nghiên cứu sử dụng các tác nhân vi sinh vật trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh nấm hại rễ (phytophthora spp.) ở cây trồng có múi

Trên thế giới đã có nhiều thí nghiệm và thực nghiệm về việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm … trong phòng chống bệnh hại cây trồng, đặc biệt là nhóm bệnh h

MỞ ĐẦU

Hàng năm trên thế giới các bệnh thực vật như bệnh đạo ôn, bệnh xì mủ, thối cổ rễ gây ra những tổn thất nặng nề cho sản xuất nông nghiệp Khoảng hơn 8000 loài nấm có khả năng gây bệnh cho cây trồng và một vài loài nấm

có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng[5] Trong đó các bệnh do nấm

Phytophthora spp gây ra được xem rất nguy hiểm ở nhiều loại cây như sầu

riêng, cam, quýt, nhãn Ở Mỹ, nấm Phytophthora spp gây thiệt hại cho cây

trồng gây thất thu hàng tỉ đô la mỗi năm Chỉ ở bang Ohio của Mỹ, nấm

Phytophthora spp gây bệnh thối rễ trên cây đậu nành làm thiệt hại trên 50 triệu đô la mỗi năm Ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay, bệnh này đã phát triển

và gây hại ở một số tỉnh phía Nam Bệnh do nấm Phytophthora spp gây ra là

bệnh rất nguy hiểm trên cây ăn quả, bởi chúng tấn công và gây hại cho cây từ giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành, thậm chí đến giai đoạn sau thu hoạch Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, trồng trọt quanh năm, sự lan truyền của các tác nhân gây bệnh trong nước tưới, hệ thống thoát nước kém, cây giống không sạch bệnh là những yếu tố tạo điều kiện thuận lợi cho

sự phát triển của bệnh này

Trên thế giới, hàng loạt các biện pháp phòng trừ nấm bệnh đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và được áp dụng[1, 8] Việc sử dụng thuốc hoá học trừ nấm bệnh thường rất độc và rất tốn kém, có khả năng tồn dư trong đất, nước, nông sản sẽ gây ảnh hưởng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái Mặt khác việc sử dụng thuốc hoá học nhiều làm cho nhiều loài vi khuẩn và nấm bệnh hại có khả năng kháng lại thuốc nên hiệu quả diệt trừ không cao Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn Khu vực Thái Bình Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định: đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (quản lí dịch hại tổng hợp) với 3 chiến lược cơ bản chính [23]:

1 Sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể kí sinh Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng

2 Làm tăng các vi sinh vật có ích, đấu tranh chống các vi sinh vật ký sinh cho cây ở trong đất

3 Thúc đẩy khả năng sinh trưởng cây trồng, làm tăng sức chống chịu của cây

Hiện nay biện pháp phòng chống nấm bệnh cây trồng bằng chế phẩm sinh học, đang được sử dụng rộng rãi bởi tính bền vững, an toàn với môi trường sinh thái, an toàn với sức khỏe con người và tính hiệu quả của chúng Trên thế giới đã có nhiều thí nghiệm và thực nghiệm về việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm … trong phòng chống bệnh hại cây trồng, đặc biệt là nhóm bệnh hại có nguồn gốc trong đất (nấm, vi khuẩn…) Tại Việt Nam, việc tìm kiếm các vi sinh vật có khả năng đối kháng, tiêu diệt nấm bệnh đã và đang được nhiều nhà khoa học tiến hành Các chế phẩm từ vi sinh có khả năng kháng nấm bước đầu đã được thử nghiệm ở nhiều quy mô khác nhau [3, 4, 5, 8]

Xuất phát từ những yêu cầu, thực trạng đó, cùng với xu hướng nghiên cứu

trên thế giới hiện nay, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:"Nghiên cứu sử

dụng các tác nhân vi sinh vật trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh nấm hại rễ (Phytopthora spp.) ở cây trồng có múi”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẤU TRANH SINH HỌC (Biological control)

1.1.1 Khái niệm

Đấu tranh sinh học là việc giảm các quần thể phá hoại bằng các đối thủ

tự nhiên và thông thường có sự tham gia tích cực của con người Các đối thủ

tự nhiên của các loài phá hoại, còn được gọi là các tác nhân đấu tranh sinh học bao gồm những loài ăn mồi, các loài kí sinh và các mầm bệnh Các tác nhân đấu tranh sinh học đối với các bệnh ở thực vật thường được đề cập là các loài đối kháng (antagonist) Các tác nhân đấu tranh sinh học của cỏ dại bao gồm các loài ăn cỏ và các mầm bệnh ở thực vật Các loài ăn mồi như bọ cánh cứng (lady beetle) và lacewing, là các loài sống tự do mà sử dụng số lớn con mồi trong đời sống của nó Các loài kí sinh (Parasitoids) là những loài mà giai đoạn chưa trưởng thành của nó phát triển trên hoặc trong một cơ thể chủ duy nhất và cuối cùng tiêu diệt cơ thể chủ Hầu hết có một dãy vật chủ rất hẹp Nhiều loài côn trùng và một số loài ruồi là những sinh vật kí sinh Các vi sinh vật gây bệnh được coi như là mầm bệnh bao gồm vi khuẩn, nấm và virut, chúng tiêu diệt hoặc làm suy yếu cơ thể chủ và khá đặc hiệu với một số nhóm côn trùng nhất định [25]

1.1.2 Đấu tranh sinh học các bệnh thực vật

Đấu tranh sinh học (kiểm soát sinh học) đối với các loài gây hại và mầm bệnh ở thực vật tiếp tục thu hút nhiều nghiên cứu và phát triển ở nhiều lĩnh vực Theo nghĩa hẹp, đấu tranh sinh học là quá trình ức chế các sinh vật gây hại bằng các sinh vật khác [11,36] Tuy nhiên, mối quan hệ tương tác lẫn nhau của các môi trường có thể tạo ra nhiều tương tác giữa các sinh vật và môi trường của chúng, nhiều trong số đó có thể góp phần tạo nên quá trình đấu tranh sinh học hiệu quả Hơn nữa, các sản phẩm tự nhiên và các chất hoá học đã được phát hiện như là kết quả của nghiên cứu về cơ chế phân tử của

quá trình phát sinh bệnh và đấu tranh sinh học đã dẫn đến sự phát triển của các chất diệt loài gây hại dựa trên nguyên lý sinh học [25,35]

Trải qua hàng trăm năm, các nghiên cứu liên tục chỉ ra rằng các vi sinh vật có thể hoạt động như các tác nhân đối kháng với nhiều mầm bệnh khác nhau ở thực vật Các tương tác giữa vi sinh vật và cơ thể thực vật chủ có thể

là rất phức tạp, những tương tác dẫn tới quá trình kiểm soát sinh học bao gồm: kháng sinh, cạnh tranh, cảm ứng sự kháng của vật chủ và tiêu diệt Khi kiểm tra các chủng vi khuẩn và nấm được phân lập từ môi trường về hoạt tính đấu tranh sinh học thì có ít nhất từ 1 đến 10% khả năng ức chế sự sinh trưởng của các mầm bệnh Tuy nhiên, một vài dòng có thể ức chế các bệnh ở thực vật dưới các điều kiện sinh trưởng khác nhau và một vài loài có phổ tác dụng rộng chống lại nhiều loài mầm bệnh Chính vì vậy, việc sàng lọc kỹ càng sẽ tạo ra nhiều vi sinh vật trong việc phát triển các chế phẩm thương mại Một vài dòng vi sinh vật đã được thương mại hoá thành công và hiện tại được phân phối như là các chất diệt loài gây hại sinh học ở Mỹ, bao gồm các vi

khuẩn thuộc về các chi Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces

và nấm thuộc về các chi Ampelomyces, Candida, Coniothyrium, Trichoderma

Sàng lọc là một bước quan trọng trong việc phát triển các tác nhân đấu tranh sinh học Thành công của các giai đoạn sau đó sẽ phụ thuộc vào phương pháp sàng lọc để xác định một loài thích hợp Nhiều tác nhân đấu tranh sinh học hữu dụng đã được phát hiện bằng cách quan sát các vùng ức chế trên đĩa thạch Đối với sự cạnh tranh, các phương pháp sàng lọc bao gồm việc tìm kiếm các vi sinh vật mà nhanh chóng tạo được khuẩn lạc trong đất vô trùng và

có khả năng loại bỏ các sinh vật khác lây nhiễm vào đó, tìm kiếm các vi sinh vật mà tạo khuẩn lạc bảo vệ đối với quá trình lây nhiễm Việc sàng lọc cơ bản đối với các vi sinh vật đấu tranh sinh học mới vẫn còn được sử dụng và dường như sẽ tiếp tục cần để làm đa dạng các ứng dụng của kiểm soát sinh học cũng như thay thế các sản phẩm đấu tranh sinh học đang được sử dụng mà có thể sẽ dẫn tới sự kháng [36]

1.2 TÁC NHÂN VI SINH VẬT TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC CHỐNG LẠI CÁC BỆNH THỰC VẬT (Biological control agents-BCAs)

Các tác nhân đấu tranh sinh học có thể là một phương pháp thay thế các chất hoá học trong việc quản lý các bệnh mùa màng do nấm Nhiều tác nhân đấu tranh sinh học hiện nay đã có sẵn trên thị trường Cạnh tranh không gian

và dinh dưỡng đối với các mầm bệnh cũng như sản sinh các hợp chất chống nấm là các cơ chế đấu tranh sinh học quan trọng nhất Điều này sẽ phụ thuộc vào khả năng tồn tại một lượng lớn các tác nhân đấu tranh sinh học ở vị trí đích Ức chế cạnh tranh và gây độc đối với các vi sinh vật khác thường xảy ra trong tự nhiên là hai vấn đề đã được xác định là những ảnh hưởng bất lợi đến việc sử dụng các tác nhân đấu tranh sinh học

1.2.1 Vi khuẩn

Nhiều tác nhân vi khuẩn đã được sử dụng rộng rãi để ức chế mầm bệnh

ở thực vật Chẳng hạn chế phẩm của B subtilis đã được thương mại hoá với thương hiệu Quantum-4000, Kodiak và Epic, sử dụng để xử lý hạt quả đậu,

rau, bông để kiểm soát bệnh do Rhizoctonia và Fusarium gây ra Một tác nhân diệt nấm chống lại bệnh mốc xám dựa trên B subtilis gần đây đã được chấp nhận cho thương mại hoá bởi EPA của Mỹ Ở Trung quốc, Bacillus sp

đã được sử dụng để tăng năng suất của lúa gạo, lúa mì, ngô, củ cải đường, cải

bắp và hạt cải dầu [36] Nhiều sản phẩm khác từ B subtilis cũng đang được

phát triển bởi các tổ chức thương mại trên khắp thế giới [33]

Việc phối trộn sẽ cung cấp một môi trường bảo vệ cho các vi khuẩn đưa vào, do đó làm tăng khả năng sống sót của nó và cho quá trình hình thành

khuẩn lạc thành công Trong khi các sinh vật dựa trên Bacillus có thể ổn định hơn về mặt di truyền thì một số loài vi khuẩn Gram âm như Pseudomonas cần

phải có những hệ thống bảo vệ đặc biệt Vidhyazakara và Muthamilan đã phát triển một chế phẩm dựa trên bột đá tan, than bùn, chất khoáng bón cây,

cao nilit, mùn cưa và phân bón sân trại mà trong đó các chủng P fluorescens

có thể sống sót tới 240 ngày dự trữ Một chủng P fluorescece được tạo ra trên

methylcellulose: đá tan có khả năng sống sót trong 10 tháng ở 4oC và làm giảm tới 68,5% bệnh ở lúa gạo Những chế phẩm vi sinh khác được sử dụng

để kiểm soát bệnh tật bao gồm Agrobacterium radiobacter, hiện nay đã được thương mại hoá ở Úc, New Zealand và Mỹ dùng để kiểm soát các bệnh mụn cây (crown gall) dưới dạng lỏng, dưới dạng bột than, bùn ẩm [36] Những chế phẩm này được hoà tan trong nước trước khi xử lý hạt và đào những rãnh nhỏ,

phun hoặc nhúng Streptomyces griseoviridis được sử dụng chống lại nhiều

nấm gây bệnh và có sẵn ở nhiều nước trên thế giới dưới dạng bột có thể làm

ẩm, được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở rễ gây ra bởi Pythium, Fusarium,

Phytophthora và Phomopsis Các chế phẩn dạng than bùn hoặc lỏng của Burkholderia cepacia cũng đang được sử dụng để kiểm soát các nấm gây

bệnh như Phytophthora, Pythium và Fusarium

Ngày nay, các CKS trong bảo vệ thực vật sử dụng có hiệu quả thường được dùng dưới dạng các chế phẩm như là: thuốc chống nấm blastixidin, kasugamyxin…; thuốc chống vi khuẩn streptomyxin, oxytetracylin…; thuốc trừ sâu avermectin – B, milbemctins…; thuốc diệt cỏ bilanafos và các chất điều hòa sinh trưởng của cây như là gibberellins Ở Nhật Bản, người ta đã có những chế phẩm chống đạo ôn và khô vằn rất có hiệu quả như: blastixidin S

chiết từ S.griseochromogenes, kasugamixin từ S.kaysugaensis, validamixin từ

S hygroscopicus Ở Ấn Độ, sử dụng aureofulvin chống bệnh thối cổ rễ Ở Anh và một số nước Châu Âu cũng đã sử dụng griseofulvin trong nông nghiệp để chống các bệnh ở cây trồng [17] Tại Việt Nam, hiện nay có sử dụng nhiều loại thuốc như: validamycin chống bệnh khô vằn, polyoxin complex chống bệnh đen lá, streptomycin chống bệnh bạc lá hại lúa

Năm 1954 Trung Quốc đã phân lập được Streptomyces spp 5406 có khả

năng sinh ra chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ cây và đã áp dụng trên

6 triệu ha trồng bông và đã thu hoạch được những kết quả rất khả quan Ngoài

ra, Trung quốc còn ứng dụng chế phẩm YIB (yield increasing bacteria) trên 6,7 triệu ha ở 30 tỉnh khác nhau Chế phẩm này không những phòng chống bệnh do vi khuẩn gây ra mà còn chứa các hormon thực vật như IAA, giberilin làm tăng năng suất cây trồng Sau đó cũng tại Trung Quốc, jingangmycin,

một chất kháng sinh được tách chiết từ một loài Streptomyces hygroscopicus,

ứng dụng rất thành công trong phòng bệnh thối rễ [34].Vi khuẩn cũng có khả năng ảnh hưởng đến chu trình sống của giun tròn trong đất do chúng bắm chặt vào vùng rễ Nhiều vi khuẩn ở rễ được biết là có tác dụng làm giảm quần thể

giun tròn và các chi quan trọng bao gồm Agro-bacterium, Alcanigenes, Bacillus, Clostridium, Desulfovibrio, pseudomonas, Ser-ratia, and Streptomyces [39] Các loài nấm kí sinh bắt buộc vào vi khuẩn như Pasteuria penetrans thường không được sản xuất ở mức thương mại vào thời điểm này,

có thể giảm quần thể giun tròn bằng khả năng kí sinh của chúng, trong khi các loài vi khuẩn trong rễ không kí sinh có thể làm giảm quần thể giun tròn bằng cách tạo khuẩn lạc ưu tiên trên thực vật chủ hoặc tạo ra các chất trao đổi độc

với giun tròn [37] Các chế phẩm thương mại của B.cepacia đã được điều chế

dưới dạng bột ẩm, hạt khuếch tán trong nước hoặc dưới dạng huyền phù đang được đánh giá để kiển soát các loại giun tròn

Trước khi một tác nhân đấu tranh sinh học vi khuẩn có thể được thương mại hoá thì một đánh giá mức độ nguy hiểm cũng phải được hoàn thành Đối với một tác nhân đấu tranh sinh học được đăng kí như là các chất diệt loài gây hại thì những quy định hiện hành đòi hỏi nhà sản xuất phải cung cấp các dữ liệu

về sự phân tán của tác nhân đấu tranh sinh học và các tác động đến các vi khuẩn khác trong môi trường mà tác nhân này được sử dụng

1.2.2 Nấm

Các loài nấm chủ yếu sử dụng trong đấu tranh sinh học là Trichoderma spp, Gliocladium viens, Tilletiopsis pallescens, and Pseudozyma flocculose [19] Nhiều nấm gây bệnh ở lá và rễ như Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora, Botrytis có khả năng được kiểm soát bởi những loài nấm này [19, 30, 36]

Có nhiều phương pháp khác nhau dùng để phát triển các chế phẩm nấm, bao gồm làm khô sợi nấm đã phân đoạn, chứa một viên hệ sợi nấm [12], viên nang bào tử hoặc hệ sợi nấm trong tinh bột hoặc alginate và bao bọc các bao tử khô lên hạt cám, một số bào tử nấm sinh sôi nhanh chóng trong nước Tương tự, các chế phẩm dạng nước thường dễ bị nhiễm do đó mà việc sử dụng các chế phẩm dưới dạng này không được ưa thích, các chế phẩm dạng bột ẩm

hoặc dạng mùn thường được sử dụng hơn Trichoderma harzianum có biểu

hiện sinh trưởng tốt hơn và đa dạng hơn khi được sản xuất dưới dạng đất

diamomit có bổ sung 10% mật đường để kiểm soát Sclerotium rolfsii trong lạc [15]

Ở Ấn Độ, đã ứng dụng chế phẩm từ một loại nấm là Trichoderma

viridae và dùng aureofulvin để phòng chống một số nấm bệnh ở rễ như

Rhizoctonia spp., Fusarium spp., Pythium, Phytophthora spp Một công thức

đã đuợc tập trung vào Trichoderma và Gliocladium như là các tác nhân đấu tranh sinh học chống lại các nấm khác do dễ phân lập, nuôi cấy và lên men

[31, 32] Các chế phẩm sinh học của T.harzianum đã được điều chế bằng

cách trộn sinh khối nấm trong môi trường đất

Các loài nấm Trichoderma đã được biết là có hoạt tính đối kháng

chống lại nhiều vi sinh vật, nhiều chủng Công thức chế phẩm của những

loài này đã được sử dụng để bảo vệ thực vật Các quần thể Trichoderma có

thể được thiết lập một cách dễ dàng trong các loại đất khác nhau Những quần thể này trở nên nhỏ hơn theo thời gian nhưng có thể tiếp tục duy trì ở mức có thể phát hiện được sau nhiều tuần hoặc thậm chí nhiều tháng Điều này được xem như là một ưu điểm đối với BCA bởi vì một trong số những khó khăn trong việc sử dụng các BCA để chống lại nấm gây hại là khó khăn trong việc tạo dựng một mật độ quần thể cần thiết ở vị trí đích với việc giảm khả năng kiểm soát mầm bệnh tương ứng với việc giảm kích thước quần thể BCA 1.3 CƠ CHẾ ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM GÂY BỆNH CÂY TRỒNG CỦA CÁC TÁC NHÂN VI SINH VẬT TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC

Ở đâu có vi sinh vật tồn tại thì sẽ có những vi sinh vật cạnh tranh, đối kháng với nó, đó là quy luật cạnh tranh sinh tồn của sinh vật nói chung trong

hệ sinh thái Vi sinh vật trong đất cũng vậy, bao gồm cả vi sinh vật hữu ích và

vi sinh vật gây bệnh Ở vùng rễ, vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng nguy hiểm

và đáng quan tâm là nấm gây bệnh Những vi sinh vật hữu ích trong vùng rễ

là các vi khuẩn kiểm soát sinh học, xạ khuẩn, nấm chúng là hàng rào phòng thủ đầu tiên chống lại các nấm gây bệnh cho cây trồng Sự có mặt của các vi sinh vật đối kháng với nấm bệnh ngăn chặn bệnh và giảm tác động gây bệnh của nấm với cây trồng [4]

Các vi sinh vật đối kháng với nấm, cho đến nay đã được biết là nhờ các cơ chế như cạnh tranh dinh dưỡng, tiêu diệt mầm bệnh (các sản phẩm trao đổi chất của các sinh vật kiểm soát sinh học có tính kháng, có tính độc đối với tế bào nấm), ký sinh đối với nấm (vi sinh vật sinh ra các emzym có khả năng phân huỷ thành tế bào nấm bệnh làm nguồn cơ chất và nguồn cacbon cho mình) và đề kháng cảm ứng của cây trồng với nấm bệnh Các cơ chế này cho đến nay vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ, nhưng các nhà khoa học cho rằng nấm bị tiêu diệt bởi các vi sinh vật đối kháng không chỉ đơn thuần từ một cơ chế nào đó mà có sự kết hợp bởi các cơ chế nói trên [4, 35]

1.4 ĐẤU TRANH SINH HỌC - CƠ HỘI VÀ THÁCH THỨC

Có nhiều cơ hội và thách thức của việc sử dụng biện pháp đấu tranh sinh học bao gồm việc phát hiện và sử dụng các vi sinh vật làm tác nhân đấu tranh sinh vật Chúng bao gồm các thách thức về khoa học và công nghệ và các quá trình điều tiết ở các nước khác nhau mà đòi hỏi những xem xét và kiểm tra trước

Ở nhiều nước cũng như cộng đồng Châu Âu, các tác nhân sinh học được xử lý với tầm quan trọng tương đuơng với các thuốc trừ sâu hoặc các thuốc diệt nấm thương mại Đánh giá dữ liệu độc học và an toàn sinh học phải thu được và cung cấp bởi các cơ quan luật pháp dẫn đến một thời gian chờ đợi dài trước khi được đăng kí, hơn nữa giá thành lại cao để có thể phát triển sản phẩm

Việc hiểu động học giữa tác nhân vi sinh học trong đấu tranh sinh học

và các quần thể vi sinh vật định cư trong đất là một tiêu chí quan trọng để đánh giá Bằng việc nghiên cứu sự đa dạng và những thay đổi trong mật độ quần thể qua thời gian, người ta có thể quan sát cách thức các quần thể tác nhân vi sinh vật và các hệ vi sinh vật bản địa ảnh hưởng với nhau như thế nào

và cho biết tác nhân vi sinh vật có tác động gì đến quần thể vi sinh vật bản địa hay không Trong thập kỉ trước, nhiều kĩ thuật dựa trên các phương pháp phân

tử đã được phát triển để nghiên cứu các quần thể sinh vật trong đất Để thiết lập nhanh thành phần quần thể với khả năng sinh sản sinh trong lượng mẫu lớn, phương pháp ELISA là một trong những phương pháp thích hợp nhất [25]

Bản chất của tác nhân vi sinh vật, đích tác dụng và kĩ thuật được sử dụng là các yếu tố rất quan trọng để quyết định các chiến lược nhằm đánh giá mức độ nguy hại đến các vi sinh khác trong đất Phần lớn những nghiên cứu đánh giá mức độ nguy hại này tập trung vào các cơ thể “địa phương” mà gần giống nhất với tác nhan vi sinh vật trong đấu tranh sinh học hoặc với các sinh vật đích do chúng có khả năng ảnh hưởng nhất Thậm chí trong các trường hợp mà những ảnh hưởng đến các cơ thể khác của tác nhân vi sinh vật đã được phát hiện thì những ảnh hưởng này nhìn chung chỉ mang tính tạm thời

và có số lượng nhỏ Bản chất tạm thời của bất kì ảnh hưởng nào đến quần thể

vi sinh vật bản địa trong đất có thể cho thấy rằng việc sử dụng các tác nhân vi sinh vật có thể xem là an toàn và không ngây hại Tuy nhiên do xác suất mà các tương tác đặc hiệu có thể xảy ra giữa các chủng đưa vào và các vi sinh vật bản địa không thể được loại bỏ nên tính an toàn của mỗi dòng mới sẽ được đánh giá trước khi nó được sử dụng rộng rãi

1.5 NẤM Phytophthora spp

1.5.1 Các đặc tính chủ yếu của Phytophthora spp

Chi Phytophthora thuộc họ Pythiaceae, lớp Oomycetes (lớp nấm noãn hay lớp nấm 2 roi) trong giới Chromista Nấm Phytophthora hay còn gọi là

nấm trứng, chi này sản sinh ra các sợi nấm không vách ngăn, các vách tế bào cấu tạo bởi polysacarit và xenllulo

Sợi nấm: cấu tạo dạng sợi giống như sợi chỉ với đặc tính phát triển phân nhánh - đây là một đặc tính phổ biến ở hầu hết các nấm Sợi nấm phát triển trên giá thể để vi sinh vật có thể hấp thu dinh dưỡng từ đó [11, 22, 26] Các loài gây bệnh cây phát triển xuyên qua bề mặt kí chủ, qua việc thâm

nhiễm trực tiếp, xuyên qua các bề mặt cây chủ còn nguyên vẹn (Phytophthora infestans) [11]

Vách tế bào sợi nấm: Khác với đa số các nấm thực sợi nấm có vách

ngăn, vách tế bào cấu tạo bởi polysacarit và kitin (Fusarium…), sợi nấm Phytophthora không có vách ngăn, vách tế bào cấu tạo bởi xenllulo,và polysacarit Đây là một đặc điểm giúp phân biệt hai nhóm này khi quan sát dưới kính hiển vi [11]

Bào tử động: Các bào tử động (hình thành từ sinh sản vô tính) thường

phổ biến ở nhiều loài thuộc nấm Oomycota (như Pythium, Phytophthora)

Các du động bào tử có thể lan truyền qua nước trong đất và trên bề mặt cây Bào tử lan truyền từ gió - nhiều loài nấm thực sản sinh ra các bào tử vô tính hoặc hữu tính với chức năng lan truyền nhờ gió Tuy nhiên một số bào tử

(Phytophthora, Pythium) lại thích ứng với hình thức lan truyền nhờ mưa và

Cấu trúc bảo tồn – các bào tử vách dày (như bào tử trứng và bào tử hậu

ở vi sinh vật như Phytophthora, Pythium) có vai trò rất quan trọng trong chu

kì bệnh [28] Trong các điều kiện bất lợi hoặc không có kí chủ hay các giá thể thích hợp khác, những vi sinh vật này thường tồn tại ở các dạng cấu trúc bảo

tồn đặc biệt như vậy Vì thế nấm Phytophthora spp có khả năng lưu tồn trong

đất, phát triển và gây hại nặng ở các vùng có tưới tiêu chủ động, lượng mưa nhiều hoặc mực thủy cấp cao [22, 28]

1.5.2 Các hình thức sinh sản của nấm Phytophthora spp

Sinh sản vô tính tạo thành các cấu trúc gọi là bọc bào tử động, nơi hình thành và giải phóng du động bào tử Những du động bào tử này di chuyển được và có vai trò quan trọng trong chu kì bệnh, đặc biệt là chức năng lan truyền trong đất ướt hoặc trong bề mặt cây trồng [11, 22, 26, 27] Sự hình

thành du động bào tử cũng là một đặc điểm phân biệt phytophthora với các

chi nấm thực Du động bào tử giúp cho việc lan truyền bệnh nhanh chóng từ cây bệnh sang cây bình thường

Phytophthora tạo các túi bào tử có những hình dạng nhất định Các du động bào tử hình thành trong bọc bào tử và được giải phóng trực tiếp từ bọc

bào tử Một số loài như P infestans và P palmivora tạo các bọc bào tử rất dễ

rụng ra khỏi cành mang bọc bào tử và có thể phân tán nhờ gió Một số loài

Phytophthora , như P cinnamomi, tạo bào tử hậu trên môi trường nhân tạo

Các bào tử này có chức năng bảo tồn trong đất

Sinh sản hữu tính: Sự sinh sản hữu tính liên quan đến sự hình thành các túi noãn (thể cái) và túi đực (thể đực) Sau khi thụ tinh, noãn cầu trong túi noãn phát triển thành bào tử trứng có vách dày Bào tử trứng là bào tử bảo tồn

và có vai trò quan trọng trong chu kì bệnh Sterol là chất cần thiết cho việc sản xuất túi noãn Vì vậy, nấm này được nuôi cấy trên môi trường PCA (thạch

cà rốt khoai tây) bởi vì chất chiết từ cà rốt chứa sterol [11, 22] Khoảng 50%

loài Phytophthora là khác tản và đòi hỏi sự kết hợp của hai cá thể có dạng

giới tính khác nhau Phần lớn các loài Phytophthora gây bệnh phổ biến ở Việt

Nam là dị tản, như P capsici, P palmivora, P nicotianae, P cinnamomi và

P colocasiae

Trong điều kiện có đầy đủ nguồn dinh dưỡng, noãn bào tử và bào tử Chlamydo trong mô rễ sẽ phát triển thành sợi nấm làm cho rễ bị thối rữa và dẫn đến cây bị hoại sinh Sau cây khi bị hoại sinh, chúng không còn thức ăn, lúc này nếu gặp điều kiện thuận lợi về thức ăn chúng sẽ lại phát triển thành sợi nấm, còn nếu trong điều kiện môi trường có lượng dinh dưỡng thấp chúng

sẽ kết lại trong túi bào tử và sống tự do trong môi trường nước cho đến khi nó bám được vật chủ là rễ cây và gây hại, nếu không gặp được vật chủ và sống trong điều kiện nghèo chất dinh dưỡng thì chúng kết thành bào xác, khi gặp điều kiện thuận lợi về dinh dưỡng thì chúng lại phát triển thành tiểu bào tử Nếu được cung cấp thêm chất dinh dưỡng thì chúng phát triển thành sợi nấm, trong điều kiện hàm lượng dinh dưỡng thấp thì chúng lại sống trôi nổi trong môi trường nước

1.5.3 Ký chủ của nấm Phytophthora spp

loại cây trồng khác nhau như: cam quýt, sầu riêng, cây dừa, ca cao, bơ, đu đủ, dứa, xoài… Ngoài ra nấm còn gây hiện tượng thối trái trên cây ổi, nhãn, táo,

cây tiêu, cao su…

1.5.4 Đặc điểm phát sinh và phát triển của nấm Phytophthora spp

Nấm Phytophthora phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 16 đến

32oC, độ ẩm không khí từ 80 đến 95%, nhất là trong mùa mưa,tuy nhiên ở nhiệt độ dưới 10OC hay trên 35oC nấm ngừng phát triển

1.5.5 Nguồn bệnh và lây lan

Nấm Phytophthora ưa thích và cần độ ẩm để sinh sản, phát triển Vì thế

ở các tỉnh Nam bộ, bệnh thường xuất hiện và gây hại nhiều trong mùa mưa, nhất là ở những vườn sau khi bị ngập lũ, những vườn trồng dầy, tán lá bít bùng, không thông thoáng khô ráo Từ nguồn bệnh ban đầu, khi gặp điều kiện

thích hợp như mưa nhiều thì bào tử vách dày có khả năng sinh sản động bào

tử và chúng có thể bơi lội trong nước tự do đến vị trí rễ và lông hút để gây hại nhờ 2 lông roi Từ các vết bệnh ban đầu các sợi nấm sẽ sinh sản rất nhiều bào

tử và lây lan rất nhanh trong điều kiện có gió, mưa hay lũ lụt Nguồn nước tưới trong vườn cũng là yếu tố làm cho nấm phát tán, lây lan rất nhanh trong vườn và trong cùng khu vực

1.5.6 Sự thiệt hại do nấm Phytophthora spp gây ra

Thiệt hại do nấm Phytophthora trên cây trồng ở Mỹ làm thất thu hàng

tỷ đô la mỗi năm và nếu tính trên cả thế giới thì còn gấp hơn nhiều lần so với

con số này Chỉ riêng Bang Ohio của nước Mỹ, nấm Phytophthora gây bệnh

thối rễ trên cây đậu nành làm thiệt hại trên 50 triệu đô la mỗi năm (Mc Blain

và ctv , 1991a, 1991b) Theo báo cáo của Whiteside về các tác nhân có liên quan đến việc dịch mục nâu đã được hạn chế trong suốt thời gian từ tháng

chín đến tháng mười năm 1968 và 1969, bị gây ra bởi loài Phytophthora có

khả năng trải rộng cao (>1m) trong cây vòm và tạo ra một số lượng lớn các các bào tử rất nhanh từ đó làm cho cây ăn quả bị hại Nguyên nhân của các bệnh do nấm gây ra ở một số vườn cây ăn quả được xác định là do

P.citrophthora (R.E.Smith & E.H Smith) Leonian

Vào năm 1994 và 1995, sự bùng phát dịch Phytophthora spp cũng

tương tự với P.palmivora (Butler) Butler được báo cáo ở một số khu vực dọc theo các vùng duyên hải và trung tâm phía nam của Florida [32] Trong trường hợp, theo kết quả của Hurricane Gordon thì hàng trăm hecta bị ảnh

hưởng với thiệt hại lên đến 90% P.palmivora được tìm thấy từ trong đất ở Florida thuộc hai vùng đông duyên hải, và Phytophthora được báo cáo là một

mầm bệnh ở cam quýt xảy ra trên diện rộng ở những vùng nhiệt đới ẩm Khi tiến hành nghiên cứu trong nhà kính và in vitro, Zitko và Timmer đã chứng

minh được rằng P palmivora tấn công và cạnh tranh gây ra mầm bệnh ở rễ, thân, và quả ở cam quýt cao hơn so với P nicotianae

Trên cây ca cao nấm Phytophthora spp gây bệnh thối trái làm thất thu

khoảng 1500 triệu bảng Anh hằng năm, khoảng 10-30% sản lượng trên thế giới (Evans và Prior, 1987) Năm 1994 do ảnh hưởng của lũ lụt nên hầu hêt

diện tích sầu riêng ở Thái Lan đã bị nhiễm nấm Phytophthora spp và bệnh

bộc phát rất nhanh gây thiệt hại nghiêm trọng, có khoảng 40% số cây bị chết

do thối gốc chảy nhựa

Ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay bệnh này đã phát triển và gây hại

nặng ở một số tỉnh phía Nam Bệnh do Phytophthora spp gây ra là bệnh rất

nguy hiểm trên cây ăn quả, do chúng tấn công và gây hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng từ giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành thậm chí đến giai đoạn sau khi thu hoạch Trong mùa lũ, phần lớn cây trồng đều bị tổn thương, nhất là bộ rễ, vì thế nấm bệnh dễ dàng tấn công, đôi khi làm cho vườn cây chết hàng loạt, hơn cả thiệt hại khi ngập Như vậy, vấn đề phòng chống nấm bệnh cây trồng là vô cùng quan trọng và cần thiết

hậu quả như: làm cho nấm bệnh quen và dẫn đến kháng thuốc, ngoài ra nhiều loài vi sinh vật có ích trong đất cũng bị tiêu diệt từ đó làm mất cân bằng môi trường sinh thái vùng rễ Bên cạnh đó hoá chất còn dư đọng trong đất sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cũng như xâm nhiễm vào thức ăn làm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Vì vậy biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại rễ bằng chế phẩm sinh học rất cần thiết bởi tính bền vững, an toàn với sức khỏe con người, môi trường sinh thái và hiệu quả kinh tế cao

1.6 Một số bệnh liên quan do nấm Phytophthora spp gây ra trên cây có múi

Do giá trị kinh tế cao nên diện tích cây ăn trái ngày càng gia tăng ở Việt Nam, từ 346.000 ha năm 1995, diện tích cây ăn trái đã gia tăng đến 500.000 ha vào năm 2000 Trong các loại cây ăn trái được trồng phổ biến thì nhóm cây có múi Citrus (cam, quýt, chanh, bưởi) chiếm một diện tích rất lớn Chỉ riêng trong khu vực miền Nam Việt Nam trong năm 2000, diện tích của

nhóm cây có múi đã chiếm đến 40.000 ha [14] Tuy nhiên từ 1998 đến nay, bệnh

do Phytophthora trên cây có múi ngày càng phát triển và gây hại nặng [25]

• Bệnh thối gốc, chảy nhựa ở cây có múi

Tri ệu chứng:

nền đất thấp, kém thoát nước nhất là vào mùa mưa Một số nấm Phytophthora

trong đất thông qua việc nhiễm trên bộ rễ mềm, khi gặp điều kiện nhiệt độ và

độ ẩm cao thích hợp, những nang bào tử sẽ phóng thích bào tử động có hai roi Bào tử này thường bị hấp dẫn từ những chất tiết ra từ những rễ non Chúng nhiễm vào chóp rễ, nhiễm dần vào vỏ rễ và từ từ sẽ nhiễm toàn bộ Triệu chứng lúc đầu là vỏ của thân cây bị sũng nước ở xung quanh gốc sau đó

vỏ cây bị thối có màu nâu hợp thành những vùng bất dạng, kèm theo là ứ nhựa ra màu nâu đen và có mùi hôi Bệnh có thể phát triển nhanh vòng quanh thân, hoặc rễ chính làm cho các lá bị vàng, nhất là gân lá, sau đó lá rụng đi, bệnh nặng làm lá trên cành rụng gần hết, cành khô chết đi, sau đó trên thân mọc nhiều nhánh non nhưng chết sớm [14, 16]

Tác nhân gây b ệnh

Loài P nicotianae (P parasitica) phổ biến trong điều kiện Á Nhiệt đới,

gây bệnh thối gốc, chảy nhựa và thối rễ, nhưng ít gây hại trên phần thân cây

Loài P citrophthora gây hiện tượng chảy nhựa thân và thối rễ, loài này

có thể gây hại trên phần thân cây phía trên

Loài P palmivora thường gây hại trên phần trên mặt đất của thân Ngoài ra, còn một số loài khác như: P citricola; P hibernalis; P Sygingae

• Bệnh vàng và rụng lá (thối rễ, vàng lá chết nhanh)

Tri ệu chứng:

Bệnh thường gây hại trên quít, cam sành Trong năm, bệnh thường gây hại trong mùa mưa lũ hoặc sau khi tưới nước ra hoa Cây bị bệnh lá vẫn lớn bình thường nhưng gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh, và sau đó rụng đi, nhất là khi có gió hoặc khi ta lắc nhẹ cây Các lá già rụng

trước sau đó dẫn đến các lá trên Lúc đầu chỉ có một vài nhánh biểu hiện vàng

lá, rụng lá nhưng sau đó toàn cây sẽ rụng lá Cây có nhiều chồi gắn lá nhỏ, nhiều hoa, trái, trái chua và cuối cùng cây chết hẳn Đào rễ lên thấy phía cành

bị rụng lá, rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần vào rễ lớn Bệnh nặng thì tất cả các rễ đều bị thối và cây chết [14, 16, 18]

Tác nhân:

Do nấm Fusarium solani, Phytophthora spp., Pythium tấn công vào

chóp rễ và làm thối rễ Nếu rễ cây bị ngập úng làm rễ suy yếu hoặc do tuyến trùng chích hút tạo vết thương và từ đó nấm tấn công gây hại làm cây bị bệnh trầm trọng và chết nhanh hơn Ngoài ra nấm còn kích thích cây tạo ra ethylen làm lá vàng nhanh, rụng sớm Thường vào mùa nắng hoặc do nước siết kích thích ra hoa làm cho rễ suy yếu và một số rễ ăn sâu xuống để tìm nước hoặc đến mùa mưa, bón phân cây ra nhiều rễ non, đất thoát nước không kịp, mực thủy cấp dâng cao, rễ bị ngập úng, ngộp và thiếu oxy, làm rễ suy yếu đồng thời qua tác đông trung gian của tuyến trùng (vết chích hút) tạo điều kiện thuận lợi cho nấm tấn công nhanh hơn và bệnh nặng hơn

• Bệnh lở cổ rễ, chết cây con

Là bệnh rất quan trọng và phổ biến ở hầu hết các vườn ươm cây giống Bệnh được gây ra bởi nhiều loại nấm hại trong đất Điều kiện độ ẩm cao của đất là yếu tố thích hợp cho bệnh phát triển Bệnh này xảy ra trên hầu hết các loại cây ăn trái khác nhau trong vườn ươm

Tri ệu chứng của bệnh:

Bệnh có thể xảy ra ở hai giai đoạn:

Giai đoạn trước khi cây mọc mầm, lúc mà các tử diệp của cây chưa nhô

thường xuất hiện ở phần gốc gần mặt đất Phần mô bị bệnh ban đầu chuyển màu hơi sậm hơn sau hóa màu đen và hơi lõm vào làm cho phần vỏ thân dễ

bị tuột ra Kích thước vết bệnh phát triển rất nhanh khi gặp điều kiện độ ẩm cao Khi vết bệnh lan rộng, cây con thường bị ngã rạp, bộ rễ của cây bị thối đen Trên líp ươm, bệnh thường xuất hiện thành từng cụm sau đó lan rất nhanh Đối với những cây trồng trong bầu, những bầu bị ứ nước thì cây dễ bị thối toàn bộ rễ của cây, phần vỏ rễ bị lở ra làm cho cây bị héo và chết rất nhanh [14, 16, 25]

Tác nhân gây ra b ệnh:

Bệnh có thể do các loại nấm trong đất gây hại như: Phytophthora, Fusarium hay Pythium, ngoài ra còn có thể do các nấm Rhizoctonia và Sclerotium gây ra Nếu do nấm Sclerotium gây hại thì trên mắt đất gần gốc

cây bệnh có thể nhìn thấy các hạch nấm tròn màu nâu Trong khi nấm

Rhizoctonia tạo nên các hạch nấm tròn dẹt và bề mặt hạch nấm sần sùi Đây là các loại nấm có khả năng lưu tồn trong đất Chúng phát triển và lây lan mạnh trong điều kiện đất có độ ẩm cao, những lúc mưa kéo dài, luống ươm hay bầu đất bị ứ đọng nước, thiếu ánh nắng như ở vườn ươm Ngoài ra, nếu phần cổ rễ của cây con (nơi tiếp xúc với đất) bị sây xước mà trong đất có chứa sắn mầm

bệnh thì vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng tiếp xúc và xâm nhiễm vào cây hơn

Tri ệu chứng

Bệnh thường tấn công vào cây con một năm tuổi trở lại, ở thân cây ngang mặt đất, cây nảy mầm làm cây gãy gục Cây cũng có thể bị tấn công muộn hơn (cây cao 5 – 10 cm), làm vỏ thân ngang mặt đất bị hư và cây bị chết nhưng cây vẫn còn đứng không ngã rạp như lúc nhỏ [14, 16]

Tác nhân

Do nấm Phytophthora palmivora; Fusarium spp; Rhizoctonia solani; Sclerotium rolfsii

Ở mặt đất, nơi gốc cây bệnh có thể quan sát thấy hạch nấm, nếu hạch

nấm nhỏ màu vàng nâu đến nâu và bóng láng thì đó là nấm S rolfsii, nếu hạch nấm to, sần sùi, hơi dẹt là nấm R solani, nếu ở gốc cây có tơ nấm trắng dày

đặc là Fusarium spp, nếu chỉ thấy tơ nấm rất ít vào sáng sớm như mạng nhện

là do P palmivora

khí cao bệnh gây hại trên tất cả các giai đoạn phát triển của lá, vết bệnh xuất hiện ở bất cứ vị trí nào trên lá, lúc đầu vết bệnh tròn nhỏ, có màu xanh đậm, nhũn nước, sau đó vết bệnh lan dần nhưng vẫn giữ hình tròn, đôi khi bất dạng,

có màu xám nâu, đôi khi nâu đen làm rụng lá Nếu độ ẩm cao, tơ nấm màu trắng bám trên vết bệnh vào buổi sáng hoặc trong bóng râm Bệnh còn gây hại trên đọt non, làm thối đen đọt và chết, đôi khi bệnh tấn công vào mắt tháp, làm toàn bộ cành tháp héo đột ngột và chết rất nhanh

• Bệnh thối nhũn trái

mùa lũ Bệnh gây hại trên trái già và những trái trong, tán cây, gây hại nặng trên quýt đường, cam mật Bệnh làm cho trái bị mất màu từ rốn trái lan dần lên trên, lúc đầu vết bệnh như bị úng nước, sau đó có màu xám đen Vào sáng sớm hoặc những ngày có độ ẩm cao và trời âm u, phần trái bị bệnh có phần tơmàu trắng phủ trên vết bệnh Khi vết bệnh lan chiếm 1/3 đến 1/2 diện tích, trái sẽ rụng

.CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

albicans, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Salmonella typhi do Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật - Trung tâm Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp

- Các loại nấm, vi khuẩn gây bệnh thực vật: Phytophthora spp, Fusarium moniliform, Fusarium oxysporum

2.1.2 Hoá chất

Hóa chất: Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao men, các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, inositol, mannitol, arabinoza, raffinoza

Các loại dung môi: n- butanol, etanol, ethyl acetate, iso propanol, methanol, aceton (Trung quốc)

Các hóa chất dùng trong phân loại và nghiên cứu: agaroza, Tris-HCl, EDTA, SDS, isoamyl alcohol, ethilium bromide, Tris-HCl, EDTA, SDS (Merck)

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Cân điện 0,001 (Thụy Điển), kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản), máy lắc ổn nhiệt (Nhật), nồi lên men (Nhật), máy đo pH (Mỹ), máy li tâm, máy đo OD, máy GeneAmp PCR System, máy đọc trình tự ABI PRISM

3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sigma, Đức), máy soi gel (Mỹ); máy đo quang phổ UV3000, máy chạy điện di

2.1.4 Môi trường

Khoai tây miếng: 200g

Đường gluco: 20g

Thạch : 16g Nước : 1 lit

• Môi trường Czapeck:

MgSO4.7H2O : 0,5g Nước : 1lit

Khoai tây : 200g

Cà rốt : 100g

Đường gluco: 20g

Thạch : 16g Nước : 1l

• Môi trường ISP4

• Môi trường A4 Glucoza; 10g

Bột đậu tương: 10g

NaCl: 5g

CaCO3: 1g Nước: 1lit

pH : 7

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật

2.2.1.1 Phân lập vi sinh vật

Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứa 90 ml nước vô trùng, lắc đều 30 phút trên máy lắc Pha loãng mẫu với nồng độ giảm dần theo cơ số 10 Hút 0,05 ml dịch đã pha loãng ở từ 103-106 cấy gạt đều trên môi trường khoai tây, ISP4 ở 37oC Sau 3-5 ngày cấy xạ khuẩn, nấm đã mọc dùng môi trường thạch ISP4, Czapeck để giữ giống Đối với các chủng vi khuẩn, phân lập trên môi trường thạch thường, ủ ở 300C trong 48 giờ

2.2.1.2 Bảo quản giống

Các chủng vi sinh vật đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch nghiêng ở các điều kiện thích hợp, sau đó các ống giống được bảo quản trong

tủ lạnh ở 4-6 oC, sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần

2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng sinh

* Phương pháp đặt thỏi thạch

Vi sinh vật được nuôi trong môi trường ở nhiệt độ thích hợp trong các đĩa petri Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định Để trong tủ lạnh từ 4-8 giờ cho CKS khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm (30oC) Đọc kết quả sau một ngày đối với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn, 3 ngày đối với nấm

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:

2.2.2 Đặc điểm hình thái

a Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử:

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 cắm lamen nghiêng Sau 6-7 ngày lấy lamen ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử và đếm số lượng bào

tử trên kính hiển vi quang học Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng kí hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn kí hiệu là RA (Ratinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira)

b Bề mặt bào tử

Quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử

Bào tử có dạng: tròn, ovan, elip, hình que

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng: nhẵn kí hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc Wa (Warty), dạng gai Sp (Spiny) và dạng tóc là Ha (Hairy)

2.2.3 Phân loại theo sinh học phân tử

 Phương pháp tách ADN vi khuẩn, nấm

Vi khuẩn

- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 µl TE trong ống Eppendoff

- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 100 µl SDS 10%, ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 300 µl PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên (Bước này được lặp lại 2 lần)

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN

- Rửa tủa bằng etanol 70%

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không

- Thêm 30-50 µl nước, bảo quản để dùng dần

- Thêm 100 µl axetat kali, trộn đều và đặt trên đá 1giờ, ly tâm lạnh 40C ở 15.000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy phần nổi phía trên

- Thêm 200 µl CHCl3-Izoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/phút trong 2 phút (Bước này được lặp lại 2 lần)

- Thêm 200 µl 2-propanol (Izo-propanol) và đặt trong tủ đá 20 phút Ly tâm 15.000v/ph trong 15 phút và lấy kết tủa

- Rửa sạch kết tủa bằng etanol 70% Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 10 phút

- Làm khô thiết bị ly tâm trong 10 phút Hòa tan tủa trong TE (30-50 µl), giữ trong tủ lạnh 40C trong 1 ngày Giữ ở -200C trước khi sử dụng

- Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic Điều đó có nghĩa là các phân tử

sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước

- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE Trộn đều 2µl dung dịch loading buffer 6x với 5µl mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 µl/ml) 20 phút vớt ra Quan sát vạch ADN trên máy soi gel

 Phản ứng khuếch đại ADN

Taq polymeraza 1,2 Takara Ex Taq(5 unit/ µl) Tm 0,5

Mồi xuôi 18F: 5'- CACCAGGTTGATTCTGCC-3'

Mồi ngược 18R: 5′-GTGCACGGTCTACGAGACCTC-3′

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như đối với điện di genom

 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự

Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau:

2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau

 Xác định hàm lượng axit nucleic

Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường là micro - nano - hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng không thể xác định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50µg/ml của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng

độ 40µg/ml của ADN hoặc ARN mạch đơn Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein Tỷ số A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch

 Đọc trình tự ADN

Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài

2.2.4 Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành

chất ức chế nấm Phytophthora spp của chủng XS2 và Trichoderma sp T1

2.2.4.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

XS2 được lên men trên các môi trường cơ bản là: PDA, A-4, A-4H, ISP4, Gauze I Sau 120 giờ nuôi cấy, xác định hoạt tính kháng nấm

Với chủng Trichoderma sp.T1 được nuôi cấy trên 5 loại môi trường

dịch thể khác nhau: PDA, PCA, LCA, Czapeck.Sau 72 giờ xác định hoạt tính kháng nấm

2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng hình thành chất ức chế nấm hại rễ

Chủng xạ khuẩn XS2, Trichoderma sp.T1 được nuôi cấy lắc 180

vòng/phút trên môi trường thích hợp được chỉnh ở các giá trị pH khác nhau:

4, 5, 6, 7, 8, 9 Sau 120 giờ đối với XS2, 72 giờ đối với T1, xác định HTKS,

pH sau nuôi cấy

2.2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất ức chế nấm

hợp ở nhiệt độ200C,250C, 350C, 400C, 450C trên máy lắc ổn nhiệt Xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ, pH, sinh khối sau nuôi cấy

* Phương pháp xác định sinh khối của nấm và xạ khuẩn

Sinh khối nấm, xạ khuẩn trong 5 ml dịch nuôi được lọc qua giấy đã biết trọng lượng khô Tiếp đó rửa giấy đã lọc sinh khối nấm 3 lần với nước máy vô trùng, sau đấy được sấy khô ở 100 0C trong 7h và và cân trên cân phân tích Dịch qua giấy lọc được kiểm tra dưới kính hiển vi để kiểm tra khả năng tổn hao sinh khối nấm, xạ khuẩn

Trọng lượng khô của sinh khối nấm, xạ khuẩn (mg/ml ) được tính theo công thức:

M =

Trong đó: M là trọng lượng khô của nấm mốc

M1 là trọng lượng khồng đổi của giấy lọc

M2 là trọng lượng khô của giấy sau khi lọc

2.2.4.4 Ảnh hưởng của thời gian

Chủng xạ khuẩn XS2, nấm Trichoderma sp.T1 được nuôi cấy trong môi

trường thích hợp, cứ sau 24 giờ lại lấy mẫu xác định HTKS, pH, sinh khối sau nuôi cấy

.2.2.5 Xác định tính đối kháng

Các chủng vi sinh vật được tiến hành thử tính đối kháng theo phương pháp nhỏ dịch tương tự như xác định hoạt tính kháng sinh

2.2.6 Phương pháp tạo chế phẩm

2.2.6.1 Lựa chọn nguồn cơ chất cho lên men xốp

Cấy giống cấp hai vào các môi trường có chứa các loại chất mang khác nhau như: cám gạo, bột đậu tương, cám ngô, bã mía, mùn cưa và hỗn hợp của hai hoặc vài chất trên theo các tỉ lệ khác nhau Bổ sung nước đến độ ẩm 60% Ủ trong 15 ngày ở 30oC, sau đó xác định số lượng tế bào của từng loại vi sinh vật

* Xác định số lượng bào tử của từng loài vi sinh vật

- Nuôi cấy trên môi trường xốp 12 - 14 ngày tuỳ vào từng chủng, sau đó lấy

ra 1g cho vào cối xứ, nghiền nhỏ, cho vào bình nón chứa 99 ml nước vô trùng

- Lắc trên máy lắc 220vòng/ phút trong 1 giờ, pha loãng ra đến 10-7

- Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml từ mỗi nồng độ pha loãng ra, nhỏ vào đĩa petrti có chứa môi trường thích hợp, sau đó để vào trong tủ ấm nhiệt độ thích hợp.sau vài ngày đưa ra đếm số khuẩn lạc

- Số lượng bào tử trong 1g môi trường nuôi cấy được tinhd theo công thức:

Số lượng bào tử = a × 1/k × 1/V

Trong đó: a là số khuẩn lạc

k hệ số pha loãng

V thể tích pha loãng được cấy trên đĩa petri

2.2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình lên men xốp của 2 chủng

XS2 và Trichoderma sp.T1

2.2.6.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Chất mang sau khi bổ sung giống và làm ẩm được nuôi ở nhiệt độ 30 0C Sau các khoảng thời gian 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ngày tiến hành lấy mẫu xác định số lượng tế bào/1g chế phẩm của từng chủng

2.2.6.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm

Các chủng được lên men riêng rẽ trên các môi trường xốp thích hợp có

độ ẩm ban đầu khác nhau: 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% nuôi ở điều kiện

300C trong 10 ngày Theo dõi sự phát triển của hệ sợi, đếm số lượng bào tử/1g chế phẩm

2.2.6.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ

Cấy 2 chủng XS2, Trichoderma sp.T1 vào môi trường xốp thích hợp,

theo dõi trong 15 -20 ngày ở các nhiệt độ 18, 23, 25, 28, 32, 35, 40 Xác định khả năng sinh trưởng của nấm, XS2 thông qua theo dõi sự phát triển của hệ

sợi nấm, số lượng tế bào/1g chế phẩm của từng chủng

2.2.6.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống thích hợp đối với lên men xốp

Giống cấp hai được bổ sung vào môi trường chứa chất mang thích hợp đối với từng chủng theo tỷ lệ khác nhau: 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20 %

Bổ sung nước đến độ ẩm thích hợp và ủ 15 ngày, sau đó đếm số lượng tế bào/1g chế phẩm

2.2.7 Thời gian bảo quản của chế phẩm:

Dịch lên men sau thời gian thích hợp được trộn với chất mang theo tỷ

lệ giống cấy thích hợp, sau khi ủ đem sấy Trộn các thành phần và nghiền nhỏ, đóng vào các gói polyme hai lớp 250g Kiểm tra biến động số lượng từng chủng và hoạt tính sinh học của chế phẩm mỗi tháng

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM HẠI RỄ MẠNH

Từ các mẫu đất mà phòng đa dạng vi sinh vật (trung tâm khoa học sự sống- ĐHKHTN) thu được từ Kon Tum, Đaklac, Bình Dương, khu hệ sinh thái Cần Giờ, mẫu đất và nước biển tại Qui Nhơn, Nha Trang chúng tôi phân lập được chủng 78 chủng vi khuẩn, 47 chủng xạ khuẩn và 32 chủng nấm

ở các nhiệt độ 28-300C và 37-420C Sau khi điều tra sơ bộ các chủng có hoạt

tính ức chế nấm Phytophthora spp và Fusarium oxysporum, chúng tôi đã

chọn ra 15 chủng có hoạt tính mạnh nhất

Bảng 3.1: Hoạt tính kháng nấm của các chủng phân lập

Hoạt tính ức chế nấm (D-d, mm) Chủng vi sinh vật

Fusarium oxysporum Phytophthora spp

Kết quả được trình bày ở bảng 1 cho thấy, hai chủng XS2 và

Trichoderma T1 có khả năng ức chế nấm hại rễ: Phytophthora spp và Fusarium oxysporum mạnh nhất Chủng XS2 có khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum (38) mạnh hơn so với các chủng khác, khả năng ức chế nấm Phytophthora spp cũng rất cao (35), trong khi chủng nấm Trichoderma

spp lại có khả năng ức chế nấm Phytophthora spp (35) mạnh hơn so với các chủng khác, khả năng ức chế Fusarium oxysporum cao (30)

đề kháng kém hơn so với các bệnh do các tác nhân gây bệnh từ đất Nông dân

không thể phun kháng sinh vào đất Do đó 2 chủng XS2 và Trichoderma

sp.T1 là những chủng rất quí cần được nghiên cứu sâu hơn nhằm đưa vào ứng dụng thực tiễn

3.2.1 Đặc điểm hình thái

kép Số lượng bào tử trên mỗi chuỗi: 10-50

 Trichoderma sp.T1

Hình thái: Khuẩn lạc phát triển nhanh, bông xốp Sau 3-5 ngày thì chùm kín toàn bộ đĩa Petri đường kính 9cm, kèm theo đó là sự xuất hiện đám bào tử màu xanh da bò trên bề mặt khuẩn lạc

Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử phân nhánh dạng cây, 2-3 lần, các nhánh cụm lại 2, 3 hoặc đơn độc, kích thước 125 (255) x 3- 5 µm

Thể bình hình cổ chai, bào tử hình cầu hoặc ovan, vách rơi ráp, kích thước 2,5-5 µm (hình cầu), 4,5-5 x 3,75-4,5 µm (hình ovan)

3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn có đặc điểm rất khác biệt với các nhóm vi khuẩn khác ở chỗ rất đa dạng về màu sắc khi nuôi trên các môi trường nuôi cấy khác nhau Chủng XS2 Sau 7 ngày nuôi cấy, màu KTKS của chủng XS2 thay đổi từ trắng đến xám Sau 14 ngày nuôi cấy KT màu của KTKS đều

chuyển dần sang đen Sau 21- 30 ngày, màu KTKS bị nát ra và có dạng xám đen Trichoderma sp.T1sau 5 ngày nuôi cấy, trên mặt đĩa petri có màu xanh

da bò tại chỗ cấy, và sợi màu trắng xung quanh Sau 7 ngày màu xanh xuất hiện ngày càng nhiều hơn ở cả 5 môi trường với độ đậm nhạt khác nhau

3.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: