Tinh chế IgG Chuột kháng đặc hiệu IgG người và cộng hợp HRP.pdf

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018-2019 Tên đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng IgG thỏ đặc hiệu kháng IgG người” sổ hợp đồng:/HĐ-KHCN Chù nhiệm đề tài: Thái Thị Tuyết Trinh Đơn vị công tác: Đại học Nguyền Tất Thành Thời gian thực hiện: 12 tháng, từ 06/2018 đến 05/2019 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 10 tháng 05 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2017-2018 Tên đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng thể IgG thỏ đặc hiệu kháng thể IgG người” Sổ hợp đồng: HĐ-KHCN Chú nhiệm đề tài: Thái Thị Tuyết Trinh Đơn vị công tác: Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 12 tháng, từ 06/2017 đến 05/2018 Các thành viên phối họp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác TS Nguyển Hữu Hùng ThS Lê Thị Phương Thảo Lê Nhật Hòa Miển dịch Sinh lý động vật ĐH Nguyển Tất Thành ĐH Nguyễn Tất Thành Công nghệ sinh học ĐH Nguyễn Tất Thành ii Ký tên MỤC LỤC MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỪ VIẾT TẤT V DANH SÁCH CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1.1 Khái quát chung ve IgG 1.2 Úng dụng cùa kháng the đa dòng 1.3 Sắc ký lực cột protein G 1.3.1 Sắc ký lực 1.3.2 Protein G 1.4 Nghiên cứu nước ngồi nước kháng thể đa dịng 1.4.1 Nghiên cứu nước 1.4.2 Nghiên cứu nước CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 10 2.1 Vật liệu 10 2.1.1 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 10 2.1.2 Hóa chất .10 2.1.3 Trang thiết bị 12 2.2 Nội dung phương pháp 14 2.2.1 Tạo kháng thể thò kháng kháng thể người 14 2.2.1.1 Phương pháp gây đáp ứng miền dịch thò 14 2.2.1.2 Phương pháp thu nhận máu tách huyết thở 16 2.2.1.3 Phương pháp khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) 16 2.2.2 Tinh chế IgG thỏ kháng IgG người 17 2.2.2.1 Phương pháp tùa huyết nồng độ Ammonium Sulphate [(NH4)2SO-i] 45% 17 2.2.2.2 Phương pháp thẩm tích 18 2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lực qua cột Protein G cột IgG người 19 2.2.3 Kiểm tra đánh giá chất lượng IgG thỏ kháng IgG người sau tinh chế 20 2.2.3.1 Phương pháp điện di biến tính (SDS-PAGE) 20 2.2.3.2 Phương pháp Dot Blot 22 2.2.3.3 Phương pháp đo mật độ quang OD280 22 CHƯƠNG KÉT ỌƯẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Tinh chế IgG người 24 iii 3.2 Ket quâ gây đáp ứng miền dịch thỏ với IgG người 25 3.2.1 Kiểm tra thỏ trước tiêm mẫn cảm 25 3.2.2 Đánh giá chất lượng kháng the thỏ 26 3.2.2.1 Kiềm tra đáp ứng miễn dịch 26 3.2.2.2 Hiệu giá kháng thể 27 3.3 3.4 3.5 Tinh ché IgG thỏ kháng IgG người 28 Tinh chê IgG thỏ đặc hiệu IgG người 29 Kiểm tra hoạt tính cùa IgG thỏ kháng IgG người đặc hiệu phương pháp Dot Blot 29 KỂT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC CỒNG TRÌNH ĐÀ CƠNG Bố 34 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS: Ammonium sulphate APC: Te bào trình diện kháng nguyên (Antigen presenting cell) Ch: Domain co định chuồi nặng (Constant domain of heavy chain) Cl: Domain co định chuồi nhẹ (Constant domain of light chain) cs: Cộng dH2O: Nuớc cat DTT: Dithiothreitol DUMD: Đáp ứng miễn dịch ELISA:: Kỳ thuật chất thụ hấp miễn dịch gắn enzyme (Enzym - Linkimmunosorbent Asay) Fab: Phân mảnh gắn kháng nguyên (Fragment antigen binding) Fc : Phân mảnh kết tinh (Fragment crystallisable) FCA: Tá chất hoàn chỉnh (Fruend’s Complete Adjuvant) FIA: Tá chất khơng hồn chỉnh (Fruend’s Incomplete Adjuvant) NCV: Nghiên cứu viên MWCO: Molecular weight cut - off HRP: Horseradish peroxidase ICC/IF: Hóa tế bào dịch/Miền miền dịch huỳnh (Immunocytochemistry/Immunlouranscene) IgG: Immunoglobulin G IHC: Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể Mer: p - B-Mercaptoethanol ethanol PBS: Phosphate buffered saline PVDF: Polyvinylidene difluoride SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS: Sodium Dodecyl Sulphate TBST: Tris - buffered saline (TBS) + Tween 20 TC: Tăng cuờng V quang TEMED: N, N, N’, N’ - Tetramethylendiamine TMB: 3, 3’, 5, 5' - Tetramethylbenzidine VH: Domain biến thiên chuồi nặng (Variable domain of heavy chain) Vl: Domain biến thiên chuồi nhẹ (Variable domain of light chain) vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân từ kháng thể IgG Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình tinh chế kháng thể thỏ kháng đặc hiệu the nguời Hình 3.1 Kết tinh chế IgG người Hình 3.2 Kiểm tra đáp ứng thỏ với IgG người trước gây mẫn cảm Hình 3.3 Đáp ứng cùa kháng nguyên (IgG người) với huyết sau mẫn cảm Hình 3.4 Ket quan sát hiệu giá kháng thể qua lần tăng cường Hình 3.5 Ket sắc ký lực qua cột protein G tinh chế IgG người Hình 3.6 Sắc ký đồ qua cột sắc ký lực IgG người Hình 3.7 Ket kiếm tra hoạt tính IgG thỏ đặc hiệu IgG người vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ái lực protein G protein A IgG Bảng 2.1 Thành phần điện di Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài Bảng 2.3 Phác đồ tiêm thỏ Bảng 3.1 Ket thu hoi protein sau qua cột protein viii TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh IgG người tinh chể: độ ~95%, 10 mg IgG thở tinh chế: độ ~95%, 70 mg IgG thở đặc hiệu IgG người, 4mg Bài báo đăng Kỷ yều KHCN Trường ĐH NTT số sv thực hiện, đủ liệu cho sv báo cáo Khoá luận tốt nghiệp IgG người tinh chế: độ ~95%, - 5mg IgG thỏ tinh chế: độ ~95%, - 5mg IgG thỏ đặc hiệu IgG người, Img Bài báo đăng Kỷ yểu KHCN Trường ĐHNTT Đào tạo Đại học Thời gian đăng ký: từ 06/2018 đến 05/2019 Thời gian nộp báo cáo: ngày 10/05 /2019 MỞ ĐÀU Trong lĩnh vực nghiên cứu miền dịch học chấn đoán huyết học kháng thể nguồn nguyên liệu thiếu, nhờ vào khả liên kết với kháng nguyên ngưng kết tế bào vi khuẩn ngăn ngừa bám dính độc tố vi khuẩn lên thụ thể tế bào Chúng sử dụng chủ yếu phương pháp nghiên cứu phát vi sinh vật chấn đoán bệnh ELISA, Western Blot, miễn dịch huỳnh quang Hiện nay, nguồn kháng thể ý nhiều kháng thể đặc hiệu huyết động vật Việc tạo tinh chế kháng động vật đặc hiệu mang lại nhiều lợi ích, khơng mang lại lợi nhuận mà cịn giúp ích q trình kiểm tra phát bệnh người động vật Việc tạo tinh chế kháng the huyết động vật điều mong muốn nước có Việt Nam Kháng the lưu trữ thời gian lâu nhiệt độ < o°c đảm bảo cho thí nghiệm nghiên cứu nguồn nguyên liệu Tuy nhiên, kháng the phải nhập nguồn từ nước ngồi với giá thành cao, vận chuyển khó khăn dẫn đến nguồn nguyên liệu bị hạn chế nguyên nhân gây ảnh hưởng đến trình nghiên cứu chấn đoán ... trúc phân từ kháng thể IgG Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình tinh chế kháng thể thỏ kháng đặc hiệu the nguời Hình 3.1 Kết tinh chế IgG người Hình 3.2 Kiểm tra đáp ứng thỏ với IgG người trước gây... thực hiện, đủ liệu cho sv báo cáo Khoá luận tốt nghiệp IgG người tinh chế: độ ~95%, - 5mg IgG thỏ tinh chế: độ ~95%, - 5mg IgG thỏ đặc hiệu IgG người, Img Bài báo đăng Kỷ yểu KHCN Trường ĐHNTT Đào... cứu Sản phẩm thực đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh IgG người tinh chể: độ ~95%, 10 mg IgG thở tinh chế: độ ~95%, 70 mg IgG thở đặc hiệu IgG người, 4mg Bài báo đăng Kỷ yều KHCN Trường ĐH NTT số