Nghiên cứu tạo cây hoa hồng (Rosa sp.) ra hoa in vitro.pdf

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH —-—0O0 - BÁO CÁO TỐNG KẾT ĐỀ TÀI CHƯƠNG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 2017 - 2018 TÊN ĐÈ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO CÂY HOA HÒNG (Rosa sp.) RA HOA IN VITRO Mã số đề tài : 2017.02.28 Chii nhiệm đề tài : NGUYỄN THỊ BẢO HÂN MSSV :1411531232 Lớp : 14DSH01 Giảng viên hướng dẫn : ThS NGUYỄN THỊ NHÃ Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG TP Hồ Chi Minh, thảng 04 năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỪ VIẾT TẮT iii DANH SÁCH CÁC BẢNG BIÊU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH iv Chương TỐNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Giới thiệu hoa hong (Rosa sp.) 1.3.1 VỊ trí phân loại 1.3.2 Đặc điểm hình thái 1.4 Tính ứng dụng việc nghiêncứu hoa in vitro 1.4.1 Vấn đề hoa in vitro 1.4.2 Tính ứng dụng 1.5 Một số nghiên cứu điều khiến hoa Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Mầu nuôi cấy 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 2.2.3 Hóa chất thí nghiệm 2.3 Trang thiết bị dụng cụ 2.4 Nội dung nghiên cứu 2.4.1 Thí nghiệm 1: Phương pháp khảo sát nồng độ chất khử trùng thời gian xử lý mầu cấy hoa hồng 2.4.1 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng BA đến khả tạo đa chồi hoa hồng in vitro 2.4.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng BA đến khả cảm ứng hoa hoa hong in vitro 2.4.3 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng AgNO3 đến khả cảm ứng hoa hoa hồng in vitro 10 2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu 10 Chương KÉT QUẢ VÀ SẢN PHÁM ĐẠT ĐƯỢC 12 3.1 Ket tạo nguồn hoa hong in vitro 12 3.1.1 Khảo sát nồng độ chất khử trùng thời gian xử lý mầu cấy hoa hồng 12 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng BA từ chồi vô mầu đến khả tạo đa chồi hoa hong in vitro 13 3.2 Ket khảo sát so môi trường nuôi cấy cảm ứng hoa hoa hong in vitro 15 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng BA từ chồi sau nhân đến khả cảm ứng hoa hoa hong in vitro 16 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ AgNO3 đến khả cảm ứng hoa hoa hong in vitro 17 Chương KẾT LUẬN 19 TÀI LIỆU THAM KHAO 19 PHỤ LỤC 23 11 DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT ABA: Abscisic Acid BA: Benzyl Adenin BAP: Benzylamino Purine GA: Gibberellic Acid IAA: P-indole acetic acid MS: Murashige and Skoog NAA: a-naphthaleneacetic Acid NT: Nghiệm thức PDZ: Paclobutrazol ỉiỉ DANH SÁCH CÁC BẢNG BIÉƯ, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây hoa hong (Rosa sp.) Hình 3.1 Mầu hoa hồng tiếu muội vô trùng sau 14 ngày .13 Hình 3.2 Choi hoa hong in vitro mơi trường bổ sung BA 15 Hình 3.3 Choi hoa hồng hoa môi trường bố sung BA 17 Hình 3.4 Choi hoa hồng hoa môi trường bổ sung AgNO3 18 Bảng 2.1: Các nghiệm thức nồng độ thời gian xử lý mẫu Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng BA đến khả tạo đa chồi hoa hong in vitro 10 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng BA đến khả cảm ứng hoa hoa hong in vitro 11 Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng AgNO3 đến khả cảm ứng hoa hoa hong in vitro 11 Bảng 3.1: Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng thời gian xừ lý mẫu cấy hoa hồng 12 Bảng 3.2: Ánh hưởng BA đến khả tạo đa chồi hoa hong in vitro 14 Bảng 3.3: Ảnh hưởng cùa nồng độ BA đến khả cảm ứng hoa hoa hong ỉn vitro 16 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nong độ AgNO3 đến khả cảm ứng hoa hoa hong in vitro 17 iv Chương TỔNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Hoa hồng lồi hoa mang nét đẹp kiêu sa, yêu mến không ý nghĩa tượng trưng cho tình u mà cịn hương thơm đặc trưng, phong phú màu sắc chủng loại Vì thế, hoa hồng có nhiều ứng dụng dùng làm hoa cắt cành trang trí, quà tặng, nguồn cung cấp tinh dầu làm nước hoa, thức ăn Chính đa dạng cơng dụng từ kéo theo phong phú chủng loại sản phẩm từ hoa hồng Tại Việt Nam, Đà Lạt nơi hoa nhiều nước ta lấy hoa hồng làm chủ đạo, nhừng năm gần nghề trồng hoa hồng trồng đại trà lan xuống tỉnh phía nam Tiền Giang, Hậu Giang, Đong Tháp, mang lại giá trị kinh tế lớn cho nước ta Chính lợi ích lớn mà hoa hồng đối tượng nhà khoa học nghiên cứu nhiều không nhằm tăng suất, cải tiến giong cũ, lai tạo giống quý lạ để trồng ngồi tự nhiên mà cịn co gắng khai thác nhiều phương pháp nuôi cấy mơ lồi hoa Phương pháp ni cấy mơ ứng dụng nhiều loài hoa, cảnh, dược liệu thân gồ với nhiều lợi ích in vitro cần lượng giống ban đầu có the tạo so lượng lớn giống đong thời gian sinh trưởng Ngoài với việc kết họp phương pháp khác nuôi cấy mơ ni cấy đình sinh trưởng tạo nguồn giống bệnh, không bị ảnh hưởng sâu bệnh mẹ Dù nghiên cứu rộng rãi, đa phần nuôi cấy mô ứng dụng nhiều vi nhân giống mà chưa khai thác, ứng dụng nhiều lĩnh vực khác, đặc biệt điều khiển hoa in vitro Hơn nữa, loài điều khiển hoa in vitro thành cơng có ý nghĩa lớn việc tìm hiếu tồn q trình sinh trưởng phát triển hồn thiện lồi Hơn nữa, có the áp dụng phương pháp vi lai giống đe lai tạo giống điều kiện in vitro Riêng hoa hồng, việc điều khiển hoa in vitro thành cơng lồi hoa tạo giá trị tiểu cảnh lớn với nhiều ưu điểm nhỏ gọn, không cần tốn thời gian chăm sóc nhiều, khơng sâu bệnh khơng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người bị dị ứng phấn hoa, thích hợp trang trí văn phịng, qn ăn, nhà với diện tích nhỏ Ngồi nghiên cứu thành cơng hoa in vitro hoa hồng sè cung cấp cánh hoa để sản xuất tinh dầu vào lĩnh vực mỹ phẩm làm dược liệu dề dàng nhanh chóng, hoa có chất lượng đong không bị ảnh hưởng yếu tố môi trường thời tiết, sâu bệnh hoa hồng trồng tự nhiên Cây hoa hồng hoa ỉn vitro có nhiều lợi ích tiềm thương mại giúp làm đa dạng hóa sản phẩm hoa, đe có sở cho việc ứng dụng điều khiển hoa Vì đề tài “Nghiên cứu tạo hoa hồng (Rosa sp.> hoa in vitro" tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài - Tạo chồi hoa hong in vitro - Xác định số môi trường nuôi cấy cảm ứng hoa in vitro hoa hồng 1.3 Giới thiệu hoa hồng 1.3.1 VỊ trí phân loại Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots (không phân hạng) Rosids Bộ (ordo) Rosales Họ (familia) Rosaceae Phân họ (subfamilia) Rosoideae Liên tông (supertribus) Rosodae Chi (genus) Rosa L Hình 1.1 Cây hoa hồng (Rosa sp.) Cây hoa hồng có tên khoa học Rosa sp., thuộc lóp song tử diệp có nguồn gốc ơn đới nhiệt đới vùng Bắc bán cầu Cách khoảng 5000 năm, Trung Quốc nơi hóa hoa hồng mài đến kỷ VIII giong hồng từ Trung Quốc giới thiệu Châu Âu hầu hết giống hồng ngày có nguồn gốc từ Hiện tại, hệ thống APG II cơng nhận 2.520 loài hoa hồng 90 chi Theo hệ thống, hoa hồng chia thành phân họ: Rosoideae, Spiraeoideae, Maloideae, Amygdaloideaefl] Họ hồng phân bố chủ yếu vùng ôn đới cận nhiệt đới bắc bán cầu Các nước sản xuất hoa hồng là: Hà Lan, Bunggagi, Mỹ, Nhật, Việt Nam hoa hồng trồng khắp nước nhiều Đà Lạt với nhiều giong quý 1.3.2 Đặc điểm hình thái Họ hồng có dạng bụi leo lâu năm, hoa hồng kép lông chim mọc cách, cuống có kèm, có - hay - chét, tuỳ giống mà có màu sắc xanh đậm hay xanh nhạt, cưa nơng hay sâu hay có hình dạng khác Hoa có nhiều màu sắc kích thước khác nhau, cụm hoa chủ yếu có hoa tập hợp vài hoa, cuống hoa dài, cứng, có gai, đài hoa màu xanh Hoa hồng thuộc loài hoa lưỡng tính, nhị nhụy hoa, nhị dính vào bao quanh vịi nhụy nên có the tự thụ phấn Quả hầu hết loại hoa hồng màu dở thầm màu đen, mồi hoa hồng bao gồm tầng cùi phía ngoài, bên chứa từ - 25 quả, bao bọc nỗn mịn, cứng có lơng nhở Hồng lâu năm, có the trồng quanh năm tốt trồng vào hai thời vụ chính: vụ xuân tháng 2-4 (bắt đầu thu hoa tháng năm đó) vụ thu tháng 9-10 (bắt đầu thu hoa từ tết nguyên đán) [2] 1.4 Tính ứng dụng việc nghiên cứu hoa in vitro 1.4.1 Vấn đề hoa in vitro Ra hoa thực vật diễn sau hồn thành giai đoạn sinh trưởng, cột mốc đánh dấu chuyển đổi từ trình sinh trưởng sang trình sinh sản [3] Giai đoạn đặc biệt kiểm soát nhiều yếu tố khác nhau, cần phải điều khiển hài hòa nhân tố nội sinh (hormon, chất điều hòa sinh trưởng) ngoại sinh (ánh sáng, nhiệt độ, độ am, pH ) Sự kết hợp yeu tố nội sinh, ngoại sinh độ tuổi thích hợp tống hợp nhùng chất hormon hoa (florigen) [4] sau di chuyển đến đỉnh sinh trưởng quy định hình thành mầm hoa [5] Ảnh hưởng nhiệt độ đặc biệt nhiệt độ thấp đến hoa gọi xuân hoá Ảnh hưởng độ dài ngày đến hoa gọi tượng quang chu kì [6] Ra hoa hoa in vitro chế giống hoa in vivo phát triển môi trường nhân tạo, để hoa xảy sớm, cần điều khiển trình cách bố sung chất điều hòa sinh trưởng, tạo stress môi trường thay đồi yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, Tuy nhiên, tất lồi thực vật cảm ứng hoa in vitro, cịn phụ thuộc vào chất cùa lồi độ tuổi, yếu tố di truyền cùa Mặc dù có nhiều nghiên cứu cảm ứng hoa nhiều lồi thực vật thành cơng hầu hết kết cho thấy chất lượng hoa in vitro màu sắc, kích thước, hình dạng hoa hoa in vivo, Ngoài ra, hoa in vitro dề bị đột biến cho hoa có hình dạng bất thường [7] 1.4.2 Tính ứng dụng Việc nghiên cứu cảm ứng hoa bước tiến lớn lĩnh vực nuôi cấy mô mặt khoa học, tạo thành công hoa in vitro cho phép quan sát rõ ràng trình sinh trưởng phát triển lồi thực vật mà khơng nhiều thời gian Từ thực tiếp nghiên cứu để rút ngắn trình sinh trưởng, phát triển hay thực vi lai giống in vitro, Đối với đời sống, việc tạo hoa in vitro tạo sản phẩm khắc phục nhiều hạn chế hoa ngồi tự nhiên tốn cơng chăm sóc, tránh vấn đề trùng, tránh tình trạng mần cảm, dị ứng với phấn hoa, tiết kiệm diện tích gieo trồng, khơng bị tác động mơi trường ngồi, góp phần làm đa dạng thị trường cảnh, đưa sản phẩm khoa học đến gần với người tiêu dùng 1.5 Một số nghiên cứu điều khiển hoa Cho đến nghiên cứu điều khiển hoa nói chung điều kiện in vitro có so nhân tố thiết yếu tác động đến việc cảm ứng hoa trồng như: chất điều tiết sinh trưởng, carbonhydrate, ánh sáng, nhiệt độ, yếu tố vi lượng, stress môi trường Một yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến điều khiển hoa trồng chất điều tiết sinh trưởng thực vật loài tre Bambusa arundinacea nuôi cấy môi trường MS long, bo sung succrose (2%), nước dừa (5%) BAP (2,2 pM), có đến 70% chồi nở hoa 3-6 tháng [8] Trên đối tượng hoa hồng Rosa hybrida L nuôi cấy môi trường MS chứa mg/1 BA, sau tuần ni cấy, cánh hoa tương đối bình thường lúc nở màu nhạt hoa in vivo [9] Sau năm 2015, Ebru Demirci Fatih A Canli tiến hành khảo sát ảnh hưởng Gibberellic Acid (GA3) lên hoa hoa hong Aprikola in vitro, kết cho thấy tỷ lệ nụ hoa tạo thành cao 71,7%, hiệu hoa 50,8% thu ni cấy mơi trường có BA 0,125 mg/1, khơng có GA3 Sự diện GA3 môi trường nuôi cấy cản trở hoa nở hoa Aprikola Đối với loài Ipomoea sepiaria, tỷ lệ hoa in vitro tối ưu đạt 38% quan sát thấy môi trường bổ sung mg/1 ABA [10] Nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng lên cảm ứng hoa in vitro Trên đối tượng sâm Án Độ Withania somnifera, nồng độ khác nguồn nito (L-glutamine, adenine sulphate, amoni nitrat, kali nitrat natri nitrat từ - 25 mg/1) kết hợp với 4% succrose BA 1,5 mg/1 IAA 0,3 mg/1 cho số hoa đạt cao (20 hoa/cành) bổ sung 15 mg/1 adenine sulphate [11] Trên đối tượng lan Cymbỉdium nỉveo-marginatum Mak, Kostenyuk cộng (1999) kích thích hoa sớm thành cơng sau 90 ngày việc thay đoi tỷ lệ thành phần chứa N p mơi trường MS có bo sung PDZ BA [12] Succrose không nguồn cacbon tạo lượng cho tăng trưởng phát triển mà cịn nghiên cứu có chức kiêm sốt hoa Khi phân tích hiệu succrose hoa in vitro đối tượng thảo dược Án Độ Oldenlandia umbellata L cho thấy, môi trường chứa 3% succrose cho tỷ lệ hoa tối đa đạt 92,73% [13] Đối với lồi lan Gypsophiỉa paniculata L., để kích thích hoa ống nghiệm, choi kích thích hoa hiệu nuôi cấy môi trường MS chứa 13,3 pM BA 50 g/1 sucrose [14] Thí nghiệm Kinnow mandarin (Citrus nobilis Lour X c deliciosa Tenora) cho thấy tỷ lệ hoa tối đa đạt 31,94% nuôi cấy môi trường MS bo sung kinetin mg/1 40 g/1 succrose [15] Bạc nitrat (AgNO3) yếu tố kích thích hoa số loài Cụ the đối tượng ớt Capsicum frutescens, 45 ngày sau cấy chồi vào môi trường MS bổ sung 10 pM AgNO3 nhận thấy hoa nhất, thu đến hoa nở môi trường bổ sung AgNO3 40 pM [16] Nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng nhiệt độ đến việc điều khiển hoa in vitro tiến hành nhiều trồng khác Thí nghiệm điều khiển hoa thực hai giong đậu lăng CDC Greenland CDC Maxim cho thấy cảm ứng hoa bị ảnh hưởng đáng ke tỷ lệ ánh sáng nuôi cay R: FR (red: red far) Cây nuôi cấy tỉ lệ ánh sáng R: FR 3,1:1 hoa sớm so với Cây nuôi cấy tỉ lệ ánh sáng R: FR 5,6:1 [17] Cho đến Việt Nam có nghiên cứu lĩnh vực điều khiển hoa in vitro Năm 2010, Nguyền Hoài Nguyên, Bùi Văn Lệ xác định nước dừa có Hình 3.2 Chồi hoa hồng in vitro môi trường bổ sung BA (A) nồng độ BA mg/1 (B) nồng độ BA 0,5 mg/1 (C) nồng độ BA mg/1 (E) nồng độ BA mg/1 (D) nồng độ BA 1,5 mg/1 3.2 Ket khảo sát số môi trường nuôi cấy cảm ứng hoa hoa hồng ìn vitro Cytokinin cho chịu trách nhiệm truyền tín hiệu bắt đầu hoa thực vật thực vật [21 ] với nhiều nghiên cứu cho thấy gia tăng cytokinin cung cấp vật liệu cho mô phân sinh trình hình thành hoa [22] [23] [24] [25] Trong thời kỳ đầu phytohormon tác động hoa cách tăng phân chia mô phân sinh đỉnh, đặc biệt khởi phát giảm phân [25] Các ion bạc cung cấp dạng nitrat (AgNO3) bổ sung vào môi trường gây ảnh hưởng đến phôi soma, cảm ứng hoa hình thành chồi rề điều kiện để chuyển đoi yếu to di truyền [26] Ngồi ra, AgNO3 cịn biết đến chất ức chế hoạt động ethylene [27], Ethylene hydrocacbon đơn giản (C2H4), có tác động tối đa đến phát triển, khác biệt tế bào, chín lão hóa thực vật nồng độ thấp tới 0,01 pl [28] Dựa sở kết nghiên cứu trên, BA AgNO3 đánh giá ảnh hưởng lên cảm ứng hoa hoa hồng 15 ... dạng hóa sản phẩm hoa, đe có sở cho việc ứng dụng điều khiển hoa Vì đề tài ? ?Nghiên cứu tạo hoa hồng (Rosa sp.> hoa in vitro" tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài - Tạo chồi hoa hong in vitro - Xác định... dạng hoa hoa in vivo, Ngoài ra, hoa in vitro dề bị đột biến cho hoa có hình dạng bất thường [7] 1.4.2 Tính ứng dụng Việc nghiên cứu cảm ứng hoa bước tiến lớn lĩnh vực nuôi cấy mô mặt khoa học, tạo. .. Hình 1.1 Cây hoa hồng (Rosa sp.) Cây hoa hồng có tên khoa học Rosa sp., thuộc lóp song tử diệp có nguồn gốc ơn đới nhiệt đới vùng Bắc bán cầu Cách khoảng 5000 năm, Trung Quốc nơi hóa hoa hồng mài