Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (mrsa) từ cao chiết sâm đại hành (eleutherine subaphylla gagnep ) nghiên cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) TỪ CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.) Bình Dương, tháng 03 năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) TỪ CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.) Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Xuân Sanh Khoa: Công nghệ sinh học Các thành viên: Nguyễn Đoàn Thanh Liêm Lƣơng Thị Cẩm Vân Nguyễn Châu Khoa Nguyễn Thị Trúc Ly Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Dƣơng Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Bình Dương, tháng 03 năm 2019 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ ii DANH MỤC HÌNH ẢNH ii DANH MỤC VIẾT TẮT ii ĐẶT VẤN ĐỀ iv PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) 1.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) 1.1.2 Tình hình MRSA kháng kháng sinh giới Việt Nam 1.2 Sơ lƣợc sâm đại hành ( Eleutherine subaphylla Gagn/ .10 1.2.1 Phân loại khoa học 10 1.2.2 Đặc điểm hình thái 11 1.2.3 Phân bố, thu hái chế biến 12 1.2.4 Thành phần hóa học 12 1.2.5 Tác dụng dƣợc lý 15 1.2.6 Công dụng 15 1.2.7 Tình hình nghiên cứu giới nƣớc 16 1.3 Khái quát phƣơng pháp chiết cao dƣợc liệu .18 1.3.1 Khái niệm 18 1.3.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 19 1.3.3 Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng 19 1.3.4 Cô đặc sấy khô .20 1.3.5 Phƣơng pháp sắc ký cột 21 1.3.6 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất .22 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Sơ đồ bố trí thí 24 2.2 Vật liệu nghiên 24 2.3 Khảo sát ảnh hƣởng dung môi chiết đến khối lƣợng cao chiết 24 2.4 Xác định giới hạn nhiễm khuẩn cao ch .26 2.5 Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) loại cao chiết 27 2.5.1 Phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch 27 2.5.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) 28 2.6 Khảo sát cao chiết phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 28 2.7 Phƣơng pháp sắc ký cột 29 2.8 Phƣơng pháp xác định cấu trúc 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết giám định tên khoa học 32 3.2 Khảo sát ảnh hƣởng dung môi chiết đến khối lƣợng cao chiết 32 3.3 Kết thử giới hạn nhiễm khuẩn cao chiết .35 3.4 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA loại cao chiết 35 3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với vi khuẩn MRSA 37 3.6 Khảo sát cao chiết phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 41 3.7 Phân lập hợp chất từ cao n-hexane củ sâm đại hành 43 3.8 Xác định cấu trúc hợp chất 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4.1 KẾT LUẬN .47 4.2 ĐỀ NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 51 DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 3.1 Khối lƣợng hiệu suất thu hồi dung môi 32 Bảng 3.2 Kết số lƣợng nấm vi khuẩn sống có cao chiết 35 Bảng 3.3 Kết thử khả kháng MRSA cao chiết từ sâm đại hành 36 Bảng 3.4 Kết khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC vi khuẩn MRSA từ cao chiết sâm đại hành 38 Bảng 3.5 Kết sắc ký lớp mỏng (TLC) 42 Bảng 3.6 Giá trị Rf (cm) tỉ lệ dung môi khảo sát (chloroform : methanol) 43 Biểu đồ 3.1 Ảnh hƣởng dung môi đến khối lƣợng cao chiết 33 Biểu đồ 3.2 So sánh kết kháng MRSA loại cao chiết từ củ sâm đại hành 37 i DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình vi thể MRSA Hình 1.2 Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) .11 Hình 1.3 Cơng thức hóa học eleutherin isoeleutherin 12 Hình 1.4 Cơng thức hóa học eleutherol anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester 13 Hình 1.5 Cơng thức hóa học mangiferin isomangiferin 13 Hình 1.6 Cơng thức hóa học eleutherinone 13 Hình 1.7 Cơng thức hóa học (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-Dglucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin hongconin 14 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24 Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao sâm đại hành .26 Hình 3.1 Thu cao n-hexane phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 34 Hình 3.2 Thiết bị máy cô quay thu cao .34 Hình 3.3 Cao n-hexane thu nhận đƣợc sau chiết lỏng – lỏng .34 Hình 3.4 Kết thử hoạt tính kháng MRSA loại cao chiết từ củ sâm đại hành 36 Hình 3.5 MIC kháng MRSA cao nƣớc nồng độ 1/32 1/64 40 Hình 3.6 MIC kháng MRSA cao ethyl acetate nồng độ 1/32 1/64 .40 Hình 3.7 MIC kháng MRSA cao n-hexane nồng độ 1/32 1/64 41 Hình 3.8 Kết cao chiết phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) theo tỉ lệ khác 41 Hình 3.9 Cao n-hexane đƣợc trộn với silica gel để chuẩn bị cho trình chạy cột 44 Hình 3.10 Ổn định silica gel cột sắc ký 44 Hình 3.11 Cột sắc ký thu phân đoạn 44 Hình 3.12 Cột sắc ký thu phân đoạn 44 Hình 3.13 Khảo sát khả kháng MRSA ES-H1 ES-H2 45 ii DANH MỤC VIẾT TẮT Acinetobacter baumannii: A.baumannii Aeromonas hydrophila: A hydrophila Bacillus cereus: B cereus Cộng sự: cs Dimethyl sulfoxide: DMSO Escherichia coli: E coli ES-H1: Cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H2: Cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H3: Cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H4: Cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H5: Cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn Klebsiella pneumoniae: K pneumoniae Minimum Inhibitory Concentration: MIC Mueller Hinton Agar: MHA Nutrient Agar: NA Pseudomonas aeruginosa: P aeruginosa Sắc ký lớp mỏng (TLC): SKLM Staphylococcus aureus kháng methicillin: MRSA Staphylococcus aureus nhạy methicillin: MSSA Staphylococcus aureus: S aureus Streptococcus faecalis: S faecalis iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Phân lập tinh chế hoạt chất kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Xuân Sanh - Lớp: DH15YD51 Khoa: Công nghệ sinh học - Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Dƣơng Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Mục tiêu đề tài: Năm thứ: Số năm đào tạo: - Khảo sát khả kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành - Phân lập tinh chế hoạt chất kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành Tính sáng tạo: Hiện giới có nhiều cơng trình nghiên cứu khả kháng khuẩn sâm đại hành, nhƣng Việt Nam hƣớng nghiên cứu vi khuẩn kháng thuốc chƣa đƣợc quan tâm nhiều Đặc biệt khả kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành chƣa đƣợc nghiên cứu MRSA vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện gây nhiễm trùng cộng đồng nguy hiểm Đây hƣớng nghiên cứu hợp chất dƣợc liệu có khả kháng số loại vi khuẩn kháng thuốc Trong phƣơng pháp chiết cao nhóm đổi quy trình chiết để có đƣợc hiệu suất thu hồi cao tối ƣu Ngoài phƣơng pháp chiết truyền thống ngâm dầm nhóm kết hợp phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng để thu đƣợc loại cao với dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao từ thu đƣợc hợp chất cao củ sâm đại hành cách tối ƣu Kết nghiên cứu:  Chiết xuất cao dƣợc liệu từ sâm đại hành dung môi khác thu đƣợc khối lƣợng cao chiết tăng dần từ ethyl acetate, n-hexane cao dung mơi nƣớc (6,62 g)  Trong cao chiết n-hexane cho kết vòng kháng cao (28,00 (25,67 0,86a mm) 0,86a mm) cao ethyl acetate Còn cao chiết nƣớc cho kết vịng kháng (20,33 0,86b mm) Các thí nghiệm đƣợc lập lại ba lần Kết thu đƣợc cho thấy cao n-hexane có hợp chất kháng khuẩn mạnh với MRSA  Kết MIC cho thấy cao chiết loại dung mơi n-hexane, ethyl acetate nƣớc có khả kháng MRSA nồng độ tối thiểu nhƣ (31,25 µg/ mL)  Khảo sát tỉ lệ dung môi nhận thấy đƣợc hệ dung môi chloroform : methanol có tỉ lệ 85 : 15 cho vệt rõ ràng Dựa vào khoảng cách Rf hai chất dung môi n-hexane (0,375 cm) cho thấy hệ dung môi 85 : 15 tốt so với hệ dung môi hai tỉ lệ lại 0,325 cm (90 : 10) 0,25 (95: 5)  Phân lập hợp chất từ cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H1 thu đƣợc 21 g chất Phân lập hợp chất từ cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H1 thu đƣợc 21 g chất Vòng kháng MRSA phân đoạn cao phân đoạn (ES-H1 21 mm ES_H2 27 mm) Các phân đoạn cịn lại nhóm tiếp tục thu Do thời gian làm nghiên cứu có hạn nên nhóm hoàn thành đến kết báo cáo Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: Kết đề tài tạo tiền đề cho công trình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ dƣợc liệu sâm đại hành kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh cho ngƣời, kháng khuẩn kháng thuốc, động vật thủy sản Từ kết nghiên cứu khả kháng kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành mở hƣớng dƣợc liệu có khả kháng số loại vi khuẩn kháng thuốc Các hợp chất sâm đại hành bào chế thành thuốc kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm khuẩn ngƣời, diệt giun sán, chữa bệnh kinh nguyệt, làm thuốc chống sinh sản nhanh đẻ non Ngoài ra, nghiên cứu giới cho thấy sâm đại hành có khả điều trị ung thƣ Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày 25 tháng 03 năm 2019 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Xuân Sanh Nhận xét ngƣời hƣớng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài (phần người hướng dẫn ghi): Xác nhận đơn vị (ký tên đóng dấu) Ngƣời hƣớng dẫn (ký, họ tên) Ngày 25 tháng 03 năm 2019 Ngƣời hƣớng dẫn (ký, họ tên) ThS Dƣơng Nhật Linh TS Nguyễn Tấn Phát Đƣờng kính (mm) Kết kháng khuẩn MRSA cao chiết sâm đại hành 35 30 25 n-hexane 20 Ethyl acetate Nước 15 10 Lần Lần Lần Lần lặp lại Biểu đồ 3.2 So sánh kết kháng MRSA loại cao chiết từ củ sâm đại hành Từ bảng 3.4 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa đƣờng kính kháng MRSA cao chiết dung môi khác Trong cao chiết n-hexane cho kết vòng kháng cao (28,00 0,86a mm) cao ethyl acetate (25,67 mm) Còn cao chiết nƣớc cho kết vòng kháng thấp (20,33 0,86a 0,86b mm) Các thí nghiệm đƣợc lập lại ba lần Kết thu đƣợc cho thấy cao n-hexane có hợp chất kháng khuẩn mạnh với MRSA Theo kết nghiên cứu Harlita cs (2018) củ sâm đại hành, kết từ thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn n-hexane, ethyl acetate, chiết xuất ethanol 96% có hoạt tính ức chế phát triển MRSA Hoạt tính kháng khuẩn sâm đại hành chiết với loại dung môi khác cho thấy hoạt tính sinh học cao khác (Harlita cs, 2018) 3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với vi khuẩn MRSA Mẫu cao chiết từ củ sâm đại hành đƣợc chiết lỏng – lỏng dung mơi khác nhau, chúng tơi tiến hành hịa tan mẫu cao chiết DMSO % nồng độ 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64 Từ dung dịch gốc cao chiết thử nghiệm đƣợc pha loãng với nƣớc cất 37 vô trùng thành dãy nồng độ liên tiếp (nồng độ sau ½ nồng độ trƣớc) Tác động kháng vi sinh vật đƣợc xác định dựa vào nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật chất thử (MIC) kết đƣợc trình bày bảng Bảng 3.4 Kết khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC vi khuẩn MRSA từ cao chiết sâm đại hành Chủng vi khuẩn MRSA Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (µg/ mL) Nƣớc n-hexane Ethyl acetate 500 - - - 250 - - - 125 - - - 62,5 - - - 31,25 - - - 15,63 + + + Ghi chú: (+): Vi khuẩn MRSA mọc đƣợc đĩa (-): Vi khuẩn MRSA không mọc đƣợc đĩa Cao chiết dung môi nƣớc tác động kháng chủng vi khuẩn MRSA nồng độ tối thiểu MIC = 31,25 µg/ mL Cao chiết dung môi ethyl acetate, tác động kháng chủng vi khuẩn MRSA nồng độ tối thiểu MIC = 31,25 µg/ mL Cao chiết dung mơi n-hexane, tác động kháng chủng vi khuẩn MRSA nồng độ tối thiểu MIC = 31,25 µg/ mL Từ kết cho thấy cao chiết loại dung môi n-hexane, ethyl acetate nƣớc cho kết MIC tốt vi khuẩn MRSA nồng độ tối thiểu nhƣ (MIC = 31,25 µg/ mL) Theo Harlita cs (2018) nghiên cứu củ sâm đại hành, nồng độ cao chiết cao khả ức chế vi khuẩn MRSA mạnh Kết cho thấy nồng độ 38 tối thiểu cao chiết sâm đại hành kháng tất vi khuẩn đƣợc thử nghiệm mg / mL MIC (2 mg / mL) cao n-hexane, ethyl acetate ethanol 96% chống lại MRSA, B Cereus, Shigella spp Và P Aeruginosa So với kết MIC (MIC = 256-512 µg/ml) Huỳnh Kim Diệu (2011) cho giá trị MIC với vi khuẩn MRSA cao chiết sâm đại hành tốt (MIC = 31,25 µg/ml) Theo Đỗ Tất Lợi (2003), cho sâm đại hành có tác dụng ức chế rõ rệt in vitro phế cầu khuẩn, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng, khơng có tác động E coli Hiện nay, chủng vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh mạnh nhƣ Staphylococcus aureus đề kháng cao với penicillin (89,4%), tetracyclin (82,4%), trimethoprimsulfamethazin (80,65%), chloramphenicol (64,8%), erythromycin (38,4%) methicillin (35,9%), ampicillin, Co-trimoxazol, erythromycin, lincomycin (50-80%) Streptococcus faecalis kháng gentamicin (7%), streptomycin (20%), gentamicin + streptomycin (22%), kháng vancomycin (4%); Streptococcus faecalis kháng aztreonam, cephalosporins, clindamycin, nafcillin, oxacillin, trimethoprim-sulfamethoxazol Pseudomonas aeruginosa kháng tất cephalosporin (ngay ceftazidim cịn nhạy 50%), kháng mạnh với nhóm aminoglycosid (65-70%) Nhóm vi khuẩn gây bệnh cá kháng nhiều kháng sinh mạnh nhƣ ampicillin (100%), oxacillin (100%), bacitracin (100%), streptomycin (26%), clindamycin (43%), nalidixic acid (26%), novobiocin (87%), rifampicin (4%), vancomycin (9%)…(Orozoval et al., 2008) Colistin (>90%), streptomycin (83%), oxytetracycline (81%), trimethoprim (73%) (Bùi Thị Tho, 2003; Tu Thanh Dung et al., 2008) Qua kết MIC, cho thấy sâm đại hành có tính kháng khuẩn cao nồng độ thấp từ sử dụng sâm đại hành để thay kháng sinh trị bệnh cho ngƣời, gia súc động vật thủy sản tƣơng lại 39 1/32 1/64 Hình 3.5 MIC kháng MRSA cao nƣớc nồng độ 1/32 1/64 1/32 1/64 Hình 3.6 MIC kháng MRSA cao ethyl acetate nồng độ 1/32 1/64 40 1/32 1/64 Hình 3.7 MIC kháng MRSA cao n-hexane nồng độ 1/32 1/64 3.6 Khảo sát cao chiết phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 85:15 90:10 3 95:5 Ghi chú: Cao n-hexane; Cao ethyl acetate; Cao nƣớc Hình 3.8 Kết cao chiết phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) theo tỉ lệ khác Nếu ta sử dụng hệ dung mơi sắc ký khác hợp chất có cao phân đoạn sâm đại hành thể sắc kí lớp mỏng khác Trong thí nghiệm sử dụng hệ dung môi chloroform : methanol 41 Bảng 3.5 Kết SKLM (TLC) Dung mơi (chlorofrom : Theo tỉ lệ Số vết Hình dạng vết 85 : 15 90 : 10 95 : 85 : 15 90 : 10 95 : 85 : 15 90 : 10 Kéo dài 95 : Kéo dài, màu nâu methanol) Cao n-hexane Cao ethyl acetate Cao nƣớc Kéo dài, có màu nâu, bị tách đoạn Kéo dài, có tâm nâu đoạn Kéo dài, màu nâu Kéo dài, có màu nâu, bị tách đoạn Kéo dài, có tâm nâu đoạn Kéo dài, màu nâu Kéo dài, có màu nâu, bị tách đoạn 42 Bảng 3.6 Giá trị Rf (cm) tỉ lệ dung môi khảo sát (chloroform : methanol) Giá trị Rf (cm) Tỉ lệ hệ dung n-hexane môi Ethyl Nƣớc Rf1 Rf2 acetate 85 : 15 0,375 0,75 0,938 0,938 90 : 10 0,4 0,725 0,875 0,875 95 : 05 0,563 0,813 8,13 0,913 Theo kết khảo sát tỉ lệ dung môi nhận thấy đƣợc hệ dung mơi chloroform : methanol có tỉ lệ 85 : 15 cho vệt rõ ràng Dựa vào khoảng cách Rf hai chất dung môi nhexane (0,375 cm) cho thấy hệ dung môi 85 : 15 tốt so với hệ dung môi hai tỉ lệ lại 0,325 cm (90 : 10) 0,25 (95: 5) Do dịch chiết sâm đại hành tƣơi lẫn nhiều nƣớc, khó xử lý q trình thí nghiệm 3.7 Phân lập hợp chất từ cao n-hexane củ sâm đại hành Từ cao n-hexane (80 g) đem chạy sắc ký cột với hệ dung môi theo tỉ lệ lần lƣợt n-hexane : ethyl acetate (100 : %), n-hexane : ethyl acetate (75 : 25 %), n-hexane : ethyl acetate (50 : 50 %), n-hexane : ethyl acetate (25 : 75 %) n-hexane : ethyl acetate (0 : 100 %) Sau thu đƣợc phân đoạn, hệ dung môi đƣợc sử dụng để chạy cột tƣơng ứng với phân đoạn: ES-H1, ES-H2, ES-H3, ES-H4, ES-H5 Phân đoạn ES-H1 chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate (100 : %) thu đƣợc 21 g chất Qua khảo sát kháng MRSA thấy đƣợc vòng kháng MRSA phân đoạn cao phân đoạn (ES-H1 21 mm ES_H2 27 mm) Và nhóm tiếp tục chạy cột để thu phân đoạn lại Dự kiến khoảng tuần nhóm thu xong phân đoạn cịn lại 43 Hình 3.9 Cao n-hexane đƣợc trộn với silica gel để chuẩn bị cho trình chạy cột Hình 3.11 Cột sắc ký thu phân đoạn Hình 3.10 Ổn định silica gel cột sắc ký Hình 3.12 Cột sắc ký thu phân đoạn 44 DMSO ES-H1 ES-H2 Hình 3.13 Khảo sát khả kháng MRSA ES-H1 ES-H2 3.8 Xác định cấu trúc hợp chất Hiện nhóm thực 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài chúng tơi hồn thành mục tiêu khảo sát khả kháng S aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành thu đƣợc kết nhƣ sau:  Chiết xuất cao dƣợc liệu từ củ sâm đại hành dung môi khác thu đƣợc trọng lƣợng cao chiết tăng dần từ ethyl acetate, n-hexane cao dung mơi nƣớc (6,62 g)  Trong cao chiết n-hexane cho kết vòng kháng cao (28,00 mm) (25,67 0,86a 0,86a mm) cao ethyl acetate Còn cao chiết nƣớc cho kết vòng kháng (20,33 0,86b mm) Các thí nghiệm đƣợc lập lại nhiều lần Kết thu đƣợc cho thấy cao n-hexane có hợp chất kháng khuẩn mạnh với MRSA  Kết MIC cho thấy cao chiết loại dung môi n-hexane, ethyl acetate nƣớc cho kết MIC vi khuẩn MRSA nồng độ tối thiểu nhƣ (31,25 µg/ mL)  Khảo sát tỉ lệ dung môi nhận thấy đƣợc hệ dung môi chloroform : methanol có tỉ lệ 85 : 15 cho vệt rõ ràng Dựa vào khoảng cách Rf hai chất dung môi nhexane (0,375 cm) cho thấy hệ dung môi 85 : 15 tốt so với hệ dung mơi hai tỉ lệ cịn lại 0,325 cm (90 : 10) 0,25 (95: 5)  Phân lập hợp chất từ cao n-hexane sâm đại hành phân đoạn ES-H1 thu đƣợc 21 g chất Vòng kháng MRSA phân đoạn cao phân đoạn (ES-H1 21 mm ES_H2 27 mm) Các phân đoạn cịn lại nhóm tiếp tục thu Dự kiến khoảng tuần nhóm thu xong phân đoạn lại Qua trình thực đề tài, chúng tơi nhận thấy cao chiết từ củ sâm đại hành đƣợc chiết dung mơi nƣớc có tiềm lớn việc sử dụng để nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh ngƣời chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Do nƣớc dung mơi khơng khan khơng có giá trị kinh tế cao nên thích hợp để sử dụng việc nghiên cứu sản xuất với quy mô công nghiệp 47 4.2 ĐỀ NGHỊ Kết đề tài tạo tiền đề cho cơng trình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ dƣợc liệu sâm đại hành kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh cho ngƣời, kháng khuẩn kháng thuốc, động vật thủy sản Để hoàn thiện cho đề tài nghiên cứu chúng tơi có đề nghị nhằm củng cố phát triển thêm kết đề tài đạt đƣợc:  Khảo sát thêm loại dung mơi sử dụng q trình chiết cao để thu đƣợc tối đa lƣợng cao hợp chất có dƣợc liệu sâm đại hành  Khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc khác  Xác định cấu trúc hợp chất cao sâm đại hành  Thử hoạt tính gây độc tế bào ƣng thƣ hợp chất thu đƣợc cao sâm đại hành 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học [2] Đỗ Tất lợi, (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học [3] Huỳnh Kim Diệu (2011), “Sự chủng tính kháng khuẩn sâm đại hành (Eleutherine subaphylla)”, Khoa học kỹ thuật Thú y, 18(5), 77 - 81 [4] Lƣơng Thị Mỹ Vân cs (2016), “Nghiên cứu hoạt tính kháng Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae cao chiết dâm bụt (Hibiscus rosasinensis L.)”, ĐHQG-HCM, 19(5), 84 – 94 [5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất ĐHQG TP Hồ Chí Minh [6] Nguyễn Thị Hồng Vân, Đỗ Thị Nguyệt Quế, Nguyễn Thu Hằng, Lê Thị Loan, Lƣu Tuấn Anh, Nguyễn Văn Hoan (2014), “Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro tác dụng điều trị chỗ chế phẩm EB chiết tách từ củ Sâm đại hành bỏng thực nghiệm”, Tạp chí sinh học, 36(1), 81 – 87 [7] Nguyễn Thu Gƣơng, Nguyễn Vũ Giang Bắc, Lê Thị Lệ Uyên, Nguyễn Đinh Nga (2014), “Phân lập xác định cấu trúc hóa học hoạt chất kháng nấm có cao chiết từ trầu khơng”, Y học TP Hồ Chí Minh, 18(2), 235 - 239 [8] Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, NXB Y học [9] Trƣơng Minh Lƣơng, Trần Văn Huy (2009), “Góp phần nghiên cứu Eleutherine sâm đại hành Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHSP TP HCM, 16, 69-79 Tài liệu tiếng Anh [10] Almeida A T M., Helmut K., Leomar Z C (2003) “Eleutherinone, a novel fungitoxic naphthoquinone from Eleutherine bulbosa (Iridaceae)”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 98(5): 709-712 [11] Alves T M A., Kloos H & Zani C L (2003) “Eleutherinone, a novel fungitoxic naphthoquinone from Eleutherine bulbosa (Iridaceae)” Memórias Instituto Oswaldo Cruz, 98(5), 709-712 49 [12] Bianchi C., Ceriotti G (1975) “Chemical and pharmacological investigations of constituents of Eleutherin bulbosa (Miller) Urb (Iridaceae)”, Journal of PharmaceuticalSciences, 64(8), 1305 - 1308 [13] Chauhan, A K., Maheshwari, D K., & Bajpai, V K (2017), “Isolation and preliminary characterization of a bacteriocin-producer Bacillus strain inhibiting methicillin resistant Staphylococcus aureus”, Acta Biologica Hungarica, 68(2), pp 208 - 219 [14] Elisha I L., Botha F S., McGaw L J., Eloff J N (2017), “The antibacterial activity of extracts of nine plant species with good activity against Escherichia coli against five other bacteria and cytotoxicity of extracts”, BMC complementary and alternative medicine, 17(1), 133 [15] Harlita T D., Oedjijono A A (2018) “The Antibacterial Activity of Dayak Onion (Eleutherine palmifolia (L.) Merr) towards Pathogenic Bacteria” Tropical life sciences research, 29(2), 39 - 52 [16] Jeyanthi V., Velusamy P (2016), “Anti-methicillin resistant Staphylococcus aureus compound isolation from halophilic Bacillus amyloliquefaciens MHB1 and determination of its mode of action using electron microscope and flow cytometry analysis”, Indian journal of microbiology, 56(2), pp 148 - 157.7 [17] Jiang H., Man W J., Hou A J., Yang L., Xing X D., Yan M L & Yang L (2018) “The chemical constituents from the active fractions of Eleutherine bulbosa with their antimicrobial activity” Natural product research, 1-7 [18] Williams C A & Hartern J B (1985) Flavonoids, quinones and xanthones are one of the different things Zeitschrift für Naturforschung C, 40 (5-6), 325330 50 PHỤ LỤC Kết thống kê khảo sát ảnh hƣởng hệ dung môi đến khối lƣợng cao chiết Kết thống kê đƣờng kính vịng kháng MRSA cao chiết sâm đại hành Kết thống kê đƣờng kính vịng kháng MRSA cao chiết sâm đại hành 51 ... khả kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành - Phân lập tinh chế hoạt chất kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành. .. chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep. )? ?? Mục tiêu: - Khảo sát khả kháng Staphylocuccus aureus kháng methicillin (MRSA) cao chiết từ sâm đại hành - Phân lập tinh chế hoạt chất kháng Staphylocuccus... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) TỪ