Tạo kháng thể IgG Thỏ đa dòng kháng kháng thể IgG Chó cộng hợp HRP.pdf

ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP TẠO KHÁNG THÈ IgG THỎ ĐA DỊNG KHÁNG KHÁNG THẺ IgG CHĨ CỘNG HỢP HRP : Trần Tuấn Anh Sinh viên thực :1411533195 GVHD : ThS Lê Thị Phương Thảo TP HCM, 2019 ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP TẠO KHÁNG THẺ IgG THỎ ĐA DÒNG KHÁNG KHÁNG THẺ IgG CHÓ CỘNG HỢP HRP Sinh viên thực : Trần Tuấn Anh Mà sổ sinh viên : 1411533195 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Phương Thảo TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TẤT THÀNH KHOA CÒNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HỊA XÀ HƠI CHÙ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Trần Tuấn Anh MSSV: 1411533195 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 14DSH02 Đầu đề luận văn: Tạo kháng thể IgG thỏ đa dịng kháng kháng thể IgG chó cộng họp HRP Mục tiêu: - Tạo thành công cột sắc ký lực bắt IgG thỏ kháng kháng thể IgG chó - Tinh chế kháng đa dịng thỏ kháng kháng the IgG chó có độ đặc hiệu độ tinh cao - Cộng họp thành công HRP lên IgG thỏ kháng kháng the IgG chó tinh Nội dung: - Tạo cột sắc ký lực bắt IgG thỏ kháng kháng thể IgG chó - Tinh chế kháng IgG thỏ kháng đặc hiệu kháng the IgG chó - Cộng họp HRP lên IgG thỏ kháng kháng thể IgG chó Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dần chính: ThS Lê Thị Phương Thảo Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng năm20 Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẢN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận giúp đỡ nhiều người Trong đặc biệt, xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ths Lê Thị Phương Thảo ln động viên, tận tình hướng dần, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, thực nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn tồn the thầy, giáo, anh chị bạn phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng phòng Ưng thư - Te bào gốc, Khoa Công nghệ Sinh học hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình nghiên cứu thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân bên cạnh ùng hộ tạo điều kiện tốt giúp đỡ tơi thực khóa luận thành công Trần Tuấn Anh Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU viii DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT ix ĐẶT VẤN ĐỀ xi CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng thể IgG .1 1.1.1 Cấu trúc chức IgG 1.1.2 ứng dụng rlgG kháng đặc hiệu dlgG 1.2 Một số kỳ thuật proteomics 1.2.1 Phương pháp tủa huyết muối AS 1.2.2 Phương pháp thẩm tích 1.2.3 Phương pháp sắc ký lực 1.2.4 Phương pháp sắc ký qua cột dlgG 1.2.5 Phương pháp cộng họp HRP 1.2.6 Phương pháp Dot Blot 1.2.7 Phương pháp SDS-PAGE 10 1.2.8 Phương pháp định lượng quang phố 10 1.3 Enzyme Horseradish peroxidase 11 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 13 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 ii 2.1 Nơi thực 15 2.2 Vật liệu 15 2.2.1 Nguyên vật liệu 15 2.2.2 Hóa chất 15 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp tủa huyết muối AS 20 2.4.2 Phương pháp thẩm tích 20 2.4.3 Phương pháp sắc ký lực qua cột protein G 21 2.4.4 Phương pháp tạo cột sắc ký lực dlgG 22 2.4.5 Phương pháp tinh chế rlgG đặc hiệu dlgG .24 2.4.6 Phương pháp cộng hợp HRP 25 2.4.7 Phương pháp kiếm tra đánh giá 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết tinh chế dlgG 30 3.1.1 Kết tủa huyết chó AS 60% 30 3.1.2 Sắc ký lực qua cột protein G 31 3.2 Ket tạo cột sắc ký lực dlgG 32 3.2.1 Kết cộng hợp dlgG lên gel 32 3.2.2 Kết nén cột dlgG 32 3.3 Kết tinh chế thu nhận rlgG kháng đặc hiệu dlgG 33 3.3.1 Ket sắc ký lực qua cột dlgG 33 3.3.2 Đánh giá hoạt tính rlgG đặc hiệu với dlgG sau tinh chế 34 3.4 Kết cộng hợp HRP 35 iii KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 41 IV TÓM TẤT Kháng thể đa dòng động vật sử dụng phố biến có giá trị cao nghiên cứu Y Sinh học Đe tài “Tạo tinh chế kháng thể IgG thỏ đa dịng kháng kháng thể IgG chó cộng họp HRP” thực từ tháng 2/2019 đến 8/2019 PTN Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng PTN Ung thư - tế bào gốc, Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành với mục tiêu tạo tinh chế thành công kháng thể đa dịng thỏ kháng kháng thể IgG chó cộng họp HRP Đe tài có ba nội dung: (1) Tạo cột sắc ký lực bắt IgG thỏ (rlgG) kháng kháng thể IgG chó (dlgG); (2) Tinh chế kháng thể rlgG đa dịng kháng kháng thể dlgG có độ đặc hiệu độ tinh cao; (3) Cộng họp HRP lên rlgG kháng dlgG tinh Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Tạo thành công cột sắc ký lực bắt rlgG kháng kháng the dlgG Tinh chế sắc ký lực qua cột bắt đặc hiệu thu nhận 19 mg kháng the rlgG kháng đặc hiệu kháng thể dlgG với độ tinh >93% Kháng rlgG kháng kháng the dlgG với độ đặc hiệu cao: kháng the rlgG nồng độ 3,90625 ng/ml phát lượng kháng nguyên dlgG 31,25 ng Dot Blot Kháng the rlgG kháng đặc hiệu dlgG cộng hợp thành công HRP giữ hoạt tính kháng the kiểm tra bang Dot Blot V SUMMARY Animal’s polyclonal antibodies are becoming popular and presenting high-values in Biomedical Research Topic "Production and purification of rabbit polyclonal IgG antibodies against dog IgG conjugated HRP" was implemented from February 2019 to August 2019 at the Biochemistry - Biomedical - Parasitology Lab and Cancer - Stem cells Lab., Derparment of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University The goals of this study are developing the process of creating and refining rabbit polyclonal IgG antibodies against dog IgG conjugated HRP The study has three contents: (1) Creating affinity chromatographic column for specific capture rabbit IgG (rlgG) against dog IgG antibodies (dlgG); (2) Purification of polyclonal rlgG anti-dlgG antibodies with high specificity and purity; (3) Developing a process of conjugating HRP into pure rlgG anti-dlgG The results achieved after months of research: Successful in creating affinity chromatographic column captures rlgG antidlgG antibodies Purification using affinity chromatography through dlgG column obtained about 19 mg of rlgG anti-dlgG antibodies with purity >93% rlgG anti-dlgG antibodies with high specificity: rlgG antibody at a concentration of 3.90625 ng/ml detected 31.25 ng dlgG by Dot Blotting Successful in conjugating rlgG anti-dlgG antibodies and HRP, rlgG anti-dlgG conjugated HRP remain the antibody-activated after combining vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc Immunoglobunin G Hình 1.2 Ái lực kháng the từ loài khác với protein G protein A đo xét nghiệm ELISA cạnh tranh Hình 1.3 Cấu trúc enzyme Horseradish peroxidase 11 Hình 1.4 Một số chất tạo màu HRP biến 12 Hình 1.5 Liên kết protein với HRP 13 Hình 2.1 Tong quan quy trình thí nghiệm 19 Hình 3.1 Ket điện di gel polyacrylamide sau tủa AS 60% 30 Hình 3.2 Ket sắc ký qua cột protein G thu nhận dlgGtong so 31 Hình 3.3 Kết chạy acetone 1% kiếm tra cột dlgG 33 Hình 3.4 Sắc ký lực qua cột dlgG tinh chế rlgG đặchiệu với dlgG 34 Hình 3.5 Ket đánh giá hoạt tính rlgG sau tinh chế 35 Hình 3.6 Ket kiểm tra hiệu cộng họp HRP bangDot Blot 36 vii ... Tạo kháng thể IgG thỏ đa dịng kháng kháng thể IgG chó cộng họp HRP Mục tiêu: - Tạo thành công cột sắc ký lực bắt IgG thỏ kháng kháng thể IgG chó - Tinh chế kháng đa dòng thỏ kháng kháng the IgG. .. chó có độ đặc hiệu độ tinh cao - Cộng họp thành công HRP lên IgG thỏ kháng kháng the IgG chó tinh Nội dung: - Tạo cột sắc ký lực bắt IgG thỏ kháng kháng thể IgG chó - Tinh chế kháng IgG thỏ kháng. .. với mục tiêu tạo tinh chế thành cơng kháng thể đa dịng thỏ kháng kháng thể IgG chó cộng họp HRP Đe tài có ba nội dung: (1) Tạo cột sắc ký lực bắt IgG thỏ (rlgG) kháng kháng thể IgG chó (dlgG);