Tối ưu hóa quá trình thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cell - PBMC) và quá trình chuyển nạp tạo tế bào CAR-T. Đối tượng và phương pháp: Máu ngoại vi từ người hiến tặng khỏe mạnh được tiến hành tách PBMC bằng FicollPaque.
Tạp chí y - dợc học quân số 4-2021 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH TÁCH TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI VÀ CHUYỂN NẠP TẠO KHỐI TẾ BÀO CAR-T CHO ĐIỀU TRỊ LƠ-XÊ-MI CẤP DÒNG LYMPHO Hồ Viết Hoành1, Đặng Thành Chung2 Nguyễn Thị Phương Thảo3, Cấn Văn Mão2 TĨM TẮT Mục tiêu: Tối ưu hóa trình thu nhận tế bào đơn nhân máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cell - PBMC) trình chuyển nạp tạo tế bào CAR-T Đối tượng phương pháp: Máu ngoại vi từ người hiến tặng khỏe mạnh tiến hành tách PBMC FicollPaque Phản ứng chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T thực sau thu nhận PBMC sau kích hoạt tế bào bi từ gắn kháng thể kháng CD3 CD28 Các thông số: Hệ thống chuyển nạp, số lượng tế bào cho phản ứng lượng plasmid DNA tối ưu hóa Kết quả: Máu pha lỗng lần với PBS 1X cho hiệu suất thu nhận PBMC tỷ lệ tế bào sống cao Thực phản ứng chuyển nạp hệ thống Nucleofector 2b (Lonza) với × 10 PBMC khơng kích hoạt, lượng plasmid DNA µg SB100X 10 µg pSB-CAR19 cho kết tốt Kết luận: Tối ưu hóa trình tách PBMC chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T cho điều trị lơ-xê-mi cấp dòng lympho * Từ khóa: CAR-T, CD19; Tế bào đơn nhân máu ngoại vi; Chuyển nạp; Hệ thống Sleeping Beauty Optimization of Peripheral Blood Mononuclear Cells Isolation and Nucleofection for Development of Anti-CD19 CAR-T Cells in Treatment of B Lymphoblastic Leukemia Summary Objectives: To optimize isolation and nucleofection (based on Sleeping Beauty system) of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Materials and methods: PBMCs were isolated from peripheral blood of healthy donors using Ficoll-Paque Different dilutions of whole blood and PBS 1X were tested Nucleofection was performed on either unstimulated PBMC or stimulated PBMC (using CD3/CD28 dynalbeads) Parameters including nucleofector, number of cells, Trung tâm Ung bướu, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện quân y Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người phản hồi: Cấn Văn Mão (canvanmao2011@gmail.com) Ngày nhận bài: 05/02/2021 Ngày báo đăng: 27/4/2021 87 Tạp chí y - dợc học quân số 4-2021 Bài viết sản phẩm đề tài nghiên cứu KC 10.39/16-20 tài trợ chương trình KC.10/16-20 and amount of DNA substrate were optimized Results: The best result was obtained when × 10 unstimulated PBMCs were nucleofected using Nucleofector 2b, µg sSB100X, and 10 µg pSB-CAR19 Conclusion: We have successfully developed an optimized protol for PBMC isolation and nucleofection for development of anti-CD19 CAR-T cells * Keywords: CAR-T; CD19; Peripheral blood mononuclear cell; Nucleofection; Sleeping Beauty system ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới, lơ-xê-mi cấp dòng lympho (acute lymphoblastic leukemia - ALL) bệnh ung thư phổ biến trẻ em, chiếm khoảng 75% tất loại ung thư máu [1] Bệnh đặc trưng phát triển số lượng lớn tế bào lympho chưa trưởng thành Triệu chứng thường bao gồm thiếu máu, xuất huyết, nhiễm khuẩn, hạch to Bệnh tiến triển nhanh thường gây tử vong thời gian ngắn [2] Điều trị bệnh lơ-xê-mi cấp dòng lympho nhằm tiêu diệt tế bào bạch cầu ác tính phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Liệu pháp điều trị tiêu chuẩn cho lơ-xê-mi cấp dịng lympho hóa trị liệu, thường chia thành giai đoạn: Cảm ứng, củng cố trì Tuy nhiên, hạn chế hóa trị liệu khơng có khả chữa khỏi bệnh hoàn toàn mà thuyên giảm phần Bệnh điều trị xạ trị lan đến não Ghép tế bào gốc sử dụng bệnh tái phát sau liệu trình điều trị tiêu chuẩn [3] Tuy nhiên, tỷ lệ khỏi bệnh hoàn tồn theo hướng điều trị khơng cao, đạt tối đa 20% người trưởng thành Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào T mang thụ thể nhân tạo CAR (chimeric antigen receptors) hướng tiếp cận Nguyên tắc liệu pháp CAR-T điều trị ung thư 88 tạo tế bào T mang thụ thể nhân tạo có khả nhận biết kháng nguyên đặc hiệu bề mặt tế bào ung thư, từ kích hoạt khả phân giải tế bào ung thư tế bào T Năm 2017, Cơ quan Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép cho dạng điều trị sử dụng CAR-T Kymriah (hãng Novartis) cho điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp trẻ em Yescarta (hãng Kite Pharma) cho bệnh u lympho ác tính khơng Hodgkin người lớn Ngoài sử dụng retrovirus, khối tế bào CAR-T tạo phương pháp “non-virus”, sử dụng hệ thống chuyển nạp Sleeping Beauty Nguyên lý phương pháp chuyển nạp đồng thời thành phần SB transposase SB transposon SB transposase có chức cắt đoạn trình tự đích transposon gắn vào thể gen tế bào chủ vị trí giàu nucleotide T A [4] Tuy liệu pháp CAR-T FDA công nhận ứng dụng Việt Nam chưa có nghiên cứu liệu pháp tế bào CAR-T điều trị ung thư nói chung lơ-xê-mi cấp dịng lympho nói riêng Do đó, tiến hành nghiên cứu nhằm: Tối ưu hóa q trình tách PBMC chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T ứng dụng điều trị lơ-xê-mi cấp dũng lympho Tạp chí y - dợc học quân sè 4-2021 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Tế bào máu ngoại vi tách từ máu toàn phần người hiến khỏe mạnh - Nguyên vật liệu nghiên cứu: + Plasmid pmaxGFP (Lonza Biosciences) + Plasmid pSB100X (pCMV(CAT)T7SB100, #34879) + Plasmid pSB-CAR19 mã hóa phân tử CAR hệ thứ hai kháng CD19 + Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI1640, huyết bào thai bò (fetal bovin serum - FBS), dung dịch penicillin streptomycin 1% - Ficoll-Paque PREMIUM (Cytiva Life Sciences, Hoa Kỳ) - Kít chuyển nạp P3 Primary Cell 4D-Nucleofector - Kít chuyển nạp Human T cell nucleofector - Hệ thống chuyển nạp Nucleofector 2b khác Sau đó, đưa nhẹ nhàng 10 ml hỗn hợp vào ống falcon 15 ml chứa sẵn ml Ficoll-Paque PREMIUM (p = 1,077 g/ml) cho lớp Ficoll máu không trộn lẫn với Các ống falcon ly tâm lạnh 400g 35 phút (không sử dụng chế độ phanh) Sau ly tâm, lớp PBMC (nằm plasma Ficoll) hút hòa vào 10 ml PBS 1X (0,5% BSA; pH 7,2) Sau tế bào rửa lần PBS 1X (ly tâm 300 ×g, 10 phút) hịa tan ml mơi trường ni cấy (RPMI-1640 bổ sung 10% FBS) 200 µl PBMC sử dụng cho đếm tế bào phân tích flow cytometry PBMC thu quan sát kính hiển vi soi ngược, đếm sống/chết nhuộm trypan blue 0,4% phân tích flow cytometry Các thơng số tổng lượng tế bào đơn nhân thu được, tỷ lệ tế bào sống tỷ lệ lymphocyte quần thể PBMC xác định - Hệ thống chuyển nạp Amaxa 4DNucleofector * Chuyển nạp vào PBMC tạo khối tế bào CAR-T: - Hệ thống BD FACSLyric Clinical System Tế bào đơn nhân máu ngoại vi sau tách kích hoạt sử dụng cho chuyển nạp Kích hoạt tế bào thực bi từ Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Hệ thống chuyển nạp, lượng tế bào, lượng DNA cho phản ứng chuyển nạp tối ưu Sau thu đủ số tế bào yêu cầu (ly tâm 200 ×g, 10 phút, nhiệt độ phịng, khơng sử dụng phanh), hịa tan 100 µl đệm chuyển nạp bổ sung lượng DNA khác - Các vật tư tiêu hao cần thiết phục vụ cho nuôi cấy tế bào: Chai nuôi cấy tế bào, pipet, chai đựng mơi trường, lọc vi khuẩn 0,45 µm (hãng ATCC, Hoa Kỳ) - Hệ thống phịng thí nghiệm phục vụ ni cấy tế bào: Phịng sạch, tủ ấm CO2, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C, tủ âm -200C, -800C, bình chứa nitơ lỏng Phương pháp nghiên cứu * Tách PBMC: Máu tươi (đã xử lý chống đơng) pha lỗng với PBS 1X (pH 7,2) tỷ lệ 89 T¹p chÝ y - dợc học quân số 4-2021 Hn hp ny sau chuyển vào Cuvette chuyên dụng (Lonza Biosciences), xung điện chương trình U-014 T-020 (đối với hệ thống Nucleofector 2b) EO-115 (đối với hệ thống Amaxa 4D-Nucleofector) Ngay sau xung điện, 500 µl môi trường nuôi cấy làm ấm bổ sung vào Cuvette toàn hỗn hợp chuyển vào đĩa giếng chứa ml môi trường nuôi cấy giếng Tế bào nuôi 24 trước đánh giá hiệu suất chuyển nạp phân tích tế bào theo dòng chảy * Đánh giá hiệu suất chuyển nạp phân tích tế bào theo dịng chảy: Thu 106 tế bào sau 24 chuyển nạp nhuộm với CD19 tái tổ hợp gắn FITC (rCD19-FITC, abcam, # ab246020) PI 7-AAD (hãng Thermo Fisher Scientifics, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau nhuộm, tế bào rửa PBS 1X hòa tan PBS 1X bổ sung 1% FBS trước phân tích với hệ thống BD FACSLyric Clinical System * Xử lý số liệu: So sánh trung bình nhóm độc lập T-test, so sánh trung bình nhóm phân tích phương sai ANOVA Xử lý số liệu phần mềm SPSS 20.0 GraphPad Prism 6, khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tối ưu hóa tỷ lệ pha lỗng máu với PBS Bảng 1: Kết đếm tế bào phân tích flow cytometry mẫu PBMC với tỷ lệ pha loãng máu PBS 1X khác Tổng số tế bào thu (× 10 ) Tỷ lệ tế bào sống (%) Tỷ lệ tế bào lympho (%) lần 1,66 ± 0,13 94,5 ± 2,1 63,04 ± 2,9 lần 1,84 ± 0,49 95,5 ± 0,7 60,82 ± 6,9 Khơng pha lỗng 0,97 ± 0,21 77 ± 1,4 60,9 ± 1,1 Pha loãng Tổng cộng 30 ml máu tươi chia thành phần pha lỗng với PBS 1X theo tỷ lệ: Khơng pha loãng, pha loãng lần pha loãng lần (do nhà sản xuất thường khuyến cáo tỷ lệ pha lỗng từ - lần) Sau đó, mẫu thực tách PBMC trình bày Đếm tế bào máy Countess II FL Automated Cell Counter; quan sát mẫu PBMC thu qua kính hiển vi thấy pha lỗng máu lần lần với PBS 1X cho kết tương đương Cụ thể, lượng tế bào sống đạt > 90% tổng lượng PBMC thu từ 10 ml máu đạt xấp xỉ 1,7 × 107 tế bào Tuy nhiên, khơng pha lỗng máu khiến tỷ lệ tế bào sống giảm 78%; tổng lượng tế bào thu từ 10 ml máu thấp hơn, mức 0,97 × 107 tế bào Phân tích flow cytometry cho thấy tỷ lệ tế bào lympho mẫu PBMC thu tương đương nhau, mức 60% Như vậy, thí nghiệm tách PBMC thực với tỷ lệ pha loãng máu lần PBS 1X (do pha lỗng lần có kết tốt chút so với lần tốn vật tư hóa chất nhiều thời gian xử lý mẫu kéo dài so với pha lỗng máu lần) 90 T¹p chí y - dợc học quân số 4-2021 Tối ưu hóa q trình chuyển nạp Hình 1: So sánh hiệu suất chuyển nạp vào PBMC hệ thống Nucleofector 2b Amaxa 4D-Nucleofector So sánh hiệu suất chuyển nạp tế bào khơng kích hoạt kích hoạt hệ thống Nucleofector 2b Amaxa 4D-Nucleofector Mỗi phản ứng chuyển nạp bao gồm 107 tế bào, 100 µl đệm chuyển nạp µg plasmid pmaxGFP Kết cho thấy hệ thống có hiệu suất chuyển nạp tương đương tế bào sau tách tế bào kích hoạt bi từ gắn kháng thể kháng CD3 CD28 Ngồi ra, kích hoạt PBMC cho hiệu suất chuyển nạp cao hệ thống Về mặt giá thành, cuvette chuyển nạp hệ thống 4D độc quyền hãng Lonza Biosciences, đó, cuvette cho hệ thống 2b mua từ số nhà sản xuất khác Mirus Bio, Biorad hay Thermo Fisher Scientifics với giá thành rẻ hơn, đó, lựa chọn chuyển nạp vào PBMC hệ thống Nucleofector 2b cho thí nghiệm Tối ưu số lượng tế bào cho phản ứng chuyển nạp Hình 2: Tối ưu hóa lượng PBMC cho phản ng chuyn np 91 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 4-2021 Phản ứng chuyển nạp vào PBMC sử dụng kít Lonza Biosciences thường thực với 106 - 107 tế bào/phản ứng Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy hiệu suất chuyển nạp tăng sử dụng × 107, chí × 107 tế bào cho phản ứng [4, 10] Do đó, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa lượng tế bào cho phản ứng chuyển nạp với × 106, 107 × 107 tế bào/phản ứng µg plasmid pSB100X µg plasmid pSB-CAR19 Kết cho thấy sử dụng × 107 tế bào/phản ứng cho hiệu suất biểu cao nhất, xấp xỉ 21% Ngoài ra, tỷ lệ tế bào sống 24 sau chuyển nạp đạt xấp xỉ 60% tất nghiệm thức (kết hiện) Do đó, × 107 PBMC sử dụng cho phản ứng chuyển nạp thí nghiệm Tối ưu hóa lượng plasmid cho phản ứng chuyển nạp Hình 3: Tối ưu hóa lượng chất pSB-CAR19 cho phản ứng chuyển nạp A: Tỷ lệ tế bào sống hiệu suất chuyển nạp B: Tổng số tế bào thu sau chuyển nạp 92 T¹p chÝ y - dợc học quân số 4-2021 Lng plasmid ảnh hưởng lớn tới hiệu suất tỷ lệ tế bào sống sau chuyển nạp Do đó, chúng tơi tiến hành so sánh thông số thực chuyển nạp với µg pSB-CAR19 (theo khuyến cáo nhà sản xuất Lonza Biosciences) 10 µg pSB-CAR19 Đối với pSB100X, lượng plasmid nhiều chứng minh gây chết lượng lớn PBMC sau chuyển nạp, vậy, pSB100X giữ nguyên mức µg/phản ứng Kết cho thấy hiệu suất chuyển nạp cải thiện rõ rệt (22,86 - 33,42%) tăng lượng chất pSB-CAR19 Bên cạnh đó, tỷ lệ tế bào sống tăng lượng DNA giảm từ 62,05% cịn 50,84% Như vậy, tính tổng lượng tế bào CAR-T sau chuyển nạp sử dụng 10 µg pSB-CAR19 2,8 × 106 3,39 × 106 Qua đó, sử dụng 10 µg chất pSB-CAR19 cho kết tốt sử dụng µg chất BÀN LUẬN Những nỗ lực nhằm chuyển gen vào tế bào T tạo khối tế bào CAR-T thực vào đầu năm 2000, dựa xung điện plasmid mã hóa phân tử CAR hướng đích CD19 kết hợp với gen kháng kháng sinh nhằm sàng lọc tăng sinh tế bào CAR-T Tuy nhiên, nỗ lực cho kết chuyển gen thấp, hệ thống Sleeping Beauty đời Nghiên cứu Huang CS trường Đại học Minnesota [5] Singh CS Trung tâm Ung thư MD Anderson [6] tất lợi việc sử dụng hệ thống chuyển vị SB so với phương pháp virus sử dụng phổ biến vector DNA trần khác Ngoài ra, plasmid transposase hệ SB100X đời giúp cải thiện đáng kể hiệu suất chuyển nạp vào tế bào T nói riêng PBMC nói chung [7], cho thấy hiệu chuyển nạp cao 10 - 100 lần so với plasmid SB11 hệ cũ Chất lượng số lượng PBMC phân lập từ máu toàn phần tác động đáng kể đến trình chuyển nạp tăng sinh tế bào CAR-T sau [8] Do đó, chúng tơi thực tối ưu hóa q trình tách PBMC từ máu ngoại vi người hiến khỏe mạnh Phương pháp tiêu chuẩn cho tách PBMC từ máu ngoại vi ly tâm mật độ môi trường tỷ trọng (Ficoll polysaccharide…) Kết cho thấy tỷ lệ pha loãng máu ngoại vi ≥ lần trước ly tâm cho hiệu suất thu hồi tế bào > 60% tỷ lệ tế bào sống khoảng 95% Kết tương tự với nghiên cứu công bố giới, với khuyến cáo thực pha loãng máu ngoại vi trước ly tâm tỷ trọng [9] Trong nghiên cứu, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa phản ứng chuyển nạp vào PBMC từ máu ngoại vi người khỏe mạnh Kết cho thấy điều kiện chuyển gen tối ưu đạt sử dụng hệ thống Nucleofector 2b, chương trình xung điện U-014, kít chuyển nạp Human T Cell Nucleofector, × 107 tế bào/phản ứng, µg SB100X 10 µg pSB-CAR19 Ngồi ra, hiệu suất chuyển nạp đạt tương đương với số công bố quốc tế lĩnh vực [10] 93 Tạp chí y - dợc học quân sè 4-2021 KẾT LUẬN Tối ưu hóa thành cơng q trình tách PBMC chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T hướng đích CD19 cho điều trị lơxê-mi cấp dịng lympho TÀI LIỆU THAM KHẢO Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E Cancer statistics CA Cancer J Clin 2010; 60(5):277-300 Terwilliger T, Abdul-Hay M Acute lymphoblastic leukemia: A comprehensive review and 2017 update Blood Cancer Journal 2017; 7(6):e577-e577 doi:10.1038/bcj.2017.53 Hunger SP, Mullighan CG Acute lymphoblastic leukemia in children N Engl J Med 2015; 373(16):1541-1552 doi:10.1056/ NEJMra1400972 Singh H, Manuri PR, Olivares S, Dara N, Dawson MJ, Huls H, et al Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system Cancer Res 2008; 68(8): 2961-2971 doi:10.1158/00085472.Can-07-5600 Jin Z, Maiti S, Huls H, Singh H, Olivares S, Mátés L, et al The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor Gene Therapy 2011; 18(9):849-856 doi:10.1038/gt.2011.40 Nazarpour R, Zabihi E, Alijanpour E, Abedian Z, Mehdizadeh H, Rahimi F Optimization of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) cryopreservation International Journal of Molecular and Cellular Medicine 2012; 1(2):88-93 Singh H, Figliola MJ, Dawson MJ, Olivares S, Zhang L, Yang G, et al Manufacture of clinical-grade CD19-specific T cells stably expressing chimeric antigen receptor using Sleeping Beauty system and artificial antigen presenting cells PLOS ONE 2013; 8(5):e64138 doi:10.1371/journal.pone.0064138 Kleiveland CR Peripheral blood mononuclear cells In K Verhoeckx, P Cotter, I López-Expósito, C Kleiveland, T Lea, A Mackie, T Requena, D Swiatecka, H Wichers (Eds.) The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models (pp.161-167) Cham: Springer International Publishing 2015 Huang X, Guo H, Kang J, Choi S, Zhou TC, Tammana S, et al Sleeping Beauty Transposon‐ mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies Molecular Therapy 2008; 16(3):580-589 doi:10.1038/sj.mt.6300404 10 Chicaybam L, Abdo L, Viegas M, Marques LVC, de Sousa P, Batista-Silva LR, et al Transposon-mediated generation of CART cells shows efficient anti B-cell leukemia response after ex vivo expansion Gene Therapy 2020; 27(1):85-95 doi:10.1038/ s41434-020-0121-4 KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ GIÃN NÃO THẤT BẰNG PHẪU THUẬT DẪN LƯU NÃO THẤT Ổ BỤNG Ngô Mạnh Hùng1 TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá kết điều trị phẫu thuật dẫn lưu não thất ổ bụng điều trị giãn não thất (GNT) người trưởng thành Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu mô tả, cắt 94 ... thống chuyển nạp Amaxa 4DNucleofector * Chuyển nạp vào PBMC tạo khối tế bào CAR-T: - Hệ thống BD FACSLyric Clinical System Tế bào đơn nhân máu ngoại vi sau tách kích hoạt sử dụng cho chuyển nạp. .. trình tách PBMC chuyển nạp tạo khối tế bào CAR-T ứng dụng điều trị lơ- xê- mi cấp dũng lympho Tạp chí y - dợc học quân sè 4-2021 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, vật liệu nghiên cứu. .. pháp CAR-T FDA công nhận ứng dụng Vi? ??t Nam chưa có nghiên cứu liệu pháp tế bào CAR-T điều trị ung thư nói chung lơ- xê- mi cấp dịng lympho nói riêng Do đó, tiến hành nghiên cứu nhằm: Tối ưu hóa q trình