Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại (SAR) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - N gu yễ n P h ƣ ơn g V ũ HỒN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ TR A O Đ ỔI IO N LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội 202 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Phƣơng Vũ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Dƣơng Hữu Thái TS Huỳnh Hoàng Nhƣ Khánh Hà Nội - 2021 L I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn Th c s “Hồn thiện quy trình tinh chế huyết kháng dại (SAR) phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion”là cơng trình nghiên cứu riêng cá nhân nh m nghiên cứu, không chép Do nh m nghiên cứu tự nghiên cứu, đọc, dịch tài liệu, tổng hợp thực Nội dung lý thuyết luận văn c sử dụng số tài liệu tham khảo nhƣ trình bày phần tài liệu tham khảo Các số liệu, chƣơng trình phần mềm kết luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc Học viện Khoa học Công nghệ phát sai ph m hay chép đề tài này! Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2021 Học viên Nguyễn Phƣơng Vũ L I CẢM ƠN Đề tài đƣợc thực t i Viện Vắc xin Sinh ph m Y tế IV C , nơi làm việc, học tập nghiên cứu Viện đƣợc phân chia thành phòng chức chuyên biệt nhƣ nghiên cứu, sản xuất, đ ng g i,… Trong thời gian thực đề tài, đƣợc trực tiếp tham gia học hỏi, thực hành nhiều giai đo n khác quy trình sản xuất huyết kháng d i S R Tôi nhận đƣợc nhiều hỗ trợ từ cán hƣớng dẫn anh chị em phòng Huyết phòng Ki m định Tôi xin chân thành cảm ơn Viện trƣởng TS Dƣơng Hữu Thái hƣớng dẫn t o điều kiện cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn t i Viện IV C Tôi xin cảm ơn lãnh đ o, ban giám hiệu Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng Đào t o tồn th thầy khoa Cơng nghệ Sinh học t o điều kiện cho tơi hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu khoa học Cảm ơn phụ trách phòng Huyết ThS Dƣơng Tuấn Hiệp TS Huỳnh Hồng Nhƣ Khánh, quan tâm, hỗ trợ kiến thức, tinh thần, giúp đỡ thiết kế bố trí thí nghiệm cho tơi, nhƣ phụ giúp vào ngày miệt mài viết luận văn Đƣợc giúp đỡ nhiệt tình ngƣời, tơi hoàn thành luận văn thời h n Học viện Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình hỗ trợ vật chất tinh thần suốt thời gian năm học th c s qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2021 Học viên Nguyễn Phƣơng Vũ IVAC WHO SDS-PAGE IgG SE-HPLC SAR CV RNP RIG PEP RNA DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Sự khác biệt d ng sắc ký trao đổi ion 22 ảng 2.1 Kết tiêu chu n chất lƣợng lô 13.18 R 32 ảng 2.2 Danh sách h a chất dùng tinh chế 33 ảng 2.3 Danh sách thiết bị dụng cụ 33 ảng 3.1.Kết thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl 49 ảng 3.2 Kết thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Phosphate + 50mM NaCl 51 ảng 3.3 Kết khả bám mẫu vào cột với n ng độ protein mg ml lô thử nghiệm .55 ảng 3.4 Kết khả bám mẫu vào cột với n ng độ protein mg ml lô thử nghiệm .56 ảng 3.5 Kết khả bám mẫu vào cột với n ng độ protein mg ml lô thử nghiệm .56 ảng 3.6 Kết hàm lƣợng protein sau sắc ký mẫu 60 ảng 3.7 Kết tăng trọng trung bình chuột thử nghiệm an tồn chung .62 ảng 3.8 Kết ki m tra chất gây sốt huyết SAR tinh s ch sắc ký .62 ảng 3.9 Tiêu chu n chất lƣợng sở sản ph m huyết kháng d i sau tinh s ch phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 64 ảng 3.1 Các thông số quy trình tinh s ch huyết kháng d i phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 65 Bảng 3.11 Chất lƣợng huyết kháng d i sử dụng quy trình cũ 67 Bảng 3.12 Chất lƣợng huyết kháng d i sử dụng quy trình tinh s ch đƣợc thiết lập 68 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi rút d i Hình 1.2 Hình thái, cấu trúc vi rút d i Hình 1.3.Cấu trúc F ab Hình 1.4.Nguyên tắc sắc ký lọc gel Hình 1.5 H t gel liên kết Protein A, sử dụng tinh chế kháng th Hình 1.6 Vị trí Fc IgG với protein A Hình 1.7 Nguyên tắc sắc ký kỵ nƣớc Hình 1.8 Cơ chế sắc ký trao đổi ion Hình 1.9 Các giai đo n trình trao đổi ion Hình 1.1 Nguyên tắc sắc ký trao đổi Cation Hình 1.11 Cơ chế thay đổi điện tích bề mặt protein theo pI Hình 1.12 Nguyên tắc sắc ký trao đổi Anion Hình 3.1 Phổ đ ch y máy sắc ký dung dịch đệm 20mM Acetate + mM NaCl lô S R_SK Hình 3.2 Phổ đ ch y máy sắc ký dung dịch đệm 20mM Phosphate + mM NaCl lô P1 S R_SK Hình 3.3 Kết ki m tra độ s ch kháng th lô 13.18 phƣơng pháp SE-HPLC Hình 3.4 Kết ki m tra độ s ch kháng th huyết kháng d i chứa dung dịch đệm cetate lô S R_SK phƣơng pháp SE-HPLC Hình 3.5 Kết ki m tra độ s ch kháng th huyết kháng d i chứa dung dịch đệm phosphate lô P1 S R_SK phƣơng pháp SE-HPLC Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch lo i dung dịch đệm sau lần thử nghiệm so với mẫu ban đầu mẫu thơ Hình 3.7 Kết điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch khả bám mẫu dung dịch đệm cetate 57 Hình 3.8 Kết định tính kháng th F ab Hình 3.9 Kết độ tinh s ch lơ Hình 3.1 Kết độ tinh s ch lô 8.1S 8.2S ngựa 58 R_SK 59 R_SK 59 Hình 3.11 Kết độ tinh s ch lơ A80.03/SAR_SK 60 Hình 3.12 Kết điện di SDS-PAGE lô huyết SAR đƣợc tinh chế thử nghiệm theo quy trình tinh chế thiết lập so với mẫu Ấn Độ mẫu Pháp .69 Hình 3.13 Đ thị độ tinh s ch huyết kháng d i lô tinh s ch thử nghiệm, Ấn Độ, Sanofi-Pháp 70 Hình 3.14 Đ thị hàm lƣợng endotoxin lô sử dụng quy trình chƣa tinh s ch lơ sử dụng quy trình tinh s ch thiết lập 71 Hình 3.15 Đ thị hàm lƣợng protein lơ sử dụng quy trình chƣa tinh s ch lơ sử dụng quy trình tinh s ch thiết lập 71 Hình 3.16 Hình ảnh cảm quan lơ 7.19 R mẫu trƣớc tinh s ch lô 02.21/AR_SK_TC (mẫu sau tinh s ch) 72 MỤC LỤC LỜIC MĐO N LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 T NG QU N VỀNH DẠI 1.1.1 Sơ lƣợc bệnh d i 1.1.2 Tác nhân gây bệnh 1.1.3 Tình hình bệnh d i 1.1.4 Các biện pháp phòng ngừa 1.1.5 Sản xuất huyết kháng d i S 1.2 C NG NGH SẮC K 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Các kỹ thuật sắc ký tinh s ch protein 1.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG KỸ THUẬT SẮC K 1.3.1 Giới thiệu 1.3.2 Nguyên lý chung 1.3.3 Các bƣớc thực 1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC K KHÁNG DẠI 1.4.1 Các nghiên cứu giới 1.4.2 Các nghiên cứu nƣớc -  Lần 3: Kết tinh thử nghiệm lô: - Lô 1.21 R-SK-TC - Lô 2.21 R-SK-TC - Lô 3.21 R-SK-TC - Lô 4.21 R-SK-TC - Lô 5.21 R-SK-TC  Kết mẫu huyết kháng dại Pháp:  Kết mẫu huyết kháng dại Ấn Độ: Phụ lục 2: Kết Western lot  Kết Western blot lô tinh s ch thử nghiệm Mẫu – Marker 240 Mẫu – BTP Mẫu – 01.21/SAR-SK- 140 TC Mẫu – 02.21/SAR-SK- 110 TC Mẫu – 03.21/SAR-SKTC 75 Mẫu – 04.21/SAR-SKTC 50 Mẫu – 05.21/SAR-SKTC Mẫu – Mẫu Favirab-Pháp Mẫu – Mẫu Ấn Độ Kết luận: Các mẫu SAR sắc ký tinh chế chứa F ab huyết ngựa với mẫu chứng huyết Pháp Ấn Độ Phụ lục 3: Kết an toàn chung  Kết an toàn chung x y dựng tiêu chuẩn chất lƣợng sở - ảng theo dõi trọng lƣợng triệu chứng chuột nhắt sau tiêm Lô A80 Ký hiệu TT chuột 01 Đầu vàng 02 Đuôi vàng 03 Lƣng vàng 04 Sọc vàng 05 Trắng Trọng lƣ chuột - ảng theo dõi trọng lƣợng triệu chứng chuột lang sau tiêm Lô A80 Ký hiệu TT chuột Trọng lƣợ chuột Trƣớc tiêm 01 Đầu vàng 305 02 Lƣng vàng 310  Kết an tồn chuột nhắt lơ tinh s ch liên tiếp Lô 01 21/AR-SK-TC TT Ký hiệu Trọng lƣợng chuột gam) Trƣớc Sau tiêm ngày 19.17 24.50 20.20 24.90 17.47 22.59 19.20 25.17 17.30 22.56 chuột 01 02 03 04 05 Đầu vàng Đuôi vàng Lƣng vàng Sọc vàng Trắng  Kết an toàn chuột lang lô tinh s ch thử nghiệm liên tiếp Lô 01 21/AR-SK-TC Trọng lƣợng chuột Ký hiệu TT 01 02 gam) chuột Đầu vàng Lƣng vàng  Trƣớc Sau tiêm ngày 330 350 320 370 Kết tiêm thử nghiệm thăm dò dung dịch NaCl Mẫu tinh Lần Lần Số th Cn n ng (kg) 2,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 2,0 Lần 2,0 1,9 1,9 2,0 Phụ lục 4: Phổ đồ trình chạy mẫu  Phổ đồ chạy máy sắc ký tinh dung dịch đệm 20 mM Acetate + 50 mM NaCl - Lần - Lần  Phổ đồ chạy máy sắc ký tinh dung dịch đệm 20 mM Phosphate + 50 mM NaCl - Lần - Lần ... tài:“Hồn thiện quy trình tinh chế huyết kháng dại (SAR) phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion? ?? đƣợc thực nhằm hoàn thiện quy trình tinh chế huyết kháng d i đ nâng cao chất lƣợng sản ph m huyết Kết bƣớc... Thiết lập quy trình giai đo n tinh s ch sắc ký trao đổi ionvới sản ph m huyết kháng d i tinh chế - Tinh chế thử nghiệm đánh giá chất lƣợng huyết kháng d i phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion thiết lập... lƣợng sở sản ph m huyết kháng d i sau tinh s ch phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 64 ảng 3.1 Các thơng số quy trình tinh s ch huyết kháng d i phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 65 Bảng