(Luận văn) nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào e coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cyp264b1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - TRẦN THỊ MAI lu an va n NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI tn to TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA p ie gh MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE d oa nl w lu ll u nf va an LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC oi m z at nh z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - TRẦN THỊ MAI lu an n va NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ tn to HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA p ie gh MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE w oa nl Chuyên ngành: Công nghệ sinh học d Mã số: 60420201 ll u nf va an lu m oi LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÝ THỊ BÍCH THỦY z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu dƣới tơi nhóm cộng nghiên cứu phịng Sinh hóa thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201… Học viên Trần Thị Mai lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Lý Thị Bích Thủy – Nghiên cứu viên phịng Sinh hóa thực vật – Viên Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn tạo điều kiện kinh phí, hóa chất thiết bị suốt thời gian tơi thực luận văn phịng Tơi xin chân thành cảm ơn CN Đồn Hữu Thanh chú, anh chị cán phịng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng Nghệ Việt Nam nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến q báu để tơi hồn thành luận văn lu an Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh thầy cô giáo n va nhà trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, thầy cô Viện tn to Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều Tôi xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia p ie gh kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nl w (NAFOSTED) cung cấp kinh phí để chúng tơi thực nghiên cứu đề d oa tài mã số 106-NN.02-2013.57 an lu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ngƣời ln bên tơi, động viên góp ý cho tơi suốt trình học tập ll u nf va thực luận văn oi m Bằng lịng biết ơn sâu sắc tơi xin chân thành cảm ơn! z at nh Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201… Học viên z gm @ m co l Trần Thị Mai an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si CÁC TỪ VIẾT TẮT lu an Giải thích µg Micro gram µM Micromol µl Microlit AdR Adrenodoxin reductase Adx Adrenodoxin APS Amonium persulphate bp Base pair CYP Cytochrome P450 CPR Cytochrcome P450 reductase n va Chữ viết tắt gh tn to Deoxyribonucleic acid p ie DNA Deoxyribonucleotide triphosphate Flavin adenin dinucleotid Fdx d oa nl FAD w dNTP Ferredoxin Ferredoxin reductase Flavodoxin ll u nf va Fldx an lu FdR m Flavin mononucleotide oi FMN z at nh Gas chromatography mass spectometry HPLC High pressure liquid chromatography IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton KppG Kali phosphate glycerol LB Lysogeny broth z GCMS m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si NMR Nuclear Magnetic Resonance NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PCB Polychlorinate biphenyl PCR Polymerase chain reaction SDS – PAGE Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis lu an Terrific Broth TLC Thin layer chromatography v/p Vòng/phút n va TB p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC .V DANH MỤC CÁC HÌNH VII DANH MỤC CÁC BẢNG IX MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytochrome P450 1.1.1 Định nghĩa phân loại lu 1.1.2 Cấu trúc cytochrome P450 an va 1.1.3 Cơ chế xúc tác cytochrome P450 n 1.1.4 Ứng dụng cytochrome P450 gh tn to 1.2 Nghiên cứu CYP264B1 10 1.3 Hợp chất sesquiterpene 13 ie p 1.3.1 Định nghĩa nguồn gốc 13 nl w 1.3.2 Phân loại sesquiterpene 13 d oa 1.3.3 Vai trò ứng dụng sesquiterpene 15 lu 1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa hệ thống cytochrome P450 16 va an 1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene u nf giới Việt Nam 19 ll CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 m oi Vật liệu nghiên cứu 20 z at nh 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 21 z gm @ 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.4 Dung dịch đệm 22 l 2.1.5 Môi trƣờng 23 m co 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 an Lu 2.2.1 Nuôi cấy E.coli 24 http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN n va 2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli phƣơng pháp sốc si nhiệt 24 2.2.3 Kiểm tra có mặt gene CYP264B1, AdR Adx 25 2.2.4 Kiểm tra khả biểu gene 27 2.2.5 Kiểm tra khả chuyển hóa nootkatone 30 2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu 30 2.2.7 Chuyển hóa số hợp chất sesquiterpene 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA kiểm tra có mặt gene mã hóa CYP264B1, AdR Adx 34 3.2 Kiểm tra khả biểu gene 35 lu 3.2.1 Khả biểu gene CYP264B1 35 an 3.2.2 Khả biểu Adx 36 va n 3.3 Kiểm tra khả chuyển hóa nootkatone hệ xúc tác tế bào tn to C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx 38 ie gh 3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu 39 p 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng lên khả chuyển hóa chất 39 nl w 3.4.2 Ảnh hƣởng mật độ tế bào lên khả chuyển hóa chất 41 oa 3.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả chuyển hóa chất 42 d 3.4.4 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả chuyển hóa chất 44 lu va an 3.4.5 Lựa chọn nồng độ chất thích hợp để chuyển hóa 45 u nf 3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa số hợp chất ll sesquiterpene 47 m oi 3.5.1 Kết chuyển hóa longipinene 48 z at nh 3.5.2 Kết chuyển hóa isolongifolene 50 3.5.3 Tinh nhận dạng sản phẩm chuyển hóa 51 z gm @ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 l PHỤ LỤC 60 m co an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si DANH MỤC CÁC HÌNH Nội dung Tên hình 1.1 Trang Cách gọi tên enzyme P450 Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử hệ thống cytochrome 1.2 P450 1.3 Cấu trúc không gian Cytochrome P450cam 1.4 Cấu tạo nhân heme enzyme cytochrome P450 Sắp xếp gene mã hóa CYP264B1 terpene cyclase 10 1.5 GeoA cụm gene myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 Cấu trúc nhóm sắt-lƣu huỳnh 11 1.7 Cấu trúc nhóm FAD 12 1.8 Một số sesquiterpene phổ biến 13 1.9 Một số Sesquiterpene mạch thẳng 14 1.10 Một số sequiterpene mạch vòng đơn 14 p Một số sesquiterpene đa vòng 15 Plasmid pET C4AA 20 2.2 Sơ đồ nghiên cứu đề tài oa 24 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR colony 34 3.2 Cấu trúc đa gene vector pETC4AA lu 1.6 an n va ie gh tn to nl 2.1 w 1.11 d an lu u nf va 35 Phổ hấp thụ ánh sáng vùng 400-500 nm dịch 36 ll chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 cảm ứng 3.4 Kết điện di protein ngoại bào 37 Phân tích khả biểu Adx với kháng thể đặc hiệu 38 oi z at nh kỹ thuật Western blot z 3.5 m 3.3 @ Sắc ký đồ HPLC phân tích kết chuyển hóa nootkatone gm 39 hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA 3.7 Chuyển hóa glycerol tế bào vi sinh vật 3.8 Cấu trúc longipinene isolongifolene 3.9 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene l 3.6 m co 43 an Lu 47 49 n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 3.10 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene 50 Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) cấu 51 trúc dự đoán GCMS (b) 3.11 Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) cấu 3.12 trúc dự đoán GCMS (b) 3.13 Cấu trúc phân tử 15-hydroxy longipinene 52 52 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://www.lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si 3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa số hợp chất sesquiterpene Trong phần sử dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa hợp chất sesquiterpenes longipinene isolongifolene Đây sesquiterpene có hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn [18], [12] lu an n va p ie gh tn to Hình 3.8 Cấu trúc longipinene isolongifolene w oa nl Q trình chuyển hóa đƣợc thực nhƣ điều kiện tối ƣu trên: Tế bào d C43DE3/pETC4AA đƣợc nuôi lắc môi trƣờng TB lỏng 37οC lu an mật độ quang dịch nuôi cấy OD600 nm = bổ sung 1mM IPTG hạ nhiệt độ u nf va nuôi cấy xuống 30οC Sau 24 giờ, tế bào đƣợc thu nhận ly tâm chuyển sang ll môi trƣờng KppG cho mật độ tế bào đạt 20 g/l, bổ sung 200 µM chất tiếp m oi tục lắc 24 Sau đó, mơi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết lần z at nh thể tích chloroform đem phân tích GCMS Trong thí nghiệm sử dụng hệ xúc tác với điều kiện tối z gm @ ƣu xác định trên, không phát thấy sản phẩm chuyển hóa Đồng thời, kết phân tích dịch chiết mơi trƣờng sau 24 chuyển hóa khơng thể l m co có mặt chất đƣa vào (longipinene; isologifolene) Phân tích nguyên nhân, nhận thấy longipinene isologifolene an Lu sesquiterpenes hydrocacbon nên dễ bay Chính q trình lắc, n va hợp chất khỏi mơi trƣờng ni cấy tiếp xúc đƣợc với hệ xúc ac th 47 si tác tế bào Do đó, câu hỏi đƣợc đặt là: làm để ngăn chặn trình bay sesquiterpenes tăng cƣờng tiếp xúc chúng với hệ xúc tác tế bào? Qua tham khảo nghiên cứu giới, chúng tơi nhận thấy sử dụng cyclodextrin để giải vấn đề [41], [42] Cyclodextrin (CDs) đƣợc biết đến từ lâu nhƣ chất làm tăng khả di chuyển qua màng sinh học hợp chất tan [30] Chúng không đƣợc sử dụng làm chất vận chuyển thuốc mà đƣợc sử dụng chuyển hóa sinh học nhờ vào tính “thân thiện” chúng với vi sinh vật [42] Chẳng hạn, có mặt cyclodextrin, chuyển hóa cholesterol thành androst-4-ene-3,17-dione lu Saccharomyces cerevisiae tăng tới 90% [5] Sở dĩ cyclodextrin có tính chất an thú vị chúng có cấu trúc đặt biệt Cyclodextrin hợp chất đƣợc tạo va n thành từ phân tử đƣờng liên kết với tạo thành cấu trúc vòng (vòng tn to oligosaccharides) Các đơn vị -D, glucosyl liên kết với theo liên kết → ie gh tạo thành hình nón cụt [43], [21] p Một cyclodextrin điển hình đƣợc tạo thành 6-8 đơn vị đƣờng Mặt cyclodextrin k m ƣa nƣớc nên giữ đƣợc gốc khơng phân cực có kích thƣớc thích hợp khoang mà khơng có hình thành hay xáo trộn liên kết hóa trị Ngƣợc lại, mặt ngồi cyclodextrin có độ ƣa nƣớc đủ để làm cho chúng phức hợp chúng tan đƣợc nƣớc [32] Trong số loại cyclodextrin khác nhau, hydroxypropyl-β-cyclodextrin có hiệu để tăng cƣờng chuyển hóa sinh học [41], [27] Do đó, chúng tơi sử dụng hợp chất để trợ d oa nl w u nf va an lu ll giúp hệ xúc tác tế bào việc chuyển hóa hợp chất sesquiterpene Nồng độ cyclodextrin ban đầu sử dụng cho chuyển hóa 1% [30] Cơ chất cyclodextrin đƣợc hịa vào đệm KppG lắc trƣớc đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng chuyển hóa oi m z at nh z 3.5.1 K t chuy n hóa longipinene Chuyển hóa longipinene đƣợc thực theo điều kiện xác định Sau 24 chuyển hóa, mơi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết với thể tích ethyl acetate đem phân tích GC-MS Kết đƣợc trình bày hình 3.9 m co l gm @ an Lu n va ac th 48 si b a lu an n va gh tn to d ie c p Hình 3.9 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene w oa nl Hình a: Sắc ký đồ GCMS longipinene tinh khiết d Hình b: Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene in vitro hệ thống CYP264B1(Sản phẩm chuyển hóa in vitro đƣợc cung cấp Phịng Sinh hóa thực vật) an lu u nf va Hình c: Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene in vivo E coli C43DE3/pET17b Hình d: Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene in vivo E coli ll oi m C43DE3/pETC4AA z at nh Kết cho thấy longipinene có thời gian lƣu 10,35 phút (hình 3.9a) Chuyển hóa longipinene in vitro CYP264B1 cho sản phẩm có thời z gian lƣu 13,85 phút (hình 3.9b) Khi đƣa longipinene vào môi trƣờng KppG @ gm C43DE3/pET17b khơng thấy xuất sản phẩm có thời gia lƣu 13,85 phút l (hình 3.9c) Ngƣợc lại, sản phẩm lại xuất môi trƣờng KppG m co C43DE3/pETC4AA sau bổ sung chất (hình 3.9d) Điều chứng tỏ an Lu longipinene đƣợc chuyển hóa hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA n va ac th 49 si 35 K ả ch nh i ngifolene Chuyển hóa isolongifolene đƣợc thực theo điều kiện xác định mục 3.4 Sau 24 chuyển hóa, mơi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết với thể tích ethyl acetate đem phân tích GC-MS Kết đƣợc trình bày hình 3.10 lu an n va b p ie gh tn to a d oa nl w u nf va an lu c d ll oi m Hình 3.10 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene z at nh Hình 3.10a: Sắc ký đồ GCMS isolongifolene tinh khiết Hình 3.10b Sắc ký đồ GCMS kết chuyển hóa isolongifolene in vitro hệ thống z CYP264B1(Sản phẩm chuyển hóa in vitro đƣợc cung cấp Phịng Sinh hóa @ thực vật) gm l Hình 310c: Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongipinene in vivo E coli m co C43DE3/pET17b an Lu Hình 3.10d Sắc ký đồ GCMS kết chuyển hóa longipinene in vivo E coli C43DE3/pETC4AA n va ac th 50 si Kết cho thấy isolongifolene có thời gian lƣu 10,87 phút (hình 3.10a) Chuyển hóa isolongifolene in vitro CYP264B1 cho sản phẩm có thời gian lƣu 13,57 phút (hình 3.10b) Khi đƣa isolongifolene vào mơi trƣờng KppG C43DE3/pET17b khơng thấy xuất sản phẩm có thời gian lƣu 13,57 phút (hình 3.10c) Tuy nhiên, sản phẩm lại xuất môi trƣờng KppG C43DE3/pETC4AA sau bổ sung isolongifolene (hình 3.10d) Điều chứng tỏ isolongifolene đƣợc chuyển hóa hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA Tinh ạch v nhận ạng ản hẩ ch nh Để có lƣợng sản phẩm chuyển hóa đủ để gửi nhận dạng NMR, chuyển lu hóa longipinene isolongifolene đƣợc thực lít mơi trƣờng KppG với nồng độ chất 200 µM (tƣơng đƣơng với 40,8 mg) Sau chuyển hóa, mơi an n va gh tn to trƣờng đƣợc chiết thể tích ethyl acetate cô đặc máy hút chân không nhƣ mô tả phần phƣơng pháp Sản phẩm cô đặc (3 ml) đƣợc đƣa lên cột silicagel để phân tách với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetate (95:5) Các phân đoạn đƣợc kiểm tra phƣơng pháp TLC với mẫu đối chứng sản phẩm chuyển hóa in p ie vitro chất CYP264B1 Các phân đoạn chứa sản phẩm đƣợc tập hợp lại nl w kiểm tra độ tinh phƣơng pháp GCMS Sản phẩm, sau đƣợc đặc lại máy quay chân khơng trƣớc gửi phân tích phƣơng pháp NMR d oa Kết kiểm tra sản phẩm tinh longipinene isolongipine GCMS đƣợc thể hình 3.11 3.12 ll u nf va an lu oi m z at nh z a @ b gm Hình 3.11 Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) m co l cấu trúc dự đoán GCMS (b) an Lu n va ac th 51 si a b Hình 3.12 Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) cấu trúc dự đoán GCMS (b) lu an n va tn to Kết hình 3.11 cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa longipinene có độ tinh cao (hình 3.11a) Khi so sánh với thƣ viện phổ khối NIST 2.0 (National Institute of Standards and Technology), sản phẩm có độ tƣơng đồng cao (63%) với chất có cơng thức phân tử C15H24O, có tên 2-(4a,8-Dimethyl1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydro-naphthalene-2γ)1-prop-2-en-1-ol, có cấu trúc phân tử ie gh đƣợc minh họa hình 3.11b) p Kết hình 3.12 cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa isolongifolene có độ tinh cao (hình 3.12a) Khi so sánh với thƣ viện phổ khối NIST 2.0, sản phẩm w d oa nl có độ tƣơng đồng cao (89%) với chất có cơng thức phân tử C15H24O có tên 9-hydroxy-isolongifolen, cấu trúc phân tử đƣợc minh họa hình 3.12b) lu u nf va an Từ lít mơi trƣờng chuyển hóa longipinene, chúng tơi thu dƣợc 11mg sản phẩm sau tinh Sản phẩm đƣợc gửi phân tích cấu trúc phƣơng ll pháp NMR Kết phân tích cho thấy, sản phẩm 15 hydroxy-longipinene, có cấu trúc phân tử đƣợc minh họa hình 3.13 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình 3.13 Cấu trúc phân tử 15-hydroxy longipinene Đối với chuyển hóa isolongifolene, lƣợng sản phẩm thu đƣợc sau tinh n va ac th 52 si chƣa đủ để phân tích NMR (dƣới mg) Nguyên nhân trình tinh chƣa tối ƣu, dẫn đến lƣợng sản phẩm bị nhiều sau trình Hiện nay, tiến hành tinh để nhận dạng sản phẩm chuyển hóa isolongifolene NMR lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 53 si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Qua thí nghiệm đƣợc trình bày trên, đề tài rút số kết luận sau: Điều kiện để hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA hoạt động tối ƣu - Môi trƣờng biểu hiện: TB - Mơi trƣờng chuyển hóa: KppG - Mật độ tế bào: 20 g/l - Nhiệt độ biểu chuyển hóa chất: 30oC - Tốc độ lắc: 180 v/p - Nồng độ chất: 200 µM lu an Sử dụng thành công hệ xúc tác tế bào E.coli C43DE3/pETC4AA để chuyển n va hóa hợp chất sesquiterpenes longipinene isolongifolene Kết sản phẩm gh tn to chuyển hóa hợp chất cho thấy chúng đƣợc chuyển hóa thành ie Tinh xác định đƣợc cấu trúc sản phẩm chuyển hóa longipinene p phƣơng pháp NMR, sản phẩm có cơng thức phân tử C15H24O đƣợc nhận nl w dạng 15-OH-longipinene oa Đã tinh sản phẩm chuyển hóa isolongifolene, sản phẩm có độ tƣơng d đồng cao (89%) với 9-hydoxy isolongifolene, có cơng thức phân tử lu an C15H24O Sản phẩm tiếp tục đƣợc chuyển hóa tinh ll ĐỀ NGHỊ u nf va để gửi phân tích phƣơng pháp NMR m oi Tiếp tục tinh để nhận dạng sản phẩm chuyển hóa isolongifolene z at nh Chúng gợi ý thêm số sesquiterpene thú vị có hàm lƣợng cao hoạt tính dƣợc học tinh dầu để chuyển hóa hệ xúc tác tế bào z @ C43DE3/pETC4AA nhƣ: caryophyllene (chiếm 19,22% tinh dầu ngải gm cứu); selinene (chiếm 68,54% tinh dầu cúc tần); curcumen có dầu zingiberen thành phần chủ yếu dầu gừng m co l nghệ, có tác dụng diệt khuẩn, làm vết thƣơng chóng thành sẹo, chữa loét tá tràng; an Lu Đánh giá so sánh hoạt tính sinh học sesquiterpene sản phẩm chuyển hóa chúng qua khả chống xi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn… n va ac th 54 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đào Hùng Cƣờng Huỳnh Thị Thanh Hƣơng (2009), “Nghiên cứu xác định thành phần terpenoid tinh dầu rái Đại Lộc – Quảng Nam”, Tạp ch hoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng 6(35) Nguyễn Thị Ngọc Dao (2011), Cytochrome – P450, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội, 17-41, 167-185 Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đái Duy Ban, Nguyễn Thị Bích Nhi (1985), “Tách chiết làm phần cytochrome P450”, Báo cáo nghiên cứu khoa học – Trung lu tâm Sinh lý Hóa sinh Người Động vật – Viện Khoa học Việt Nam 1975-1985, Hà an va Nội, 370-374 n Nguyễn Văn Tuyến, Trần Văn Lộc, Nguyễn Đức Vinh, Đặng Thị Tuyết Anh tn to Trần Văn Sung (2012), “Nghiên cứu tổng hợp sesquitecpen lacton thuộc khung p ie gh pseudoguainolide với hệ vịng -lacton -metyl”, Tạp chí Hóa học 50 (4B):83-86 w Tài liệu tiếng anh d oa nl Bar R (1989), “Cyclodextrin aided bioconversions and fermentations”, Trends Biotechnol 7:2– Bernhardt R (1996), “Cytochrome P450 : structure, function, and generation of an lu va reative oxygen species”, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 127, pp, 137-221 oi m Biotechnol.124:128-145 ll u nf Bernhardt R (2006), “Cytochromes P450 as versatile biocatalysts”, J Chu SS, Jiang GH, Liu ZL (2011), Insecticidal compounds from the essential oil z at nh of Chinese medicinal herb Atractylodes chinensis, Pest Manag Sci 67:1253-1257 z Denisov IG, Makris TM, Sligar SG, and Schlichting I (2005), “Structure and @ chemistry of cytochrome P450”, Chem Rev 105:2253–2278 gm l 10 Ewen KM, Hannemann F, Khatri Y, Perlova O, Kappl R, Krug D, Hüttermann m co J, Müller R, Bernhardt R (2009), “Genome mining in Sorangium cellulosum So ce56: identification and characterization of the homologous electron transfer an Lu proteins of a myxobacterial cytochrome P450”, J Biol Chem 284:28590–28598 n va 11 Fraga BM (2006), “Natural sesquiterpenoids”, Nat Prod Rep 23:943–72 ac th 55 si 12 Gabriela Paun, Saadia Zrira, Amale Boutakiout, Oana Ungureanu, Demetra Simion, Ciprian Chelaru and Gabriel Lucian Radu (2013), “Chemical composition, antioxidant and antibacterial activity of essential oils from moroccan aromatic herbs”, Rev Roum Chim., 58(11-12), 891-897 13 Hannemann F, Bichet A, Ewen KM, Bernhardt R (2007), “Cytochrome P450 systems-biological variations of electron transport chains”, Biochim Biophys Acta, 1770(3):330-44 14 Imai M, Shimada H, Watanabe Y, Matsushima-Hibiya Y, Makino R, Koga H, Horiuchi T and Ishimura Y (1989), “Uncoupling of the cytochrome P-450cam monooxygenase reaction by a single”, Proc Natl Acad Sci USA 86:7823–7827 lu an 15 Jörg Degenhardt, Tobias G Köllner, Jonathan Gershenzon (2009), va Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal n tn to diversity in plants, Phytochemistry, 1621-1637 gh 16 Khatri Y, Hannemann F, Perlova O, Müller R, Bernhardt R (2011), p ie “Investigation of cytochromes P450 in myxobacteria: excavation of cytochromes oa nl 1513 w P450 from the genome of Sorangium cellulosum So ce56”, FEBS Lett, 585:1506– d 17 Kimata Y, Shimada H, Hirose T, Ishimura Y (1995), “Role of Thr-252 in lu an cytochrome P450cam: a study with unnatural amino acid mutagenesis”, Biochem u nf va Biophys Res Commun 208:96–102 18 Kowsalya Rangasamy and Elangovan Namasivayam (2014), “In vitro ll oi m Antioxidant and Free Radical Scavengin Activity of Isolongifolene”, Asian Journal z at nh of Biological Science Doi: 10.3923/ajbs.2014 19 Laemmli UK (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of z the head of bacteriophage T4”, Nature, 1970;227:680–5 @ gm 20 Lamb DC, Lei L, Warrilow AG, Lepesheva GI, Mullins JG, Waterman MR and l Kelly SL (2009), “The first virally encoded cytochrome P450”, J Virol 83:8266– m co 8269 an Lu 21 Larsen KL (2002), “Large cyclodextrins”, J Inclusion Phenom Macro 43:1–13 22 Legault J and Pichette A (2007), “Potentiating effect of beta-caryophyllene on n va ac th 56 si anticancer activity of alpha-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel”, J Pharm Pharmacol 59(12):1643-7 23 Liu Q, Majdi M, Cankar K, Goedbloed M, Charnikhova T, Verstappen FW, de Vos RC, Beekwilder J, van der Krol S, Bouwmeester HJ (2011), “Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana”, PLoS One 6(8):e23255 24 Loeber DE, Russell SW, Toube TP, Weedon BCL, and Diment J (1971), “Carotenoids and related compounds Part XXVIII Syntheses of zeaxanthin, βcryptoxanthin, and zeinoxanthin ( -cryptoxanthin)”, J Chem Soc 404–408 25 Luo DQ, Wang F, Bian XY, Liu JK (2005), “Rufuslactone, a New Antifungal lu an Sesquiterpene from the Fruiting Bodies of the Basidiomycete Lactarius rufus”, J va Antibiot 58(7): 456-459 n tn to 26 Ly TT, Khatri Y, Zapp J, Hutter MC, Bernhardt R (2012), “CYP264B1 from gh Sorangium cellulosum So ce56: a fascinating norisoprenoid and sesquiterpene p ie hydroxylase” Appl Microbiol Biotechnol 95(1):123-33 w 27 Mahato SB, Garai S (1997), Advances in microbial steroid biotransformation, oa nl Steroids 62:332–45 d 28 Mansuy D (1998), The great diversity of reactions catalyzed by cytochromes lu an P450, Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 121:5–14 u nf va 29 Martinis SA, Atkins WM, Stayton PS, Sligar SG (1989), “A conserved residue of cytochrome P450 is involved in heme-oxygen stability and activation”, J Am ll oi m Chem Soc 111:9252–9253 z at nh 30 Másson M, Loftssona T , Mássonb G, Stefánsson E (1999), “Cyclodextrins as permeation enhancers: some theoretical evaluations and in vitro testing”, Journal of z Controlled Release 59:107–118 @ gm 31 McGarvey DJ and Croteau R (1995), Terpenoid Metabolism, The Plant Cell l 7:1015–1026 m co 32 Munoz-Botella S, del Castillo B, Martin MA (1995), Cyclodetrin properties an Lu and applications of inclusion complex formation, Ars Pharm 36:187–98 33 Nelson D.R (2009), The cytochroem P450 homepage, Hum Genomics, 4(1), n va ac th 57 si pp, 59-65 34 Nonaka Y, Murakami H, Yabusaki Y, Kuramitsu S, Kagamiyama H, Yamano T, Okamoto M (1987), Molecular cloning and sequence analysis of full-length cDNA for mRNA of adrenodoxin oxidoreductase from bovine adrenal cortex, Biochem Biophys Res Commun 1987 Jun 30;145(3):1239-47 35 Omura T and Sato R (1964), “The Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver Microsomes”, Ii Solubilization, Purification, and Properties J Biol Chem 239:2379–85 36 Pylypenko O, Schlichting I (2004), “Structural aspects of ligand binding to and electron transfer in bacterial and fungal P450s”, Annu Rev Biochem 73:991–1018 lu an 37 Ringle M, Khatri Y, Zapp J, Hannemann F, Bernhardt R (2012), “Application va of a new versatile electron transfer system for cytochrome P450-based Escherichia n tn to coli whole-cell bioconversions”, Appl Microbiol Biotechnol 2012 Dec 20 gh 38 Sahdev S, Khattar SK, and Saini KS (2008), Production of active eukaryotic p ie proteins through bacterial expression systems: A review of the existing w biotechnology strategies, Mol Cell Biochem 307:249–264 35(6) 844–849 d oa nl 39 Sakaki T (2012), Practical Application of Cytochrome P450 Biol, Pharm Bull lu an 40 Shirano Y and Shibata D (1990), Low temperature cultivation of Escherichia u nf va coli carrying a rice lipoxygenase L-2 cDNA produces a soluble and active enzyme at a high level, FEBS Lett 271:128–130 ll oi m 41 Singer Y, Shity H, and Bar R (1991), Microbial transformations in a z at nh cyclodextrin medium Part Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae Appi Microbiol Biotechnol 35:731–737 z 42 Singh M, Sharma R, Banerjee UC (2002), Biotechnological applications of @ gm cyclodextrins, Biotechnology Advances 20:341–359 l 43 Szejtli J (1998), “Introduction and General Overview of Cyclodextrin m co Chemistry”, Chem Rev 98:1743–1753 an Lu 44 Takahashi S, Yeo YS, Zhao Y, O'Maille PE, Greenhagene BT, Noel JP, Coates RM, Chappell J (2007), “Functional characterization of premnaspirodiene n va ac th 58 si oxygenease, a cytochrome P450 catalyzing regio- and stereo-specific hydroxylations of diverse sesquiterpene substrates” J Biol Chem 282(43):3174454 45 Urlacher VB, Lutz-Wahl S, Schmid RD (2004), “Microbial P450 enzymes in biotechnology”, Appl Microbiol Biotechnol 64:317–325 46 Urlacher VB, Girhard M (2012), Cytochrome P450 monooxygenases: an update on perspectives for synthetic application, Trends Biotechnol 30(1):26-36 47 Urlacher VB, Makhsumkhanov A, Schmid RD (2006), Biotransformation of beta-ionone by engineered cytochrome P450 BM-3, Appl Microbiol Biotechnol 70:53–9 lu an 48 Volonte F, Marinelli F, Gastaldo L, Sacchi S, Pilone MS, Pollegioni L, and va Molla G (2008), Optimization of glutaryl-7- aminocephalosporanic acid acylase n tn to expression in E.coli, Protein Expr Purif 61:131–137 gh 49 Walton AZ, Stewart JD (2004), Understanding and Improving NADPH- p ie Dependent Reactions by NongrowingEscherichia coliCells, Biotechnol Prog w 2004;20:403–11 oa nl 50 Yu F, Okamoto S, Harada H, Yamasaki K, Misawa N, Utsumi R (2011), d Zingiber zerumbet CYP71BA1 catalyzes the conversion of α-humulene to 8- u nf va 1040 an lu hydroxy-α humulene in zerumbone biosynthesis, Cell Mol Life Sci 68:1033– 51 Zhao B, Lin X, Lei L, Lamb DC, Kelly SL, Waterman MR, Cane DE (2008), ll oi m Biosynthesis of the sesquiterpene antibiotic albaflavenone in Streptomyces z at nh coelicolor A3(2), J Biol Chem 283(13):8183-9 z m co l gm @ an Lu n va ac th 59 si PHỤ LỤC I Vector pET17b lu an n va p ie gh tn to oa nl w d II Trình tự gene mã hóa cho CYP264B1, AdR Adx an lu Trình t gene mã hóa cho CYP264B1 va u nf atgggcactcaagaacaaaccccccagatctgtgtggtgggcagtggcccagctggcttttacacggcccagcacctg ll ctaaagcaccactcccgggcccacgtggatatctacgagaaacagctggtgcccttcggcctggtgcgctttggcgtgg m oi cgcctgaccaccccgaggtcaagaatgttatcaacacctttacccagacggcccgctctgaccgctgtgccttctatggc z at nh aacgtggaggtgggcagggatgtgactgtgcaggagctgcaggacgcctaccacgccgtggtgctgagctatgggg cagaggaccatcaggccctggatatccctggtgaggagttgcccggcgtgttctcggcccgggcctttgtgggctggta z @ caatgggcttcctgagaaccgggagctggccccggacctgagctgtgacacagccgtgattctggggcaggggaatg gm tggctctggacgtggcccggatcctgctgaccccccccgaccacctggagaaaacggacatcactgaggccgccctg m co l ggagccctgagacagagtcgggtgaagacggtgtggatcgtgggccgacgtggacccctacaagtggccttcaccat aaaggagcttcgggagatgattcagttaccaggaactcggcccatgttggatcctgcggatttcttgggtctccaggaca an Lu gaatcaaggaggccgctcgcccgaggaagcggctgatggaactgctgcttcgaacagccacggagaagccagggg tggaggaggctgcccgccgggcatcagcctcccgtgcctggggcctccgcttcttccgaagcccgcagcaggtcctg n va ccctcgccagatgggcggcgggcggcaggcatccgcctggcagtcaccagactggagggcattggagaggccacc ac th 60 si cgggcagtgcccactggggatgtggaggacctcccctgtgggctggtgctgagcagcattgggtataagagccgccc catcgaccccagtgtgccctttgaccccaagctcggggttgtccccaatatggagggccgggttgtggatgtgccaggc ctctactgcagcggctgggtgaagcggggacccacaggtgtcatcaccaccaccatgaccgacagcttcctcaccgg ccagattctgctacaggacctgaaggccgggcacctgccgtctggccccaggccgggctctgcattcatcaaggccct gctggacagccgaggggtctggcccgtgtctttctcggactgggagaaactggatgctgaggaggtgtcccggggcc aggcctcggggaagcccagagagaagctgctggatcctcaggagatgctgcggctgctggggcactga Trình t gene mã hóa cho AdR atgggcactcaagaacaaaccccccagatctgtgtggtgggcagtggcccagctggcttttacacggcccagcacctg ctaaagcaccactcccgggcccacgtggatatctacgagaaacagctggtgcccttcggcctggtgcgctttggcgtgg cgcctgaccaccccgaggtcaagaatgttatcaacacctttacccagacggcccgctctgaccgctgtgccttctatggc lu an aacgtggaggtgggcagggatgtgactgtgcaggagctgcaggacgcctaccacgccgtggtgctgagctatgggg va cagaggaccatcaggccctggatatccctggtgaggagttgcccggcgtgttctcggcccgggcctttgtgggctggta n caatgggcttcctgagaaccgggagctggccccggacctgagctgtgacacagccgtgattctggggcaggggaatg tn to tggctctggacgtggcccggatcctgctgaccccccccgaccacctggagaaaacggacatcactgaggccgccctg ie gh ggagccctgagacagagtcgggtgaagacggtgtggatcgtgggccgacgtggacccctacaagtggccttcaccat p aaaggagcttcgggagatgattcagttaccaggaactcggcccatgttggatcctgcggatttcttgggtctccaggaca gaatcaaggaggccgctcgcccgaggaagcggctgatggaactgctgcttcgaacagccacggagaagccagggg w oa nl tggaggaggctgcccgccgggcatcagcctcccgtgcctggggcctccgcttcttccgaagcccgcagcaggtcctg d ccctcgccagatgggcggcgggcggcaggcatccgcctggcagtcaccagactggagggcattggagaggccacc lu an cgggcagtgcccactggggatgtggaggacctcccctgtgggctggtgctgagcagcattgggtataagagccgccc u nf va catcgaccccagtgtgccctttgaccccaagctcggggttgtccccaatatggagggccgggttgtggatgtgccaggc ctctactgcagcggctgggtgaagcggggacccacaggtgtcatcaccaccaccatgaccgacagcttcctcaccgg ll oi m ccagattctgctacaggacctgaaggccgggcacctgccgtctggccccaggccgggctctgcattcatcaaggccct gctggacagccgaggggtctggcccgtgtctttctcggactgggagaaactggatgctgaggaggtgtcccggggcc z at nh aggcctcggggaagcccagagagaagctgctggatcctcaggagatgctgcggctgctggggcactga z Trình t gene mã hóa cho Adx @ gm atgagcagctcagaagataaaataacagtccactttataaaccgtgatggtgaaacattaacaaccaaaggaaaaattggtga l ctctctgctagatgttgtggttcaaaataatctagatattgatggttttggtgcatgtgagggaaccttggcttgttctacctgtcac m co ctcatctttgaacagcacatatttgagaaattggaagcaatcactgatgaggagaatgacatgcttgatctggcatatggactaa cagatagatcgcggttgggctgccagatctgtttgacaaaggctatggacaatatgactgttcgagtaccttaa an Lu n va ac th 61 si