Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng của sâm việt nam chế biến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SÂM VIỆT NAM CHẾ BIẾN Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 25 Cơngtrìnhđược hồn thành tại: ĐẠIHỌCYDƯỢC THÀNHPHỐHỒCHÍMINH DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHNGHIÊN CỨU LIÊNQU AN TẠP CHÍTRONGNƯỚC Ngườihướngdẫnkhoa học: GS TS NGUYỄN MINH ĐỨCPGS.TS.NGUYỄNNGỌCKH ÔI Phảnbiện1: Phảnbiện2: Phảnbiện3: Luận ánsẽ đượcbảovệ tạiHội đồngchấmluận án cấptrườnghọptại ĐẠIHỌCYDƯỢC THÀNHPHỐHỒCHÍMINH vàohồi …… giờ……….ngày…….tháng…… năm……… Cóthểtìmhiểuluậnántại: - ThưviệnQuốcgia Việt Nam - ThưviệnKhoa họcTổnghợp Thành phốHồ ChíMinh - ThưviệnĐại họcYDượcThànhphố HồChíMinh Isolation of Ginsenoside Isomers from Processed VietnameseGinseng by Preparative HPLC.Journal of Medicinal Materials(2015) ginsenoside-Rg5isolated Ginsenoside-Rk1and processedVietnamese ginseng.Journal MedicinalMaterials(2015) from of Phân lập thiết lập chất chuẩn majonosid–R2 từ sâm Việt Nam(Panax vietnamensisHa et Grushv.),Tạp chí Dược học, Số 53,tập 8,tr.14-20, Tạpchí Dược học (2014) ginsenoside-Rh4isolated from Ginsenoside-Rk3and processedVietnameseginseng(PanaxvietnamensisHaetGrushv.).Jour nalofMedicinalMaterials(2013) TẠP CHÍQUỐCTẾ GinsengSaponinsinDifferentPartsofPanaxvietnamensis.Chemic al&pharmaceuticalbulletin01/2015;63(11):950-954 Anti-inflammatoryeffectsofvinaginsenosideR2andmajonosideR2isolatedfromPanaxvietnamensi sandtheirmetabolitesinlipopolysaccharidestimulatedmacrophages.InternationalImmunopharmacology09/2015;2 8(1):700-706 EffectsofsteamingonsaponincompositionsandantiproliferativeactivityofVi etnameseginseng.Journalofginsengresearch07/2015;39(3) Processed Vietnamese ginseng: Preliminary results in ChemistryandBiologicalactivity,JournalofGinsengResearch,201 4,38(2) 24 thưphổiA549:Tácdụngnàytăngkhithờigianchếbiếntăngvàđạtcực đạiở khoảngthời gianchế biến12 giờ.Tác dụngnàyđược cholà cóliênquanđếnnồngđộcủacácginsenosidđượchìnhthànhdoq trìnhch ếbiếnlàG-Rg3,-Rg5,-Rk1là cácginsenosidđượcchứngminhquarấtnhiềucơngtrình nghiêncứuđốivớitácdụngkhángung thư.Sựthayđổitácdụngchốngoxyhóa:Qtrìnhchếbiếnlàmtăngtácdụn gchốngoxyhóa thử nghiệmDPPHkhi chế biến ở120 ℃ Tácdụngkhángviêm:Ởnhiệtđộchếbiếncaohơnnhưở120℃.,hàmlượngsaponi ncóaglyconthuộckhungOCTnhưM-R2vàV-R2giảmdần hàm lượng PRT4tăng lên, điều cho thấy P-RT 4chínhlàchấtchuyểnhóacủaMR2domấtđimộtphầnđườngglucoseởvịtríC-6khábềnvớinhiệt.M-R2vàV-R2cũngchothấy đượcchuyển hóa thành P-RT4và OCT qua đường uống P-RT4và OCT cóthể ngăn chặn biểu cytokin tiền viêm gây LPS kíchhoạtyếutốtranscriptionNFκBBbằngcáchứcchếgắnkếtLPSvớithụthểTLR4 trêntế bào miễndịchcũngnhư tế bàođạithực bào KIẾN NGHỊ Cáckếtquảđạtđươcnêutrênlàcơsởkhoahọcđểthựchiệncáchướngnghiên cứutiếptheocho SâmVN: Kết phân tích thành phần hàm lượng saponin cho tháysaponin có aglycon thuộc khung OCT chiếm đến từ 36 ~ 75%saponintồnphần.Kếtquảnàylàmtiềnđềchocácnghiêncứuvềxâydựng tiêuchuẩnchoSâmVN,đồngthờiđểthửnghiệmtácdụngsinhhọccủa SâmVN Có thay đổi đáng kể thành phần hóa học sau chế biến Dovậy, cần thêm thử nghiệmin vitrotrên dòng tế bào ung thưkhácvàkhảosátthêmmộtsốtácdụngsinhhọccủaSâmVNchếbiến.Khảosát điều kiệnchế biếntốiưu cho số tácdụngsinh học Nghiên cứu quy trình phân tích định tính định lượng saponintrongSâmVNvớiđầudịMSnhằmxácđịnhkhơngchỉcácginsenosidcó aglyconthuộckhungPPD,PPTmàcịncócácsaponincóaglyconthuộckhungOCT GIỚITHIỆULUẬNÁN 1.Đặtvấn đề Hồng sâm chế biến từ Nhân sâm (Panax ginsengC.A Meyer)theophươngphápcổtruyềnbằngcáchhấpcủsâmtươiởnhiệtđộcao.Q trìnhchếbiếnlàmthayđổivềmặtthểchấtvàthànhphầnhóahọc,đặc biệt thành phần ginsenosid.Đồngthờitácdụngsinhhọcđượcgia tăng tác dụng kháng phân bào, kháng viêm, chống oxy hóa,chống kết tập tiểu cầu Do vậy, Hồng sâm cho tốt hơn, đắttiềnhơnvàsửdụngphổbiếnhơnBạchsâm.SâmViệtNam(SâmVN,Panax vietnamensisHa et Grushv.) phát từ năm 1973, đếnnayđãđượcthếgiớibiếtđếnquanhữngnghiêncứuvềthànhphầnhóahọc tác dụngdượclý.NhómnghiêncứucũngđãsơbộkhảosátsựthayđổithànhphầnSâmVNbằngcáchhấpở khoảng 0-8 QuátrìnhchếbiếnSâmVNtươngtựtheocáchcủaHồngsâmlàmgiatăngthànhph ầnginsenosidkémphâncựcvàlàmgiảmginsenosidphâncựcbịthayđổi trongquátrìnhchế biến Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý củaSâmVNchế biến”được thực vớicác mục tiêusau:  Phân tích, phân lập xác định thành phần hóa học saponin trongSâmVN  PhânlậpvàxácđịnhcấutrúcthànhphầnsaponintrongSâmVNchếbiến khảo sátsựthayđổithànhphầnhóahọcsaponinquaqtrình chế biến SâmVN  Khảo sát tác dụng sinh học Sâm VN chế biến thành phầnsaponinphân lập Tính cấpthiếtcủa đềtài ThànhphầnhóahọcchủyếuvàquantrọngnhấtcủacáclồithuộcchiPanaxlà saponin hay cịn gọi ginsenosid Đã có 52 saponin đượcphânlậptừthânrễvàrễcủvà8ginsenosidmớitừláSâmVNvớihiệusuấtcao CácsaponinnàycóaglyconthuộckhungPPD,PPTvàOCT,đặcbiệtsaponinOCThiện diện Sâm VN hàm lượng cao màkhơngcóhoặcvớihàmlượngthấptrongcáclồithuộcchiPanaxkhác.Sựkhácbiệt nàytạonênsựkhácbiệtvềtácdụngsinhhọcchoSâm 23 VNvàhứahẹnrấtnhiềutácdụngmớicầnđượcnghiêncứu.Dođó,việcp hântích thànhphần hóahọcsaponin rấtcầnthiếtnhằmbổsungdữliệuvềthành phầnvàhàmlượngcácsaponincótrongSâm VN.SâmVNđasốđượcsửdụngdướidạngchưachếbiếnởdạngtươihoặcphơisấyk hơthơngthường.Dovậyviệcnghiêncứumộtdạngbàochếmớicũng nghiên cứusựthay đổithànhphầnhóa họcvàtác dụngsinhhọcquaqtrìnhchế biếnlàcầnthiếtnhằmtạoramộtsảnphẩmcóchất lượngđiềutrịtốtvà gia tănggiátrị sử dụngcho SâmVN Nhữngđóng gópmới luậnán 3.1 Quy trình phân tích Đề tài xây dựng quy trình phân tích định tính định lượngcácthànhphầnsaponinPPD,PPTvàOCTtrongSâmVNvớiphươngphá pHPLC/UVELSD 3.2 Thànhphầnhóahọcsaponin Đề tài phânlập được28hợpchất,trongđó: - 6ginsenosidlầnđầuđượcphânlậptrongSâmVNchếbiến:20(S)G-Rg3,20(R) G-Rg3,G-Rk3,G-Rh4,G-Rk1vàG-Rg5 - 4ginsenosidlầnđầuđượcphânlậptừSâmVNlà:Notoginsenosid R 2,notoginsenosidR4, ginsenosidRa1và notoginsenosid D - 1ginsenosidmớicấutrúcđượcxácđịnhlà3-O-α-D-xylopyranosyl -(1→2)-α-D-glucopyranosyl(1→2)-α-D-glucopyranosyl-20(S)protopanaxadiol2 - O - α-D-xylopyranosyl( → ) - α-Dxylopyranosyl(1→6)-α-D-glucopyranosid 3.3 Sựthay đổithànhphầnsaponin củaSâmVNchếbiến Bằng phương pháp HPLC/ELSD, đề tài khảo sát thay đổi thànhphầnhóahọcsaponincủaSâmVNquaqtrìnhchếbiến.Ginsenosidcóagl yconthuộckhungPPDvàPPTphâncựcnhưG-Rg1,-Re,-Rb,-Rd… bịchuyểnhóathànhcácginsenosidPPD,PPTkémphâncựchơnnhư20(S)GRh 1,20(R)-Rh1,20(S)-Rg3,20(R)-Rg3,-Rk 3,-Rh 4,-Rk -Rg5 Ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT bền so vớikhungPPD.SaponincấutrúcOCTdokhơngcóđườnggắnvàovịtrí C-20nên tươngđối bền ngaycả chế biếnở120oC trong20 3.4 Tácdụng sinh học Sử dụng kỹ thuật Q-TOF-MS kết hợp 1H-NMR xác định 5ginsenosidmớithuộckhungPPDcó4-6phântửđườngtrongcấutrúc.Hàmlượng saponin tổng thân rễ, rễ củ rễ là195,156và139mg/g,caohơnrấtnhiềutrongcácloàiPanaxkhác.Tỉlệ PPT:PPD:OCT phận thân rễ 1:1,7:7,8; rễ củlà 1:1,6:5 rễ conlà1:4,8:3,3 Phân lập xác định cấu trúc saponin có Sâm VN chếbiến khảo sát thay đổi thành phần saponin trìnhchếbiến SâmVN Tổngcộng28thànhphầnđãđượcphânlậpvàxácđịnhcấutrúc từ Sâ mVNchếbiến.Cácsaponinđãđượccơngbốlà:G-Rb 1,-Rc,-Rd, -Re,-Rg 1,N-R1,M-R1,M-R2,V-R2,P-RT 4,V-R11,V-R10vàcác saponinm ớilầnđầutiênđượcphânlậpnhưNR2 vàc c cặpđồngphâncủasaponinđượchìnhthànhdoqtrìnhchếbiếnn hư:20(S)và20(R)G-Rh1,20(S)và20(R)G-Rg3,-Rk3,-Rh4,-Rg1và Rg5bằng cáckỹthuậtsắckýthơngthường,sắckýphađảovàprepHPLC.Ngồira,có4ginsenosidmớigồmGRa 1,notoginsenosidR4,notoginsenosidDvàmộthợpchấtchưacơngb ốtrướcđâylà3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl(1→2)β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol2 - O-β-Dxylopyranosyl( → ) - β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosid (SciFinder, tham khảo ngày 08-102017).Luậnánthi ết l ậ p phư ơngphá p phâ n lậpcá ct hà nhphầ n sapo nin c ó aglyconthuộckhungOCTđơngiản,hiệuquảvàhiệusuấtcao.Luận ánc ũ n g g ó p p h ầ n x â y d ự n g d ữ l i ệ u p h ổ N M R c ủ a c c s a p o n i n c ó aglyconthuộc khungPPD, PPTvàOCTtrongSâmVN Quá trình chế biến Sâm VN 105 ℃ 120 ℃ cho khuynh hướngthay đổi thành phần hóa học saponin tương tự nhau, nhiên tốc độthay đổi 105 ℃ chậm so với 120 ℃ khoảng 1/3 lần So vớisaponincóaglyconthuộckhungPPDvàPPT,saponinkhungOCTbềnhơn, khơngthayđổi nhiềusauq trìnhchếbiến, cóthể giảithíchdo OCTsaponin khơngcó liên kếtkémbềntại vịtrí C-20 TácdụngsinhhọccủaSâm VN Sựthayđổitácdụngứcchếtăngtrưởngtếbàotrêndòngtếbàoung 22 ginsenosidkémphâncực,đặcbiệtlà G-Rg3, -Rg5v - R k Tác dụng chống oxy hóa: tăng dần theo thời gian chế biến SâmVN.Tuynhiênkhácvớitácdụngứcchếtăngtrưởngtếbàodocácthành phần ginsenosid, tác dụng chống oxy hóa cholàxuấtpháttừcáchợpchấtphenolic vàsảnphẩmcủaphảnửngMaillard Tácdụngkhángviêm:P-RT4vàOCTứcchếqtrìnhphosphoryl hóa IRAK1, TAK1 IκBBα, hoạt hóa NFκBBtronggắnkếtLPSvớiđạithựcbàophúcmạc.Nhữnghoạtchấtnàycũng ức chế mạnhbiểuhiệncủacácyếutốTNF-α, IL-1β, COX-2 vàiNOS gắn kết LPS với đại thực bào phúc mạc Hơn P-RT 4và OCT ức chế gắn kết LPS với thụ thểTLR4, thụ thể nhậndiệnkiểu mẫu đáp ứng LPS đại thực bào phúc mơ thơng qua có/khơng có transfected MyD88 siRNA, giống ginsenosid-Re cóaglyconthuộckhungPPTđãđượccơngbốtrướcđó.Tuynhiên,nhữngchấtchuyể nhóanàykhơngảnhhưởngđếnbiểuhiệncủathụthểTLR4trênđạithựcbàophúcmạcgây bởiLPS.P-RT4và OCT ngănchặn biểu cytokin tiền viêm gây LPS kích hoạt yếu tố transcriptionNF-κBBbằngcáchứcchếgắnkếtLPSvớithụ thể TLR4trên tế bào miễn dịch tế bào đại thực bào Các cytokin đượcthểhiệnthơngquasựkíchhoạtcủaNF-κBB.Nhiềuyếutố,baogồmcảLPS,kíchhoạtNFκB LPS gây biểu IL-1βvà TNF-α in vitrovàin vivotrong tế bào miễn dịch qua TLR4 liên kết đườngtruyền tín hiệu NF-κBB, qua thúc đẩy viêm sưng Kết nghiêncứuchothấyrằngsửdụngđường uống hợp chất V-R2, M-R2 từ SâmVNcóthểđượcchuyểnhóathànhPRT4,giúpcảithiệntìnhtrạngviêmbằngcáchức chếgắn kếtLPSvàothụcthểTLR4trênđạithựcbào Nghiên cứu tác dụng chống phân bào dòng tế bào ung thư phổiA549 cho thấy tác dụng Sâm VN tăng sau chế biến Tác dụngchốngphân bào tăngvà đạt cực đạiởkhoảng12 giờsau chế biến Tác dụng chống oxy hóa gốc tự DPPH tăng thời gian chếbiếntăngngaycả đến 20 giờsauchếbiến 120oC Saponin khung OCT (P-RT4và OCT) có tác dụng kháng viêm bằngcách ức chế gắn kết LPS vào thụthểTLR4trên đạithực bào Bốcụcluậnán Luận án gồm 143 trang: Mở đầu trang, Tổng quan tài liệu 40 trang,Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 trang, Kết nghiêncứu57trang,Bànluận16trang,Kếtluậnvàđềnghị3trang.Luậnáncó37bảng,29hình,9sơđồ,153tài liệuthamkhảogồm9tàiliệutiếng Việt 144 tài liệu tiếng Anh, phụ lục (10 tiểu mục) thể hiệncáckết thực nghiệm KẾTLUẬN Theonội dungđề ra, đềtàiđã thuđược kết quảnhưsau: Phântíchthành phầnsaponin trongSâmVN Xâydựngquytrìnhđịnhtínhvàđịnhlượng17saponintrongcácbộphậnt hânrễ,rễcủvàrễconcủaSâmVNbằngkỹthuậtHPLC/ELSD Chương 1.TỔNGQUANTÀI LIỆU 1.1 Thực vật học lồi thuộc chiPanax:Ở Việt Nam có lồithuộc chiPanaxđã cơng bố:P bipinnatifidusSeem (Sâm vũdiệp);P.notoginseng(Tamthất):lồidithựctrồngởphíaBắcVN;P.stipuleana tus(Tamthấthoang)vàP.vietnamensis(SâmVN).HaithứcủaSâmVNlàP.vietn amensisvar.fuscidiscusvàP.vietnamensisvar.langbianensis… 1.2 Thành phần hóa học lồi thuộc chiPanax:Có nhómchính:Saponin,polyacetylen,polysaccharidvàflavonoid.Đếnnay,cókhoảngh ơn300saponinđãđượcphânlậptừcáclồithuộcchiPanax.Thànhphầnsaponintrit erpenoidtrongđóchủyếucácginsenosidđóngvai trị quantrọngđối vớicáctác dụngliên quan đãđược cơngbố 1.3 Thànhphầnhóahọcvàtácdụngsinhhọctừcácdạngchếbiếnkhácnhaucủa lồi thuộc chiPanax:Phương pháp chế biếnHồngsâm:Nhânsâmởdạngkhơhaytươiđượchấpởnhiệtđộcao98105oCởthờigiankhácnhau.Thayđổithànhphầnhọc:Qtrìnhchếbiến bẳng nhiệt làmthayđổithànhphầnsaponin(ginsenosid)tạocácginsenosid thơng qua q trình cắt đường vị trí C-20, C-3 hayC-6(khóhơn)vàkhửnướctạivịtríC20của-OHtựdođểhìnhthành 21 cácginsenosidkémphâncực.Sựthayđổitácdụngsinhhọc:Đasốcáctác dụng sinh học tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng tế bàoungthư,tácdụngbảovệgan,… đềutănglênsovớidạngchưachếbiếnlàBạchsâm 1.4 SâmViệtNam:Tênkhoahọc:PanaxvietnamensisHaetGrushv., họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Tên Việt Nam: Sâm Việt Nam,SâmNgọc Linh, SâmKhuNăm, SâmK5, Sâmđốt trúc 1.4.1 Thành phần hóa học Sâm VN: Thành phần chủ yếu làsaponinthuộcnhómdammaran.SâmVNchứamộthàmlượngsaponincó aglycon thuộc khung OCT cao, đặc biệt majonosid-R2 Chođến naycó khoảng73hợpchấtsaponin phânlậptừSâmVN 1.4.2 TácdụngdượclýcủasâmVN:Tácdụngbồibổcơthể,tănglực,chốngnhược sức;Tácdụngđiềuhịacácrốiloạnchuyểnhóatrongcơthể;Tác dụngsinhthích nghi, chốngstress,tăngsức đề kháng 1.4.3 SâmVNchếbiến:Đasốđượcdùngdướidạngtươihayphơisấykhơ mà chưa cónhiềunghiêncứuvềbàochếdạngHồngsâm.Chếbiến Sâm VN theo kiểu chế biến Hồng sâm cho thấy số thay đổitrongthànhphầnsaponincủaSâmVN.ThànhphầnsaponintrongSâmVNcósự thayđổitrongsuốtqtrìnhhấp:HàmlượngcácginsenosidchínhnhưG-Rb1,Rd,Rg1giảmđángkểvàxuấthiệncủacácpicmớivàthểhiệnrõnhấtởmẫuSâmVNch ếbiếntrong8giờ.TácdụngtănglựccủasaponintồnphầnSâmVNsaukhichếbiếnvàtrướckhi chếbiếnkhơngcósựkhácbiệt.Dođó,việcchếbiếnkhơngảnhhưởngđếntác dụngtănglực–một tácdụngchính vàquan trọngcủa SâmVN Chương2.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Đốitượngnghiêncứu 2.1.1 Nguyênvậtliệu:SâmVN(PanaxvietnamensisHaetGrushv.)6tuổiđược thu hái vườnsâmTràLinh, QuảngNam 2.1.2 Hóachấtvàdungmơi:CHCl3,MeOH,EtOH,EtOAc,nBuOH,ACN,MeOH(Merckvà J.T.Baker)… 2.1.3 Trangthiếtbị:MáyHPLCAlliance2695XE,đầudịPDA2996(Waters);M áysắckýlỏngPerkinElmer200kếtnốivớiđầudịELSDvàWaters AcquityUPLC; NMR(Brüker)500MHzvà 600MHz 2.1.4 Tếbào,độngvậtthínghiệm:DịngtếbàoA549(ATCC,Mỹ); Chế biến sâm VN cách hấp có nước nhiệt độ 105 ℃ chothấy xu hướng thay đổi tương tự 120 ℃ hình thành cácginsenosid phân cực ngoại trừ tốc độ chậm Tốc độ phản ứngtăng từ 2-3 lần nhiệt độ tăng 10 ℃ Hiện tượng đượcquansáttrongnghiêncứunày.Tốcđộthốigiángcủaginsenosidtănglên khoảng3lầnkhinhiệtđộchếbiếntăngthêm15℃ G-Rh1và G-Rg3đều có dạng đồng phân 20(S) 20(R) Dạng 20(S) G-Rh1nguyên thủy có Sâm VN dạng 20( R) hình thànhvàtăngdầnsauthờigianchếbiến.Tỉlệđồngphân20(R)/20(S)củaGRh1l 0,36lầnở2giờvàtănglên0,83lầnsau20giờchếbiếnở105 ℃ G-Rg3c ũn g chokếtquảtươngtự.Tỉlệđồngphân20(R)/20(S)củaG-Rg3là 0,55 tăng lên 0,78 sau 20 chế biến Kết tương tự nhiệt độ chế biến 120 ℃., tỉ lệ 20(R)/20(S) G-Rh1sau giờchếbiếnlà0,52tănglên1,98lầnsau20giờ.Tỉlệ 20(R)/20(S) G-Rg3sau nhiệt độ chế biến 120 ℃ 0,78 tăng lên đến 1,11 lần sau 20 chế biến Điều cho thấy nhiệt độ chế biến tăng vàthờigianchếbiếncàngdàithìcànggiatănghàmlượngcủađồngphândạng20(R) TrongkhiđótỉlệcủahaicặpđồngphânlậpthểG-Rk1/G-Rg5và G-Rk3/GRh4,khơngthayđổinhiềukhithờigianhoặcnhiệtđộchếbiếntănglên Sựthay đổi tác dụngsinhhọc qtrìnhchế biếnSâmVN Tácdụngứcchếtăngtrưởngtếbào:tănglêncóýnghĩakhithờigian chế biến tăng.Tácdụngkhángphânbàođạtcựcđạisau12giờchế biến 105 ℃ 120 ℃ Điều đáng kể tổng hàm lượng cácginsenosid phân cực hình thành trình chế biến cũngđạtcựcđạisau12giờchếbiến.Giữacácginsenosid phân cựcnày,cácginsenosidcóaglyconthuộckhungPPDnhưG-Rg3,Rg5v -Rk1là ginsenosid chứng minh có tác dụng kháng phân bào mạnh ginsenosid PPT phân cực khác G-Rh 1, -Rk3và -Rh4và ginsenosid phân cực khác dòng tế bào ung thư Hàm lượng ginsenosid đạt cực đại khoảng từ12-14 sau trình chế biến Điều chứng tỏ có quan hệgiữat c d ụ n g ứ c c h ế t ă n g t r n g t ế b o v h m l ợ n gcủacác 20 hấpnhằmmụcđíchchuyểnhóahồntồncácginsenosidcấutrúcphâncựcPPTnhư G-Re,Rg1t h n h cácginsenosidkémphâncựcgiúpchoqtrìnhphânlậpcácsaponincó aglyconthuộckhungOCTmộtcáchdễdàng.ChỉvớiphươngphápSKCcổđiểnsửdụngpha đảoRP-18,các saponin có aglycon thuộc khung OCT phân lập với sốlượng lớn, đơn giản hiệu Một lượng nhỏ aglycon thuộc khungOCTđượcphânlậptrongcaonướcsaukhiđượctiếptụcchếbiếnbằngcách hấp ởnhiệt độ 120 ℃.trong8 Đề tài phân lập panaxynol hiệu suất tương đối cao Đâylà thành phần bền sau phân lập, bền SâmVN sau chế biến Các thành phần polyacetylen chứngminh có hoạt tính kháng phân bào mạnh nhiều nghiên cứu.ViệcchếbiếnSâmVNtheokiểuHồngsâmkhônglàmảnhhưởngđángkể đến panaxynol, thành phần polyacetylen Sâm VNcũngnhưP ginsengcótácdụngsinh học mạnh Sự thay đổi thành phần hàm lượng saponin Sâm VNDựavàobiểuđồthayđổicácsaponincóaglyconthuộckhungPP D,PPTvàOCTở0chothấycácginsenosidPPTbị thốigiángnhanh hơnginsenosidPPD.Sau12giờchếbiếnở105 ℃ , khơngcịnphát hiệnsaponinnàytrênSKĐ trongkhihàmlượngginsenosidPPTkém ChuộtnhắtđựcICR(20-23g,6tuầntuổi,RaonBioInc.,HànQuốc) 2.2 Phươngphápnghiêncứu 2.2.1 Phântíchthành phầnsaponin trongcácbộphận củaSâmVN - PhântíchđịnhtínhbằngSKLM,HPLC/UV/ELSDvàLC/MS - Xâyd ự n g q u y t r ì n h đ ị n h l ợ n g v x c đ ị n h h m l ợ n g s a p o n i n trongSâmVN bằngHPLC/ELSD Chuẩnbịmẫuthử:Cânchínhxác100mgbộtSâmVNcủacácbộphậntươngứngch ovàoốngnghiệm12ml,thêmchínhxác10mldungmơiMeOH70%đậychặtnắp,s iêmtrong40phútở30℃,lytâmở1000vịng/phút.Dịchchiết đượclọc qua mànglọc 0,45µm Phân tích HPLC/ELSD:Hệ thống sắc ký: Perkin Elmer series 200HPLC kết hợp đầu dò ELSD.Cột: Phenomenex Gemini C18 (150 ×4,6mm;5m).Phađộng:Nước(A)vàACN(B):0-11phút(21%B);1125phút(21→32%B);25-35phút(32→40%B);3540phút(40→95%B);40-60phút(95%B);6061phút(95→21%B)và6171 phút (21% B).Tốc độ dịng: ml/phút.Thể tích bơm mẫu: 20l.Nhiệtđộcột:30℃.Đầudị:ELSD,nhiệtđộhóahơi:50℃,áplựckhínitơ 3,8 bar.Hàmlượngsaponin(mg/g)trongcácbộphậnthânrễ,rễcủ rễ Sâm VN xác định theo quy trình định lượngHPLC/ELSD: phâncựcđạtcựcđại.G-RdtươngđốibềnhơnsovớiG-Rb1v -Rb G-Rd sau 20 chế biến ginsenosid phân cựckhungPPD tiếptụctănglên sau 20 Hàm lượng saponin khung OCT thay đổi khơng nhiều sau q trìnhchếbiếndocóliênkếtglycosidbềntạivịtríC-6.Khoảng84%saponincó aglycon thuộckhungOCTcịnlạisau20giờchếbiến.HàmlượngsaponinP-RT4này tăng lên 70% sau 20 chế biến Điều có thểthấyrằngPRT4có thểđượctạothànhdoqtrìnhdeglycosylhóacủaM-R1,M-R2vàV-R2tạivịtríC6 Tuy nhiên, M-R1, M-R2, V-R1vàVR2tươngđốibềnngaycảsau20giờchếbiếnở120℃ Điềunàythêmkhẳngđịnhsa ponincó aglyconthuộc khungOCTtươngđốibềnvớinhiệt khơngcó nhómglycosid vịtrí C-20 So sánh sựtương quanởnhiệt độ chếbiến105℃ 120℃ 120℃ 120℃ lg(𝑆)−𝑏0 Hàmlượng(𝑚𝑔/𝑔)= 10 𝑏 ×1 0 𝑚 Trong đó: S: diện tích đỉnh thu được; b0, b: hệ số phương trình hồi quy nồng độtheolgdiện tíchđỉnh; m:khốilượngdượcliệu khơ(mg) 2.2.2 Nghiêncứuthànhphầnhóahọc saponin củaSâmVN chế biến -Chế biến Sâm VN, chiết xuất phân lập cao chiết, phân đoạnvà thành phần Sâm VN: Bột sâm VN chế biến (1,5 kg) chiết lầnlượtvớiEt2OvàMeOH(Soxhlet).DịchchiếtMeOHđượccơloạidungmơi,chiếtph ânbốlầnlượtvớiEtOAcvàn-BuOHbão hịanước.CaochiếtEt2O,EtOAcvànBuOHđượctiếptụcsửdụngđểphânlậpbằngcácphươngphápsắckýkhác nhau(prep-HPLC, semiprep-HPLC) - Xácđịnhcấutrúc:MS,Q-TOF-MSvà1D-NMRvà2D-NMR - Khảo sát thay đổi thành phần saponin theo điều kiện nhiệt độ vàthời gian chế biến khác HPLC/ELSD: Sâm VN chếbiến 105oC 120oC khoảng thời gian 0-20 Đánh giá sựthayđổithành phầnsaponin bằngHPLC/ELSD 6 2.2.3 Nghiêncứutác dụngsinh họccủa SâmVN chếbiến - ĐánhgiátácdụngứcchếtăngtrưởngtếbàocủadịngtếbàoungthưphổiA549,tá cdụngchốngoxyhóacủa SâmVNởđiều kiệnchế biếnkhácnhau(105oCvà 120oCtrongkhoảngthờigian 0-20 giờ) - Đánh giá hoạt tính khảo sát chế kháng viêm M-R2, VR2vàcácchấtchuyểnhóaP-RT4, OCT sử dụng đại thực bào phúc mạcphânlập từ chuột,xử lývớitác nhânkíchthích phản ứngviêmLPS Chương3.KẾT QUẢNGHIÊNCỨU 3.1 PhântíchthànhphầnsaponintrongcácbộphậncủaSâmVN 3.1.1 Phân tích định tính thành phần saponin rễ Sâm VNKếtq u ả L C / M S v Q - T O F M S đ ị n h d a n h c c p i c c h í n h t r ê n S K Đ HPLCcủa rễcon SâmVNđượcthểhiện ởBảng 3.10 Bảng3.10.KếtquảLC/MSvàQ-TOF-MSđịnhdanh cácpic trênSKĐ HPLCcủamẫurễ conSâm VN STT Saponin Pic MW Rt(phút) [M-H]― N-R1 932 14,51 931,52 M-R1 816 15,47 815,48 G-Rg1 800 19,22 799,48 G-Re 946 19,65 945,54 M-R2 786 20,75 785,46 V-R11 786 21,92 699,42 V-R1 828(V-R2) 29,03 827,78 + V-R2 842(V-R1) 841,90 u1* u1 1372 29,32 1371,6835 u2 u2 1240 30,65 1239,6414 10 u3 u3 1240 31,69 1239,6404 11 N-R2 770 32,5 769,48 12 u4 u4 1342 33,05 1341,67 13.G - R b 1108 33,13 1107,9 14.u u5 1209 34,11 1209,6268 15.G - Rb 10 1078 35,23 1077,90 16.G - R d 11 946 37,69 945,91 DựavàokếtquảQ-TOFMS,CTPTcủa5picu1,u2,u3,u4vàu5lầnlượtđượcxácđịnhlàC 64H108O31,C5 9H100O27,C 59H100O27,C 63H106O30 vàC 58H98O26d ự a v o giát r ị p h â n m ả n h [ M - H ] , (C64H107O31: 1371,6796), 1239,6414 (C59H99O27: 1239,6373), 1239,6404 (C58H97O26: 1239,6268), 1341,6690 (C63H105O30: 1341,6691)v , 6 ( C 58H97O26:1 , 6 ) v i đ ộ l ệ c h k hối 19 Dasovớisốkhốilýthuyếtlầnlượtlà0,039;0,041; 0,136;0,009và0,000.Cácpic nàyđều chohấp thu UVởbướcsóng203 nm 6 20(R)-Rh1;20(S)G-Rg3và20(R)-Rg3 Bên cạnh ginsenosid phân cực hình thành trìnhchếbiếnđượcphânlậpnêutrên,đềtàicũngphânlậpđượccácsaponink hácnhư: 4 ginsenosidphân cực có aglycon thuộc khung PPT gồm: Gthusuấtthấphơnso Re, -Rg1,N-R1,N-R2với vớicácđềtràitrước.TrongđóNR2làginsenosidlầnđầuđượcphânlậptrongSâmVN.Điềunàycho thấy saponincóaglyconthuộckhungPPTkémbềnvàbịchuyểnhóa thành ginsenosid phân cực khác có khung PPT Kết quảhiệusuất phânlập phù hợpvới kết phântích HPLC 10ginsenosid phân cực có aglycon thuộc khungPPDgồm: GRb1,-Rb2,-Rc,Rd làcácthànhphầnginsenosidchínhcótrongSâmVNchưac hếbiến.Bêncạnhcác ginsenosidtrên,đềtàicịnphânlậpđược4ginsenosid cóaglyconthuộckhungPPDrấtphâncựctrongcấutrúccótừ56đườngtừSâmVNchếbiếngồmnotoginsenosidD(N-D),N-R4,GRa 1vàhợpchất22đượcxácđịnhlà3-O-β-D-xylopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl-20(S)protopanaxadiol2 - O-β-D-xylopyranosyl( → ) - β-Dxylopyranosyl(1→6)-β-Dglucopyranosid.ĐiềunàychứngtỏginsenosidcóaglyconthuộckhungPP Dkhá bền sovới khungPPT Ởnhiệtđộ chế biến105 ℃ vòng giờ, thành phần ginsenosid phân cực có aglyconthuộc khung PPD cịn diện phân lập từ Sâm VN chếbiến.NhưvậychứngtỏginsenosidcóaglyconthuộckhungPPDphân cựctươngđốibềnởnhiệtđộchếbiếncủaHồngsâmvàthờigianchếbiến8 6 saponin có aglyconthuộc khung OCT gồm: M-R1, M-R2, PRT4,V-R2, V-R11 OCT genin Trước việc phân lập saponin cóaglyconthuộckhungOCTnhưMR2thườngphảisửdụngsắckýlỏngđiềuchếdohaithànhphầnM-R2vàG-Rg 1khó phân tách SKC pha thuận hay pha đảo Đồng thời việc sử dụng đầu dị UV ởbướcsóng203nmđểpháthiệncũngcónhiềuhạnchế.Dovậyđểphânlậpcác 19 saponin có aglycon thuộc khung OCT, đặc biệt thành phầnchínhMR2,caonướcsaukhilắcphânbốvớiEtOAcđãđượctiếptục 18 nghiên cứu cho thấy số ginsenosid với khối lượngphân tử lớn tương đương với 5-6 đường cấu trúc diện chủyếutrongrễconSâmVNvàchưađượcphânlậpvàxácđịnhcấutrúc ThànhphầnsaponincủaSâm VNchế biến Sâm VN đa số sử dụng dạng tươi phơi khơ mà chưa cónhiều nghiên cứu chế biến theo kiểu Hồng sâm Thái dươngsâm Hơn nữa, hai thành phần ginsenosid cấu trúc phổ biến làPPDvàPPT,SâmVNcịnchứahàmlượnglớncácsaponincóaglyconthuộc khungOCT.Sựthayđổicấutrúccủaginsenosidcóaglyconthuộc khung PPD PPT qua q trình hấp (steaming) thựchiện nhiều nghiên cứu trước đây, nhiên saponincó aglycon thuộc khung OCT chưa khảo sát Do trongnghiêncứunàychúngtơinghiêncứuthànhphầnsaponincủaSâmVNchế biến thay đổi thành phần hóa học saponin Sâm VN chếbiếntheokiểuHồngsâmvàTháidươngsâmở105℃.và120℃.trongkhoảngth ờigiankhácnhautừ2đến20giờ,đồngthờisosánhsựtươngquanởhai nhiệtđộ chế biến Phân lập xác định thành phần hóa học Sâm VN chế biếnSửdụngcácphươngphápchiếtxuấtvàphânlậpthườngquy,kếthợpcácphươngphápMPLC,semiprep HPLC prep HPLC, đề tài đãphân lập 28 hợp chất: 25 saponin có aglycon thuộc khung PPD,PPT OCT, polyacetylen (panaxynol), hỗn hợp sistosterol vàstigmaterolvà daucosterol Cácginsenosidmớiđượctạothànhquaqtrìnhchếbiếnđasốlàcáccặpđồngph ân20(S)và20(R)doqtrìnhkhửđường(deglycosylation) ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD/PPTphân cực [85] Trên SKLM, ginsenosid không táctoh dovậykhôngthểsửdụngkỹthuật SKCthôngthường.Dovậyviệcphântáchcácginsenosidnàycũngkháphứctạp.Nghiêncứunàysửdụngkỹ thuật SKC cổ điển kết hợp HPLC điều chế để phân lập đồngphân ginsenosid hình thành trình chế biến Sâm VN.PhươngphápHPLCđiềuchếchothấysựhiệuquảtrongphânlập cặpđồ ng phânnhư G- Rk v - R h ;G - R k v - R g ;2 0( S)G- Rh v 3.1.2 Phântíchđịnhtính vàđịnhlượng Sắc kýđồ định tính địnhlượngbằngHPLC/ELSDSâmVN Hình3.12.SKĐHPLC/ELSDđại d i ệ n cho5bộphậ nkhác nh au củaSâmVN (A)Thân rễ;(B)Rễ củ;(C)Rễ con;(D)Lá;và(E) Thân(Nồng độphân tíchcủa mẫuThân vàLácaogấp3lần mẫukhác).Chúthích: N-R1 (1),M-R1(2),G-Rg1( 3),G-Re(4), M-R2 (5), P-RT4(6), V-R11 (7), V-R1 + V-R2 (8), N-R2 (9), G-Rb1(10), G-Rb2(11),G-Rd (12)và 5picchưaxácđịnh (u1-u5) KếtquảchothấySKĐcủamẫutrênmặtđất(lávàthân)khácvớimẫudướimặtđất QuytrìnhđịnhlượngbằngphươngphápHPLC/ELSD Bảng3.13 Đường tuyếntính 9saponin vớiđầu dịELSD Khoảng tuyếnLOQ Saponin Phươngtrìnhhồiquy R2 tính(mg/ml) (mg/ml) N-R1 y=16.095.158x1,6081 0,9985 0,013-1,040 0,0220 G-Rg1 y=14.505.168x1,5687 0,9983 0,007-0,955 0,0220 G-Re y=15.540.853x1,6196 0,9977 0,013-1,075 0,0220 M-R2 y=20.958.157x1,6685 0,9984 0,019-0,61 0,0190 P-RT4 y=20.123.608x1,6351 0,9990 0,009-0,56 0,0160 V-R11 y= 4.707.057x1,6007 0,9994 0,055-1,69 0,0550 V-R2 y=22.774.081x1,6510 0,9994 0,007-0,56 0,0130 G-Rb1 y=30.016.270x1,6916 0,9991 0,007-0,495 0,0130 LOD (mg/ml) 0,0060 0,0070 0,0070 0,0040 0,0065 0,0260 0,0035 0,0038 17 PI Saponin G-Rd Phươngtrìnhhồiquy R2 y=28.974.603x1,7116 0,9993 Khoảng tuyếnLOQ tính(mg/ml) (mg/ml) 0,007-0,495 0,0120 LOD (mg/ml) 0,0039 p65 Bảng3.12.Kếtquả độ đúngcủa9 saponinchínhtrongSâmVN ELSD SaponinOriginalThêmvàoTìmthấy Tỉlệhồi R.S.DOriginalThêmvào (mg/g) (mg/g) (mg/g) phục(%) (%) (mg/g) (mg/g) N-R1 G-Rg1 0,150 , 0,11 3,662 , 3,02 5,95 6,69 94,8 100,2 3,27 1,183 , 10,17 11,21 2,72 2,81 1,17 1,31 0,25 0,28 1,98 2,12 1,05 1,13 94,3 96,5 98,5 89,4 111,5 102,3 103,7 101 97 92 95 90 4,15 1) 0,4 N.D 4,49 0,9 N D 4,06 0,42N D G-Re 0,09 M-R2 6,413 , 4,98 P-RT4 1,711 , 1,23 V-R11 0,670 , 0,62 V-R2 0,170 , 80,1 G-Rb1 1,011 , 1,2 G-Rd 0,560 , 0,63 2,4 3,02 0,1 0,12 UV TìmthấyT ỉ lệhồi R.S.D (mg/g) phục(%) (%) 0,24 98 6,9 0,26 97,8 5,7 6,11 99,5 1,66 6,83 100,2 1,14 0,17 81,6 0,3 0,19 84,5 0,4 5,4 6,36N D 2,3 1,0 7,631 , 1,2 0,96 0,560 , 3,07 0,63 2,01 2,15 1,1 1,19 101 96 106,3 98 %R.S.D 3,03 2,43 3,78 2,37 3,87 2,96 2,26 Kết quảđịnhlượngsaponin trongthân rễ,rễcủ vàrễcon SâmVN Loại PPD saponin LPS Saponin (10 µM) - + - + M-R2 Hình3.27.Tácdụngcủa M-R2,P-RT4vàOCT lênsựchuyểnvịNF-κBBvàonhântếbào Bảng3.14.Độlặp lạitrongngàyvàliênngày củaphương phápHPLC-ELSD ELSD T r o n g ngày Liênngày Saponin Hàmlượng (mg/g) %R.S.D Hàmlượng (mg/g) N-R1 G35,8±0,2 0,75 36,6±1,1 Rg1GRe M-R2 62,8±0,3 0,51 64,1±1,5 P-RT4 16,8±0,2 1,4 17,6±0,6 VR11 6,7±0,2 3,03 7,7±0,18 VR2 1,5±0,05 3,77 1,7±0,06 G-Rb1 10,1±0,00 0,09 10,5±0,3 G-Rd 5,6 ±0,06 1,14 5,6 ±0,12 Bảng 3.16.Hàmlượng1) Merge trongcácbộphậnthânrễ,rễcủvàrễcon Saponin G-Rb1 G-Rb2 G-Rd CTPT C54H92O23 C53H90O22 C48H82O18 Thânrễ 8,1±2,8 3,6±2,1 2,3 ±0,4 Rễ củ 10,1 ± 4,3 2,2±1,1 1,5 ±0,5 Rễ 11,5 ±3,7 1,9±0,5 1,7 ±0 , u12) 4,9u22) 4,6u32) 1,3u42) 0,9u52) C64H108O31 C59H100O27 C59H100O27 C63H106O30 C58H98O26 N.D7) 9,2 ±2,3 N.D N.D 8,0 ±3,2 N.D 12,1 ± 4,1 N.D N.D 5,3 ±1,3 24,2 ± 14,2 ± 7,0 ± 5,2 ± 7,8±3,6 1,62 5,75 2,86 6,45 Chương4.BÀNLUẬN Phântíchthànhphần saponintrongsâmVN ELSD lựa chọn tối ưu cho việc định lượng saponin trongcác lồi thuộc chiPanax, saponin có aglycon thuộc khung OCT.SaponinkhungOCTlàthànhphầnsaponinchínhcủaSâmVN,chiếmhơ n50%hàmlượngsaponintồnphầngồmM-R2(thànhphầnchính),M-R1, V-R2 chưa đượcpháthiệncũngnhưđịnhlượngtrongcácnghiên cứu trước Trong nghiên cứu sử dụng đầu dò ELSD,các thành phần saponin có aglycon thuộc khung OCT pháthiệnvàđịnhlượng.Việcđánhgiáthànhphần,hàmlượngcácsaponinthuộc cácnhómnàyrấtquantrọngđểđánhgiátiêuchuẩnchấtlượngcho Sâm VN định hướng cho nghiên cứu tác dụngsinhhọcvàdượclý.KếtquảphântíchchothấySâmVNkháccáclồiSâmk hácởthànhphầnsaponincũngnhưhàmlượngsaponincaohơngấpnhiềulần SửdụngphươngphápTLCđiềuchế,prep-HPLCkết hợp kỹ thuật xác định phổ khối Q-TOF-MS đại, ginsenosidmới Sâm VN xác định Phương pháp hiệu quả,đơn giản nhanh chóng, giúp định hướng cho việc phân lập cácginsenosidmớichưađượcxácđịnhcấutrúctrongSâmVN.Kếtquả 16 100 Loại Saponin TổngPPD3) GReGPPT Rg1NN-R2 R1 Tổng PPT4) M-R1 M-R2 P-RT4 OCT V-R11 V-R1 * 80 %ứcchế *** *** ** 60 * ** 40 ** ** ** ** 20 mg/mL 0 1012 Thời gian mg/mL 14 16 0.5 mg/mL 18 5) 20 +V-R2 Biểu đồ 3.7.SựthayđổitácdụngkhángphânbàocủaSâmVNchếbiếnở120 ℃trêndòng tếbàoungthưphổiA549 3.4.3 Tác dụng kháng viêm: P-RT 4và OCT nồng độ 10 20 µMứcchếqtrìnhphosphorylhóacủaIRAK1,TAK1vàIκBBα,cũngnhưhoạthóa NF-κBBtronggắnkếtLPSvớiđạithựcbàophúcmạc.Những hoạtchấtnàycũngứcchếmạnhbiểuhiệncủacácyếutốTNF-α,IL1β,COX-2vàiNOS gắnkếtLPS vớiđạithựcbào phúc mạc.PRT4và OCT ngăn chặn biểu cytokine tiền viêm gâybởiLPSvàkíchhoạtyếutốtranscriptionNF-κBBbằngcáchứcchếgắnkết LPSvới thụthểTLR4trêntếbàomiễndịchcũngnhưtếbàođạithựcbào CTPT C48H82O18 C42H72O14 C47H80O18 C41H70O13 C42H72O15 C41H70O14 C36H62O10 C41H70O14 CH O (V-R1) 44741 Rễcon 73,4±11,7 6,1±1,4 4,9±2,3 2,6±1,1 1,7 ±0,4 15,2±3,5 1,8±1,0 26,5±13,1 N.D 6,3±2,6 33,7 ± 8,9 23,7 ± 4,9 16,2±4,3 145,5 ±23,5 105,4 ±22,2 Hàmlượngtổng 155,9±34,4 139,3±29,9 195,2±35,3 1) Kếtquảđượcthểhiệnởgiátrịtrungbình±SD(n=6),mg/g(tínhtrêndượcliệuSâmVN khơ) 2) C c picchưabiết,đượcxácđinhthuộcnhómPPDdựavàokếtquảQ-TOF-MSvà H-NMR.Hàmlượngcủau1-u5đượctínhtốndựavàođápứngvớiđầudịELSD sovớiG-Rb 3)PPD: G-Rb , -Rb , -Rd u14)PPT:G-Re,-Rg ,N-R1 vàN-R2.5) Được u5.tínhchoV-R2 6)OCT:M-R1,M-R2,P-RT , V-R1,V-R2vàV-R11 7)N.D:khơngpháthiện Hàm lượng saponin toàn phần Sâm VN phận thân rễ, rễcủ rễ 195,2; 155,9; 139,3 mg/g dược liệu khô Tỉ lệhàm lượng saponin có aglycon thuộc khung PPT:PPD:OCT thể hiệntrongBiểu đồ 3.1 Hàmlượng(mg/g) LPS Rễcủ 31,3±10,3 0,7±0,5 11,3±2,2 3,8±1,3 3,5 ±1,4 19,2± 4,5 4,9 ±1,5 70,6 ± 15,1 1,2 ±0,1 5,0 ±1,4 C43H72O15(V-R2) Tổng OCT6) 50,7± 20,7 200 Saponin (10 µM) Hình 3.26.Tác dụng M-R2, P-RT4 OCT biểu yếutốthamgiađườngtruyềntínhiệuviêmthơngquaNF-κBBkhixửlývớiLPS Thânrễ 31,2±9,9 1,1±0,4 10,9±1,9 3,5±1,0 3,0 ±1,6 18,5 ±3,0 7,2 ±1,4 93,5 ± 16,2 2,4 ±0,5 8,7 ±1,3 Thânrễ Rểcủ Rễcon TỉlệPPT:PPD:OCT :1,7 : 7,8 1:1,6 : 5,5 :4,8 : 3,3 150 PPT PPD OCT 100 50 Thânrễ Rễ củ Rễcon Biểuđồ3.1.Biểuđồsosánhhàmlượng cácsaponinchínhnhómPPT,PPDvàOCTtrongcácbộ phậndướimặtđấtcủaSâmVN 10 3.2 Thànhphầnsaponincủasâm VNchếbiến 3.2.1 Chiếtxuất phânlậpsaponin từ SâmVNchếbiến 15 Chúthích:105,120:tươngứngvớinhiệtđộchếbiếnở105℃và120℃.0-2-4,…20:tươngứngvớithờigianchếbiến0giờ(SâmVNchưachếbiến),2,4,…,20giờ 3.4 Sựthay đổitác dụngsinhhọccủa sâm VNsauchế biến 3.4.1 Tácdụngchốngoxyhóa:TácdụngchốngoxyhóacủaSâmVNchưa biến(0giờ)vàSâmVNchếbiếntừ2-20giờđượcthểhiệntrongBiểu đồ 3.5 + OCT + Hoạttínhchốnggốctựdo 70 chế P-RT4 60 *** * *** 50 ** * 30 40 ** 20 10 Hình3.15.SơđồquytrìnhchiếtcáccaotừdượcliệuSâmVNchếbiến Kết quảphânlậpthànhphần từcaoEAđượctómtắttrong0 10 12 16 14 Thời gian 18 20 Biểuđồ3.5.HoạttínhchốnggốctựdoDPPHcủaSâmVNởthờiđiểmchếbiếnkhácnhautại1 20℃ 3.4.2 Tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào: Kết chế biến điềukiện105℃.và120oCtrongkhoảngthờigiantừ2-20 giờtrêndòngtếbàou n g t h p h ổ i A đ ợ c t h ể h i ệ n t r o n g B iểuđồ3.6và3.7 100 %ứcchế ** ** ** ** ** 80 * * * 60 ** ** ** ** ** ** ** * 40 20 mg/ml Hình3.16.SơđồphânlậpcácthànhphầntừcaoEA KếtquảphânlậpthànhphầntừcaoBu1đượctrìnhbàytrongHình3 18 10 12 Time(hr) Thời gian 0,75 mg/ml 1,5 mg/ml 14 (giờ) 16 18 20 Biểuđồ3.6.Tácdụngkhángphânbào củaSâmVNchế biếnởđiềukiện105℃ trongkhoảngthờigiantừ2-20giờtrêndòngtếbàoungthưphổiA549 14 140 11 Cao Bu1 [70 g] Hàm lượng (mg/ g) Content(mg/g) SKC 120 PPD(1) Prep -HPLC PPD(2) PPT (2) 40 PđBu 1.17 PđBu1.16 PđBu1.13PđBu1.14 PPT(1) 100 [300mg] O CT 14 12 [10,5g][ 0 mg] 20 PđBu 1.25 MPLC(RP-18) PđBu1.17.3 PđBu1.17.7P đ Bu 1.25.1P đ Bu 1.25.2 SKC 15 0 10 12 14 Thời gian (giờ) 16 18 SK C 11 [4,6g] 20 HPL C PđBu 1.17.6 17 18 [300mg][ mg] [700m g ] 19 Rp-18 23 [16mg] HPL 22[50mg] 21 [36mg][ 2 mg] SKC 16 [350mg ] 19 [10 mg] PPD(1):G-Rb1,G-Rb2,vàG-RdP P T (1):G-Re G-Rg1O C T :M-R1, M-R2,V-R1vàV-R2 PPD(2):20(S)G-Rg3,20(R)-Rg3, G-Rk1và-Rg5.PPT(2): 20(S) G-Rh1, 20(R)-Rh1,G-Rk3và-Rh4 20 [18mg] Hình3.18.SơđồphânlậpcácthànhphầntừcaoBu1 Content(mg/g) Hàm lượng (mg/ g) 18 HPL C PđBu1.25.3 C Biểuđồ 3.2.Sựthayđổihàmlượng saponincóaglyconthuộckhungPPD,PPTvàOCTtrong qtrình chếbiếnSâmVNở105℃ 20 PđBu 1.25.4PđBu1.25.5 HPLC CaochiếtWEtiếptụcđượchấpở105℃.trong8giờvàđượcchiết phânbốlỏnglỏngvớin-BuOH,phânđoạnn-BuOHđượccôthuhồi dung môi thu được10 gcaoBu2 16 14 12 10 4 Rk1 20(R)-Rg3 0 Rk3 Rg5 20(R)-Rh1Rh4 20(S)-Rh1 20(S)-Rg3 10 12 14 Thời gian (giờ) 16 18 20 Time(hr) Biểuđồ3.4.SựthayđổihàmlượngsaponinkémphâncựckhichếbiếnSâmVNở120℃ So sánh thay đổi hàm lượng thành phần saponin điều kiện105 ℃ 120 ℃ hệ số tương quanSI(similarity index) đượcthểhiệntrongBảng 3.26 Bảng3.26.ChỉsốtươngquangiữathànhphầnhóahọcsaponincủacácmẫuSâm VNchếbiến ở105 ℃và 120 ℃ Nhiệtđộ-Thờigian 120-0 120-2 120-4 120-6 120-8 105-0 0,903 0,693 0,530 0,468 0,420 0,902 105-2 0,753 0,585 0,525 0,480 105-4 0,837 0,861 0,687 0,632 0,592 105-6 0,789 0,903 0,743 0,691 0,652 105-8 0,774 0,774 0,722 0,683 0,918 105-10 0,663 0,819 0,883 0,835 0,796 105-12 0,628 0,785 0,903 0,877 0,836 105-14 0,602 0,780 0,900 0,872 0,905 105-16 0,601 0,774 0,902 0,906 0,868 105-18 0,594 0,762 0,901 0,906 0,863 105-20 0,596 0,770 0,901 0,909 0,881 Hình3.19.QuytrìnhphânlậpcáchợpchấttừcaochiếtBu2 OH 120-10 0,421 0,478 0,585 0,635 0,664 0,772 0,815 0,851 0,852 0,857 0,869 R 12 b c a R2 R1O R2 A OH O 21 HO B OR1 C 12 13 Bảng3.22.KếtquảphânlậpcácthànhphầntừSâmVNvà cảmquan,đặcđiểm hóahọcvà khốiphổ KýKhung STTHợp R R2 R3 chấth i ệ u 20(R) (a)G-Rg3 1a A- 20(S) 1bl c G G-Rg3 V-R2 A-(a) 2- -Glc Glc KL - B -H -H Glc [6-Ac]Glc2-Xyl -H -H 664 30 G-Rh1 6D au co ol st Bộtv ô địn hhình,khôn gmàu Kémt an/ MeOH 203 -H 2115 Tinhthể hìnhkim,k hơngmàu -nt- -nt- -nt- 3a A-(a) -H -Glc -H 132 3b A-(a) -H -Glc -H 290 -nt- -nt- 25 -nt- -nt- -nt- -nt- -H -Glc 18 -nt- -nt- 203 -Glc -H 418,8 -nt- -nt-