Mục đích của nghiên cứu là khảo sát đơn yếu tố nồng độ dung môi ethanol, thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết, ảnh hưởng tới quá trình tách chiết flavonid từ cây gai xanh cho kết quả tương ứng: 70%; 90 phút; 80°C; 1/15 (w/v).
ISSN: 1859-2171 e-ISSN: 2615-9562 TNU Journal of Science and Technology 207(14): 207 - 212 TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH TÁCH CHIẾT FLAVONOID TỪ CÂY GAI XANH CAO BẰNG Trần Văn Chí1, Nguyễn Sinh Huỳnh2, Lưu Hồng Sơn1, Nguyễn Thị Hồng Ngọc1*, Vũ Thị Diệp1 Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên Công ty Cổ phần Giống Thức ăn chăn ni Cao Bằng TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu khảo sát đơn yếu tố nồng độ dung môi ethanol, thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết, ảnh hưởng tới trình tách chiết flavonid từ gai xanh cho kết tương ứng: 70%; 90 phút; 80°C; 1/15 (w/v) Trên sở khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết tách nồng độ dung mơi, thời gian chiết tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi yếu tố ảnh hưởng mạnh đến trình chiết tách Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm BoxBehnken tìm điều kiện tối ưu trình tách chiết flavonoid từ gai xanh sử dụng ethanol 71,33%, thời gian tách chiết 94 phút, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15,67; hàm lượng flavonoid theo điều kiện 36,17% Kết thực nghiệm cho kết có độ tương thích cao với mơ hình Từ khóa: Cao Bằng, gai xanh, flavonoid, tách chiết, tối ưu Ngày nhận bài: 19/4/2019; Ngày hoàn thiện: 25/9/2019; Ngày đăng: 17/10/2019 OPTIMIZE THE EXTRACTION PROCESS OF FLAVONOID FROM BOHENIVEA L GAUD IN CAO BANG PROVINCE Tran Van Chi1, Nguyen Sinh Huynh2, Luu Hong Son1, Nguyen Thi Hong Ngoc1*, Vu Thi Diep1 University of Agriculture and Forestry – TNU, Cao Bang Breesing and Feed Joint Stock Company (CABACO) ABSTRACT The purpose of this study was to investigate the one way ethanol concentrations, time, temperature and the ratio of material/solvent extraction, which affected the extraction process of flavonoids from Boehmeria nivea (L.) Gaud, resulting in 70%; 90 minutes; 80°C; 1/15 (w/v) On the basis of the factors affecting the extraction conditions, we found that the solvent concentration, extraction time and material/solvent ratio strongly influence the extraction process Application of BoxBehnken design found the optimal condition for the extraction process of Boehmeria nivea (L.) Gaud with ethanol at concentration of 71.33%, extraction time 94 minute, material/solvent ratio 1/15.67 which created the amount of flavonoids of 36.17% Experimental results showed high degree of compatibility with the model Keywords: Cao Bang province, Boehmeria nivea (L.) Gaud , extraction, flavonoids, optimize Received: 19/4/2019; Revised: 25/9/2019; Published: 17/10/2019 * Corresponding author Email: luuhongson@tuaf.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 207 Trần Văn Chí Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN Mở đầu Cây gai xanh (Boehmeria nivea (L.) Gaud) loại thuốc – dược liệu quý chủ trị động thai, huyết, đái đục, đái máu, bong màng ni thai, có tác dụng tốt cho phụ nữ mang thai nêu “ Những thuốc vị thuốc Việt Nam” Đỗ Tất Lợi (2004) [1] Các nghiên cứu xác định thành phần hóa học gai xanh flavonoid, apigenin, axit hữu nhiều thành phần dinh dưỡng khác khống chất, protein, vitamin [2] Trong nhóm flavonoid quan tâm nghiên cứu Flavonoid từ gai xanh biết đến với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vi khuẩn, chống virus chống dị ứng [3] Việc tách chiết flavonoid từ gai xanh chịu ảnh hưởng dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi.Vì vậy, mục đích nghiên cứu nhằm tối ưu hóa q trình tách chiết flavonoid tổng số từ gai xanh Cao Bằng Vật liệu phương pháp nghiên cứu 207(14): 207 - 212 khả ảnh hưởng chúng, phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box - Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ sử dụng 2.3 Phương pháp phân phân tích 2.3.1 Xác định hàm lượng flavonoid tổng số phương pháp cân Cân xác g bột gai chiết bình Soxhlet este dầu hỏa để loại clorophyl (trong giờ) Sau lấy túi chứa bột gai để nhiệt độ phòng cho bay hết dung mơi chiết kiệt flavonoid ethanol 70%, cất thu hồi ethanol, dịch chiết nước để nguội loại bỏ tanin thuộc da gelatin 3% khơng xuất kết tủa Chiết lấy kiệt flavonoid ethylacetat, bốc dung môi sấy cặn tới khối lượng không đổi, đem cân Hàm lượng flavonoid tổng số mẫu thử tính theo cơng thức [4]: X (%) b 100% a (1) Trong đó: 2.1 Vật liệu nghiên cứu X: % khối lượng flavonoid tổng số Cây gai xanh tươi (Boehmeria nivea (L.) Gaud) thu mua xã Cao Bình, huyện Hòa An, tỉnh Cao Bằng b: Là khối lượng cặn thu (g) a: Là khối lượng mẫu đem phân tích khơ tuyệt đối (g) Nguyên liệu rửa sạch, sau đem sấy nhiệt độ 60°C đến độ ẩm 10% Tiến hành bảo quản túi PE đặt hộp nhựa kín, lưu trữ nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng ẩm 2.3.2 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu đến khối lượng không đổi Dung môi: Dùng dung môi ethanol Merck – Đức (dạng tinh khiết) 2.2 Bố trí thí nghiệm Flavonoid chiết từ gai xanh dung môi ethanol 60; 70; 80% Nhiệt độ chiết 70, 80, 90°C khoảng thời gian 60, 90, 120 phút với tỷ lệ dung môi: Nguyên liệu 10: 1; 15:1; 20:1 (v/w) Sau tiến hành khảo sát đơn nhân tố, lựa chọn 03 yếu tố yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm lượng flavonoid tổng số, để đánh giá 208 Nguyên tắc: Sấy mẫu đến khối lượng không đổi nhiệt độ 105oC Dưới tác dụng nhiệt độ sấy làm bay ẩm tự liên kết có mẫu Độ ẩm mẫu tính dựa vào khối lượng giảm mẫu trình sấy [4] Cơng thức tính: W(%) m1 m2 100% m1 m0 (2) Trong đó: W: Độ ẩm (%) m1: Khối lượng mẫu chén sứ trước sấy (g) http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Trần Văn Chí Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 207(14): 207 - 212 m2: Khối lượng mẫu chén sứ sau sấy (g) 3.2 Ảnh hưởng thời gian chiết m0: Khối lượng chén sứ (g) Sau tìm nồng độ ethanol thích hợp q trình tách chiết flavonoid từ gai xanh khoảng thời gian tách chiết 60, 90, 120 phút lựa chọn để tiến hành nghiên cứu Sau đó, phân tích hàm lượng flavonoid tổng số Kết thu hàm lượng flavonoid thể bảng 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu xử lý phần mềm xử lý số liệu SPSS 20 Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol Ethanol có khả chiết xuất hầu hết thành phần nguyên liệu cao nước Vì dung mơi sử dụng việc chiết tách dịch gai xanh ethanol Tiến hành nghiên cứu với nồng độ khác 60%, 70%, 80% Sau tiền hành phân tích hàm lượng flavonoid tổng số dịch chiết kết thu hàm lượng flavonoid thể bảng Kết bảng cho thấy chiết nồng độ ethanol khác hàm lượng flavonoid khác hàm lượng tăng lên chiết nồng độ ethanol từ 60% đến 70% Flavonoid cao nồng độ ethanol 70% tương ứng hàm lượng flavonoid 35,58mg, tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 80% hàm lượng flavonoid không tăng mà lại giảm (34,69 mg) Lưu Hồng Sơn (2017) [5], nghiên cứu tối ưu hóa flavonoid từ chè dây Cao Bằng nhận thấy, nồng độ ethanol 70% cho hàm lượng flavonoid cao Do từ kết nghiên cứu trên, CT2 với nồng độ ethanol 70% lựa chọn để thực trình chiết flavonoid gai xanh Qua bảng ta thấy, thời gian tách chiết có ảnh hưởng tới hàm lượng flavonoid tổng số Nhìn chung tăng thời gian tách chiết, hàm lượng flavonoid tổng số thu tăng Hàm lượng flavonoid tổng số thu CT2 CT3 cao so với CT1, CT2 CT3 lại khơng có khác biệt mức ý nghĩa α = 0,05, CT3 thời gian tách chiết dài CT2 30 phút Điều giải thích thời gian 90 phút hàm lượng flavonoid tách chiết triệt để Từ nhận xét trên, để giảm thời gian sản xuất, tiết kiệm chi phí, thời gian tách chiết flavonoid tổng số lựa chọn 90 phút 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết Để xác định nhiệt độ tách chiết flavonoid phù hợp, tiến hành tách chiết nguyên liệu điều kiện cố định yếu tố công nghệ xác định thí nghiệm nhiệt độ khác là: 70oC, 80oC, 90oC Sau 90 phút tiến hành đo hàm lượng flavonoid tổng số, thu kết thể bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hàm lượng flavonoid tổng số Công thức CT1 CT2 CT3 Nồng độ ethanol (%) 60 70 80 Hàm lượng flavonoid tổng số (mg) 33,5ª 35.58b 34,69a Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thơng kê mức α < 0,05 Bảng Ảnh hưởng thời gian tách chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số Công thức CT1 CT2 CT3 Thời gian (phút) 60 90 120 Hàm lượng flavonoid tổng số (mg) 31,5ª 35,46b 36,12b Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α < 0,05 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 209 Trần Văn Chí Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 207(14): 207 - 212 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số Công thức CT1 CT2 CT3 Nhiệt độ ºC 70 80 90 Hàm lượng flavonoid tổng số (mg) 33,78ª 35,12ª 35, 08ª Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thơng kê mức α < 0,05 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ nước dung môi/nguyên liệu Công thức CT1 CT2 CT3 Hàm lượng flavonoid tổng số (mg) 32,45ª 36,05b 32,02ª Tỷ lệ dung mơi/ngun liệu 10:1 15:1 20:1 Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thông kê mức α < 0,05 Bảng Ma trận thực nghiệm Box-Behken ba yếu tố chiết gai xanh TN 10 11 12 13 14 15 16 17 A (ethanol) 60 80 60 80 60 80 60 80 70 70 70 70 70 70 70 70 70 Biến thực B (thời gian) 60 60 120 120 90 90 90 90 60 120 60 120 90 90 90 90 90 C (tỷ lệ dung môi) 15 15 15 15 10 10 20 20 10 10 20 20 15 15 15 15 15 Dựa vào kết bảng 3, nhận thấy nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng tới hiệu tách chiết flavonoid Khi tăng nhiệt độ tách chiết từ 70oC tới 80oC hàm lượng flavonoid tổng số thu tăng, nhiên tiếp tục tăng nhiệt độ lên tới 90oC hàm lượng flavonoid thu thay đổi khơng đáng kể có xu hướng giảm đi, hàm lượng flavonoid thu nằm khoảng 35mg Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho tách chiết flavonoid 80ºC Theo Spigno đồng tác giả (2007) [6], nhiệt độ trích ly tác động đến khả hòa tan, tốc độ truyền khối ổn định hợp chất polyphenol Từ kết trên, để tránh ảnh hưởng đến ổn định hợp chất flavonoid gai xanh nhiệt độ tối ưu cho trình tách chiết lựa chọn 80oC 210 Hàm lượng flavonoid tổng số (mg) 34.51 33.02 34.69 35.05 31.25 35.58 33.86 34.09 34.27 35.05 34.46 36.12 36.05 36.05 36.05 36.05 36.05 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Sau tối ưu nồng độ ethanol, nhiệt độ thời gian tách chiết flavonoid, tiến hành nghiên cứu tìm tỉ lệ dung mơi/ngun liệu thích hợp thông qua hàm lượng flavonoid tổng số Kết thể bảng Dựa vào kết bảng 4, thay đổi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu hiệu tách chiết flavonoid thay đổi khác công thức nghiên cứu Hàm lượng flavonoid thu cao CT2 36,05 mg thấp với CT3 32,02 mg Từ kết nghiên cứu trên, để xây dựng quy trình tách chiết flavonoid từ gai xanh CT2, với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 15:1 lựa chọn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Trần Văn Chí Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN 3.5 Tối ưu hóa q trình tách chiết Trên sở khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện tách chiết, yếu tố ảnh hưởng mạnh đến trình chiết tách bao gồm nồng độ dung môi, thời gian chiết tỷ lệ dung môi Phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken với ba biến ba cấp độ sử dụng cho nghiên cứu Các số liệu xử lý phần mềm Design-Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USD) ANOVA dùng để đánh giá dịch thu Phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box- Behnken với ba biến ba cấp độ sử dụng Các số liệu thu từ dịch chiết gai xanh xử lý phần mềm Design- Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA dùng để đánh giá kết thu Tiến hành giải toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi” Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định 207(14): 207 - 212 giá trị ba yếu tố mà hàm lượng flavonoid cao Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy số liệu thực nghiệm, thu mơ hình đa thức bậc hai thể hàm lượng flavonoid tổng số: Y = + 36.05 + 0.43*A + 0.58*B + 0.30 *C + 0.46*A*B - 1.02*A*C + 0.22*B*C 1.51*A2 - 0.23*B2 - 0.85*C2 Hay Y = + 36.05 + 0.43*ethanol + 0.58*thời gian + 0.30 *tỷ lệ dung môi + 0.46*ethanol*thời gian - 1.02*ethanol*tỷ lệ dung môi + 0.22*thời gian*tỷ lệ dung môi 1.51*ethanol² - 0.23*thời gian² - 0.85*tỷ lệ dung mơi² Trong Y hàm lượng flavonoid tổng số dịch chiết thu Phân tích ANOVA sử dụng để đánh giá mơ hình Kết phân tích ANOVA thể qua bảng Bảng Phân tích phương sai ANOVA mơ hình tách chiết dịch từ gai xanh Nguồn Model A B C AB AC BC A² B² C² Residual Lack of Fit Sai số SS tổng số SS 23.86 1.47 2.7 0.71 0.86 4.2 0.19 9.55 0.22 3.03 4.06 4.06 0.000 27.92 DF 1 1 1 1 16 MS 2.65 1.47 2.7 0.71 0.86 4.2 0.19 9.55 0.22 3.03 0.58 1.35 0.000 Chuẩn F 4.58 2.54 4.66 1.22 1.48 7.25 0.33 16.49 0.37 5.33 Giá trị p