Từ lá của cây Cóc đỏ thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ, 5 hợp chất flavonoid đã được cô lập, bao gồm naringenin (1), quercetin (2), quercitrin (3), myricetin (4), myricitrin (5). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định thông qua các phương pháp phổ nghiệm. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất cô lập được khảo sát, trong đó naringenin có hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 là 1.87 µg/ml và cao hơn chất đối chứng dương acarbose (IC50 = 138.20 µg/ml).
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α - GLUCOSIDASE CỦA FLAVONOID TỪ LÁ CÓC ĐỎ (LUMNITZERA LITTOREA) Trương Thị Thùy Đang*, Huỳnh Tấn Lộc, Bùi Thanh Tùng, Lê Linh Ngọc, Nguyễn Thị Thu Hồng, Nguyễn Thị Lệ Thủy Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: 1553010031dang@ou.edu.vn TÓM TẮT Từ Cóc đỏ thu hái rừng ngập mặn Cần Giờ, hợp chất flavonoid cô lập, bao gồm naringenin (1), quercetin (2), quercitrin (3), myricetin (4), myricitrin (5) Cấu trúc hợp chất xác định thơng qua phương pháp phổ nghiệm Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất cô lập khảo sát, naringenin có hoạt tính cao với giá trị IC50 1.87 µg/ml cao chất đối chứng dương acarbose (IC50 = 138.20 µg/ml) Từ khóa: Cóc đỏ, rừng ngập mặn, flavonoid, enzyme α-glucosidase FLAVONOIDS FROM LEAVES OF LUMNITZERA LITTOREA AND IN VITRO α - GLUCOSIDASE INHIBITORY ACTIVITIES Truong Thi Thuy Đang*, Huynh Tan Loc, Bui Thanh Tung, Le Linh Ngoc, Nguyen Thi Thu Hong, Nguyen Thi Le Thuy Ho Chi Minh City Open University *Corresponding Author: 1553010031dang@ou.edu.vn ABSTRACT From the Lumnitzera littorea leaves, collected at Can Gio mangrove forest, five compounds, including naringenin (1), quercetin (2), quercitrin (3), myricetin (4), myricitrin (5) were isolated Their structures were elucidated by extensive analysis of the spectroscopic data The α-glucosidase inhibitory activity of isolated compounds was evaluated All of them exhibited strong inhibitory activity There are two compounds, naringenin, quercetin were the most potent with IC50 values of 1.87 µg/ml 3.42 µg/ml, higher than the positive control acarbose( IC50 = 138.20 µg/ml) Keywords: Lumnitzera Littorea, mangrove plant, flavonoid, α-glucosidase inhibitory activity kháng lại sáu lồi vi khuẩn gây bệnh người Bên cạnh dân gian chiết xuất từ dùng để chữa nấm vịm họng trẻ Ngồi ra, sử dụng phương thuốc để chữa bệnh tiêu chảy xứ nóng, bệnh viêm ruột, loét miệng Đái tháo đường (hay gọi tiểu đường) bệnh trạng lượng đường máu tăng cao Bệnh đái tháo ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Cóc đỏ (Luminitzera littorea) loài thuộc họ Bàng (Combretaceae) phân bố rừng ngập mặn Ở Việt Nam, chi Lumnitzera gồm hai lồi Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) Cóc trắng (Lumnitzera racemosa) Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết n-haxane, ethylacetate methanol từ lồi có khả 30 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 đường chia làm hai loại: loại loại Trong bệnh tiểu đường loại chiếm đến 90% nguyên nhân chủ yếu rối loạn insulin thể Mặt khác, enzyme α-glucosidase yếu tố gây nên bệnh tiểu đường Enzyme α-glucosidase enzyme đường ruột phá vỡ liên kết α -1,4 polysaccharides thành α-glucose dẫn đến mức đường máu cao Mục tiêu nghiên cứu lập số hợp chất flavonoid có khả ức chế enzyme α-glucosidase từ Cóc đỏ Kỷ yếu khoa học littorea) thu hái trưởng thành rừng ngập mặn Cần Giờ, sau loại bỏ hư hỏng sâu bệnh, rửa loại đất cát, phơi khô xay nhuyễn Bột (7.8000 g) chiết xuất hoàn toàn ethanol nhiệt độ phòng phương pháp ngâm Từ 7.8 kg nguyên liệu khô sử dụng phương pháp ngâm dầm nhiệt độ phòng, thu 880 g cao tổng Với 400 g cao tổng ethanol áp dụng cho trình chiết pha rắn silic, tách chiết liên tục với n-hexan, etyl axetat, etyl axetat:methanol (1:1) cuối metanol Sau cô quay, bốn chất chiết xuất thu được, n-hexan (100.87 g), etyl axetat (36.45 g), etyl axetatetanol (1:1) (85.12 g) methanol (150.43 g) Từ cao ethanol chiết pha rắn với loại dung môi n-hexane, EA, EA:Me (1:1) thu phân đoạn cao n-hexane (cao A), cao ethyl acetace (cao B), cao EA:Me (1:1) (Cao C), cao methanol (cao D) Chiết xuất cao C cô lập phương pháp sắc ký cột silicagel với hệ dung môi EA:Me 9:1, 4:1, 1:1, 0:1 Sau thu phân đoạn nhỏ ký hiệu từ C1-C8 Phân đoạn C2 tái sắc ký silicagel với hệ CHCl3- MeOH với tỷ lệ 1:1, 9:1, sau với Sephadex LH - 20 với methanol để thu hợp chất (4) 10 mg Phân đoạn C3 tái sắc ký silicagel- hệ dung môi CHCl3- MeOH với tỷ lệ 1:0, 9:1 sau với Sephadex LH - 20 với methanol để thu hai hợp chất (1) 30 mg (2) 15 mg Phân đoạn C4 tái sắc ký silicagel với hệ CHCl3-MeOH với tỷ lệ 1:0,0;1 cho phân đoạn (C4.1C4.9) sử dụng phương pháp sắc ký sắc ký lớp mỏng áp dụng cho phân đoạn để thu hợp chất (5) (C4.4) mg, (3) (C4.9) g Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) trưởng thành, có màu xanh đậm, khơng bị sâu, thu hái rừng ngập mặn Cần Giờ từ tháng 8/2017 đến tháng 8/2018 Cây định danh khoa học tiến sĩ Phạm Văn Ngọt, Khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Phương pháp nghiên cứu Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) đo máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer phổ ESI-MS thực +IDA TOF MS Sắc ký cột thực với cột silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Đức) có kích thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh), silica gel pha đảo, sephadex LH-20 để cô lập chất Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20) thu nhận từ Saccharomyces cerevisiae (750 UN) p-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside mua từ công ty hóa chất Sigma (Mỹ) Acarbose dimethyl sulfoxide mua từ cơng ty hóa chất Merck (Đức) Các loại hóa chất khác đạt mức độ tinh khiết phân tích Quy trình chiết lập chất Mẫu tươi Cóc đỏ (Lumnitzare 31 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 glucosidase Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase khảo sát tất loại cao chiết hợp chất cô lập theo phương pháp Apostolidis cộng [4 pnitrophenyl-α-D-glucopyranosid] (pNPG) sử dụng làm chất Cơ chất p-nitrophenyl-α-Dglucopyranosid bị enzyme αglucosidase thủy phân chuyển hóa thành α-D-glucose p-nitrophenol (pNP) Hoạt tính ức chế α-glucosidase tính phương trình sau: % Inhibition = Kỷ yếu khoa học Acontrol Asample Acontrol x100 Giá trị IC50 tính từ phương trình tuyến tính thể phụ thuộc phần trăm ức chế hoạt tính enzyme với nồng độ cao chiết KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biện luận cấu trúc hợp chất cô lập Quá trình nghiên cứu thành phần hóa thực vật Cóc đỏ lập xác định cấu trúc hợp chất flavonoid Cấu trúc hợp chất trình bày Hình Hình Cấu trúc hợp chất flavonoid cô lập từ Cóc đỏ Hợp chất (4): Dữ liệu phổ 1H-NMR carbon δC 107.2 (C-2, 6), 98.2 (Cra có tín hiệu mũi đơn độ 6) 93.2 (C-8), tín hiệu carbon dịch chuyển δ 12.49 (1H, s) nhóm bậc IV δC 103.0 (C-10) 120.8 (COH kiềm nối vị trí C-5 Hai tín hiệu 1) Vì vậy, hợp chất (4) proton mũi đơi ghép meta vị trí δH myricetin 6.18 (1H, d, 2.0 Hz) 6.37 (1H, d, 2.0 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Hz) H-6 H-8, tương ứng với hợp chất (4) (2) tương tự, vòng A 5,7-dihydroxyflavonoid nhiên thay có proton đối xứng Ngồi ra, tín hiệu vị trí δH 7.24 (2H, vịng B hợp chất (4) hợp chất s) đặc trưng cho nhóm 3,4,5– (2) cho tín hiệu δH 7.67 (1H, d, 2.0 trisubstituted phenyl đối xứng Dữ liệu Hz), 7.54 (1H, dd, 2.0 Hz, 8.5 Hz) phổ 13C-NMR (4) cho thấy 13 tín 6.88 (1H, d, 8.5 Hz) Dữ liệu phổ 13C hiệu bao gồm tín hiệu nhóm NMR (2) cho thấy 15 tín hiệu bao carbonyl vị trí δC 175.8 (C-4), sáu gồm tín hiệu nhóm carbonyl tín hiệu carbon sp2 gắn dị nguyên tố tại vị trí 175.9 (C-4), bảy tín hiệu δC 163.9(C-7), 160.8 (C-5), 156.1 (C- carbon sp2 gắn dị nguyên tố 9), 146.9 (C-2), 135.9 (C-3, 4), 164.0(C-7), 161.0 (C-5), C-9), 146.8 145.8 (C-3, 5), tín hiệu methine (C-2), 135.8 (C-3), 147.7 (C-4), 32 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học 145.1 (C-3) tín hiệu methine Dữ liệu phổ 1H 13C-NMR hợp carbon (C-8), 98.2 (C-6), 120.0 (C- chất (3) có khung flavonoid tương tự 6), 115.6 (C-5), 115.1 (C-2), hợp chất (2) Trên phổ H-NMR, tín hiệu carbon bậc IV C-10 tín hiệu proton anomer vị trí δH 5.25 122.0 (C-1) Từ liệu phổ 1H (1H, d, 1.5 Hz, H–1), bốn tín hiệu 13 C NMR hợp chất (2) cho thấy proton nhóm CH-OH vùng 3.1 – 4.0 ppm tín hiệu methyl cấu trúc quercetin Dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân vị trí δH 0.82 (3H, d, 6.0 Hz, H-6) H-NMR hợp chất (1) (4) cho thấy diện đường tương tự, nhiên thay có cặp rhamnose Dữ liệu phổ 13C-NMR cho proton đối xứng vòng B (4), thấy có 21 tín hiệu carbon, bao gồm δC (1) cho cặp proton đối xứng 177.7 (C-4), 164.4 (C-7), 161.2 (C-5), vịng B tín hiệu δH 7.31 (2H, d, 8.5 157.3 (C-9), 156.5 (C-2), 148.5 (C-4), Hz) 6.78 (2H, d, 8.5 Hz), tín hiệu 145.2 (C-3), 134.2 (C-3), 121.1 (C-6), hệ AMX H 5.43 (dd, J = 120.7 (C-1), 115.6 (C-5’), 115.4 (C13.0, 3.0 Hz, H-2), 2.68 (dd, J = 17.0, 2’), 104.0 (C-10), 98.7 (C-6), 93.6 (C3.0 Hz, Hax-3) 3.25 (dd, J = 17.0 Hz, 8) tín hiệu đường rhamnose 13.0 Hz, Heq-3) Dữ liệu phổ 13C NMR δC 101.8 (C-1), 71.2 (C-4), 70.6 (Ccủa (1) cho thấy 15 tín hiệu bao gồm: 5), 70.4 (C-2), 70.0 (C-5), 17.5 (Cmột tín hiệu nhóm carbonyl vị 6) Tín hiệu carbon anomeric xuất trí C 196.5 (C-4), bốn tín hiệu vùng từ trường cao với δC vùng 157-167 carbon sp2 gắn với 101.9 cho thấy hợp chất (5) hợp dị nguyên tố (C-5, C-7, C-9 C-4’), chất flavonoid có gắn nhóm nhóm tín hiệu từ C 95.0 đến 129.0 O–glycosyl Từ liệu phổ 1H carbon vịng thơm tín hiệu C 13C NMR hợp chất (3), cho thấy 78.5 42.0 đặc trưng C-2 C-3 cấu trúc quercitrin khung flavanone Do đó, hợp chất Kết sát hoạt tính ức chế enzyme (1) kết luận naringenin α-glucosidase Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết từ Cóc đỏ Cao Nồng độ IC50 0.1 0.25 0.5 1.0 chiết (µg/mL) (µg/mL) Cao 99.12 > 100 > 100 > 100 < 0.10 ethanol 0.14 n37.37 57.30 71.17 > 100 0.21 Hexane 0.32 0.84 0.34 %ức chế Ethyl 5.34 25.62 50.53 91.46 0.53 acetate 0.58 0.43 0.32 0.92 78.00 85.53 95.00 Ethanol > 100 < 0.10 1.00 0.80 0.20 Acarbose 138.20 Myricitrin (5), Quercetrin (3) đánh giá hoạt tính ức chế enzyme αglucosidase hợp chất lập khảo sát, hai hợp chất KẾT LUẬN Năm hợp chất flavonoid cô lập, bao gồm Myricetin (4), Naringenin (1), Quercetin (2), 33 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 naringenin, quercetin có hoạt tính cao với giá trị IC50 1.87 µg/ml 3.42 µg/ml Kết tiền đề quan trọng cho nghiên cứu Kỷ yếu khoa học mang tính ứng dụng sản xuất sản phẩm thực phẩm chức hỗ trợ phòng điều trị bệnh tiểu đường TÀI LIỆU THAM KHẢO ANDREA D.S, 2012 Diabetes: what you need to know Copyright Australian Diabetes Council, 6-90 LÊ CÔNG KHANH, 1986 Rừng ngập mặn rừng nhiệt đới đất chua phèn Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh, trang 40-80 NGUYỄN KIM PHI PHỤNG, 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM, trang 20-53 PHẠM HOÀNG HỘ, 1999 Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất Trẻ, trang 110 34 ... Enzyme α- glucosidase enzyme đường ruột phá vỡ liên kết α -1,4 polysaccharides thành α- glucose dẫn đến mức đường máu cao Mục tiêu nghiên cứu cô lập số hợp chất flavonoid có khả ức chế enzyme α- glucosidase... thu hợp chất (5) (C4.4) mg, (3) (C4.9) g Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Lá Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) trưởng thành, có màu xanh đậm, khơng... flavanone Do đó, hợp chất Kết sát hoạt tính ức chế enzyme (1) kết luận naringenin α- glucosidase Bảng Hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao chiết từ Cóc đỏ Cao Nồng độ IC50 0.1 0.25 0.5 1.0 chiết