Nghiên cứu quy trình tinh chế alpha-fetoprotein từ máu cuống rốn người.pdf

NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016 Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình tinh chế alpha-fetoprotein từ máu cuống rốn người sổ họp đồng: Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyền Hữu Hùng Đơn vị công tác: Khoa Nông nghiệp công nghệ cao Công nghệ sinh học, Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 12 tháng TP Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 12 năm 2016 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỎNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016 Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình tinh chế alpha-fetoprotein từ máu cuống rốn người Sô hợp đông: Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Hữu Hùng Đơn vị công tác: Khoa Nông nghiệp công nghệ cao Công nghệ sinh học, Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 12 tháng Các thành viên phôi hợp cộng tác: STT Họ tên Lê Thị Phương Thảo Chuyên ngành Sinh lý động vật Co’ quan công tác Khoa NNCNC&CNSH, Đại học Nguyền Tất Thành Ký tên MỤC LỤC TỎNG QUAN I Khái quát alpha-fetoprotein 1.1 1.1.1 Gene 1.1.2 Cấu trúc phân từ 1.1.3 Chức 1.2 Alpha-fetoprotein ung thư 1.3 Máu cuống rốn người NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP II II Nội dung II.2 Hóa chất II.3 Nguyên/vật liệu 10 II.4 Phương pháp 11 II.4.1 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ với AFP tạo kháng the tho kháng AFP người 11 II.4.2 Sắc ký lực loại albumin 12 II.4.3 Sắc ký trao đối ion âm 12 II.4.4 Tạo cột sắc ký lực bắt AFP 12 II.4.5 Sắc ký lực bắt AFP 14 II.4.6 Sắc ký lọc gel 14 II.4.7 Điện di biến tính (SDS-PAGE) khơng biến tính (Native-PAGE) 14 II.4.8 Kỳ thuật western blot 15 II.4.9 III Định lượng protein tồng số protein sau tinh che 15 KẾT QUẢ 15 III Tạo kháng thể IgG thỏ kháng AFP người 15 III Nhận diện AFP mẫu huyết tương máu cuống rốn ban đầubang western blot 16 III Loại albumin khỏi huyết tương máu rốn 17 III Sắc ký trao đoi ion âm 18 III Kết tinh chế IgG thỏ kháng AFP 20 III Bắt AFP cột sắc ký lực mang kháng the IgG thó kháng AFP 22 III Tinh chế AFP sắc ký lọc gel 22 III Phân tích hiệu quà tinh che AFP sau ba bước sắc ký 23 IV THAO LUẬN 23 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 Danh mục chữ viết tắt a-ALB Alpha-albumin AFP Alpha-fetoprotein ALB Albumin APS Ammonium Persulfate AS Ammonium Sulfate BSA Bovine Serum Albumin BT Bình thường Con A Concavalin A CNBr- Cyanogen bromide­ DBP vitamin D binding protein DEAE Diethylaminoethyl E2 Estradiol EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FCA Freund’s Complete Adjuvant FIA Freund’s Incomplete Adjuvant hAFP Human alpha-fetoprotein hALB Human albumin HBV Hepatitis B virus HbsAg Hepatitis B surface antigen HCC Hepatocellular carcinoma HCV Hepatitis c virus HRP Horseradish Peroxidase HT Huyết kDa Kilo Dalton mAFP Mouse alpha-fetoprotein MCR Máu cuổng rồn mRNA Messenger Ribose Nucleic Acid OD Optical Density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis rAFP Rat alpha-fetoprotein SDS Sodium Dodecyl Sulphate TBST Tris Buffered Saline Tween TEMED N,N,N',N-Tetramethylethylenediamine Danh mục bảng biểu, sơ đồ Bảng 1: So sánh thành phần nucleotide amino acid mAFP, rAFP hAFP Bàng 2: Thành phần gel điện di Bảng 3: Phác đồ gây đáp ứng miễn dịch thỏ với AFP 11 Sơ đồ 1: Quy trình tạo kháng thể IgG thỏ kháng AFP máu cuống rốn nguời 13 Sơ đồ 2: Quy trình sắc ký ba bước tinh chế AFP từ MCR người 19 Danh mục hình ảnh Hình 1: Phát IgG kháng AFP HT thó bang lai phân tử western blot 16 Hình 2: Kiểm tra diện AFP mầu MCR 17 Hình 3: sắc ký loại ALB cột sắc ký lực Hitrap Blue HP 18 Hình 4: sắc ký trao đổi ion âm qua cột DEAE 19 Hình 5: Phân tích IgG sau tủa với AS 45% bào hịa SDS-PAGE 20 Hình 6: Phân tích IgG sau tinh chế với cột protein G bang SDS-PAGE 21 Hình 7: Đánh giá hoạt tính kháng AFP IgG sau tinh chế với HT MCR bang western blot 21 Hình 8: Kết sắc ký lực bắt AFP 22 Hình 9: Phân tích AFP sau sắc ký lọc gel 23 TÓM TẮT Alpha-fetoprotein (AFP) protein huyết liên quan tới phát triên bào thai Ớ người trưởng thành AFP phát gia tăng sản xuất số trường hợp bệnh lý ung thư biểu mô tế bào gan (hepatocellular carcinoma, HCC), xơ gan số bệnh lý ung thư khác AFP sừ dụng dấu ấn quan trọng cho chẩn đoán huyết học HCC gan AFP trở thành mục tiêu cho nghiên cứu chủng ngừa HCC Máu cuống rốn có khoảng 150 - 250 pg/mL AFP thường bị bở bệnh viện Nghiên cứu nhàm mục đích tận dụng nguồn thài máu cuống rốn người làm nguyên liệu tinh che AFP có độ tinh cao Bang quy trình sắc ký ba bước gồm sắc ký loại albumin, sắc ký lực bắt AFP sắc ký lọc gel, đà tinh chế thành công AFP với độ 95% Quy trình tinh chế thiết lập thực quy mơ lớn cho ứng dụng sau I TÔNG QUAN 1.1 Khái quát alpha-fetoprotein Alpha - fetoprotein protein đặc trưng cho phôi, sân xuất giai đoạn phơi sớm gan, túi nỗn hồng lượng nhỏ sản xuất vùng thuộc dày - ruột, ỏ người, AFP sàn xuất túi nỗn hồng gan khoảng - tháng đau cùa phơi, sau chù yếu gan sản xuất; cịn lồi khác, chuột, gặm nhấm gà, tong hợp túi nỗn hồng tiếp tục sinh Hàm lượng cao cùa AFP tìm thấy nhiều trường hợp lâm sàng, bao gom mang thai, rối loạn gan, đặc biệt viêm gan mãn tính, nhiều khối u ác tính, đặc biệt khối u gan, khoi u quái, dạng dòng ruột sơ cấp Sự tập trung AFP người mẹ cao mức AFP 150 - 250 ng/mL giừa tam cá nguyệt thứ giai đoạn mang thai giảm nhanh sau sinh Mức AFP huyết thai người cao thời kỳ thai nghén tuần thứ 13, có the đạt tới mức vài mg/mL, chiếm khoáng 1/3 tong so protein huyet Ờ người trưởng thành khỏe mạnh, hàm lượng AFP thấp, khoảng