Nghiên cứu tạo tế bào e coli biểu hiện kháng thể bán phần chuỗi đơn cb6 kháng virus sars cov 2

BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VĂN ĐỐN NGHIÊN CỨU TẠO TÉ BÀO E coli BIỂU HIỆN KHÁNG THẺ BÁN PHẢN CHUỖI ĐƠN CB6 KHÁNG VIRUS SARS-CoV-2 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC sĩ THÀNH PHỐ HỔ CHÍ MINH NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Đồn Chính Chung PGS TS Trịnh Ngọc Nam Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 06 tháng 10 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: TS Nguyễn Thị Kim Anh - Chủ tịch Hội đồng TS Lao Đức Thuận - Phản biện TS Phạm Tấn Việt - Phản biện TS Nguyễn Minh Nam - ủy viên TS Trần Thị Huyền - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỊNG VIỆN TRƯỞNG VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THựC PHẨM BỘ CƠNG THƯƠNG CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÀNH PHĨ HỒ CHÍ MINH NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC sĩ Họ tên học viên: Nguyễn Văn Đoán MSHV: 20125441 Ngày, tháng, năm sinh: 14/04/1997 Nơi sinh: Nam Định Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐÈ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO TẾ BÀO E coli BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ BÁN PHẦN CHUỖI ĐƠN CB6 KHÁNG VIRUS SARS-CoV-2 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Tạo dòng vector biểu gen mã hóa kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2 Biến nạp biểu hiện kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein SARSCoV-2 vi khuẩn E.colỉ — Nghiên cứu điều kiện phù hợp nuôi cấy vi khuẩn E coỉi sản xuất kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2 - Kiểm tra đánh giá sơ chất lượng kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2 II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 30/11/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/05/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đồn Chính Chung PGS TS Trịnh Ngọc Nam Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 10 năm 2023 NGƯỜI HƯỚNG DẴN CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THựC PHẨM LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất Thầy, Cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại Học Cơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu giúp em hồn thành chương trình đào tạo báo cáo tốt nghiệp Trong q trình làm báo cáo có nhiều khó khăn giúp em có trải nghiệm quý giá nhiều bài học kinh nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Đoàn Chính Chung - Phó phịng Nghiên cứu Phát triển thuộc công ty CP CNSH Dược Nanogen thầy Trịnh Ngọc Nam - Trưởng phòng Quan hệ Hợp tác Quốc tế trường ại học Công nghiệp Tp HCM Các Thầy giúp đỡ hướng dẫn em tận tình để em hoàn thành báo cáo thời hạn Mặc dù cố gắng để hoàn thành báo cáo cách hồn chỉnh khơng tránh khỏi thiếu sót chưa có kinh nghiệm nghiên cứu khoa học kiến thức hạn chế Em mong nhận góp ý q Thầy, Cơ để báo cáo hoàn chỉnh Cuối cùng, chúng em kính chúc q Thầy, Cơ dồi sức khỏe thành công nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ Đại dịch Covid - 19 xác định nguyên nhân virus SARS-CoV-2, gây hậu 6.376.503 người tử vong Hiện nay, giới có nhiều cách tiếp cận để nghiên cứu điều chế vaccine phòng ngừa thuốc điều trị, có phương pháp tạo dịng gen mã hóa kháng thể để sản xuất protein ức ché hoạt động SARS- CoV-2 Nghiên cứu thực nhằm mục đích tạo dịng chủng vi khuẩn E coli mang gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 có khả sản xuất protein CB6, hướng đến áp dụng sản xuất thuốc ức chế SARS-CoV-2 Gen CB6 gắn vào vector pNANOGEN biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) phương pháp hóa biến nạp Sau đó, chủng vi khuẩn mang gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 nuôi cấy môi trường LBKan cảm ứng ITPG Dưới kích hoạt ITPG protein CB6 biểu hiện, tách chiết tinh thành công Kết kiểm tra, phân tích SDS PAGE Western Blot xác nhận biểu protein CB6 với kích thước đặc tính mong muốn Khi thực phản ứng trung hòa hòa SARS-CoV-2 mấu kháng thể CB6 xác định kit trung hòa SARS-CoV-2 đạt hiệu ức chế 46,5% Như vậy, từ kết cho thấy nghiên cứu tạo dòng biểu thành công protein CB6 tiền đề để sản xuất kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 điều trị COVID - 19 11 ABSTRACT The COVID-19 pandemic is primarily caused by SARS-CoV-2, resulting in over 6,376,503 deaths worldwide Currently, there are various approaches being pursued globally to study the development of preventive vaccines and therapeutic drugs One of these methods involves generating a genetically engineered antibody-producing cell line to produce proteins that can inhibit the activity of SARS-CoV-2 This study aims to create a bacterial strain of E COỈỈ carrying a gene encoding a partial single­ chain antibody CB6 to produce CB6 protein for potential application in inhibiting SARS-CoV-2 The CB6 gene is inserted into the pNANOGEN vector and transformed into E coli BL21(DE3) bacterial strain using a transformation method Subsequently, the bacterial strain carrying the gene encoding the partial single-chain antibody CB6 is cultured on LBKan medium and induced with ITPG Under the activation of ITPG, the CB6 protein is expressed, extracted, and successfully purified The results of SDS-PAGE and Western Blot analyses confirm the expression of the CB6 protein with the desired size and characteristics The neutralizing activity of the CB6 antibody against SARS-CoV-2 is determined using a SARS-CoV-2 neutralization kit, which shows an inhibitory efficiency of 46,5% Therefore, these results demonstrate the successful generation and expression of the CB6 protein, providing a foundation for the production of the partial single-chain antibody CB6 for COVID-19 treatment iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Học viên Nguyễn Văn Đốn IV MỤC LỤC LỊI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG BIỂU xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Đối tượng, phạm vi địa điểm nghiên cứu Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN LĨNH vực NGHIÊN cứu 1.1 Tổng quan virus SARS-CoV-2 1.1.1 Đại dịch COVID-19 virus SARS -CoV-2 1.1.2 Glycoprotein s vùng bắt đặc hiệu với thụ thể (Receptor Binding Domain - RBD) 1.2 Tổng quan kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb) 10 dạng khảm 11 1.2.1 Kháng thể 1.2.2 Kháng thể nhân hóa 12 1.2.3 Kháng thể người 12 1.2.4 Kháng thể bán phần cấu trúc Fab 13 1.2.5 Kháng thể bán phần chuỗi đơn 14 1.3 Biểu protein tái tổ hợp dạng thể vùi tế bào vi khuẩn E coỉi 15 1.3.1 Ưu điểm biểu protein tái tổ hợp vi khuẩn E coli 15 V 1.3.2 Sự hình thành thể vùi tế bào chất E coli 17 1.3.3 Chủng E coỉi, hệ thống vector co chế kiểm soát dùng biểu protein CB6 17 1.3.4 Tách chiết tinh plasmid 18 1.3.5 Biến nạp chọn lọc tế bào biểu gen mục tiêu 19 1.3.6 Tạo tế bào khả nạp biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coỉi 19 1.3.7 Chọn lọc tế bào biến nạp 20 1.3.8 Nuôi cấy vi khuẩn E coỉi 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Chủng vi sinh vật 22 2.1.2 Vector pNANOGEN .22 2.1.3 Gen kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 sử dụng làm khuôn 22 2.1.4 Các mồi dùng giải trình tự 23 2.2 Hoá chất nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất dùng ni cấy vi khuẩn 23 2.2.2 Hóa chất dùng xác định kích thước protein bán định lượng - SDS-PAGE 24 2.2.3 Hóa chất dùng định tính kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 - Western Blot 25 2.2.4 Hóa chất dùng kiểm tra hoạt tính trung hịa SARS-CoV-2 25 2.2.5 Hóa chất dùng xác định protein tổng số - Bradford 26 2.2.6 Hóa chất dùng định tính kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 - Immunodot 26 2.3 Dụng cụ thiết bị 27 2,4 Phưong pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 28 2.4.2 Phương pháp tạp tế bào E.coli khả nạp 30 2.4.3 Phương pháp hoá biến nạp 31 2.4.4 Thu nhận gen mã hoá kháng thể bánphần chuỗi đơn CB6 31 VI 2.4.5 Gắn đoạn gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 vào plasmid pNANOGEN 32 2.4.6 Sàng lọc thể biến nạp E.coli Top 10F’ chứa plasmid pNANOGEN-CB6 33 2.4.7 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E.coỉi TOP 10F’ 34 2.4.8 Phương pháp tạo tế bào khả nạp biến nạp plasmid pNANOGEN vào tế bàoE.cỡ//BL21 (DE3) 34 2.4.9 Phương pháp kiểm traE.cơ/? BL21 (DE3) biểu gen CB6 34 2.4.10 Khảo sát chất cảm ứng thích hợp 37 2.4.11 Khảo sát tốc độ lắc: 38 2.4.12 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng: 38 2.4.13 Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli mang vector tái tổ hợp sản xuất protein CB6 quy mơ phịng thí nghiệm điều kiện khảo sát thích hợp 38 2.4.14 Thu nhận protein CB6 từ té bào E coỉi 39 2.4.15 Tinh protein CB6 39 2.4.16 Kiểm tra đánh giá sơ chất lượng kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2 RBD 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 46 3.1 Kết 1: Tạo dòng E.coỉi mang vector pNANOGEN-CB6 biểu protein CB6 46 3.1.1 Thu nhận gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 46 3.1.2 Tạo dòngK coli TOP 10F’ mang vector tái tổ hợp pNANOGEN-CB6 47 3.1.3 Sàng lọc thể biến nạpE.ớớ/í Top 10F’ chứa plasmid pNANOGEN-CB6 48 3.2 Kết biến nạp biểu hiện kháng thể kháng protein SARS-CoV-2 RBD dạng bán phần chuỗi đơn tể bào E coli 51 3.2.1 Kết tách chiết, tinh plasmid pNANOGEN-CB6 51 3.2.2 Kết chọn lọc dòng tế bào E coli BL21 mang plasmid pNANOGEN- CB6 52 3.2.3 Kết kiểm tra biểu gen mục tiêu CB6 55 3.3 Ket 2: Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E coli BL21(DE3)/pNANOGEN-CB6 môi trường LB 56 vii