Nghiên cứu tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG của chó.pdf

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TƠNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018 Tên đề tài: NGHIÊN cứu TẠO KHÁNG THẾ IgG THỞ KHÁNG IgG CỦA CHÓ Số hợp đồng: 2018.01.56 Chủ nhiệm đề tài: Ths Lê Thị Phương Thảo Đơn vị công tác: Khoa Công nghệ sinh học, ĐH Nguyền Tất Thành Thời gian thực hiện: 12 tháng TP Hồ Chỉ Minh, ngày 01 thảng 05 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG chó Sổ hợp đồng: 2018.01.56 Chủ nhiệm đe tài: Ths Lê Thị Phương Thảo Đơn vị công tác: Khoa Công nghệ sinh học Thời gian thực hiện: 12 tháng Các thành viên phổi hợp cộng tác: STT Họ tên TS Nguyễn Hữu Hùng Ths Thái Thị Tuyết Trinh Phạm Thị cấm Tiên Trần Tuấn Anh Chuyên ngành Miền dịch học Co’ quan công tác Khoa CNSH Sinh lý động vật Khoa CNSH CNSH Y dược Sinh viên CNSH Y dược Sinh viên Ký tên Mục lục MỞ ĐÀU CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng thể IgG động vật nghiên cứu ứng dụng 1.2 Tiềm thương mại cùa IgG tinh chế 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 10 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12 2.1 Nội dung nghiên cứu 12 2.2 Vật liệu đối tượng nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phương pháp gây đáp ứng miền dịch thỏ 13 2.3.2 Phương pháp thu nhận máu tách huyết thỏ 14 2.3.3 Phương pháp khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) 14 2.3.4 Phương pháp tinh chế IgG thỏ kháng IgG chó 15 Phương pháp tủa bang ammonium sulphate [(NHặhSOặ] 15 Phương pháp sắc ký lực qua cột Protein G .15 2.3.5 Kiểm tra đánh giá chất lượng IgG thị kháng IgG chó sau tinh che 16 Phương pháp điện di biến tỉnh (SDS — PAGE) 16 Phương pháp Dot Blot 17 2.3.6 Phương pháp Western Blot 18 2.3.7 Phương pháp đo mật độ quang OD280 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Ket tinh che IgG từ huyết chó 21 3.2 Kểt tạo kháng thể thỏ đa dịng kháng IgG chó 23 3.3 Ket quà tinh che IgG từ kháng huyết thỏ 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TẮT AS Ammonium sulfate CT Cặn tủa dlgG IgG chó DN Dịch ĐUMD Đáp ứng miễn dịch ELISA Enzyme linked iummuno system assay HRP Horseradish peroxidase HT Huyết KN Kháng nguyên KT Kháng Thể Mer Mercaptoethanol rlgG IgG thỏ SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamide gel electrophoresis SK Sắc ký TC Tăng cường DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Bàng 1.1: Một so sản phẩm liên quan tới IgG thỏ chó thị trường Bàng 1: Tóm tắt nội dung nghiên cứu .12 Bâng 2: Phác đồ tiêm thở 13 Bâng 3.1: Ket quà định lượng protein mẫu huyết chó trước sau tủa bàng muối AS nong độ 22 Bàng 2: Ket quà định lượng protein trước sau cộng hợp lên gel 28 Hình 3.1: Phân tích IgG sau tủa với AS SDS - PAGE 22 Hình 2: Ket sắc ký qua cột protein G thu nhận dlgG tổng số 23 Hình 3: Huyết thó trước tiêm âm tính với kháng ngun IgG chó 24 Hình 4: Đáp ứng huyết thò sau mũi gây mần càm với kháng nguyên IgG chó 25 Hình 5: Hiệu giá kháng the thỏ thu sau tháng gây ĐƯMD 26 Hình 6: Phân tích rlgG sau tũa với AS 45% bão hòa SDS - PAGE 12,5% 27 Hình 7: Ket sắc ký phân tách cặn tũa HT thỏ qua cột protein G 28 Hình 8: Ket chạy acetone kiểm tra cột sau nhoi 29 Hình 9: Kết quà phân tách rlgG tổng số qua cột SK2 tự tạo 30 Hình 10: Kết quà kiểm tra độ đặc hiệu cũa rlgG sau tinh chế 31 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh Thu 63mg IgG chó tinh Thu Img IgG chó tinh Thu 19mg IgG thỏ kháng đặc hiệu IgG Thu Img IgG thở kháng đặc hiệu IgG chó chó Quy trình tạo tinh chể kháng thê IgG thỏ Quy trình tạo tinh chể kháng IgG thỏ kháng IgG cùa chó kháng IgG chó Bài báo đăng Kỳ yếu/Tạp chí KHCN cùa Bài báo đăng Kỳ yeu/Tạp chí KHCN cùa trường ĐH NTT (chưa đăng) trường ĐH NTT Đào tạo 02 sv chuyên ngành CNSH Đào tạo 01 sv chuyên ngành CNSH Thòi gian đăng ký: từ tháng 06/2018 đến tháng 05/2019 Thòi gian nộp báo cáo: 10/05/2019 MỞ ĐẦU Kháng thể có nguồn gốc từ động vật sử dụng phổ biến nghiên cứu bàn lẫn ứng dụng Đe tài nghiên cứu nham mục tiêu xây dựng quy trình tạo tinh che IgG thỏ kháng đặc hiệu IgG cúa chó, số nhiều nguồn cung cấp kháng phổ biến Đe tài có ba nội dung chính: (1) tinh che IgG từ huyết chó, (2) gây đáp ứng miễn dịch thành công thỏ, tạo kháng the thở kháng IgG chó, (3) tinh che IgG thỏ kháng đặc hiệu IgG chó Các phương pháp sử dụng đề tài bao gồm phương pháp tủa miền dịch bang muối ammonium sulfate, phương pháp sắc ký lực, phương pháp lai miền dịch (Western blot, dot blot, ELISA ), phương pháp điện di SDS-PAGE Đe tài thu nhận mg IgG chó tinh sạch, tạo thành cơng cột sắc ký lực bắt kháng thể kháng đặc hiệu IgG chó Đe tài xây dựng thành cơng quy trình tạo tinh che IgG thị kháng đặc hiệu IgG chó, thu nhận 19mg IgG thỏ kháng đặc hiệu IgG chó CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng thể IgG động vật nghiên cứu ứng dụng Khái quát khảng thể IgG Kháng thể động vật gồm có lớp: IgM, IgA, IgE, IgD IgG, IgG lóp kháng thể chiếm ti lệ cao nghiên cứu nhiều [7], Các lớp phân lớp kháng the khác có khối lượng phân tử khác nhau, điều diện vắng mặt cùa liên ket disulfide nội phân từ, oligomer hóa phân tử globulin miễn dịch thơng qua liên kết disulfide liên phân từ, số lượng vùng cấu trúc (domain) chuồi nặng Ở điều kiện khơng biến tính, lóp kháng the IgG thỏ có trọng lượng phân tữ 150 kDa, với hai chuồi nặng (khoảng 50 kDa chuỗi) hai chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa chuồi) Kháng IgG nghiên cứu Thỏ loài động vật chiếm ưu the sản xuất kháng the đa dịng, kích thước nhỏ, chu trình sinh sàn nhanh, khoảng cách phát sinh lớn từ hầu hết mơ hình nghiên cứu, quy trình sân xuất kháng thể phát triển tốt Trong phòng nghiên cứu, kháng thể IgG thỏ thường dùng vật liệu bàn để tạo sản phẩm kháng thể thứ cấp, như: phân mành Fc, Fab, F(ab’)2 phân tữ IgG; kháng the IgG cộng hợp Biotin, cộng hợp HRP, cộng họp FITC ; tạo kháng thể thỏ kháng IgG động vật khác Kháng thề IgG chó thường dùng làm chứng âm/chứng dương nghiên cửu bàn xét nghiệm chẩn đốn bệnh chó: Western blot, tũa miễn dịch (IP), tũa miễn dịch nhiễm sac the (Chip), ELISA, Kháng IgG xét nghiệm chẩn đoán bệnh Với phát triển cùa kinh te, nhu cầu ni thú cưng chăm sóc sức khỏe cho thú cưng ngày cao Theo khảo sát APPA (Hiệp hội thú cưng Mỳ) nãm 2017 - 2018, riêng Mỳ có 70% dân so ni thú cưng, 48% ni chó; Canada 61% [9], Thống kê năm 2016, tồn the giới có 33% thú cưng ni chó, theo sau mèo chiếm 23% động vật khác (cá, rùa, thỏ, ngựa ) chiếm khoảng 24%, theo đó, nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho chó 48%, cho mèo 31% tì lệ có xu hướng ngày tăng [9] [10] Kháng thể IgG thỏ chó sử dụng kháng thể đa dịng đơn dịng, dạng tồn phần tự nhiên dạng qua ché biến Kháng thể đơn dịng có lợi mặt ổn định giá thành cao chi phí sàn xuất ton Do vậy, dù ốn định kháng thể đa dòng mang lại hiệu kinh tế giâm giá thành sàn phẩm Việc thu IgG thỏ IgG chó tự nhiên có độ tinh cao can thiết đe phát triển sàn phẩm thứ cấp SŨ dụng kỳ thuật chẩn đoán IgG cộng hợp HRP, IgG cộng họp Biotin, IgG thỏ kháng IgG chó, dùng cho Western blot, ELISA, Flow cytometry Quy trình tinh che IgG từ huyết động vật quy trình sàn xuất kháng thể đa dịng động vật chuột, thỏ kinh điển, nhiên, Việt Nam, kháng thể đa dịng IgG ln phải nhập từ nước ngồi với giá thành cao Do đó, thực đề tài “Nghiên cứu tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG chó” nhằm tạo sàn phẩm IgG có độ tinh cao, trớ thành nguồn sẵn có phục vụ phịng nghiên cứu, đong thời có the sừ dụng cho ứng dụng chẩn đoán Việt Nam Tiềm thưong mại IgG tinh chế 1.2 Trên thị trường có nhiều sản phẩm, sinh phẩm liên quan tới kháng thề IgG thỏ tinh chế IgG thỏ kháng IgG chó thưcmg mại hóa, phục vụ cho nghiên cứu bàn cho ứng dụng chẩn đoán bệnh Tuy nhiên, Việt Nam nguồn kháng thể phải nhập từ nước với giá thành cao Điều kẻo theo chi phí cần cho nghiên cứu cho xét nghiệm chẩn đốn tăng lên, gây khó khăn cho nhà khoa học nước người dân Việc sở hữu quy trình sản xuất kháng the đa dịng cùa động vật tạo sàn phẩm kháng thể đa dịng thỏ kháng IgG chó có chất lượng cần thiết, tạo thuận lợi cho việc cung cấp nguyên liệu kháng thể phục vụ nghiên cứu ứng dụng xét nghiệm chan đoán Bàng 1.1 nêu so sàn phẩm liên quan tới IgG thỏ IgG thỏ kháng IgG chó bán thị trường Bảng 1: Một số sản phẩm liên quan tới IgG thỏ chó thị trường Sản phẩm Hãng sản xuất Giá bán Kháng the đa dòng thở tinh Abeam, Mỳ 345$/100pg Kháng thể đa dịng chó tinh Biorad, Mỳ 222$/5mg Kháng thể đa dịng thỏ kháng IgG Merck, Đức chó (huyết toàn phan) 128.63 SGD/2ml (3-6 mg/ml) Kháng the đa dịng thỏ kháng IgG Merck, Đức chó (sãc ký qua cột protein G) 318.15 SGD/lml Kháng the đa dòng thỏ kháng IgG Fitzgerald, Mỳ chó cộng họp Biotin 195$/1.5mg Kháng thể đa dịng thỏ kháng IgG Mybiosource, chó cộng hợp HRP Anh 395$/2mg STT 1.3 Tình hình nghiên cứu nước Trong nhiều nghiên cứu, cà kháng thể đa dòng kháng thể đơn dòng dùng dạng không tinh khiết: kháng the đa dịng dùng trực tiếp kháng huyết tồn phần, kháng thể đơn dịng dùng tồn dịch ni cấy mơ Tuy nhiên, nhiều kỹ thuật, địi hịi phái có kháng thể với độ đậm đặc độ tinh cao, hầu hết kỹ thuật ELISA, gan huỳnh quang hay đầu dị phóng xạ nghiên cứu cộng hợp, nghiên cửu thay đổi cấu trúc kháng thể (Fc, Fab, F(ab’)2) Tinh chế kháng thể thực từ lâu nay, có nhiều phương pháp quy trình cơng bố việc tinh chế kháng thể nói chung IgG nói riêng Trong đó, từ đau năm 1970, phương pháp sắc ký sừ dụng để tinh chể kháng thể phổ biến ngày Năm 1996, Mark Page Robin Thorpe cơng bo quy trình tinh che IgG từ huyết sắc ký trao đổi ion sừ dụng cột DEAE (diethylaminoethyl) Phương pháp dựa nguyên tắc IgG có điểm đẳng điện cao hầu hết protein khác huyết thanh, đó, pH giữ thấp điểm đẳng điện kháng thể, kháng thể khơng bám vào nhóm ion âm tách khói đa so protein cịn lại [6] Năm 2004, Jan stec cộng công bo ket quà tinh chế IgG đa dòng từ huyết bò bang phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) theo sau phương pháp túa miền dịch bang muối ammonium sulfate Nghiên cứu sữ dụng ba kỹ thuật HPLC để tinh chế IgG từ huyết bò: sắc ký lực, sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel [2] Roque cộng [8], Low cộng [5] viết đánh giá hoàn chỉnh phát triển cùa phối từ lực sữ dụng để tinh chế kháng thể từ phối từ sinh học tong hợp nhân tạo sắc ký lực trở thành phương pháp ưu tiên lựa chọn đe tinh chế kháng the đơn dịng [4] [5], quy trình tinh che truyền thống cho kháng the đa dịng có nguồn gốc từ huyết tương kết họp phương pháp tùa miền dịch với sac kí trao đổi ion Tại Việt Nam, có số nghiên cứu tự sản xuất kháng the đa dòng đơn dòng để dùng cho nghiên cứu thương mại Nổi bật viện Pasteur thành phổ Hồ Chí Minh, nơi đầu lĩnh vực tạo kháng thể đa dòng từ động vật sử dụng nghiên cứu ... nghiên cứu tạo tinh chế kháng thể thỏ kháng kháng thể IgG chó, hướng tới tạo kít chẩn đoán sử dụng nguồn kháng thể tự tạo Đe tài mở rộng nghiên cứu cộng hợp HRP, FITC lên phân tứ kháng thể tự tạo. .. chuột, thỏ kinh điển, nhiên, Việt Nam, kháng thể đa dịng IgG ln phải nhập từ nước ngồi với giá thành cao Do đó, thực đề tài ? ?Nghiên cứu tạo kháng thể IgG thỏ kháng IgG chó” nhằm tạo sàn phẩm IgG. .. đặc hiệu IgG chó CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng thể IgG động vật nghiên cứu ứng dụng Khái quát khảng thể IgG Kháng thể động vật gồm có lớp: IgM, IgA, IgE, IgD IgG, IgG lóp kháng thể chiếm