Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannlol trong quả sim và làm sạch dịch chiết

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 20 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ đến khả năng chiết polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa 3.2.2 Mô hình hóa v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả nghiên cứu của luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ một học vị nghiên cứu nào

Tôi cũng cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Phạm Thị Mai

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tôi đã

có một quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp Trong thời gian này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, và động viên của các thầy cô giáo, gia đình và của bạn bè

Lời cảm ơn đầu tiên và trân trọng nhất, tôi xin gửi tới PGS TS Nguyễn Thị Bích Thủy, người thầy đã nhiệt tình giảng dạy trong suốt thời gian tôi học tập, người thầy đã rất tận tâm hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng gửi sự cảm ơn sâu sắc tới TS Lại Thị Ngọc Hà, người đã dành rất nhiều công sức để trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm, các thầy cô trong bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Một lời cảm ơn đặc biệt dành cho những người thầy thầm lặng, những

người đã giúp tôi tin rằng: “Con đường đến với tri thức là bao la và không

bao giờ dễ dàng”, nhờ đó tôi có thêm động lực để hoàn thành khóa học cũng

như luận văn này

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình và bạn bè thân thiết của tôi, cảm ơn các bạn trong lớp CNSTH K21 Cảm ơn những người thân yêu đã luôn ở bên, động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Phạm Thị Mai

2.4.1 Một số nghiên cứu về khả năng dược lý của piceatannol 12 2.4.2 Một số nghiên cứu về chiết xuất hợp chất tự nhiên trong đó có

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 20

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ đến khả năng

chiết polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa

3.2.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol từ quả sim 21 3.2.3 Nghiên cứu khả năng làm sạch dịch chiết piceatannol từ quả sim

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công đến khả năng chiết

polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong

3.3.3 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol từ quả sim 24 3.3.4 Nghiên cứu khả năng làm sạch dịch chiết piceatannol từ quả sim

3.4.2 Phương pháp tiến hành mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách

3.4.3 Phương pháp xác định tỷ lệ thu hồi và độ sạch tương đối của chất

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ đến khả năng

chiết polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa

4.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến khả năng chiết

polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong

4.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng chiết polyphenol tổng số,

piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết từ quả sim 38 4.1.4 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khả năng chiết polyphenol tổng số,

piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết từ quả sim 41 4.2 Mô hình hóa và tối ưu hoá quá trình tách chiết piceatannol từ quả sim 44

4.3 Nghiên cứu làm sạch dịch chiết piceatannol từ quả sim bằng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

DPPH : Diphenylpicryhydrazyl

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

GAE : Gallic Acid Equivalent

TE : Trolox Equivalent

CK : Chất khô

HPLC : Hight Performance Liquid Choromatography

PIC : Piceatannol

DANH MỤC BẢNG

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết polyphenol

tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết từ

4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng chiết

polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết polyphenol tổng số,

piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết từ quả sim 38 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết polyphenol tổng số,

piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết từ quả sim 41

4.9 Kết quả thực nghiệm khi chiết piceatannol từ quả sim ở điều kiện tối ưu 51 4.10 Hàm lượng piceatannol và độ sạch tương đối của các phân đoạn 52

DANH MỤC HÌNH

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết polyphenol

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết piceatannol từ

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng kháng oxi hóa trong

4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng chiết

4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng chiết

4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng kháng oxi

4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết polyphenol tổng số từ

4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết piceatannol từ quả sim 39 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa trong dịch

4.10 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết polyphenol tổng số từ

4.11 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết piceatannol từ quả sim 42

4.12 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng oxy hóa trong dịch

4.13 Ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến hàm lượng piceatannol 49 4.14 Kết quả dự báo của hàm mục tiêu piceatannol 50

4.16 Sắc ký đồ dịch chiết ban đầu theo điều kiện tối ưu 53

1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong xã hội hiện đại ngày nay, xu hướng tìm kiếm những loại thực phẩm chứa các hoạt chất tự nhiên có lợi cho sức khỏe đang là ưu tiên của rất nhiều người cũng như thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học Một trong số đó là các hợp chất polyphenol từ thực vật Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) đã phần nào chứng minh được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm giàu polyphenol

Các hợp chất polyphenol được quan tâm nhiều về tính chất chống oxy hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, tăng tuổi thọ và hỗ trợ điều trị một số bệnh (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2011) Một số nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, việc hấp thụ các polyphenol làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, tiểu đường, làm chậm quá trình lão hóa Hơn nữa, các polyphenol còn có tác dụng sinh lý học cụ thể trong việc điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh, những bệnh liên quan đến stress oxy hóa và viêm mãn tính (Williamson, 2005; Cicerale, 2012)

Trong thực vật, polyphenol là chất tạo màu đặc trưng, bảo vệ thực vật khỏi tác động của tia cực tím, sự xâm hại của vi sinh vật và các sinh vật gây hại khác như côn trùng Đối với các sản phẩm thực phẩm, các polyphenol giữ vai trò chủ đạo trong việc tạo nên màu sắc, mùi vị, hương thơm cho nhiều sản phẩm Gần đây nhất, các nhà khoa học cũng đã quan tâm nghiên cứu piceatannol (3,4’,3’,5 – trans-trihydroxystilbene), một stilbene có nhiều giá trị sinh học quý, đặc biệt về khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng béo phì

và ngăn ngừa ung thư (Wolter, 2002; Rimando, 2004; Kuo, 2008) Những khám phá mới về piceatannol đã mở ra hướng khai thác hợp chất tự nhiên này với rất nhiều hứa hẹn

Trên thế giới, việc nghiên cứu piceatannol trong rượu vang đỏ đã khẳng định một số đặc tính sinh học quý giá của hợp chất này Piceatannol thường

được tìm thấy trong nho, trái việt quất và chanh dây Những nghiên cứu bước đầu trong nước cũng đã phát hiện sự có mặt của piceatannol trong trái sim (đặc biệt là trong hạt) Quả sim có hàm lượng polyphenol và piceatannol cao hơn nhiều so với nho đỏ, sơri, táo đỏ,… (Lại Thị Ngọc Hà, 2010) Tuy nhiên, các thông tin khoa học cũng như các thông số của quá trình tách chiết piceatannol trong trái sim còn khá hạn chế

Sim có tên khoa học là Rhodomyrtus tomentosa (Ait.), đây là loài cây mọc

tự nhiên và phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Ở Việt Nam, sim thường mọc nhiều tại các vùng núi và hải đảo Từ xa xưa, việc dùng các bộ phận của sim làm phương thuốc chữa bệnh dân gian đã được ghi nhận như: trị dạ dày, thần kinh suy nhược, cầm máu,…

Ở nước ta sim được coi là cây dại, không có giá trị kinh tế, nhưng mọc hoang ở nhiều vùng và khá dễ trồng Việc nghiên cứu tách chiết piceatannol trong quả sim với các tác động khác nhau của yếu tố công nghệ sẽ cung cấp những thông tin khoa học hữu ích cũng như mở ra tiềm năng khai thác một loại nguyên liệu thực vật ở Việt Nam Từ những cơ sở nêu trên, chúng tôi tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol trong quả sim

- Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol từ quả sim

- Nghiên cứu khả năng làm sạch dịch chiết piceatannol từ quả sim bằng phương pháp phân tách lỏng rắn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Sim

2.1.1 Đặc điểm thực vật học

Sim có tên khoa học là Rhodomyrtus tomentosa (Ait.), ngoài ra còn có

một số tên khác: Hồng sim, Đào kim phượng, Mác nim (Tày),…) Sim rừng thuộc họ Myrtaceae, được chia làm hai loại: hồng sim và tiểu sim Cây mọc tự nhiên và phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á

Ở Việt Nam, sim là loài cây quen thuộc ở khắp các vùng trung du và núi thấp Cây đặc biệt ưa sáng và có khả nặng chịu hạn tốt, thường mọc rải rác hay tập trung trên các đồi cây bụi hay đồng cỏ Cây sim cao từ một đến hai mét, mọc tại những vùng đất hoang dã, chủ yếu mọc ở vùng rừng núi hoặc hải đảo như Phú Quốc, Côn Đảo, Lý Sơn và Hòn Gai

Cây sim thường mọc trên đất hoang, đồi trọc, ở vùng trung du và miền núi,

ở những nơi đất khô và chua Sim ra hoa quả nhiều hàng năm, thường ra hoa nhiều vào khoảng tháng 4 – 6 và thu hoạch trái vào khoảng tháng 7 – 8 Chúng là loại cây bụi cao 1 – 2 m Vỏ nâu, nứt rạn dài, nhiều sợi Cành non khía cạnh, nhiều lông mềm, sau là hình trụ nhẵn

Lá sim mọc đối, hình trái xoan, đầu tròn, gốc nhọn dần, lúc non có lông mềm, về sau nhẵn ở mặt trên, có lông mềm ở mặt dưới Cuống lá dài có lông, lá già màu xanh lục đậm, nhẵn bóng, mặt dưới màu vàng xanh có nhiều lông mịn,

lá non có lông cả hai mặt

Hoa sim có màu tím hồng, mọc đơn độc hay 3 hoa ở 1 nách lá, cuống hoa

có lông Nụ hoa hình cầu Đài hình ống dính vào bầu, chia 3 – 5 thùy, có lông mềm, dễ rụng Quả sim mọng, hình trứng, màu tím đậm, mang đài ở đỉnh, màu xanh sát cuống, phía trên màu đỏ nâu nhiều lông mịn, có mùi thơm, đường kính 1,2 - 1,5 cm, chứa nhiều hạt Hạt hình thang, màu nâu, xếp thành hai dãy trong mỗi ô phôi cong (Võ Văn Chi, 2004)

2.1.2 Thành phần hóa học

Bộ phận dùng chủ yếu của sim là lá, quả và rễ Lá thu hái vào mùa hè, dùng tươi hay phơi khô Quả chín hái vào mùa thu, phơi khô Rễ thu hái quanh năm, thái nhỏ, phơi khô Rễ, lá và trái sim được dùng làm dược liệu trong y học

cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc, có tác dụng bổ huyết, an thai Sim được xem là có vị ngọt/chát, tính bình Quả sim được cư dân các vùng miền núi hái ăn chơi, và trước đây có bày bán ở chợ Ở Phú Quốc, quả sim còn được khai thác để làm các món đặc sản như Mật sim hay Rượu sim

Nụ hoa sim có nhiều tanin, axit nicotinic, flavonoit, riboflavin… hoa sim

có tác dụng sát khuẩn nên có tác dụng tốt trong điều trị bệnh tiêu chảy Quả chứa các flavon - glucosid, malvidin - 3glucosid, các hợp chất phenol, các axit amin, đường và axit hữu cơ Thân và lá có nhiều hợp chất triterpen như betulin, axit betulinec,

Búp và lá sim non dùng để chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ Lá còn là thuốc cầm máu, chữa vết thương chảy máu Quả sim chín ăn được, dùng chế rượu, chữa thiếu máu lúc có mang, suy nhược khi mới ốm dậy Rễ sim chữa đau xương, lưng gối yếu mỏi,…

Một số chỉ tiêu hóa học của quả Sim đen (trồng tại Phú Quốc) đã được xác định và giới thiệu (Nguyễn Minh Thủy, 2011)

- Hàm lượng chất khô tổng số của quả tươi: 26.04 ± 0.83%

- Các chỉ số màu quả tươi: L =26.55 ± 1.51; a = 22.52 ± 4.30; b = 2.8 ± 0.88

- Hàm lượng polyphenol tổng số: 25.90 ± 0.65 mg axit galic tương đương (GAC)/g chất khô (CK)

- Khả năng kháng oxi hóa: 244.26 ± 15.62 µmol trolox tương đương (TE)/g

CK

- Hàm lượng anthocyanin: 2.72 ± 0.02 mg cyanidin-3-glucoside/g CK

So với các loại quả có hàm lượng polyphenol cao, quả sim chứa nhiều polyphenol hơn quả nho đỏ, sơ ri, táo đỏ (7.51; 17.12; 23.93 mg GAE/g CK) nhưng ít hơn quả dâu tây (41.35 mg GAE/g CK) và một số quả mọng Khả năng kháng oxi hóa của quả sim chín cũng cao hơn nho đỏ, sơ ri (64.29; 168.89 µmol TE/g CK) nhưng thấp hơn táo đỏ (292 µmol TE/g CK), dâu tây (358.4 µmol TE/g CK ) và một số loại quả mọng khác

Nghiên cứu mới đây về polyphenol của quả sim cho thấy stilbene và ellagitannin đóng góp 33.5% và 35% tổng lượng polyphenol trong mẫu quả sim đại diện Thành phần polyphenol nhiều nhất trong mẫu quả sim là piceatannol (2.3 mg/g CK (Lại Thị Ngọc Hà, 2013) Điều thú vị là hàm lượng piceatannol trong quả sim rất cao, hơn 5000-12000 lần so với quả việt quất (186- 422ng/g

CK (Rimando, 2004) và gấp 1000-2000 lần so với nho đỏ (0.27-0.54 µg/g CK (Guerero, 2010) Hơn nữa, hợp chất piceatanol trong sim cao hơn gấp 35 lần so với một thực vật được biết đến như một nguồn cung cấp piceatannol là cây chút

chít Nhật Bản (P cuspidatum) có hàm lượng piceatannol là 66 µg/g CK (Liu,

2007) Trên cơ sở đó, quả sim được biết đến như một nguồn cung cấp stilbene tự nhiên mới và đặc biệt hơn là piceatannol có thể sử dụng được trong cả thực phẩm và dược phẩm

Những kết quả nghiên cứu về hợp chất polyphenol cho thấy quả sim là loại quả có hàm lượng polyphenol, piceatannol và khả năng kháng oxi hóa cao Đây được xem như nguồn kháng oxy hóa tự nhiên cần được quan tâm khai thác trong chế biến thực phẩm và dược phẩm

2.2 Giới thiệu về polyphenol

2.2.1 Định nghĩa, phân loại

Phenol là những hợp chất thơm có nhóm hydroxyl đính trực tiếp vào nhân benzen Phân tử có nhiều nhóm hydroxyl đính trực tiếp với vòng benzen thì được gọi là polyhydroxylphenol (monomer), nhiều monomer gắn với nhau được gọi là polymer (Lê Ngọc Tú, 2003)

Sự đa dạng về cấu trúc, chức năng và sự phân bố rộng rãi các polyphenol trong thực vật dẫn đến nhiều cách khác nhau để phân loại chúng Polyphenol có thể được phân loại theo nguồn gốc, chức năng sinh học và cấu trúc hóa học Theo cấu trúc tùy vào cấu tạo mạch cacbon mà các hợp chất polyphenol được phân thành: phenol đơn giản (C6), phenolic acid, flavonoid (C6 – C3 – C6), stilbene (C6 – C2 – C6) và lignin (C6 – C2)n (Robards, 1999)

Hydroxybenzoic

acid (C 1 -C 6 )

Hydroxycinnamic acid (C 3 -C 6 )

Isoflavone Flavone Flavanone Flavaonol Flavanol Anthocyanin Chalcone

Proanthocyanidin

Polyphenol

b) Flavanoid

Flavanoid có mạch cacbon khung là C6 – C3 – C6

Tùy thuộc vào đặc điểm mạch cacbon (chứa nối đôi, chứa nhóm ceto, chứa nhóm hydroxyl) mà các hợp chất flavonoid có thể được chia thành các nhóm nhỏ hơn

c) Stilbene

Stilbene là những hợp chất nhỏ (MW = 210÷270 g/mol), được tìm thấy nhiều trong các loại thực vật, đặc biệt là ở vỏ quả nho Stilbene có 2 dạng đồng phân lập thể tùy thuộc vào sự bố trí các nhóm chức năng ở hai bên liên kết đôi

Thứ nhất là trans-1,2-diphenylethylene, gọi là E-stilbene hoặc trans-stilbene Thứ hai là cis-1,2-diphenylethylene, gọi là Z- stilbene hoặc cis- stilbene

d) Lignin

Lignin là hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở các

mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thấm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Lignin là sản phẩm ngưng tụ của nhiều phenylpropan Hai phenylpropan trùng ngưng tạo thành lignin Chúng có nhiều trong hạt lanh (hàm lượng lên tới 3.7 g/kg chất khô) Lignin và các dẫn xuất của chúng được quan tâm nghiên cứu vì chúng được cho là có khả năng ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh khác (Salee, 2005)

2.2.2 Vai trò của polyphenol

2.2.2.1 Vai trò của các hợp chất phenolic đối với thực vật

Polyphenol tạo màu sắc cho thực vật (màu đỏ dâu tây, táo; màu tím cho nho

và sim), bảo vệ thực vật khỏi tác động của tia cực tím và sự xâm hại của vi sinh vật Anthocyanin trong lá cây có nhiều chức năng sinh học có lợi cho cây nhờ khả năng chống tia UV, hủy các gốc tự do và bảo vệ chống lại các phản ứng oxi hóa Ngoài ra polyphenol của chúng sẽ tự tạo nên các hợp chất phenol mới hoặc các hợp chất phenol sẵn có sẽ bị oxi hóa làm tăng khả năng kháng khuẩn và nấm mốc Trong một số thực vật, polyphenol còn là chất điều hòa sinh trưởng (Ngô Xuân Mạnh, 2006)

Polyphenol đóng vai trò quan trọng khi bảo quản rau quả vì chúng có khả năng điều chỉnh các đặc tính sinh lý quan trọng của thực vật như “trạng thái ngủ”

và khả năng tự kháng khuẩn Khi rau, quả bị tổn thương (sứt, gãy, ong châm, vi sinh vật kí sinh) tế bào, sự oxi hóa các hợp chất phenol sẽ triệt tiêu các tế bào khu vực bị thương tổn (để tạo nên mô sẹo) cùng với các vi sinh vật kí sinh tại đó Tính chất này gọi là “phản ứng tự vệ linh cảm” của thực vật, nó tương tự với hiện tượng thực bào trong động vật (Trần Xuân Ngạch, 2007)

Polyphenol là vật liệu góp phần vào độ bền chức năng của thực vật và sự thẩm thấu của thành tế bào đối với khí và nước Nhiều polyphenol có hoạt tính vitamin P nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản Trong số đó, catechin có hoạt tính vitamin P cao hơn cả (Lê Ngọc Tú, 2010)

2.2.2.2 Vai trò của các hợp chất phenol đối với thực phẩm

Trong công nghệ thực phẩm, polyphenol giữ vai trò góp phần vào hương

vị, màu sắc các sản phẩm có nguồn gốc thực vật Khi sản xuất chè xanh, chè đen, chè đỏ hay chè vàng mức độ oxi hóa của các hợp chất phenolic đóng vai trò quyết định đến đặc trưng riêng của từng loại Polyphenol góp phần tạo nên màu

đỏ đẹp của sản phẩm trong sản xuất rượu vang Ở mức độ nhất định chúng còn tham gia vào các quá trình tạo ra các cấu tử hương thơm mới đặc biệt cho sản phẩm (Lê Ngọc Tú, 2003)

Ngoài ra, nhờ đặc tính kháng khuẩn, các polyphenol cũng có thể áp dụng trong bảo quản thực phẩm Một nghiên cứu của Ấn Độ cho thấy chất polyphenol

có trong trà xanh có thể giúp bảo quản thực phẩm tươi sống như thịt lợn, thịt bò,

cá Tác giả cho biết trong thí nghiệm với thịt cừu, chiết xuất từ trà xanh cho phép bảo quản thịt cừu ở nhiệt độ 25oC và độ ẩm là 85% Chiết xuất từ trà xanh giàu chất polyphenol cho phép loại bỏ vi khuẩn xâm nhập làm hỏng thịt trong vòng 4 ngày Hơn nữa, việc sử dụng chiết xuất trà xanh để bảo thịt tươi sống không làm thay đổi mùi vị của thịt Ngoài ra, các gốc tự do và các sản phẩm của sự oxi hóa

ít xuất hiện ở những loại thịt được bảo quản với tinh chất trà xanh

(Kumudavally, 2008) Trong một loạt các thử nghiệm, các nhà nghiên cứu từ đại học Arkansas cho biết khi kết hợp với một lượng nhỏ các hóa chất bảo quản, các chất chiết xuất từ trà xanh và hạt nho có thể ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn

Listeria monocytogenes đến mức không phát hiện khi bảo quản thịt gà, xúc xích

gà (Mitchell, 2010) Điều này góp phần giảm đáng kể lượng hóa chất bảo quản dùng trong chế biến thực phẩm

Polyphenol còn có tác dụng như chất phụ trợ sản xuất trong sản xuất nước rau quả và rượu vang do có khả năng kết tủa với protein (tannin tạo muối tannat protein không tan) và với các chất keo tự nhiên khác (keo protein, keo pectin) để

tự làm trong sản phẩm (Trần Xuân Ngạch, 2007)

2.2.2.3 Vai trò của các hợp chất phenol đối với sức khỏe con người

Quá trình oxi hóa phá hủy các thành phần của tế bào như DNA, protein, chất béo và sự tích lũy các sản phẩm oxi hóa là nguyên nhân của các bệnh ung thư, tim mạch, loãng xương, các bệnh thoái hóa có liên quan tới quá trình lão hóa Các chất chống oxy hóa như polyphenol có trong thực phẩm có thể góp phần hạn chế những bệnh này bằng cách tác động trực tiếp lên các chất oxi hóa, kích thích hệ miễn dịch nội sinh của cơ thể (Kehrer, 1994)

Polyphenol là chất chống oxy hóa có nhiều nhất trong chế độ ăn uống và là thành phần phổ biến rộng rãi của trái cây, rau, ngũ cốc, các loại đậu khô, sô cô

la, và đồ uống, chẳng hạn như trà, cà phê, hoặc rượu Nghiên cứu thực nghiệm trên động vật hoặc các dòng tế bào nuôi cấy, polyphenol có vai trò trong công tác phòng chống bệnh tim mạch, ung thư, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường,

hoặc loãng xương

Polyphenol giúp chống lại căn bệnh tim mạch sự hiện diện của thành phần

polyphenol trong bữa ăn sẽ giúp chống lại quá trình oxy hóa của các cholesterol xấu, ngăn chặn hiện tượng tắc nghẽn động mạch Flavonoid hiện diện trong cả trà xanh, trà đen, trong một số loại rau, táo, hành, bông cải, nho và rượu vang có khả năng chống tụ máu, chống xơ cứng động mạch (Nguyễn Xuân Luyến, 2011)

2.3 Giới thiệu về piceatannol

2.3.1 Đặc điểm hóa học

Piceatannol có những tên khác nhau: 3,5,3’,4’-tetrahydroxystilbene; (3,4-dihydroxyphenyl)ethenyl] benzen-1,3-diol; 3’-hydroxyresveratol Trong phân loại các hợp chất phenol thì piceatannol thuộc nhóm stilbenes Cấu trúc hóa học của piceatannol (C14H12O4) được xác định tương tự với cấu trúc của resveratrol (Cunningham, 1963) Piceatannol là chất bột màu trắng (trong methanol) có điểm nóng chảy ở 223 – 226oC và có khối lượng phân tử 244,24 Piceatannol tan khá tốt trong dung môi ethanol với độ tan là 1mg/ml Phân tích quang phổ trong ethanol thấy rằng piceatannol hấp thụ tối đa ở bước sóng 322nm, trong khi trans- reservatrol hấp thụ tối đa ở bước sóng 308nm Cơ chế ngăn chặn các gốc tự do của hợp chất resveratrol, và chất chuyển hóa của nó piceatannol đã được nghiên cứu Cấu trúc tinh thể của piceatannol cho thấy có thể thông qua chuyển động phối hợp của các nguyên tử hydro và hydroxyl để tạo

5-[2-ra các chuỗi liên kết hydro Chính các tổ chức liên kết này cung cấp một con đường tốn ít năng lượng cho việc chuyển giao của các nguyên tử hydro và là một yếu tố góp phần vào hoạt động sinh học của piceatannol (Rossi, 2008)

Hình 2.2 Công thức hóa học của piceatannol

Cấu trúc hóa học của piceatannol tương tự như cấu trúc hóa học của resveratrol, tuy nhiên piceatannol ít được nghiên cứu hơn resveratro và hiện tại piceatannol đang được mở rộng quan tâm về hoạt tính sinh học Dựa trên nghiên cứu vivo, tại gan piceatannol nhanh chóng chuyển hóa và chủ yếu tạo một liên hợp glucuronide Các tính chất dược lý của piceatannol, đặc biệt là khả năng kháng u, chống oxy hóa, và các hoạt động chống viêm, cho thấy rằng piceatannol có thể là một phân tử sinh học dinh dưỡng và có dược khả dụng hữu

ích Piceatannol là chất chống oxy hóa mạnh So với resveratrol, piceatannol có nhiều hơn một nhóm hydroxyl do đó nó có khả năng kháng oxi hóa cao hơn Cấu trúc catechol trong piceatannol là một trong các cấu trúc có khả năng kháng oxi hóa cao nhất Tuy nhiên, các nhà khoa học cần tìm hiểu nhiều hơn về dược khả dụng cũng như độc tính của chất này ở người (Piotrowska, 2012)

2.3.2 Nguồn piceatannol

Piceatannol là một chất chuyển hóa của resveratrol Resveratrol được phân lập lần đầu tiên bởi Takaoka từ rễ cây trị điên thảo trắng vào năm 1940, và sau đó vào năm 1963, từ rễ của cây hà thủ ô Nhật Bản Rễ của nó chứa rất nhiều resveratrol, nhiều hơn bất kì loại thực vật nào và hiện nay nó là nguồn tự nhiên cung cấp resveratrol, để điều trị nhiều bệnh như các bệnh nấm, viêm da, bệnh tim mạch và gan Tuy nhiên, resveratrol đã được tìm thấy trong nhiều loại khác nhau bao gồm nho, hoa quả và đậu phộng Ngoài tác dụng bảo vệ tim mạch, resveratrol có đặc tính chống ung thư, bao gồm bạch huyết và ung thư tủy; đau tủy, dạ dày, đại tràng, tuyến tụy,… Trong cơ thể, resveratrol sau khi hấp thụ được tập trung, chuyển hóa ở gan và thận Chất này có thể ngăn chặn các chất gây ra ung thư, ngoài ra resveratrol có biểu hiện để điều trị chống ung thư Một

số thông tin dù còn hạn chế đã tiết lộ rằng resveratrol là dược phẩm khá an toàn Hiện nay, các cấu trúc tương tự của resveratrol với việc cải thiện dược khả dụng sinh học đang được theo đuổi như tác nhân điều trị tiềm năng cho bệnh ung thư (Aggarwal, 2004)

Stilbenes từ nho và rượu vang đóng một vai trò chủ đạo trong các chế độ

ăn uống của con người bởi chất chống oxy hóa, tính chất chống ung thư và chống gây đột biến Buiarelli đã mô tả phương pháp để xác định trực tiếp một số stilbenes (resveratrol, piceatannol và piceatannol glucoside) trong rượu vang bằng sắc ký lỏng cao áp và sắc ký khối phổ đa cực Tổng cộng có 19 mẫu rượu vang Ý màu đỏ và 3 mẫu màu trắng được phân tích và sự khác biệt trong thành phần stilben đã được tìm thấy trong các mẫu Tất cả các chất cần phân tích đã được tách ra trên cột C-18 sử dụng gradient rửa giải, một lần duy nhất Các giới

hạn nồng độ phát hiện là 48,0 ng/ml với resveratrol và 50,0 ng/ml với piceatannol Hàm lượng resveratrol và piceatannol giàu nhất ở trong rượu Montepulciano được sản xuất ở Lazio (Buiarelli, 2007)

Piceatannol từng được tìm thấy trong rễ một loại cây ở Na Uy (Münzenberger, 1990) Nguồn cung cấp piceatannol quan trọng nhất trong chế

độ ăn uống của con người là rượu vang và nho Một báo cáo cho biết nồng độ piceatannol trong nho thấp hơn 4 lần so với resveratrol (tương ứng là 0,78 và 3,18 µg/g), tuy nhiên nồng độ piceatannol trong vang đỏ cao hơn khoảng 2 lần

so với resveratrol (Cantos, 2000)

Piceatannol cũng được tìm thấy trong quả chanh leo (Passiflora edulis), cây trà trắng (Melaleuca leucadendron), cây đậu châu Á (Cassia garettiana),

Cassia marginata , đại hoàng (Rheum spp),… (Piotrowska, 2012)

2.4 Một số nghiên cứu về piceatannol

2.4.1 Một số nghiên cứu về khả năng dược lý của piceatannol

Trên thế giới có khá nhiều các nghiên cứu về piceatannol trong trái cây và các khả năng dược lý của hợp chất này Từ những nghiên cứu đó đã mở ra khả năng ứng dụng của piceatannol trong sản xuất một số loại dược phẩm và thực phẩm chức năng Năm 2004, một nghiên cứu được tiến hành để xác định sự hiện diện của chất resveratrol, pterostilbene và piceatannol trong quả việt quất Nghiên cứu này cũng khẳng định, các stilbenes tự nhiên được biết đến là chất chống oxy hóa mạnh mẽ và có các hoạt tính ngăn ngừa ung thư, sẽ góp phần chủ động tăng cường sức khỏe từ việc tiêu thụ các loại trái cây (Rimando, 2004)

Một loại sản phẩm mới thú vị là rượu đã được làm giàu các chất có lợi cho sức khỏe, chủ yếu là hợp chất resveratrol và piceatannol Các nhà khoa học

đã đưa ra quá trình giám sát sản xuất để có được rượu vang đỏ làm giàu hợp chất resveratrol và piceatannol mà không mất chất lượng Trong đó hàm lượng piceatannol tăng lên 26 lần (Guerreroa, 2010)

Piceatannol có khả năng ngăn chặn các khối u và ngăn chặn hoạt động của bạch cầu, tuy nhiên các cơ chế hoạt động phân tử ngăn chặn khối u thì chưa

được nghiên cứu một cách chi tiết (Wieder, 2001) Một báo cáo khác cho rằng, những phát hiện nghiên cứu đã ghi nhận piceatannol (dạng trans) có thể hoạt động như tác nhân ngăn ngừa ung thư tiềm năng theo một cơ chế khác với resveratrol (Pierre, 2001) Ngoài ra, các nghiên cứu khác cũng nhận thấy piceatannol ức chế tiến triển qua các giai đoạn S của chu kỳ tế bào trong đại trực tràng bị ung thư tế bào dòng 1 Trên cơ sở những phát hiện của các nhà khoa học, piceatannol có thể được coi là một chất ngăn ngừa ung thư hoặc điều trị ung thư đầy hứa hẹn (Wolter, 2002)

Piceatannol còn thể hiện khả năng kháng viêm theo nhiều cơ chế khác nhau Piceatannol ngăn chặn sự kích hoạt của yếu tố phiên mã NF-ĸB, đóng vai trò trung tâm như một gen điều hòa quá trình phiên mã đáp ứng lại stress tế bào gây ra bởi các gốc tự do, tia cực tím chiếu xạ, cytokine hoặc các kháng nguyên của vi sinh vật Piceatannol cũng được chứng minh là ức chế COX2 xúc tác sự tạo thành prostaglandin, các mediator trong quá trình viêm (Son, 2010)

Theo một nghiên cứu khác, PIC được đánh giá hiệu quả kháng viêm trên chuột bị bệnh viêm đại tràng Kết quả cho thấy, có sự cải thiện đáng kể các dấu hiệu lâm sang về rối loạn cấu trúc ruột cũng như lượng myeloperoxidase (MPO)

và các chất trung gian gây viêm (NO) giảm đáng kể Nghiên cứu này mở ra khả năng nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng của PIC như một tác nhân trong điều trị các bệnh viêm đường ruột ở người (Kim, 2008)

Chiết xuất từ hạt của chanh dây chứa một lượng cao Piceatannol ức chế tạo melanin và thúc đẩy tổng hợp collagen Nghiên cứu được thử nghiệm trên các tế bào có khối u ác tính của người và trên nguyên bào sợi da Hiệu quả của chanh dây trong việc ức chế melanin và tổng hợp collagen đã được khẳng định Ngoài

ra, việc sản xuất collagen hòa tan được tăng lên trong các tế bào nguyên bào sợi của da khi có mặt vỏ hạt và vỏ, hiệu ứng này không xuất hiện khi có mặt thịt quả Hơn nữa, các hiệu ứng mô tả trên cũng không xuất hiện khi loại bỏ các polyphenol từ hạt quả Nhóm tác giả phát hiện rằng, piceatannol hiện diện trong

hạt trái cây chanh dây với số lượng lớn và rằng hợp chất này là thành phần chính chịu trách nhiệm về hiệu ứng quan sát trên gen menalin và collagen tổng hợp khi

có hạt quả (Matsui, 2010)

Hoạt động Antileishmanial (chống lại một các thể nhiễm leishmanial) của piceatannol từ hạt Euphorbia lagascae Các stilben, piceatannol, đã thể hiện các hoạt động chống lại leichmania trong và ngoài tế bào, đặc biệt là hình thức ngoại bào của ba loại leishmania Cũng từ đây một loại thuốc lâm sàng dòng đầu tiên

đã ra đời có tên Pentostan (Duarte, 2008)

Bên cạnh đó, vai trò kháng sinh, khả năng ức chế tạo u và tế bào ung thư trên một số dòng tế bào và mô hình động vật của piceatannol trong nho và rượu vang cũng đã được ghi nhận Piceatannol là một chất ức chế protein kinase do đó làm thay đổi nhiều tế bào đích gây ức chế miễn dịch, chống bệnh thuộc bạch cầu,

và các hoạt động chống tạo u ở một số dòng tế bào và các mô hình động vật Trong nghiên cứu này, hoạt động kháng sinh của piceatannol đã được điều tra Kết quả cho thấy piceatannol ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư bàng quang T24 và HT1376 bằng cách ngăn chặn sự tiến triển chu kỳ tế bào trong giai đoạn G0/G1 (Kuo, 2008)

Mặc dù có nhiều tài liệu cho thấy resveratrol có nhiều lợi ích tốt với sức khỏe trong việc can thiệp sự phát triển của bệnh béo phì, vai trò của piceatannol trong sự phát triển của các mô mỡ và các bệnh liên quan chưa được biết rõ Một kết quả rất đáng chú ý vào năm 2012 tại trường đại học Purdue, các nghiên cứu thử nghiệm với các tế bào chất béo trong ống nghiệm, khi có sự hiện diện của piceatannol đã làm thay đổi thời gian biểu hiện gen, chức năng gen và hoạt động của insulin, dẫn đến sự chậm trễ hoặc ức chế hoàn toàn mỡ trong Các nhà khoa học đã tìm cách xác định chức năng của piceatannol trong mỡ trong và làm sáng

tỏ cơ chế cơ bản Kết quả cho thấy piceatannol ức chế mỡ trong kèm với giảm hoạt hóa của đường tín hiệu insulin Qua đó mở ra mục tiêu mới của piceatannol trong việc kiểm soát ở giai đoạn đầu hình thành mỡ trong (Kwon, 2008)

Với các hoạt tính có tác động tốt tới sức khỏe con người, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu thu nhận và làm giàu hợp chất piceatannol trong các loại thực vật Bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo của cây lạc (Arachis hypogaea) dưới các điều kiện được kiểm soát đã tạo ra resveratrol và piceatannol đáng kể

và được xem là nguồn sản xuất hợp chất piceatannol Đáng chú ý là hàm lượng piceatannol trong các mô sẹo là 2,17 – 5,31 mg/g cao hơn nhiều so với các giá trị trước đó đã ghi nhận trong khi hàm lượng resveratrol gần như tương đương các giá trị đã báo cáo (Kuo, 2005)

2.4.2 Một số nghiên cứu về chiết xuất hợp chất tự nhiên trong đó có piceatannol

Việc khai thác các hợp chất hoạt tính sinh học từ nguyên liệu thực vật là bước đầu tiên trong việc sử dụng hoạt tính quý từ thực vật Polyphenol có thể được chiết xuất từ nguyên liệu tươi, mẫu đông lạnh hoặc mẫu đông khô Thông thường, mẫu trước khi chiết xuất thường được nghiền, mài và đồng nhất Nói chung, mẫu đông khô vẫn giữ được mức hàm lượng phenol trong các mẫu thực vật cao hơn hơn so với mẫu sấy thường

Chiết xuất dung môi thường được sử dụng để chiết xuất từ nguyên liệu thực vật do dễ dàng sử dụng, hiệu quả và ứng dụng rộng rãi Dung môi như methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, và sự kết hợp của chúng đã được sử dụng để tách phenol từ nguyên liệu thực vật Ethanol là một dung môi tốt cho chiết xuất polyphenol và an toàn cho con người Các phương pháp khai thác thông thường như ngâm và chiết Soxhlet đã cho thấy hiệu quả thấp và tiềm ẩn nguy cơ ô nhiễm môi trường Trong những năm gần đây, một số phương pháp đã được phát triển như lò vi sóng, nhờ hỗ trợ của siêu âm (UAE), và các kỹ thuật dựa trên sử dụng chất lỏng nén làm tác nhân chiết xuất, hoặc tăng tốc tách chiết dung môi (ASE) cũng được áp dụng trong quá trình chiết xuất các hợp chất phenol từ nguyên liệu thực vật Chẳng hạn như sử dụng carbon dioxide là chất lỏng nén làm dung môi chiết là được gọi là siêu tới hạn chất lỏng, ngoài ra còn

có phương pháp khai thác chất lỏng dưới tới hạn (Dai, 2010)

Đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng các loại dung môi khác nhau để chiết xuất polyphenol từ thực vật Khi nghiên cứu về chiết xuất polyphenol trên quả chanh dây, trong đó có xác định piceatannol, chanh dây được chia thành ba phần,

vỏ, thịt, và hạt, nồng độ polyphenol trong hạt cao hơn trong vỏ và thịt Các thí nghiệm trong nghiên cứu được thực hiện bằng ethanol 80% (Matsui, 2010) Trong việc tìm kiếm các hợp chất hoạt tính sinh học từ một loại cây thân thảo mọc tại phía đông nam của bán đảo Iberic, các tác giả đã phân lập bằng phương pháp sắc ký một stilben, hai coumarin và hai este diterpene 12 deoxyphorbol Hạt đã khử chất béo được chiết xuất bằng methanol Cấu trúc của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ bởi sự kết hợp của dữ liệu vật lý và quang phổ (Duarte, 2008)

Chiết xuất polyphennol bằng hệ dung môi methanol: acetone: nước (MAW ) theo tỷ lệ thể tích 7: 7: 6 thực hiện trên cây gai dầu, lanh và hạt cải đã khử chất béo Ngoài ra các nguyên liệu trên còn được chiết với các dung môi methanol, ethanol, acetone, methanol 80% Kết quả cho thấy, MAW có khả năng chiết xuất phenol và flavonoid cao nhất trong hạt cải, tiếp theo là acetone 80% và methanol 80% Khả năng chống oxy hóa có tỷ lệ thuận với lượng polyphenol chiết xuất được Khả năng thu hồi các polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao nhất trên hạt cải dầu, tiếp theo là cây gai dầu và hạt lanh Chiết xuất MAW của cải dầu chứa hàm lượng polyphenol tổng số là 21,05 ± 2,5 mg GAE /g trọng lượng tươi Xác định các nhóm chất trong hợp chất polyphenol được thực hiện bằng HPLC cũng cho thấy sự có mặt cao nhất của các polyphenol ngoại trừ axit galic và catechin (Farhan, 2012)

Trong một nghiên cứu về chiết xuất polyphenol tổng số từ một số loại bột thực vật, nhóm tác giả đã sử dụng nước, ethanol,acetone và methanol Các kết quả cho thấy, ethanol chiết polyphenol tổng số tốt hơn hơn acetone, nước hay methanol (Koffi, 2010) Một nghiên cứu khác về tối ưu quá trình chiết xuất polyphenol từ lá ô liu Nồng độ dung dịch ethanol tối ưu được tìm ra là 70% Đồng thời dựa trên các phân tích định tính và định lượng để tìm ra thời gian và

nhiệt độ chiết xuất tối ưu Các kết quả về điều kiện tối ưu để chiết xuất được nhiều nhất polyphenol là ở nhiệt độ 85°C và thời gian 30 phút Ở điều kiện tối

ưu này thì hiệu suất thu được polyphenol cao hơn đáng kể so với phương pháp chiết xuất thông thường (40°C, 48 giờ) (Stamatopoulos, 2014)

Các tác giả cũng đã sử dụng phương pháp tối ưu hóa ngẫu nhiên (RCO) khi nghiên cứu về quá trình chiết xuất polyphenol từ thịt quả của cây ngũ vị tử,

Ba chỉ tiêu được đánh giá là hàm lượng polyphenol, chất chống oxy hóa và năng suất chiết xuất Chương trình tối ưu hóa này cho phép đề xuất tập hợp 6 giá trị biến đầu vào là: tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, thời gian gia nhiệt và số lần chiết xuất lặp lại Kết quả điều kiện chiết tối ưu thu được là: tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 8/1, nồng độ ethanol 67,3%, pH ban đầu 1.75, nhiệt độ 55°C trong 4 giờ và chiết xuất lặp đi lặp lại 4 lần Khi đó hàm lượng polyphenol tương ứng chiết được là 1,847 mg/g (Wu, 2011)

Một nghiên cứu về resveratrol, pterostilbene và piceatannol trong quả việt quất Các mẫu đại diện được lựa chọn từ giống của 10 loài từ các vùng khác nhau và được phân tích bằng sắc ký khí/phổ khối Piceatannol đã được

tìm thấy trong 2 loại V corymbosum và V stamineum ở mức 138-422 ng/g

mẫu khô Đây cũng là hàm lượng trung bình được tìm thấy ở các loại việt quất khác Hàm lượng resveratrol cao nhất được tìm thấy trong loại Lingonberry đạt 5884 ng/g mẫu khô, tương đương với hàm lượng tìm thấy trong nho, 6471 ng/g mẫu khô (Rimando, 2004)

Ở một nghiên cứu khác của cùng nhóm tác giả đã cho các thông số chi tiết của quá trình chiết xuất các stilbene và xác định sự có mặt của piceatannol từ quả một số loại quả việt quất Với việt quất của Hoa Kỳ, nhóm tác giả sử dụng quả đông khô, hỗn hợp dung môi chiết là methanol/ aceton/ nước/ acetic theo tỉ

lệ 40: 40: 20: 0,1 Trong thí nghiệm này nhiệt độ chiết là 40oC và với thiết bị chiết xuất đặc biệt có áp lực thì thời gian được theo dõi là 5 phút, 10 phút Dịch chiết sau đó được cô quay chân không và loại bỏ dung môi hữu cơ Dung dịch

thu được tiếp tục được chiết với ethyl acetate và kiểm tra hàm lượng Với quả việt quất đông khô còn có thể dùng dung môi chiết xuất khác là hỗn hợp methanol: nước: axit formic theo tỉ lệ 80: 20: 0.1 trong 30 phút ở 60oC (Rimando, 2005)

Với quả việt quất của Canada: nhóm tác giả sử dụng quả đông lạnh, hỗn hợp dung môi chiết methanol, acetone-nước-formic theo tỷ lệ thể tích 40: 40: 20: 0,1 Thí nghiệm chiết này được thực hiện trong 30 phút Dịch chiết được lọc qua sợi thủy tinh G6, phần dư tiếp tục được chiết xuất lần hai trong 30 phút Sau khi loại bỏ dung môi, dịch còn lại được tách rửa trên cột C18 Dung môi tách rửa

là hỗn hợp methanol-acetone-nước-formic theo tỉ lệ thể tích 40: 40: 20: 0,1 (Rimando, 2005)

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về polyphenol và đặc biệt là hợp chất piceatannol trong trái cây cũng như tính chất hóa học, khả năng dược lý còn khá hạn chế Tuy nhiên, các nghiên cứu bước đầu đã định hướng tìm hiểu hợp chất polyphenol trong một loại nguyên liệu sẵn có trong nước là quả sim (trồng tại Hòa Bình) (Lại Thị Ngọc Hà, 2010)

Gần nhất, nghiên cứu về các hợp chất phenol trong nguyên liệu sim trồng tại Hải Dương và Thái Nguyên đã cho thấy hàm lượng piceatannol chiếm một tỷ

lệ lớn (khoảng gần 20%) trong các hợp chất phenol được phát hiện (Lai, 2013) Mục đích của nghiên cứu này là để xác định thành phần phenolic và đánh giá những thay đổi hàm lượng trong quá trình trưởng thành Bằng phân tích HPLC- ESI - HR- MS, 19 hợp chất phenolic (PCs) đã được thăm dò và xác định, thành phần chính là stilbenes và ellagitannins, tiếp theo là anthocyanins, flavonol, và axit Gallic Các hợp chất phenolic sau đó tiếp tục được định lượng bằng HPLC - DAD Piceatannol trong quả là một trong những thành phần của kết quả chạy PC cho kết quả với hàm lượng 2,3 mg/g trọng lượng khô ở giai đoạn quả chín hoàn toàn Hàm lượng này cao hơn gấp 1000-2000 lần so với nho đỏ, trong khi nho đỏ

là một nguồn thực phẩm chính chứa stilben trong chế độ ăn uống của con người

Quả sim trưởng thành trong bóng râm cho hàm lượng piceatannol cao hơn so với các loại trái sim từ cây chịu nắng

Với những nghiên cứu trên thế giới cũng như các phát hiện ban đầu ở Việt Nam cho thấy rõ hơn tiềm năng của quả sim, một loài thực vật được khai thác từ Đông Nam Á, như một nguồn trái cây tăng cường sức khoẻ Những thông tin này đã mở ra khả năng có các nghiên cứu sâu sắc và toàn diện hơn nhằm cung cấp các thông tin khoa học cũng như để khai thác một loại cây có nhiều tiềm năng quý giá

Từ các kết quả nghiên cứu về các hợp chất polyphenol cho thấy, quả sim là loại quả có hàm lượng polyphenol, hàm lượng piceatannol và khả năng kháng oxi hóa cao Điều này hứa hẹn góp phần làm tăng giá trị sinh học và kinh tế của cây sim trong vai trò là một nguồn kháng oxi hóa tự nhiên mới cần được khai thác, ứng dụng trong chế biến thực phẩm và dược học Trong quá trình tách chiết hợp chất sinh học từ quả sim rất cần thiết nghiên cứu các ảnh hưởng của các yếu

tố công nghệ đến hàm lượng thu nhận hợp chất này Từ đó có thể mô hình hóa

và tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu là quả sim được thu hái ở Thái Nguyên Quả sau khi thu hái về được rửa sạch, để ráo, và sấy đông khô cả quả Mẫu sau khi sấy đông khô, được nghiền cả quả thành bột mịn và bảo quản ở -53oC bằng nitơ lỏng

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Các loại thiết bị

- Cân phân tích điện tử AR2140 (d=0.0001g, Ohaus Crop-pine Brook, Mỹ)

- Máy Vortex maxi mix II (Mỹ)

- Bể ổn nhiệt (GFL, Đức)

- Máy ly tâm Mikro 220R (Hettich zentrifugen, Đức)

- Máy quang phổ kế UV-1800-240V (Shimazu - Nhật Bản)

- Máy khuấy từ IKA RH basic 2 (Đức)

- Tủ lạnh sâu -53oC (Thermo scientific, Mỹ)

- Hệ thống sắc kí HPLC Shimadzu (Nhật Bản) bao gồm:

+ Bơm LC – 10Ai

+ Buồng cột CIO – 10ASVT

+ Degasser DGU – 20A3

+ UV/VIS detector SPD – 20A

+ Bộ kiểm soát CBM – 20A

+ Cột sắc ký Phenomenex C18 (Phenomenex, CA, Mỹ)

- Cột tinh sạch Sep-Pak Cartriges loại C18:

+ Chế độ đảo ngược pha

+ Kích thước hạt 55-105 mm

+ Chất nền hấp thụ chất Silica

+ Phạm vi pH: 2-8 pH

Dụng cụ

- Ống falcon 15ml, 50 ml; ống ependoff; bình tam giác thể tích 100ml,

250 ml; bình định mức 10ml, 50ml, 100ml, 500ml, 1000ml; pipetmen 100µl, 1000µl,…; pipet 5ml, 10ml; ống nghiệm, cốc đong; ống đong

Hóa chất

- Thuốc thử Folin-ciocalteu, DPPH (2,2-diphenyl-1-pricryhydrazy), Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), các chất chuẩn axit galic, piceatannol (Sigma, Đức)

- Các hóa chất phân tích HPLC: acetonitrile, axit acetic, ethylenediamine axit tetraacetic (EDTA), methanol của Merck (Đức),…

- Các loại hóa chất xuất xứ Trung Quốc: methanol, aceton, axit acetic, KCl, HCl, CH3COONa.3H2O, Na2CO3,…

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Thực hiện thí nghiệm tại bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ đến khả năng chiết polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết

từ quả sim

- Ảnh hưởng của nồng độ ethanol

- Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

- Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

- Ảnh hưởng của thời gian chiết

3.2.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol từ quả sim 3.2.3 Nghiên cứu khả năng làm sạch dịch chiết piceatannol từ quả sim bằng phương pháp phân tách lỏng rắn

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Sơ đồ chiết xuất từ mẫu quả sim

Mẫu bột

Thêm dung môi ethanol: nước

ToC, thời gian chiết τ,

Ly tâm

Loại Bã Dịch trong Phân tích trên HPLC

Thuyết minh sơ đồ

Cân chính xác khoảng 0,25 – 0,5g bột quả sim cho vào ống falcon 15ml

Bổ sung ethanol theo tỉ lệ thích hợp, lắc đều các ống falcon và đặt các ống này trong bể ổn nhiệt Các ống falcon được đặt nằm ngang và có bật máy lắc Nồng

độ của ethanol, nhiệt độ và thời gian tùy theo từng nội dung làm thí nghiệm Sau thời gian làm thí nghiệm, mẫu lập tức được đưa ra khỏi bể ổn nhiệt và tiến hành

ly tâm Chế độ máy ly tâm: vận tốc 6000 vòng/ phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ

4oC Các ống falcon sau ly tâm thu lấy dịch trong và loại bỏ bã Mẫu dịch trong này được đem đi phân tích hàm lượng piceatannol, riêng các chỉ tiêu khác cần được pha loãng thích hợp khi thực hiện các phương pháp đánh giá Dịch chiết được bảo quản ở ngăn mát của tủ lạnh

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố công đến khả năng chiết polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa trong dịch chiết

từ quả sim

3.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol

Tiến hành tách chiết mẫu theo sơ đồ phần 3.3.1 với cùng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20/1, nhiệt độ 40°C trong thời gian 60 phút với các công thức

như sau nồng độ ethanol thay đổi

+ Nồng độ ethanol: 0% (nước cất)

+ Nồng độ ethanol: 20%

+ Nồng độ ethanol: 40%

+ Nồng độ ethanol: 60% + Nồng độ ethanol: 80% + Nồng độ ethanol: 100% Phân tích hàm lượng polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết thu được để xác định nồng độ dung môi thích hợp cho tách chiết piceatannol từ quả sim

3.3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

Tiến hành tách chiết mẫu theo sơ đồ 3.3.1 bằng ethanol với nồng độ thích hợp

đã xác định ở thí nghiệm trước, nhiệt độ 40°C trong 60 phút với các công thức:

+ Dung môi/nguyên liệu: 10/1

+ Dung môi/nguyên liệu: 20/1 + Dung môi/nguyên liệu: 30/1 + Dung môi/nguyên liệu: 40/1 + Dung môi/nguyên liệu: 50/1 Phân tích hàm lượng polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết thu được để xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp cho tách chiết piceatannol từ quả sim

3.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

Tiến hành tách chiết mẫu theo sơ đồ 3.3.1 với nồng độ, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp đã xác định ở thí nghiệm trước, trong thời gian 60 phút với các công thức nhiệt độ như sau:

Phân tích hàm lượng polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết thu được để xác định nhiệt độ thích hợp cho tách chiết piceatannol từ quả sim

3.3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết

Tiến hành tách chiết mẫu theo sơ đồ 3.3.1 với nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trước với các công thức thời gian như sau:

+ Thời gian: 5 phút + Thời gian: 30 phút + Thời gian: 10 phút + Thời gian: 60 phút + C Thời gian: 15 phút + Thời gian: 120 phút Phân tích hàm lượng polyphenol tổng số, piceatannol và khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết thu được để xác định thời gian thích hợp cho tách chiết piceatannol từ quả sim

3.3.3 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình tách chiết piceatannol từ quả sim

Dựa vào khoảng ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả tách chiết picetannol từ quả sim, lựa chọn các yếu tố thí nghiệm Trong nghiên cứu này, để giảm số thí nghiệm cần tiến hành khi của ma trận thực nghiệm, đề tài chỉ lựa chọn 3 yếu tố thí nghiệm (tương ứng với 21 thí nghiệm) Trong các yếu tố khảo sát, đề tài lựa chọn các 3 yếu tố ảnh hưởng bao gồm:

βij: Hệ số tương tác đôi

Thí nghiệm mô hình hóa và tối ưu hóa được thiết kế theo Rotatable Central Composite Design bằng phần mềm JMP7

Từ mô hình thu được, xác định điều kiện tối ưu để tách chiết piceatannol

từ sim bằng cách lấy đạo hàm riêng phần Tiến hành tách chiết piceatannol 4 lần lặp tại điều kiện tối ưu, so sánh kết quả thực và kết quả tính toán từ mô hình

3.3.4 Nghiên cứu khả năng làm sạch dịch chiết piceatannol từ quả sim bằng phương pháp phân tách lỏng rắn

Hoạt hóa cột Sep-Pak Cartridges lần lượt bằng 3ml ethanol 100%, 3ml ethanol 50% và 3ml nước Mẫu sau khi chiết được đem đi cô đặc đến khô bằng thiết bị Speedvac, hòa tan trở lại các chất bằng nước và đưa vào cột đã hoạt hóa Các hợp chất phenol sẽ được hấp phụ trên các hạt có trong cột Chuẩn bị lần lượt các dung dịch ethanol có nồng độ khác nhau 0%, 25%, 50%, 75%, và 100% (3ml) Bắt đầu rửa giải cột bằng dung dịch 0% thu được phân đoạn F0 Kết thúc phân đoạn này tiếp tục rửa giải bằng dung dịch 25% thu được phân đoạn

F25 Làm lần lượt đến hết các dung dịch đã chuẩn bị, kết thúc quá trình rửa giải thu được các phân đoạn F0, F25, F50, F75, F100 Xác định nồng độ piceatannol của các phân đoạn bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Xác định tỷ lệ thu hồi và độ sạch tương đối của mỗi chất

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Các phương pháp phân tích hóa lý

3.4.1.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết sim được xác định bằng phương pháp Folin – Ciocalteu (Singleton và Rossi, 1965)

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng oxi hóa của các hợp chất polyphenol bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu tạo thành sản phẩm có màu xanh sẫm Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ polyphenol trong một phạm vi nhất định Sau khi phản ứng kết thúc ta đem đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 755 nm và dựa vào đồ thị chuẩn của axit galic để xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Tiến hành:

• 500 µL dung dịch cần phân tích đã pha loãng thích hợp

• Thêm 250 µL thuốc thử Folin – Ciocalteu 1N

• Vortex, đợi 5 phút

• Thêm 1250 µL Na2CO3 7.5%

• Vortex cho đồng nhất

• Đợi 30 phút ở nhiệt độ phòng

• Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 755 nm

Axit galic được dùng làm chất chuẩn trong test này Từ kết quả thu được và đường chuẩn axit galic ta tính được hàm lượng polyphenol trong 1 mL dịch phân tích (X1) Kết quả được biểu diễn theo mg GAE/mL (GAE – Gallic Acid Equivalent)

Hình 3.1 Đường chuẩn axit galic

Từ kết quả X1 (mg GAE/ml) ta sẽ tính được kết quả về khả năng chiết polyphenol tổng số từ quả sim như sau:

m.(100-w)/100

Trong đó:

X2: polyphenol tổng số trong mẫu (mg GAE/g chất khô)

f: Độ pha loãng của mẫu đem đo

V: Thể tích dịch của mẫu đem chiết (ml)

m: Khối lượng mẫu chiết (g)

w: độ ẩm của mẫu chiết (%)

3.4.1.2 Phương pháp xác định khả năng kháng oxi hóa

Khả năng kháng oxi hóa được xác định bằng phương pháp DPPH (Xuewe, 2007)

Nguyên tắc: DPPH – Diphenylpicryhydrazyl là gốc tự do có màu tím, độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 517 nm Khi cho dung dịch chất có khả năng kháng oxi hóa vào dung dịch DPPH thì các gốc tự do bị khử và mất màu tím Dựa vào khả năng làm mất màu tím gốc tự do DPPH của dung dịch ta xác định được khả năng kháng oxi hóa của mẫu thông qua đường chuẩn Trolox Tiến hành:

- Lấy 0.1 ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ nhất định, mẫu đối chứng thay dịch chiết bằng nước cất

- Thêm 2.9 ml DPPH 0.1 mM pha trong methanol

- Vortex cho đồng đều và để yên trong 30 phút

- Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm

Tính % kìm hãm theo công thức:

% kìm hãm = (ODđối chứng - ODmẫu)/ ODđối chứng *100

Trong đó: ODđối chứng là độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng

ODmẫu là độ hấp thụ quang của mẫu cần xác định

Trolox được dùng làm chất chuẩn trong test này, khả năng kháng oxi hóa

X1 được xác định dựa trên đường chuẩn mô tả mối tương quan giữa nồng độ trolox và % kìm hãm, được biểu diễn bằng µmol TE/ml (TE – Trolox Equivalent)

Hình 3.2 Đường chuẩn Trolox