Merr đối với vi khuẩn gây bệnh, kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n - hexane, ethyl acetate và ethanol 96% có khả năng ức chế sự tăng trưởng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu củ cây sâm đại hành được thu mua ở Đồng Tháp được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Chủng S aureus ATCC 43300 (MRSA) được cung cấp bởi công ty Nam Khoa Biotek
Chiết với các dung môi
Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Cô thành cao dược liệu Định danh tên khoa học
Chạy cột sắc ký thu phân đoạn
Xác định cấu trúc của các hợp chất thu được
Khảo sát khả năng kháng MRSA của các phân đoạn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Chọn phân đoạn kháng MRSA tốt nhất tiếp tục chạy sắc ký cột để thu nhận chất
Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
Mục đích: xác định loại dung môi thích hợp cho hiệu suất cao
Yếu tố khảo sát bao gồm: dung môi trích ly gồm n-hexane, ethanol 96 o , ethyl acetate và nước
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5, nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ
Bột dược liệu từ củ sâm đại hành được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dầm với các dung môi có độ phân cực khác nhau
Tiến hành ngâm phân đoạn bột dược liệu với ethanol 96 o trong bình ngâm chiết ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách cô quay ở 50 o C và bốc hơi hết dung môi để thu cao thô Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao thô được hòa tan với nước theo tỉ lệ 1:10 và đem chiết lỏng - lỏng qua các hệ dung môi n-hexane, ethyl acetate và nước Sau khi chiết lỏng - lỏng dịch chiết được cô đặc thành cao bằng phương pháp tương tự như trên Đem cân các cao phân đoạn này bằng cân phân tích (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức:
A: khối lượng cao thu được
B: khối lượng nguyên liệu tương ứng ban đầu
Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao sâm đại hành
Bột dược liệu độ ẩm
Chiết lỏng - lỏng với n-hexane
Chiết lỏng - lỏng với ethyl acetate
Cô quay thu cao nước Cao thô
Phơi khô dưới nắng hoặc sấy 50 o C/ 72h Xay nhuyễn
Thêm nước theo tỉ lệ 1:10
Cô quay thu cao ethyl acetate
Cô quay thu cao n-hexane
Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV (Bộ y tế, 2009)
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO theo tỉ lệ 1 mg/ mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng
❖ Đếm tổng số nấm men – nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí Đối với mẫu đếm tổng số nấm men - nấm mốc: dùng môi trường Sabourard dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA
Từ dung dịch mẫu thử 10 -1 , pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,85 % để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10 -2 , 10 -3 ,… Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40 – 45 o C Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 - 20 mL môi trường Sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37 o C/ 24 – 48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28 - 30 o C/ 5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm nem – nấm mốc
Chỉ chọn những đĩa có số khuẩn lạc mọc từ 25 - 250
Số lượng nấm và vi khuẩn hiếu khí sống lại được có trong 1g (mL) mẫu thử được tính theo công thức sau:
N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1g (mL) mẫu (CFU/ g hay CFU/ mL)
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn n i : số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i
SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 29 d i : hệ số pha loãng thứ i v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL).
Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng
2.5.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao chiết từ củ sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (Orho và cs., 2015) Trải dịch vi khuẩn thử nghiệm (mật độ 10 8 CFU/ml) lên đĩa môi trường MHA Đục lỗ đường kính 8 mm trong bản thạch bằng dụng cụ vô trùng Các cao chiết được hòa tan trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO) (theo tỷ lệ 1:5) và nhỏ vào mỗi giếng khoảng 70 μl Ủ 37 o C/18-24 giờ và đọc kết quả vòng kháng khuẩn
2.5.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với
Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA)
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) là nồng độ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp nhất mà tại đó cao chiết có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi sinh vật Để xác định MIC của các cao chiết từ dược liệu với các vi sinh vật chúng tôi áp dụng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch (CLSI, 2010) Từ dung dịch gốc cú nồng độ 1000 àg/mL, cao chiết thử nghiệm được pha loãng với DMSO theo cấp số nhân thành các nồng độ liên tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 Sau đó trộn 2,5 mL dung dịch cao chiết đã pha vào 22,5 mL thạch MHA Tiến hành nhỏ 2 àL dịch vi khuẩn (cú nồng độ 10 6 tế bào/mL) lờn đĩa thạch MHA cú chứa nồng độ cao chiết thử nghiệm, ủ trong 37 o C/18-24 giờ Đọc kết quả ở nồng độ thấp nhất mà các vi sinh vật bị ức chế sự phát triển.
Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột (SKC) được tiến hành trên cột thủy tinh, tùy vào lượng cao và chất hấp thu mà chọn cột phù hợp, làm khô cột và cân silicagel cần dùng, pha dung môi giải ly
Nhồi một ít bông gòn dưới đáy cột để silica gel không chảy ra ngoài Sau đó, cho silica gel vào dung môi giải ly, rồi rót nhẹ vào cột Để một cốc thủy tinh nhỏ (50 mL) phía dưới cột, sau khi rót hết silica gel vào thì xả cột để cố định silica gel, rót thêm dung môi vào cột để ổn định hệ Với chất nhồi cột là silica gel pha thường Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh) Hòa mẫu vào dung môi chạy cột trong cốc thủy tinh lớn 500 mL sau đó dùng một lượng silica gel cho vào cốc thủy tinh để hấp thụ mẫu, trộn mẫu và silicagel cho đến khi được một hỗn hợp khô Cho hết hỗn hợp đó vào cột và rót dung môi giải ly vào Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu cho một ít bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định, tiếp tục châm dung môi giải ly vào (Trương Minh Lương và cs., 2009) Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25- 50 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lượng) Tuy nhiên, với những hỗn hợp các chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 – 200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Các hệ dung môi được sử dụng để chạy cột lần lượt theo tỉ lệ lần lượt là n-hexane : ethyl acetate (100 : 0 %), n-hexane : ethyl acetate (75 : 25 %), n-hexane : ethyl acetate (50 : 50 %), n-hexane : ethyl acetate (25 : 75 %) và n-hexane : ethyl acetate (0 : 100
%) Sau đó sẽ thu được 5 phân đoạn, mỗi hệ dung môi được sử dụng để chạy cột tương ứng với 1 phân đoạn: ES-H1, ES-H2, ES-H3, ES-H4, ES-H5 Các phân đoạn sau khi thu được sẽ đem đi khảo sát khả năng kháng MRSA Sau đó, lựa chọn phân đoạn có khả năng kháng MRSA tốt nhất tiếp tục đem đi tiến hành chạy sắc ký cột để thu các hợp chất và cuối cùng là đem các chất sau khi chạy cột của phân đoạn tốt nhất đi xác định cấu trúc.
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn) tại Viện Hóa Học.
