BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp ) Chuyên ng[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC-XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 942 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Hà Nội - 2023 Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam (VAAS) Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Đồng Văn Quyền Phản biện 1: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy Phản biện 2: PGS.TS Kim Văn Vạn Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Quang Huy Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngành nuôi trồng thủy sản xem ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam liên tục tăng trưởng năm gần diện tích sản lượng Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3 nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, sản lượng thủy sản ni trồng ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021 Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản giới Việt Nam phải đối mặt với khó khăn thách thức, đặc biệt năm gần đây, bệnh vi rút động vật thủy sản bệnh xuất huyết cá trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân cá chép, bệnh Iridovirus cá mú, bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách thận truyền nhiễm, hoại tử quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế cho nuôi trồng thủy sản Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) phát hầu giới, gây ảnh hưởng đến 120 lồi cá biển, có nhiều lồi cá biển có giá trị kinh tế cao Bệnh xác định vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây Cá mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất triệu chứng đặc trưng: bơi lội không định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, 80 -100% cá bị bệnh chết sau 3-5 ngày Dịch bệnh nuôi trồng thủy sản ngày có xu hướng gia tăng qua năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời gian khởi phát kéo dài, thế, việc kiểm sốt dịch bệnh ni trồng thủy sản vấn đề cấp thiết Kiểm soát dịch bệnh chế phẩm vi sinh, chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày ứng dụng nhiều mơ hình canh tác sinh thái Trong đó, sử dụng vắc-xin biện pháp phịng bệnh hiệu an tồn để ngăn ngừa dịch bệnh gây vi rút, vi khuẩn Hiện tại, hầu hết loại vắc-xin thủy sản thương mại loại vắc-xin bất hoạt tính an toàn Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh nghiêm trọng giai đoạn ấu trùng, cá bột, cá hương, cá giống với tỷ lệ chết lên tới 100%, vậy, vắc-xin phịng bệnh hoại tử thần kinh thường dùng cho cá đường ngâm 2 Xuất phát từ sở lý luận nhu cầu thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)” tiến hành nhằm tạo vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoạt tử thần kinh cá mú Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Nghiên cứu vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú từ chủng vi rút phân lập miền Bắc, Việt Nam Mục tiêu cụ thể: Phân lập lựa chọn chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học: Luận án chế tạo vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú với bước: phân lập, tuyển chọn chủng giống làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin, đánh giá chủng giống gốc, nhân nuôi vi rút tế bào, bất hoạt vi rút, xác định điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm đánh giá chất lượng vắc-xin bán thành phẩm Kết nghiên cứu liệu khoa học, cung cấp thêm tư liệu tham khảo cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh cho đối tượng cá biển có giá trị kinh tế cao 3.2 Ý nghĩa thực tiễn: Luận án nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt keo phèn đạt tiêu an toàn hiệu phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ số lồi cá mú ni số tỉnh khu vực miền Bắc 4.2 Phạm vi nghiên cứu: Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ cá biển nuôi vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định) 3 Những đóng góp luận án Luận án nghiên cứu cách toàn diện đặc điểm chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú, bao gồm tính khiết, tính sinh miễn dịch bảo hộ, tính ổn định mặt di truyền suất sau nhân nuôi tế bào GS01 Luận án chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn chủng vi rút TB05 phân lập tỉnh Thái Bình, vắc-xin bất hoạt keo phèn sử dụng cho cá phương pháp ngâm, tỷ lệ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% sau tháng Bố cục luận án Luận án gồm (1) Mở đầu trang, (2) Tổng quan 27 trang, (3) Đối tượng phương pháp nghiên cứu 16 trang, (4) Kết nghiên cứu 53 trang, (5) Kết luận kiến nghị trang, 250 TLTK, 22 bảng, 18 hình Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers Có tất 87 lồi liệt kê chi Epinephelus (E.), riêng khu vực Ấn Độ, Thái Bình Dương phát 63 loài thuộc giống Epinephelus, cá mú loài cá sống đáy rạn san hô, đá cứng, vùng nước ấm, phân bố chủ yếu vùng biển nhiệt đới, nhiệt đới thấy vùng biển ơn đới Nhiệt độ thích hợp cho lồi cá mú phát triển 25-300C, độ mặn từ 11- 41‰ Hầu hết tất lồi cá mú lồi lưỡng tính nguyên sinh Tuyến sinh dục ban đầu chưa biệt hóa sau chúng biệt hóa thành buồng trứng tất cá thể Sau trưởng thành thành cái, chúng trải qua trình thay đổi giới tính thành đực, biến đổi buồng trứng thành tinh hồn Sự thay đổi giới tính tự nhiên loài cá mú xảy từ đến 11 tháng tuổi tùy theo lồi Cá mú có xu hướng đẻ trứng vào đầu mùa xuân mùa hè Mặc dù số loài cá mú sinh sản quanh năm, cịn lại hầu hết lồi cá mú sinh sản khoảng thời gian từ tháng đến tháng 1.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Việt Nam Bệnh hoại tử thần kinh báo cáo thức toàn giới, ngoại trừ Nam Mỹ VNN xuất quốc gia khu vực châu Á Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam; Châu Đại Dương Úc, Tahiti; vùng Địa Trung Hải Pháp, Hy Lạp, Ý, Malta, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Tunisia quốc gia khác như, Vương quốc Anh, Na Uy, Quần đảo Caribe Bắc Mỹ Ở châu Á, tỷ lệ tử vong hàng loạt ghi nhận giai đoạn ương giống cá mú Singapore, cá mú chấm đỏ (E akaara) cá háo sọc (Pseudocaranx dentex) Nhật Bản, cá đối đầu dẹt (Mugil cephalus) Trung Quốc, cá hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) Israel Ở Bắc Mỹ, bệnh VNN phát cá chẽm trắng (Atractoscion nobilisthe) cá tuyết Đại Tây Dương Ngồi ra, bệnh bệnh hoại tử thần kinh khơng lây nhiễm cá biển mà nhiều loại động vật thủy sinh nước Ở Việt Nam phát số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần kinh, bao gồm loài: E coioides, E fuscogutatus, E tauvina, E lanceolatus, E malabaricus Khánh Hòa, E coioides Cát Bà (Hải Phòng) Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam phát lần vào năm 2002 lồng nuôi Vân Đồn, Quảng Ninh 1.3 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh cá xác định Betanodavirus, Vi rút khơng có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 25-30 nm, có đối xứng hình tứ diện, vỏ protein bao gồm 180 protein với khối lượng 42 kDa Hệ gen Betanodavirus có cấu trúc ARN mạch đơn, sợi dương gồm tiểu phần: Tiểu phần lớn hệ gen chứa ARN1 (3.1 kb) Tiểu phần nhỏ hệ gen chứa ARN2 (1.4 kb), ARN2 chứa khung đọc mở (ORF) cho protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo thủ cao T2 (870 bp) T4 (420 bp) Giống Betanodavirus phân thành kiểu gen chính, bao gồm: vi rút hoại tử thần kinh cá bơn sọc (SJNNV), vi rút hoại tử thần kinh cá hổ (TPNNV), vi rút hoại tử thần kinh cá mú đốm đỏ (RGNNV) vi rút hoại tử thần kinh cá bơn (BFNNV) Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ phương thức lây truyền theo chiều ngang chiều dọc tạo lây nhiễm thức cách xâm nhập vào tế bào nhạy cảm hệ thống thần kinh trung ương bao gồm não, tủy sống võng mạc dẫn đến biểu lâm sàng cá mắc bệnh như: bơi không định hướng, thân thẫm màu, mắt lồi, cong thân 1.4 Tổng quan vắc-xin thủy sản Vắc-xin nuôi trồng thủy sản xem biện pháp phòng ngừa hiệu nhiều bệnh gần trở nên phổ biến Theo tác nhân gây bệnh, vắc-xin thủy sản phân loại thành vắc-xin vi khuẩn, vắc-xin vi rút vắc-xin ký sinh trùng, chúng phân loại theo thành phần bao gồm vắc-xin đơn giá, vắc-xin đa giá vắc-xin hỗn hợp, phân loại theo chất chẳng hạn vắc-xin sống giảm độc lực, vắc-xin bất hoạt vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin axit nucleic, vắc-xin tái tổ hợp Cần lưu ý loại vắc-xin có ưu điểm nhược điểm, loại vắc-xin khác cần phát triển sử dụng cho tác nhân gây bệnh động vật khác Phương pháp sử dụng vắc-xin thủy sản thường dùng đường tiêm, vắc-xin ngâm vắc-xin cho ăn Mỗi loại có ưu nhược điểm phù hợp với đối tượng khác Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Cá bệnh Mẫu cá mú thu thập vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định) 2.1.2 Cá thí nghiệm Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 2-2,5 cm, cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) dài 2-2,5 cm mú chuột (Cromileptes altivelis) dài 5,5-6 cm cung cấp Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc, Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng 2.1.3 Tế bào Tế bào GS01 (tế bào lách cá mú) trường Đại học Wageningen, Hà Lan cung cấp 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Phân lập lựa chọn chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 2.2.2 Sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 6 2.2.3 Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.3.1 Địa điểm: Đề tài thực phịng thí nghiệm Vi sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.3.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2020 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 2.4.2 Kỹ thuật phân lập vi rút tế bào mẫn cảm GS01 2.4.3 Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số 2.4.4 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 2.4.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 2.4.6 Phương pháp điện di gel agarose 2.4.7 Phương pháp giải trình tự ADN 2.4.8 Phương pháp xác định TCID50, LD50 NNV 2.4.9 Xác định điều kiện nhân giống vi rút 2.4.10 Phương pháp bất hoạt vi rút 2.4.11 Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn 2.4.12.Phương pháp trung hòa tế bào 2.4.13 Phương pháp gây miễn dịch 2.4.14 Phản ứng ELISA gián tiếp 2.4.15 Phương pháp thử thách cường độc 2.4.16 Đánh giá độ an toàn vắc-xin 2.4.17 Đánh giá hiệu vắc-xin điều kiện thực nghiệm 2.4.18 Phương pháp xử lý số liệu Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 3.1.1 Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh tỉnh miền Bắc, Việt Nam Trong tổng số 60 mẫu cá mú có triệu chứng bệnh hoại tử thần kinh thu thập từ vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định) 7 Hình 3.1 Mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh A: cá mú khỏe mạnh; B C: mẫu cá mú nghi mắc VNN Bảng 3.1 Kết sàng lọc gen T4 mẫu cá nghi nhiễm NNV Số mẫu Số lượng dương Tỷ lệ dương Địa điểm mẫu tính gen tính (%) T4 QN HP NĐ TB Tổng số 16 15 14 15 60 8 10 32 50,00 40,00 57,14 66,67 53,33 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR số mẫu nghi nhiễm NNV Giếng 1-5: mẫu nghi nhiễm NNV; M: thang ADN chuẩn 1kb 420 bp Kết sàng lọc sinh học phân tử từ 60 mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh có 32 mẫu phát thấy đoạn gen có kích thước 420 bp, tương ứng với kích thước đoạn gen T4 vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Các mẫu dương tính với gen T4 sử dụng để phân lập vi rút tế bào mẫn cảm GS01 Vi rút nhân lên tế bào đánh giá hiệu ứng huỷ hoại tế bào (cytopathic effects - CPE) STT 10 11 Hình 3.3 Hình ảnh tế bào GS01 A: Tế bào GS01 chưa gây nhiễm mẫu NNV B: Tế bào GS01 sau 120 gây nhiễm NNV Bảng 3.2 Kết nuôi cấy mẫu bệnh phẩm tế bào GS01 Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) Ký hiệu theo thời gian (giờ) mẫu 24 48 72 96 120 144 168 192 QN02 _ _ + + + ++ ++ ++++ QN04 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ QN05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ QN07 _ + + + ++ ++ ++ +++ QN08 _ _ + + + ++ ++ ++++ QN10 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ QN12 _ _ + + + ++ ++ ++++ QN14 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ HP02 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ HP03 _ _ + + + ++ ++ +++ HP05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 12 HP06 _ _ + + + ++ ++ +++ 13 HP07 _ _ + + + ++ ++ +++ 14 HP09 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 15 HP12 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 16 HP15 _ _ + + + ++ ++ +++ 17 NĐ01 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 18 NĐ03 _ _ + + + ++ ++ ++ 19 NĐ04 _ _ + + + ++ ++ ++++ 20 NĐ05 _ _ + + + ++ ++ ++ 21 NĐ07 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 22 NĐ08 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 23 NĐ10 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 24 NĐ12 _ _ + + + ++ +++ +++ 25 TB02 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 26 TB03 _ _ + + + ++ ++++ ++++ 27 TB05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 28 TB07 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 29 TB08 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 30 TB10 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 31 TB11 _ + + + ++ ++ ++ +++ 32 TB13 _ _ + + + ++ +++ ++++ Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++: CPE > 50%; +: CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: khơng có CPE Kết phân lập vi rút tế bào GS01 cho thấy, đĩa nuôi cấy tế bào GS01, mẫu bệnh phẩm bắt đầu gây hiệu ứng hủy hoại tế bào sau 72 gây nhiễm, biểu bệnh tích tế bào tăng ngày cao từ 168 đến 192 sau gây nhiễm 3.1.2 Xác định độc lực vi rút (TCID50 LD50) Độc lực vi rút xác định liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy (Tissue culture infective dose - TCID50) và/hoặc liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose- LD50) Bảng 3.3 Kết xác định TCID50 tế bào GS01 STT Ký hiệu mẫu 10-1 Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) (%) theo độ pha loãng vi rút 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 TCID 50/mL 10 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 QN02 QN04 QN05 QN07 QN08 QN10 QN12 QN14 HP02 HP03 HP05 HP06 HP07 HP09 HP12 HP15 NĐ01 NĐ03 NĐ04 NĐ05 NĐ07 NĐ08 NĐ10 NĐ12 TB02 TB03 TB05 TB07 TB08 TB10 TB11 TB13 100 65 70 85 100 85 85 90 100 95 70 90 100 60 90 95 70 85 60 65 55 100 100 85 90 95 100 70 55 90 85 95 100 60 70 80 100 80 80 90 100 95 70 90 100 60 90 95 70 80 60 60 55 100 100 80 90 95 100 70 55 90 80 95 98 55 60 80 95 70 80 85 95 90 60 85 95 50 85 80 60 80 50 55 50 95 95 80 85 90 95 60 50 85 70 90 85 40 50 70 80 52 70 60 80 70 50 70 80 40 70 75 50 70 40 40 30 80 80 70 60 70 80 50 30 70 52 70 80 15 35 50 70 45 48 50 70 60 35 50 70 20 50 60 35 50 15 15 15 70 70 50 50 60 70 35 15 50 45 60 70 20 20 60 20 20 25 60 52 20 25 60 25 52 20 20 5 60 60 20 25 52 60 20 25 20 52 50 + 10 48 10 10 15 48 35 15 48 + 15 35 10 + + + 48 48 10 15 35 48 + 15 10 35 25 + 25 5 25 20 + 25 20 + 25 25 5 20 25 + 5 20 10 10 10 10 10 10 10 10-6,9 10-3 10-3,9 10-4,9 10-6,8 10-4,3 10-4,9 10-4,8 10-6,8 10-5,9 10-3,9 10-4,9 10-6,8 10-3 10-4,9 10-5,9 10-3,9 10-4,9 10-3 10-3 10-2,7 10-6,8 10-6,8 10-4,9 10-4,8 10-5,9 10-6,8 10-3,9 10-2,7 10-4,9 10-4,3 10-5,9 11 Bảng 3.4 Kết xác định LD50 cá mú giống STT Ký hiệu mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 QN02 QN08 HP02 HP07 NĐ08 NĐ10 TB05 TB08 ĐC 100 100 100 100 100 100 100 66,7 100 100 100 100 100 100 100 53,3 100 100 100 100 100 100 100 30 100 93,3 80 73,3 86,7 93,3 93,3 13,3 80 66,7 80 66,7 86,7 66,7 93,3 6,7 53,3 30 60 53,3 53,3 30 66,7 6,7 13,3 15 46,7 13,3 30 26,6 53,3 0 13,3 15 40 13,3 15 13,3 33,3 0 Tỷ lệ chết tích luỹ sau 120 độ pha loãng vi rút (%) 60 53,3 73,3 53,3 66,7 53,3 80 6,7 LD50/ mL 10-6,2 10-5,5 10-7,5 10-6,2 10-6,5 10-5,5 10-7,5 10-1,5 K Ghi chú: K không đánh giá Kết xác định độc lực vi rút tế bào nuôi cấy cá xác định mẫu TB05 HP02 có độc lực mạnh tế bào cá với liều TCID50 LD50 tương ứng 10-6,8TCID50/mL 10-7,5LD50/mL, mẫu có độc lực cao TB05, HP02 lựa chọn để xác định loài phương pháp sinh học phân tử Kết xác định loài hai mẫu TB05 HP02 thơng qua trình tự gen T4 với trình tự ARN2 chủng vi rút hoại tử thần kinh công bố Genebank Kết cho phép kết luận mẫu TB05 HP02 vi rút hoại tử thần kinh Bảng 3.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn gen T4 mẫu HP02 TB05 với trình tự GenBank Phần trăm Mã số GenBank Tên chủng gen xác định trình tự trình tự so sánh với GenBank (%) Mức độ tương đồng (%) Mẫu TB05 KU705815.1 Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence 87 99,19 12 MG874758.1 AF283554.1 MF144241.1 KY930894.1 Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 segment ARN2, complete sequence Yellow grouper nervous necrosis virus major coat protein gene, partial cds Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence Betanodavirus sp strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds 87 98,64 87 98,64 87 98,37 87 98,37 92 98,47 92 97,95 90 98,18 90 98,18 Mẫu HP02 KU705815.1 MG874758.1 MF144241.1 KY930894.1 Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 segment ARN2, complete sequence Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence Betanodavirus sp strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds 3.1.3 Kết lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Hiệu phòng bệnh vắc-xin phụ thuộc vào chất lượng chủng giống gốc với đặc tính: đại diện kháng nguyên, hiệu kích 13 thích kháng thể bảo hộ, mức độ khiết, hiệu xuất nhân giống tế bào mẫn cảm, ổn định khả kích thích sinh kháng thể bảo hộ di truyền Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên mẫu phân lập Ký Hiệu giá kháng thể Ký hiệu Hiệu giá kháng hiệu trung hòa mẫu vi rút thể trung hòa mẫu vi rút HP02 TB05 HP02 TB05 QN02 256 512 NĐ01 64 128 QN04 128 256 NĐ02 64 128 QN05 128 256 NĐ03 128 QN07 256 128 NĐ04 128 256 QN08 128 128 NĐ05 64 256 QN10 256 512 NĐ08 256 512 QN12 128 128 NĐ10 64 128 QN14 128 128 NĐ12 128 HP02 256 512 TB02 128 HP03 128 512 TB03 128 HP05 128 128 TB05 256 512 HP06 32 128 TB07 128 HP07 256 128 TB08 512 HP09 64 128 TB10 64 128 HP12 64 128 TB11 128 HP15 64 256 TB13 64 128 Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ khiết giống gốc Môi trường đánh giá Chủng giống gốc Lần kiểm tra Thời gian theo dõi (ngày) Thạch máu (đĩa) Thạch nấm (đĩa) Nước thịt (ống) PPLO (pleuropneu monia-like organism) NNV TB05 7 7 - - - - Đối chứng Ghi chú: - âm tính Kết luận Đạt Đạt Đạt - 14 Bảng 3.8 Kết xác định hiệu giá vi rút chủng giống gốc Chủng giống gốc Số lần kiểm tra Dải pha loãng vi rút NNV TB05 10-1 – 10-8 10-1 – 10-8 10-1 – 10-8 10-1 – 10-8 đệm PBS Đối chứng Liều Hiệu giá vi Hiệu giá vi gây rút rút trung nhiễm (TCID50/mL) bình (mL) (TCID50/mL) 6,7 0,1 1010-6,8 0,1 10-6,9 0,1 10-6,8 0,1 đệm Âm tính Âm tính PBS Bảng 3.9 Kết kiểm tra độ ổn định chủng NNV TB05 Chủng giống Lần cấy Hiệu giá vi rút Hiệu giá vi rút giống chuyển (TCID50/mL) gốc (TCID50/mL) -6,8 10 10-6,7 10-6,8 10-6,9 10-6,8 10-6,8 NNV TB05 10-6,8 10-6,9 106,8 10-6,7 10 10-6,8 Đối chứng Âm tính Âm tính Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra gel agarose 1% M: thang DNA chuẩn kb; 1-10: Sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút 10 đời cấy chuyển; 11: đối chứng âm; 12: sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút TB05 10 20 30 40 50 60 70 15 | | | | | | | | | | | | | | f1 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f2 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f3 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f4 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f5 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f6 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f7 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f8 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f9 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f10AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | f1 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f2 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f3 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f4 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f5 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f6 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f7 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f8 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f9 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f10CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | f1 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f2 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f3 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f4 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f5 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f6 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f7 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f8 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f9 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f10GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | f1 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f2 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f3 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f4 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f5 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f6 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f7 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f8 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f9 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f10CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | f1 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f2 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f3 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f4 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f5 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f6 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f7 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f8 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f9 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG 16 f10ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | f1 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f2 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f3 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f4 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f5 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f6 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f7 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f8 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f9 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f10CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG Hình 3.5 So sánh trình tự gen T4 10 đời vi rút Từ kết thu được, nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng giống gốc TB05 từ chủng NNV phân lập từ mẫu bệnh phẩm mắc bệnh hoại tử thần kinh cá mú nuôi khu vực miền Bắc, Việt Nam 3.2 Kết chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú quy mơ phịng thí nhiệm 3.2.1 Xác định liều gây nhiễm (multiplicity of infection - MOI) vào tế bào mẫn cảm thời gian phù hợp để thu hoạch vi rút Chủng NNV TB05 có TCID50= 10-6,8/mL gây nhiễm vào tế bào GS01, với liều gây nhiễm (MOI) 0,1; 0,01 0,001, nhiệt độ nuôi cấy 250C Hình 3.6 Kết xác định liều gây nhiễm (MOI), ý nghĩa thống kê thực cách so sánh giá trị giá trị MOI với giá trị MOI 0.1 Giá trị trung bình ba xét nghiệm độc lập hiển thị Dấu hoa thị cho biết khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,001) 17 Hình 3.7 Tình trạng tế bào nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh thời điểm theo dõi khác A: tế bào chưa gây nhiễm; B: ngày thứ sau gây nhiễm; C: ngày thứ sau gây nhiễm; D: ngày thứ sau gây nhiễm Từ kết thu thí nghiệm cho phép kết luận, giá trị MOI 0,01 phù hợp để nhân giống vi rút, thời gian thu hoạch vi rút phù hợp ngày sau gây nhiễm 3.2.2 Kết xác định điều kiện bất hoạt vi rút Trong nghiên cứu này, chủng NNV TB05 gây bất hoạt với loại hóa chất, bao gồm formaldehyde, binary ethylenimine, βpropiolactone Bảng 3.10 Kết đánh giá mức độ bất hoạt NNV Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ) Hóa chất 12 24 36 48 60 Formaldehyde + + + - - Binary ethylenimine + + - - - β-propiolactone + - - - - Hình 3.8 Kết phát kháng thể đặc hiệu với mẫu vi rút bất hoạt (OD450) 18 Kết cho thấy hiệu vi rút bất hoạt β-propiolactone cho hiệu giá kháng thể cao thời gian dài so với bất hoạt binary ethylenimine formaldehyde Do vậy, β-propiolactone 0,1% chọn làm hóa chất bất hoạt vi rút 3.2.3 Xác định điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm 3.2.3.1 Kết xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp thời gian gây miễn dịch cho cá Liều lượng kháng nguyên thời gian gây miễn dịch cần xác định để đạt hiệu phòng bệnh tạo đáp ứng miễn dịch tối ưu Trong nghiên cứu này, cá mú chuột (kích thước 2-2,5cm) tắm với hàm lượng kháng nguyên 10-5TCID50/mL; 10-6TCID50/mL; 107 TCID50/mL với liều 1mL/10 cá vòng 20 phút, 60 phút 120 phút, đối chứng dùng PBS Hình 3.9 Tỷ lệ sống cá gây miễn dịch với liều kháng nguyên NNV sau thử thách cường độc Ý nghĩa thống kê thực cách so sánh giá trị liều lượng kháng nguyên khác với đối chứng PBS Giá trị trung bình ba xét nghiệm độc lập hiển thị Dấu hoa thị cho biết khác biệt có ý nghĩa: (*p ≤ 0,05; ***p < 0,001) 19 Hình 3.10 Tỷ lệ sống cá gây miễn dịch mức thời gian Ý nghĩa thống kê thực cách so sánh giá trị mốc thời gian 20 phút, 60 phút 120 phút Giá trị trung bình ba xét nghiệm độc lập hiển thị Dấu hoa thị cho biết khác biệt có ý nghĩa: (***p < 0,001) Với kết thu được, liều lượng tối thiểu thời gian ngâm cá lựa chọn để đạt hiệu tối đa việc phòng bệnh tạo đáp ứng miễn dịch cao tương ứng 10-6TCID50/mL 60 phút 3.2.3.2 Kết xác định chất bổ trợ vắc-xin Đối với vắc-xin bất hoạt chất bổ trợ thành phần thiếu để cải thiện hiệu thời gian bảo vệ vắc-xin Hai chất bổ trợ gốc nhôm bao gồm aluminum hydroxide (AH) aluminum phosphate (AP) sử dụng để chế tạo vắc-xin Bảng 3.11 Xác định mức độ an toàn vắc-xin STT Loại vắcxin Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ sống (%) NNV TB05 + AH 97 NNV TB05 + AP 98 Đối chứng âm (không sử dụng 98 Biểu lâm sàng Hai ngày đầu sau xử lý vắc-xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp Các ngày biểu bình thường Tăng trưởng cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Hai ngày đầu sau xử lý vắc-xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp Các ngày biểu bình thường Tăng trưởng cá khơng thay đổi so với lô đối chứng âm Các hoạt động sinh lý biểu lâm sàng bình thường 20 STT Loại vắcTỷ lệ xin chết (%) vắc-xin chất bổ trợ) Tỷ lệ sống (%) Biểu lâm sàng Hình 3.11 Mơ não võng mạc cá nhuộm hematoxylin eosin A: Mô não cá sử dụng vắc-xin 21 ngày, B: Mô não cá gây nhiễm với chủng NNV TB05, C: Mô võng mạc xá sử dụng văc-xin 21 ngày, D: Mô võng mạc cá gây nhiễm với chủng NNV TB05 Hình 3.12 So sánh mức độ bảo hộ cá với vắc-xin bất hoạt có chất bổ trợ khác nhóm thử nghiệm Ý nghĩa thống kê thực cách so sánh giá trị liều thử thách cường độc TCID50 khác với liều thử thách cường độc 4xTCID50 Giá trị trung bình ba xét 21 nghiệm độc lập hiển thị Dấu hoa thị cho biết khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001) Kết thể cho thấy: cá gây miễn dịch với dịch vi rút TB05 bất hoạt có bổ sung nhơm hydroxit nhơm phosphate an tồn với cá mú thí nghiệm, bệnh tích tế bào lơ sử dụng vắc-xin có chất bổ trợ khơng thấy xuất bệnh tích, lơ đối chứng xuất khơng bào trông mô não võng mạc, tất lơ thí nghiệm có tỷ lệ bảo hộ 75% Từ kết thu nhôm hydroxit lựa chọn làm chất bổ trợ vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 3.2.3.3 Đánh giá độ dài miễn dịch vắc-xin bán thành phẩm Trong nghiên cứu này, để đánh giá hiệu vắc-xin việc kích thích đáp ứng miễn dịch khơng đặc hiệu, theo dõi tiêu; số lượng hồng cầu tổng số, bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, tiểu cầu Cùng với nghiên cứu làm rõ khả tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cá sử dụng vắc-xin, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu đánh giá thông qua khả hình thành kháng thể bảo hộ Bảng 3.12 Kết theo dõi tế bào có chức miễn dịch cá thử nghiệm vắc-xin Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Bố trí Chỉ tiêu thứ thứ thứ thứ thứ thí theo dõi nghiệm Số lượng hồng cầu (x10 tế 2.639,00 2.598,40 2.208,64 2.186,55 2.142,82 bào/mL máu) Tổng số Lô thử bạch cầu nghiệm (x10 tế 118,16 116,98 95,92 92,08 91,16 vắc-xin bào/mL máu) Lympho (x103 tế 82,48 78,36 75,22 74,47 72,24 bào/mL máu) 22 Bạch cầu trung tính (x103 tế 2,82 2,54 2,36 2,29 2,27 bào/mL máu) Bạch cầu đơn nhân (x10 tế 3,35 3,22 2,96 2,84 2,78 bào/mL máu) Tiểu cầu (x10 tế 21,19 19,07 17,16 16,65 16,31 bào/mL máu) Số lượng hồng cầu/mL máu 2.030,00 2.036,09 2.038,13 2.038,11 2.036,07 (x103 tế bào/mL máu) Tổng số bạch cầu/mL máu 90,89 90,80 90,62 90,67 90,80 (x103 tế Lô đối bào/mL chứng máu) Lympho (x103 tế 71,72 71,58 71,65 71,65 71,60 bào/mL máu) Bạch cầu trung tính (x103 tế 2,31 2,32 2,32 2,32 2,32 bào/mL máu) 23 Bạch cầu đơn nhân (x10 tế bào/mL máu) Tiểu cầu (x10 tế bào/mL máu) 2,68 2,69 2,68 2,68 2,69 16,05 16,19 16,21 16,22 16,19 24 Hình 3.13 Tỷ lệ sống cá lơ thử nghiệm vắc-xin Tỷ lệ sống sót so sánh nhóm sử dụng thử nghiệm Dấu hoa thị biểu khác biệt thống kê nhóm thời điểm theo thử nghiệm Dấu hoa thị cho biết khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001) Kết thí nghiệm chứng tỏ rằng, vắc-xin kích thích tạo kháng thể bảo hộ cá thí nghiệm, nhiên, lượng kháng thể giảm dần qua thời gian theo dõi Kết cho thấy, để vắc-xin có hiệu theo quy định, cần thực tiêm nhắc lại sau tháng thứ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Lựa chọn chủng vi rút TB05 làm chủng giống gốc đạt tiêu chí sản xuất vắc-xin như: độc lực cao tế bào (106,8 TCID50/mL) cá (107,5 LD50/mL), chủng giống gốc độ khiết 100%, an toàn 100% ổn định nhân nuôi tế bào ổn định mặt di truyền sau 10 đời cấy chuyển Đã nghiên cứu thành cơng vắc-xin bất hoạt phịng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú với đầy đủ thông số tối ưu như: +) Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tế bào (môi trường L-15 + 10% FBS, pH 7,0-7,4); +) Điều kiện gây nhiễm vi rút vào tế bào GS01 với liều gây nhiễm MOI 0,01 cho hiệu giá vi rút cao thời điểm ngày sau nhân ni; +) Hóa chất βpropiolactone nồng độ 0,1% lựa chọn để bất hoạt vi rút; +) Vắc-xin bán thành phẩm phối trộn với nhôm hydroxit với liều kháng nguyên tối thiểu 106TCID50/mL Vắc-xin đạt tiêu chuẩn về: Tính ổn định, vơ trùng, an tồn 100% tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% cho cá sau tháng Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản vắc-xin đánh giá tính an toàn, hiệu lực bảo hộ vắc-xin thực địa sau thời gian bảo quản, tiến đến sản xuất quy mơ cơng nghiệp nhằm đưa vắc-xin vào phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Mạnh Hùng (2018), “Phân lập xác định đặc tính vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh NNV (Nervous necrosis virus) cá mú (Epinephelus sp.) miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, số 15, tr.87-93 Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Vũ Thị Bích Huyền, Lê Minh Hải (2022), “Nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú (Epinephelus sp.) quy mơ phịng thí nghiệm”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thôn, số 6, kỳ 2, tr 66-71