình trạng liêu quau đến miễn dịch tế bào vật chù gây gia tăng nguy cơ phát triển bệnh Đó là tình trạng nhiễm HTV, độ tuổi nhạy cảm, điều trị ức chế miễu dịch, ung thư, bệnh thận giai đoạu cuối, đái tháo đường, suy dinh dưỡng, cấp và can thiệp giải phẫu đường tiêu hoá trên Bên cạnh đó, tiêm chích thuốc cũng, liêu quan đến gia tăng nguy cơ mắc bệnh Như vậy, cộng đồng có tỷ lệ mắc lao cao bao gồm cả nhóm có nguy cơ nhiễm cao và nhóm có nguy cơ phát triển bệnh cao 2)
Nguy cơ nhiễm lao gia tăng theo tần xuất tiếp xúc với bệnh nhân, với điều kiện sinh sống và chế độ dinh dưỡng nghèo nàn Hiệu nay, không chỉ ở các nước đang phát triển, tỷ lệ mắc bệnh lao tăng ở nhiều quốc gia trêu thế giới, kể cả những nước phất triển như Mỹ Các yếu tố có khả năng liên quan nhiều đến sự gia tăng nhiễm lao ở
những nước này là:
- _ Tỷ lệ abiém HIV tang
- _ Số lượng cộng đồng có điều kiệu sinh sống nghèo nàn hoặc sống lang thang
gia tang
Trang 20Để xác định các yếu tố nguy cơ đối với bệnh lao, Bacr và cộng sự (Neighbechood poverty and the resurgence of tuberculosis ia New York city 1984-1992) đã đưa ra một nhóm các yếu tố liên quan trực tiếp đến tình hình cấp thiết trở lại của bệnh lao ở New York Những yếu tố này là bệnh AIDS, cộng đồng di cư từ các vùng đang có địch, tiêm chích thuốc, đa kháng thuốc và tình trạng sống lang thang không nhà cửa cùng với sự sao nhãng của hệ thống y tế cộng đồng trong lĩnh vực này (12) Kết quả nghiên cứu của Muao và C§ (2000) cũng cho thấy đói nghèo từng được coi là yếu tố nguy cơ kinh điển, tuy nhiên ở vùng có tỷ lệ AIDS va dân nhập cư cao, yếu tố này hiện nay vẫn có vai trò quan trọng đối với bệnh lao: tỷ lệ mắc lao nam 1992 ở 5.482 đối tượng láng giêng là 46,5/100.000 dân và tỷ lệ đói nghèo trung bình là 19,3% Tác giả cũng cho thấy từ năm 1908-1990, tỷ lệ rắc lao tăng khi thu nhập của cộng, đồng này giảm và kết luận thu nhập của nhóm láng giềng có ảnh hưởng trực tiếp nhất lên nguy cơ nhiễm lao và đói nghèo là yếu tố liêu quan chật chẽ với nguy cơ nhiễm lao hơn so với tình trạng nhiễm HTV, chủng tộc hoặc tôn giáo (44)
Đối với sơ nhiễm lao ở trẻ em, yếu tố nguy cơ đáng kể nhất là tiếp xúc với bố mẹ mic lao hoat tính đang có các triệu chứng điển hình như ho, soi kính đồm có AFB đương tính hoặc có hình ảnh X-quang đặc trưng Tuy nhiêu những yếu tố nguy cơ này ö mức độ khác nhau sẽ đặc trưng cho tình trạng nhiễm hoặc phất bệnh và có thể đóng vai trò là yếu tố nguy cơ đặc hiệu cho tình trạng nhiễm hoặc bị bệnh của cơ thể
32)
Trẻ em tiếp xúc với bệnh nhân lao có nguy cơ phát triểu bệnh cao (44) Mặc dù được tiêm phòng BCG, đáp ứng Maatoux dương tính ở trẻ tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhận lao thiêu về chỉ thị sự nhiễm M.tuberculasis cita co thé, ddi hồi được điều trị dự phòng, đặc biệt cho trẻ đưới 5 tuổi (41-42) Điều nầy quan trọng trong bối cảnh tỷ lệ mic lao dang gia tăng ở vùng Châu Phi cận Sahara, nơi có trẻ được tiêm phòng BCG
đang sống tiếp xúc với người lớn mắc lao hoại tính
>_ Ảnh hưởng của tuổi và giới
Trang 21trong cộng đồng,
Tổng hợp số liệu của nhiều nước, Sutherland (1976) đã nêu nguy cơ nhiễm lao tăng, theo tuổi, từ trẻ nhỏ đến thanh niên, tuy khác nhau theo mỗi nước nhưng trung bình
môi nãm nguy cơ tăng 5-6%
Về tình hình nhiễm lao ở nam và nữ tại các nước Chau Âu, nhiều tác giả cho thấy từ” 30 tuổi trở lên, số mới mrắc lao ở nữ thấp hơn so với nam Đối với các lứa tuổi, nhiều thống kê nêu rõ trong vòng 2 thập kỷ (1951-70), ð Châu Âu, bệnh lao trong trẻ em và người ít tuổi giảm đi rõ (có nơi trên 90% ở lứa tuổi dưới 30) Mức giảm ít hơn nhiều ð người trung và cao niên Đối với lớp người trên 80 tý lệ này hầu như không
thay đổi (4)
Theo số liệu của Trung tâm kiểm soát bệnh (CDC) Alauia (57), bệnh lao ảnh hưởng, không đồng đều đếu nam giới và nữ giới : nam 2000, 62% trường hợp lao xảy ra ở nam giới và 38% - ở nữ giới, như vậy tỷ lệ mắc lao ở nam giới gần gấp đơi so với ư nữ giới (7,4/100.000 và 4,3/100.000) CDC cũng thông báo tỷ lệ mắc lao xẩy ra cao hơn nhiều trong nhóm phạm nhân nhóm tuổi từ 25-44, và trong nhóm cộng đồng sinh sống chật chội
> Dan tec
Có một số dân tộc dễ bị mắc lao, ví dụ những người ở vùng núi xứ Xcôtlen ở Anh trước kia, ö một số nước Trung Phi hoặc sống trên các triểu núi Himalaya (Crofton,
1988) Lí do được giải thích là vì những người này sống tong khu vực có điều kiện tiếp xúc vi khuẩn ít, nên sức để kháng yếu, khi gập nguồn lây, hoặc khi chuyển sang,
sống nơi đô thị hoặc các nước công nghiệp, họ dễ mắc lao hơn (3)
> Ditruyén
Trang 2212.2 Tình hình nhiễm và mắc lao
Mycobacteriwn tuberculosis (a logi vị khuẩn có thành phần cấu tạo khá đặc biệt, khi xâm nhập vào trong cơ thể người, trong đa số trường hợp, vi khuẩn không bị tiêu điệt mà có thé 160 tại lâu dài ở nội bào, tạo nêu trạng thấi nhiễm lao thường không có triệu chứng lâm sàng Chỉ một số người nhiễm lao sẽ trở thành bệnh nhân lao, teong mot điều kiện nhất định (47)
Theo nghiên cứu của Sutherand (1968), trong 12.867 trẻ từ I4 đến L5 tuổi, tuberculin âm tính, XQ phổi bình thường, không tiếp xúc với bệnh nhân tại nhà, trong 10 năm, có 10,4% (1335 tre) bj ahiém bệnh và 8.1% (108 trẻ) mắc bệnh Theo đối L5 nâm với tổng số 243 trường hợp nhiễm lao, các tác giả lại thấy 54% mắc bệnh trong vòng 1 năm, và khoảng 80% trong vòng 2 năm sau khi bị nhiễm (3)
Tại Saskatchewan (Canada), theo kết luận của Baruet (1997) 6,4% trường hợp bị nhiễm sau đó đã bị rrắc một thể lao lâm sàng Một nghiên cứu dịch tễ của Hà lan đã ước tính sau khi bị sơ nhiễm, nguy cơ mrắc bệnh hàng uãm ở thể soi AEB dương tính là 12% Theo Srylo (1990), để lập các mô hình vẻ địch tế học, có thể đặt định dẻ là trong 6-8 trường hợp nhiễm lao mới sẽ có thể thấy xuất hiện một trường hợp mắc lao lâm sàng sau này (3)
1.3 Vi khudn Mycobacterium
Mycobacteriwn là têu được gọi do vi khuẩn có hình thấi phát triểu trong môi trường, lòng như sợi nấm Giống jycobacierim thuộc họ JÍycobacteriaceae, bộ
Actinomycetes
Vi khuda Mycobacterium gồm hơn 54 loài khác nhau Đa số sống ở khấp nơi trong, tự nhiêu (đất, nước, cây cối, thức ãa ), một số ít có khả nãng gây bệnh ở động vật và người Đây là nhóm vị khuẩn kháng cỏn, kháng axit nhưng tính chất kháng
nguyên lại cực kỳ mảnh mai, mồ ảo
Tựa vào tính chất gây bệnh: Mycobacterium được phân thành 3 loại: ¢ Nhém Mycobacterium diéa hình (M tuberculasis)
Trang 23+ Nhóm Mycobacterium gay béah phong (IM leprae, M lepraemurium)
Dya vio khd afag sink sic 16 vA t6c dO phét trida, Runyon (1959)(48) chia Mycabactertum thành 4 nhóm: © Phân nhóm sinh sắc tố ở ánh sáng (photochromogen) ( kí, kansassti, M marinum, ) «_ Phân nhóm sinh sắc tố trong bóng tối (scotocheomogen) (M scrofidaceum, M gordonea, )
© Pha nhóm không sinh sắc tố (À4 tuberculosis, M avium ) «ˆ Phân nhóm mọc nhanh (3-5 ngày, Äf fortuitum, M.chelonei) Tựa vào khả năng phát triển của vi khuẩn, có thể chia 2 nhóm:
« Mycobacterien mọc chậm (> 7 ngày) «- Mycobacteriien mọc nhanh (< 7 ngày)
Mycabacteria có 4 nhóm khẩng nguyên chù yếu: Nhóm kháng nguyêu chung (nhóm: ] gồm các protein hoặc polysaccharide, arabinogalactan có nhiều trêu bể mật tế Đào, ribosorne (165); Nhóm kháng nguyêu đặc hiệu cho jẤycobacieriz mọc chậm (nhám 1D) gôm protein œ, gây đáp ứng qua trung giau tế bào; Nhóm kháng nguyên đại diện cho Mấycobacteria mọc nhanh (bớm 111) không có vai trò trong thử nghiệm nội bì và Nhóm các kháng nguyên đặc higu ching (whdm IV) c6 vai ted quan trọng trong thử nghiệm nội bi g4m protein, lipid polysaccbatide, và glycolipid (30)
Một số kháng nguyên đang được sử dụng trong nghiêu cứu và chẩn đoán là nhóm kháng nguyên hỗn hợp A60 chế từ 4 b2vis, kháng nguyên toàn phần vỏ, kháng
nguyên thành phần vò tế bào lipoarabinomaanan (LAM), glycolipid, tuberculin, PPD, v.v
1.4 Miễn dịch học bệnh lao
1.4.1 Miễn dịch qua trung gian tế bào
Trang 24xà chủ yếu là các tế bào thuộc quầu thể lympho bao T Mién dich chong lao là miễn địch đồng tôn, tức là chỉ tôn tại chừng nào còn có sự hiện diện của kháng nguyên vi khuẩn lao ở trong cơ thể Miễn dịch chống lao cũng chỉ là miễn dich ¿ưng đối Một cơ thể đã có miễn dịch vẫn có thể mắc bệnh lao Sự hiệu diệu của vị khuẩn trước đó không thể hoàn toàn ngăn cản được sự lan tràn của vị khuẩn mới thâm nhập sau này Người đã được tiêm phòng lao vẫn có khả uãng mắc bệnh, tuy có thấp hơn nhiều so với chưa tiêm phòng
1.4.2 Miễn dịch dịch thể trong bệnh lao
Trong mối tương tác giữa vi khuẩn và tế bào, bên cạnh các quảu thể Iympho bào T còn có sự tham gia của các Iympho bào B qua sự kích thích của các Iympho bào T hỗ trợ và do đó sản sinh ra các kháng thể dich thể, Từ đầu những năm 70 người ta đã nhậu thấy có sự tầng gamaglobulin huyết thaah va céc globulin miéa dich IgA, IgG trong lao phổi Đặc biệt, người ta thấy các kháng thể thuộc nhóm IgG có liên quan
nhiều nhất tới sự phát triểu của bệnh lao (3)
Bên cạnh đó, các nghiêu cứu đáp ứng miễn dịch dịch thể trên người cho thấy có sự xuất hiệu sớm kháng thể IgM đặc hiệu sau đó là IgG đặc hiệu ở giai đoạn muộn hơn của quá trình nhiễm khuẩn Quá trình chuyển đổi từ IgM sang IgG được phát hiện ở hầu hết bệnh nhân lao.Tuy nhiên, trong giai đoạn nhiễm vi khuẩn lao, rniễn địch địch thể không có khả nãng ngân chặn sự phát triểu của vị khuẩn và giúp đố cơ thể chống lại bệnh lao
Sự hiển điện của kháng thể dịch thể đựơc sử dụng chủ yếu ngày nay trong huyết thanh học chấn đoán bệnh lao Việc xác định rnức độ kháng thể kháng đặc hiệu kháng nguyên vi khuẩn lao có thể đóng vai tr quan trọng trong chẩn đoáu sàng lọc bệnh lao đồng thời cung cấp thông tia có giá trị về tình trạng đáp ứng rniễn địch dich thể của vật chủ đối với nhiễm khuẩn (L8, 39, 52, 53)
14.3 Kỹ thuật huyết thanh học trong chẩn đoán bệnh lao
Trang 25và có thể làm nhiều mẫu cùng một thời điểm
Từ đầu thế kỷ, Vidal (1901) đã tìm cách chẩn đoáu huyết thanh học bệnh lao bằng, phản ứng gắn bỏ thể nhưng do rnức độ thiếu chính xác quá cao nên không được ứng
dụng Đến nâm 1950, phương hướng này lại được phục hỏi với kỹ thuật ngưng kết hồng cầu của Middlebrook - Dubos Kết quả đã đạt được mức độ khả quan hơn nhưng sai số còn khá nhiều Theo một theo doi tại Viện Lao và bệnh phổi trung ương trêu 120 bệnh nhân lao và nhóm đối tượng đối chứng đã có tới 33% dương tính giả và 41% âm tính giả (3) Nam 1959, với kỹ thuật khuyếch tán trên thạch, Padlert và Youmams thấy có 84% dương tính ö bệnh nhân nặng, 73% ở bệnh nhân trung, bình và 57% ở bệnh nhân nhẹ (3) Nãm 1962, Takabaki đo kháng thể kháng Phosphat trong huyết thanh và nhận thấy 95% dương tính ở bệnh nhâ lao, 12% ở
người lành bị nhiễm, xác định bằng phân ứng tuberculin dương tính (3)
Kỹ thuật miễn địch huỳnh quang được sử dụng từ những âm 60, theo Nassau và Merrick (1970) c6 tới 96% dương tính ở bệnh nhân lao dang điều trị và 97% âm tính ở người khoẻ mmạnh Tiếp theo, miễn dịch phóng xạ cũng được coi là kỹ thuật cho những kết quả đáng tia cậy Hewin và Coates (1982), sử dụng các kháng thể đơn đồng đặc hiệu đã phát hiện 72% dương tính ở bệnh nhân và không có dương tính giả ở người lành (3)
Phương pháp miễn dịch gắn men - ELISA (Enzyme Linked Innmuno Sorbent Assay) là phương pháp được phát tiểu và sử dụng nhiều trong những năm gần đây Nghiên cứu của Sieminska (1999) đã chứng rninh rằng các trường hợp lao phổi có câu nguyên vi khuẩn được khẳng định có mức độ kháng thể IgG kháng kháng nguyên A60 cao hơn so với các trường hợp lao phổi mà căn nguyên vi khuẩn không được xác định Trong số các trường hợp lao có căn nguyên xác định, rnức độ kháng thể kháng kháng nguyên A60 cao hơu ở nhóm bệnh nhân nặng có hang lao Điều này cho thấy mức độ đáp ứng miễu dich dịch thể tỷ lệ thuận với mức độ kháng nguyên vi khuẩn được tình diện (53)
Trang 26trong những kháng nguyên hứa hẹu trong chấu đoáu bệnh lao Việc sử dụng IMAs đã làm tầng tỷ lệ đương tính từ 26% với nuôi cấy và 0% với soi kính lên 86% Tất cả các trường hợp dương tính với nuôi cấy đều dương tính với IMAs Ngoài ra người 1a còn thấy có sự tương đồng giữa mức độ đáp ứng kháng thể với nồng độ kháng,
nguyên vị khuẩn lao trong bệnh phẩm (20)
Kiểm tra bằng kỹ thugt ELISA, Torres M và cộng sự cũng nhận thấy rnức độ đáp ứng kháng thể kháng kháng nguyên 30 KD của M;cobactzriz ð nhóm bệnh nhân lao phổi cao hơn nhiều so với nhóm tiếp xúc (58) Kháng nguyên tiết của kí tuberculoss như ESAS-7, EST-DEI, v.v cũng là đối tượng được quan tâm sử dụng, trong chấn đoáu lao phổi và lao ngoài phổi Độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA sử
dụng các kháng nguyên trên để phát hiện kháng thể dao động từ 50%-90% và 86%- 93% (LL)
1.5 Kháng nguyén M tuberculosis siêu nghiên sử dụng trong chẳn đoán huyết thanh học sàng lọc bệnh lao
Mặc dù trong hơa một thập kỷ qua nhiều kháng nguyên từ Ä taöerculostt đã được tách chiết và sử dụng Việc lựa chọn kháng nguyêu có thể ảnh hưởng tới kết quả của kỹ thuật Mức độ đáp ứng miễn dịch dịch thể của mỗi bệnh nhân lao với các kháng nguyên khác nhau của vi khuẩn lao là khác nhau Cho đếu nay vẫn chưa có một kháng nguyên nào được công nhận là có khả nãng được nhận biết và gây đáp ứng như nhau ở tất cả các bệnh nhân lao Trên thực tế kháng aguyêu tỉnh khiết thường cho độ đặc hiệu cao, song độ nhạy thấp và nếu kết hợp kết quả khi sử dụng nhiều kháng nguyên khác nhau thì độ nhạy của thử nghiệm gia tăng (7, 33, 60)
Kháng nguyên siêu nghiển là ruột kháng nguyên dễ sảu suất, đặc biệt đối với các nước dang phát triển không có điều kiện để sản xuất kháng nguyêu tỉnh khiết hoặc mua từ bên ngoài với giá thành cao Đây là dạng kháng nguyên tổng hợp, bao gồm toàn bộ các thành phần có mật trong tế bào của trực khuẩu lao So sánh độ nhạy và
độ đặc hiệu của ELISA xác định kháng thể kháng 84 tuberculosis khi sir dung cdc loại kháng nguyên khác nhau, người ta đã nhận thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA khi sử dụng kháng nguyên siêu nghiên hầu như tương đương với ELISA sử
Trang 27nguyên có tính kính thích miễn địch cao như kháng nguyên tiết, kháng nguyên tiết tách LAM, kháng nguyên toàn phân vỏ, kháng nguyên A60 và có độ nhạy cao hơn nhiều so với kháng nguyên tỉnh khiết khác như kháng nguyên lối vò tế bào v.v (58) Để nghiêu cứu hiệu quả chẩn đoán của kháng nguyên siêu aghién M tuberculosis, chúng tôi đã sử dụng kháng nguyên này để phát hiện ]gG đặc hiệu ở bệnh nhân trần
dich ming tim do lao Nông độ IgG kháng lao ở bệnh nhân lao cao hơn có ý nghĩa so với bệnh nhân nhóm chứng có tràn địch màng tỉm do các cân nguyên khác Cụ thể khi đo kết quả ELISA ở bước sóng 430 am, nồng độ pha loãng huyết thanh và địch màng tìm là 400 lần, IgG dịch màng tim và huyết thanh của bệnh nhân lao TDMT là 0,616 + 0,098 và 0,586 + 0,095 so với của bệnh nhân TDMT do nguyên nhân khác là 0,326 + 0,024 và 0,359 + 0,026 (P<0.01) Độ nhạy và độ đặc hiệu của
ELISA trong nghiên cứu này đạt 84% và 89% (4)
Độ nhạy và độ đặc hiệu của phẩm ứng huyết thanh với các kháng nguyên khác
nhau chiết xuất từ NÃ tuberculosis Kháng nguyên Độ nhạy Độ đặc hiệu PF (%) (%) EN tet Sĩ 37 30.05 KN tiết tách LAM 7L $7 KN siêu nghiền 6 $7 30.05 KN toda pha vd TB 58 %4 30.05 LAM 55 87 0.039 KN toàn phần vỏ TB ly giải 2 87 0.015 bang SDS EN loi vo TB 86 87 <0000L
* giá trị P Khí so sánh mức độ phần ứng huợế thanh kháng EN tiết tách LAM và mức độ phân ứng huyết thanh kháng các kháng nguyên khúc,
Trong một nghiêu cứu khác, ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiển phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu được kết hợp với PCR để làm tâng độ nhạy của chẩn đoán Trong số 44 bệnh nhân lao tràu dịch màng phổi, ELISA đã có kết quả dương tính với
Trang 2864% trường hợp (giá trị OD 450am trung bình là 0,73 + 0,23), và không có trường, hợp dương tính giã nào trong số 13 bệnh nhân tràn địch màng phổi do ung thư (giá 1 OD 450am trung bình là 0,24 + 0,1), đạt độ đặc hiệu 100% Trong số các trường,
hợp dương tính với ELISA, 75% có kết quả PCR dương tính (43)
Giá trị của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiễn phát hiệu kháng thể IgG đặc higu khiéag M tuberculosis trong chẩn đoáu lao phổi thể thâm nhiễm người lớn cũng được đánh giá OD 450 nrn trung bình của nhóm bệnh nhân lao so với bệnh nhân bị bệnh phổi khác không do lao là 0,863 + 0,395 so với 0,252 + 0,19 (P<0,001) Đạt độ nhạy và độ đặc hiệu là 81% và 95%, giá tả dự báo dương tính và âm tính là 96% và 79% Giá trị OD trung bình cũng tỷ lệ thuận với mức độ tổn thương của lao phổi trên phim XQ trong đó OD trung bình là 0,547 + 0,261 đối với tổ thương hẹp, 0,785 + 0,304 đối với tổn thương vừa và 0,976 + 0,435 đối với tổn thương rộng
®<0/01) (2)
Đối với lao màng não, ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiều cho độ nhạy 73%, độ đặc hiệu 100% (3)
1.6 Chuẩn hoá kỹ thuật ELISA sử dụng kháng nguyên 8# tuberculosis siêu nghiền trong chan đoán sàng lọc bệnh lao
16.1 Nông độ kháng nguyên tối ưu
Qua nhiều nghiên cứu nông độ kháng nguyên sử dụng trong ELISA phat hiện kháng, thể đặc hiệu của các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước, [0uig/ml được xác định là nồng độ kháng nguyên M tuberculosis sieu aghién 161 thiéu 161 ưu được xác định phù hợp cho phép phân biệt được bệnh phẩm âm tính và dương tính với điểm ngưỡng là giá tả OD trung bình người Việt nam khoẻ znạnh cộng trừ bai lân độ lệch chuẩn, tương đương với giá trị OD là 0,450 đo ở bước sóng 450 am (7, 43)
16.2 Độ pha loãng huyết thanh tối ru
Trang 29giới khác nhau nên có thể ảnh hưởng đến nồng độ ]gG kháng các kháng nguyên Mycabacteria ð huyết thanh cộng đồng Với điều kiện môi trường nhiệt đối và tỷ lệ mic lao cao như ở nước ta, việc đánh giá xác định nồng độ huyết thanh tối ưu trong thừ nghiệm miễn dịch gắn meu nhầm xác định lượng IgG đặc hiệu là điều cầu thiết để giảm trường hợp dương tính giả cũng như âm tính giả Qua nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ IgG kháng đặc hiệu kháng nguyêu lao ở cộng đồng người khoẻ xmạnh và bệnh nhân lao Việt œam, chúng tôi đã xác định được nồng độ pha loãng huyết thanh tối ưu đối với cộng đồng người lớn Việt oam là 1/400 Đối với trẻ em, nơng độ pha lỗng huyết thanh tối ưu là 1/200 Day là nồng độ cho phép phân biệt cơ thể nhiễm lao và người khoẻ mạnh (2, 4,7) Đối với một số cộng đồng châu Âu, nơng độ pha lỗng huyết thanh 1/100 thường được khuyến cáo sử dụng trong xét nghiệm kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyêu lao (39, 58-60)
16.3 Tính ẩn định của ELISA sử dụng kháng nguyên siêu nghiên
Trang 302 VATLIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nhóm cộng đông khoẻ mạnh
Nhóm cộng đồng khoẻ mạnh với tổng số 3.703 người, gồm:
-_ Bộ đội biên phòng: 1.458 người bao gồm 265 chiến sĩ thuộc các đơn vị đồng quân ở khu vực phía Bắc (Hải phòng), 433 chiến sĩ thuộc khu vực miễn Trung, (Nghệ An HA tinh) va 760 chiến sĩ thuộc khu vực phía Nam (Tây ninh: 238, Biên hồ và Đơng nai: 522)
- _ Bộ đội học viên tại các trường quân đội (Sơn tây, Vĩnh phúc): 1343
- _ Nhóm dân cư khòe mạnh bình thường sống tại vùng nơng thơn (Thanh hố): 141 -_ Nhóm dân cư, cán bộ, sinh viên sống/làm việc/học tập tại thành phố (Hà nội):
484
-_ Nhóm trẻ em dưới 10 tuổi đã được tiêm vacxin BCG (Hai phòng) : 277 3.1.2 Nhóm bệnh nhân lao
Bệnh nhân lao trong nghiên cứu này có 580 trường hợp, gồm:
- 357 bệnh nhân lao phổi tiến triển đã được chẩn đoán xác định, thu thập trong hai nam 2001 va 2002 tại Trung tâm lao Phạm Ngọc Thạch, thành phố Hỏ Chí Minh
- 223 bệnh nhân lao phổi mới được chấn đoán phát hiệu tại các trung tâm Tao cấp quận/huyệu thuộc Hà nội và Hà tây
2.2 Vật liệu nghiên cứu
-_ Huyết thanh: lấy khoảng 2ml mầu của đối tượng nghiên cứu, chất huyết thanh và bao quia & 20° C cho đến khi xét nghiệm
Trang 31để thực hiện phản ứng PCR tim M tuberculosis
Khdag aguyén siéu aghién cia vi khuda Mycobacteriwn tuberculosis Bộ it cita hang Lionex (Aah)
Cộng hợp kháng thể thò kháng IgM, IgG người có gắn men Pecoxydaza (Sanofi Diagnostic, Pasteuc, Pháp)
Tuberculia PPD tiêm trong da (Viga Vacxia Nha trang) Máy đọc ELISA có bước sóng 450m
Máy khuyếch đại nhiệt PCE
Trang 322.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chế kháng nguyên siêu nghiên từ M tuberculosis
= Ching vi khudn M.tubercWosis được nuôi cấy trong môi trường Sauton lòng auton, 1912) ( 2mM Mg,SO,, 10mM axit xitcic, 2,5mM K,HPO, , 30mM asparagine, 0,1 fecciamonium xitrat, 830mM glycerol, pH=7,4) tong 8 tuda 6 37°C với điều kiện lắc ở tốc độ 100 vòng/phút Thu hoạch vi khuẩn, bất hoạt ở 80°C trong vòng 20 phút; ly tâm lấy cậu vi khuẩn, rửa với dung dịch nước muối sinh lý hoặc
nước cất vô Irùng
- Nghiễn hỗn dịch vi khuẩn bằng siêu am 20 kHz (SME ultcasonicator) trong vòng, 10 phút Xác định nồng độ protein trong hỗn dịch vi khuẩn đã nghiển bằng siêu âm Bao quan ở dạng đông khô hoặc dung dich 8 20°C trong PBS
2.3.2 Quy trình thực hiện ELISA sit dung kháng nguyén M.tuberculosis siêu nghiền
1 Phả bản S6 giống với kháng nguyên M tuberculosis siêu nghiên: 50 wl kháng nguyên M tuberculosis siêu nghiền (10ug/Lml)/ giếng, ù ở 372C trong | giờ hoặc qua đêm có đậy nắp
2 Ú với huyết thanh: 30 uL huyết thanh đã pha loãng nồng độ tối ưu (từ 1:200 đến 1:400) trong PBS-Tweea-BSA 1% vào mỗi giếng, ù ở 37% trong giờ, từa bản 3 lầu với PBS-Tween 0,05%
3 Ủ với cộng hợp: 50 uL cộng hợp (Kháng thể dê kháng IgG hoặc IgM người gấu men peroxy dasa, hãng Sigma) pha loãng 1/5000 trong PBS-Tween-BSA 1% cho mỗi giếng, ù ö 37C trong lgiờ, cửa bản 3 lần với PBS-Tween 005%
4 Ủ với cơ chất: 100uLcơ chất TMB vào mỗi giếng, ù 372C trong 15 phút 5 Dừng phân ứng bằng H,SO, IN (100 uU giếng)
Trang 33ngưỡng được tính bằng giá tị OD trung bình của người Việt nam khoẻ mạnh + 2 lần độ lệch chuẩn, đã được tính ở các nghiên cứu trước là 0.45 (3) 2.3.3 Quy trình thực hiện BLISA sử dụng KIT của hãng Lionex (Anh):
Huyết thanh chuẩn đã đuọc pha loãng sấn: 10Oul/giếng (đối với IgM: chứng âm, chứng dương yếu và chứng dương; đối với các IgG, IgA: mẫu chuẩn từ
14)
Pha loãng bệnh phẩm bằng dung dịch pha loãng theo nồng độ tối ưu đã xác định tuỳ thuộc cộng đồng và nhỏ 100ul/giếng ; ù 372C X 45 phút
Rửa 4 lần bằng dung dịch đệm pha loãng L/I0 với nước cất Nhỏ cộng hợp đã pha sấu: 100ul/giếng; ù ở 37C X 30 phút Rửa như bước 4
Nhỏ 100ul cơ chất TMB pha sắn ; Ì trong bóng tối ở 372C X 10 phút Nhỏ 100ul /giếng dung dịch ngừng phẫu ứng và đo ở bước sóng 450m 2.3.4 Phương pháp tiêm trong da (Phần ting Mantoux):
245
Dùng syriage Lm, lấy đúng 0.1 yl dung dịch PPD (Viện Vacxia Nha trang) và tiêm trong da 6 vj tế 1/3 mặt trước cảng tay
Trang 34(29,4gr Na-citrat.2H2O/, lắc cho đồm loãng đều trong L5 phút, ly tâm lấy cặn Bước 2 Tách ADN của vị khuẩn lao trong bệnh phẩm (phương pháp Boom):
Phá tế bào bằng dung dịch ly giải tế bào chứa Guanidium thiocyauate (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 va 2.6 ml Triton
X 100) và Diatom (celite) 20%; tinh khiet va ich ADN bang Ethanol 70%, acetone ya dung dich TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, lmM EDTA)
Bước 3 Chạy phản ứng PCR: I0u ADN được cho vào ống phản ứng đã chứa sấn hỗn dich mix (NaCl 500 mM, Gelatin 0.1% (w/v), MgC2 25mM, đÑTP (hỗn hợp), môi PI8/INS2 (02uM) (P8: 5'-GTGCGGATGGTCGCAGAGAT-3; INS2: 5- GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3), Ampli Taq polymerasa ([U/50ul) va men khir ahiém Uracil-ADN-glycosylase (UNG) 1U/ul)
- Chương trình chay PCR: 10 phit ở 402C và 40 chu kỳ PCR gồm 1,5 phút ở 94°C (bất hoạt ADN), 2 phút ư 65°C ( gắn mơi) và 3 phút & 72°C
- Điện đi sản phẩm PCR tréa gel agarose 2% (2 gc agacose/100 ml dém TBE pH 8,3 với 0,89M Tủs, 0,89M axit boric và 0,02 EDTA) ở hiệu điện the 110 V, ddag dign 40 mA, từ 30 đến 45 phút Kết quả đuợc ghỉ nhận dương tính khi trên gel agacose xuất hiện vạch ADN có độ đài phân từ là 249 đôi bazø
a Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu thu thập được nhập bằng chương trình EPI-Data 3 và phân tích xử lý thống kê bằng phần mêm Stara 8.0
- _ So sánh hai giá trị tỷ lệ bằng Test X?;
- _ Tính tỷ xuất chênh (Odd matioa) OR bằng công thức sau:
a/b
OR=- ~, trong đó a: số trường hợp dương tính của nhóm phơi nhiễm
dd b: tổng số trường hợp dương tính của nhóm không phơi nhiễm
c: số trường hợp âm tính của nhóm phơi nhiễm
Trang 353 KET QUA NGHIEN CUU
3.1 Mic do khang thé dich thé khang dac hiéu M suberculosis trong huyét thanh các nhóm cộng đồng nghiên cứu
Kết quả xác định rnức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh kháng kháng nguyên Mituberculosis siêu nghiên trên tổng số 4.283 đối tượng thuộc các nhóm cộng đồng, khác nhau trong đó có nhóm bộ đội (2.801 người), nhóm dân cư người lớn sinh sống tại thành phố và nông thôn (625 người), nhóm trẻ em dưới 10 tuổi (277 em) và nhóm
bệnh nhân lao phổi mới (580 bệnh nhân) được phân tích và lần lượt nêu trong các bảng số liệu dưới đây Mức độ kháng thể dịch thể đặc hiệu của đối tượng được biểu điển thông qua giá trị mật độ quang học (OD) và kết quả đáp ứng dương tính khi so với giá trị ngưỡng Giá trị ngưỡng của hệ thống ELISA sử dụng kháng nguyên siêu aghiéa M tuberculosis phát higa IgG, IgM dac hiệu, đã được chúng tôi xác định từ những nghiên cứu trước (2,4-7), bằng giá tị OD trung bình của cộng đồng người khoẻ mạnh bình thường cộng với hai lần độ lệch chuẩn Giá trị này được xác định là 0,450
3.4.1 Mite 46 khang thé IgG va IgM huyét thanh dac hiéu cia nhém cong déng dân cư khoẻ mạnh bình thường
Trên tổng số 902 đối tượng cộng đồng dân cư người lớu với độ tuổi trung bình tương, đương (27 + 9,5 và 26 + 4,5) và trẻ em < 10 tuổi sinh sống tại thành phố (Hà nội, Hải phòng) và nông thôn (các huyện thuộc Thanh hoá), giá trị ƠD trong phản ứng ELISA và tỷ lệ có mức độ IgG, IgM huyết thanh đặc hiệu dương tính với kháng
nguyên uberculostb siêu nghiền được xác định, kết quả nêu trong Bằng 1
Trang 36người có IgG dac higu duvag tiah voi M tuberculosis đạt 4,9% Mức độ kháng thể IgG dac hiệu của 277 trẻ em < 10 tuổi sinh sống tại Hải phòng thấp hơn đáng kể 0,121 +0,18 (p<0,05) so với của cộng đồng người lớn Ngược lại, rnức độ IgM đặc hiệu của nhóm trẻ em cao hơn so với của người lớa với giá trị OD trung bình đạt 0,258 + 0,18 và tỷ lệ đối tượng có IgM đặc hiệu dương tính đạt 3,0%
Bang 1 Mức độ IạG và IạM huyết thanh kháng Mdubercdlosis siêu nghiên ở cộng đồng dân cư khoẻ mạnh - | GiátrịOD trung bình + ; Nhóm cộng đồng none rome TgG ae TeM aa} a ore binh IgG (4) Tâncưthành phố | 484 | 27z9,3 |0209+012|0205+012| 41 Tâancưnôngthôn | 141 |263⁄45 |0297+017 - 4" Tré em 2T <I0ÐD |0121+018|0258+018| 30**
Chú thích: ĐLC- độ lệch chuẩn, * TỶ lệ đáp ứng (+) với ]gGi- ** TỦ lệ đáp ng (+) với IeM
3.1.2 Mức độ kháng thể IgG và IyM huyết thanh đặc hiệu của nhóm bệ đội
Kết quả xác định mức độ IgG và IgM huyết thanh dic higu voi M tuberculosis chia 2801 bộ đội biên phòng và bộ đội học viên được nêu trong Bảng 2
Bang 2 Mite d6 IgG va IgM kháng Mauberculosis siêu nghiên ở cộng đồng bộ đội khoẻ mạnh (biên phòng và học viên các trường ) Số [| Tuổi | GátiODtrungbnh+ | Tỷ sông đảng | lượng | trung ĐLC đáp ứng
Nhom cong dong | in 2801 | bình TeG IgM IgG (4)
Trang 37Tuổi trung bình của nhóm bộ đội đao động từ 23,2 + 4.0 (bộ đội học viên) đếu 26,8 + 6,3 (bộ đội biên phòng) Giá trị OD xác định JgG đặc hiệu trung bình của hai nhóm dao dong tir 0,231 + 0,14 đến 0,287 + 0,L8 và tỷ lệ đáp ứng dương tính đạt 5,0% (bộ đội học viên) và 10,9 (bộ đội biên phòng) Trong tổng số 1.458 bộ đội biên phòng, có 265 bộ đội biêu phòng phía Bác (Hải phòng), 433 bộ đội biên phòng miễn Trung (Nghệ an-Hà tĩnh) và 760 bộ đội biên phòng đóng quân tại khu vực phía Nam (Tây ninh, Biên hoà) Độ tuổi trung bình của ba nhóm bộ đội biên phòng tương, đương nhau Kết quả thu được nêu trong Bảng 2 cho thấy rnức độ kháng thể IgG và IgM dac bigu Mruberculosis cla các nhóm bộ đội đóng quân ở ba khu vực đều tương đương nhau với giá td OD ]gG đặc hiệu dao động từ 0,254 + 0,157 đến 0,292 + 0,132 và giá tị OD đối với IgM dao động từ 0,166 + 0,099 đến 0269 + 0,123 Phỏ phân bố các giá trị OD đối với IgG va IgM khdng M tuberculosis các nhóm
bộ đội biên phòng khu vực khác nhau được biểu diễn trên Hình l-6 Bộ đội biên phòng khu vực phía Bắc ( Hải phòng)
Giá trị OD trung bình đối với IgG và IgM của 265 mẫu huyết thanh thu thập từ nhóm bộ đội Hải phòng là 0.292 + 0.132 và 0.190 + 0.105 Phổ dao động của hầu het các giá trị OD đối với IgG và IgM của nhóm này không lớn, phia lớn nầm dưới giá trị ngưỡng, đặc biệt tất tập trung đối với chỉ số IgM với độ lệch chuẩn trung bình
00450nn
Hint: Ph bí của bạ đi Hài phòng hù 2 Phán bốcia bị điHái phòng tea mi do dip ng IgG dae hu laa theo me dé dp tng Ig đặc liệu aa
Trang 38chỉ khoảng 0,105 (Bảng 1)
Bộ đội biên phòng khu vực miễn Trung (Nghệ an-Hà tĩnh)
Nhóm bộ đội Nghệ an Hà tĩnh có giá trị OD trung bình đối với IgG là 0,286 + 0,164 và đối với IgM là 0,269 + 0,123 So với phổ dao động của cả hai chi so IgG va IgM thu được từ bộ đội Hải phòng, nhóm bộ đội Nghệ an-Hà tĩnh có phổ dao động rộng, hơn với độ lệch chuẩn của giá trị IgG là 0,164 va cita gid tả IgM là 0,123 (Hình 3,4), tuy nhiên sự khác biệt chưa có ¥ nghĩa thống kê
13:10 bícial đ0i8glag1- H01 Hon: Pla bic itp 26 ‘tea ie 60 fg gS i ao ‘lee nie dip g MĐficlin Tai
HùiT: Phá bồcia bộ Bien Hoa hen sd dip ‘nk: Phan bi ca bi i Bin Hu theo ale ds sp
‘ag ig dae hu (ng ghi đạt Hội bọ
Trang 39Bộ đội biên phòng khu vục phía Nam ( Biên hoà, Tây ninh)
Nhóm bộ đội biên phòng đóng quân ö khu vực phía Nam (Biên hoà và Tây ninh) cũng có mức độ IgŒ (0.266 + 0.19) và IgM (0.166 + 0.L) đặc hiệu tương đương với bai nhóm bộ đội trêu (Bảng 2) Phổ dao động của các giá tả OD đối với IgG va IgM đều nhỏ, và không đáng kể đối với IgM (Hình 5,6)
3.13 Mức độ kháng thể IgG và IgM huyết thanh đặc hiệu với Mauberculosis siêu nghiên của bệnh nhân lao phổi mới
Giá trị OD trung bình xác định được khi đo phân ứng IgG và IgM huyết thanh kháng, kháng nguyên Mđ‡uberculasis của 580 bệnh nhân lao phổi mới là 0,491 + 0,36 và 0,360 + 0,24 Bệnh nhân lao được chia làm hai nhóm dựa trên kết quả soi kính tìm trực khuẩn kháng côn kháng axit (AFB): nhóm AFB Am tính (gồm 182 bệnh nhân) và nhóm AEB dương tính (398 bệnh nhân) Bệnh nhân AFB am tính có giá trị OD 1gG và IgM đặc hiệu trung bình là 0,451 + 0,320 và 295 + 0,209, khác biệt có ý nga thống kê so với giá tả tương ứng của nhóm AEB dương tính (0,531 + 0,408 và 0,426 + 0,282) (Bang 3)
Bang 3 Giá trị OD IạG, IạM đặc hiệu Mauberculosis siêu nghiền và tỷ lệ đáp ứng dương tính ở bệnh nhân lao phổi mới Nhóm bệnh nhân: Giá trị OD và tý lệ Œœ) Tỷ lệ)
n TgG IgM IgG + IgM
Bệnh nhân lao phổi AEB (+) | 398 | 0,531 £041 | 0,426+0,28 61% 548% 29,9% ‘Béah aban lao phdi AFB(-) | 182 | 0451+0,32 | 0295+0,21 50,5% 396% 170% Tổng số 580 | 0491 +0,36 | 0,360+0.24 | 58,75%
Trang 403.1.4 So sánh miức độ kháng thể IgG đặc hiệu của các nhóm cộng đồng nghiên cứu
Mức độ kháng thể IgŒ huyết thanh đặc hiệu kháng M.tuberculosis siêu nghiền của các nhóm cộng đồng khác nhau được biểu diễn thông qua giá trị OD trung bình và tỷ lệ % đáp ứng dương tính trong các Hình 7, 8 và 9
AFB+)
Hình 7 Giá tri OD trung bình và phổ dao động trong phần ứng xác định IgG huyết thanh đặc hiệu kháng M.tuberculosis của các cộng đông nghiên cứu (Chú tích: AFR{ +): bệnh nháa lao soi lính đềm dương tính: APiR-): bệnh nhán lao sai kính đồm
ám ính,BĐBP: bộ đội biên phàng BĐHW - bộ đội học viên, CĐTP: cộng đồng thành phá: CĐNT, công đẳng nồng thần)
Đề Số sánh giá trị OD trung bình
Giá tq OD trung bình trong phản ứng xác định ]gG huyết thanh đặc hiệu với Mituberculosis của nhóm bộ đội biên phòng cao hơu có ý ngtữa thống kê so với các nhóm cộng đồng khoẻ mạnh khác Bệnh nhân lao phổi mới có giá trị OD trung bình cao hơn có ý nghĩa thống kê so với giá trị này của nhóm các cộng đồng khoẺ rrạnh (<0,01) Trong nhóm bệnh nhân lao phổi mới, bệnh nhân AEB (+) có giá trị OD trung bình cao hơn có ý nghfa thống kê so với bệnh nhân AEB (-) Giá trị OD của