1 MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng một vai trò quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa Trong công tác khai thác và sử dụ[.]
1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng vai trị quan trọng sản xuất nơng nghiệp theo hướng đa dạng hóa, đại hóa…Trong cơng tác khai thác sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá đặc điểm kiểu gene công đoạn vô quan trọng không phục vụ cho việc xác định, phân biệt giống/loài khác mà cịn giúp tìm hiểu mối quan hệ di truyền chúng Sự phát triển mạnh mẽ phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử tạo cơng cụ hữu hiệu nhanh chóng ứng dụng nghiên cứu di truyền kiểu gene Hiện nay, phương pháp sử dụng thị phân tử việc định danh nghiên cứu di truyền ngày sử dụng phổ biến Sử dụng vùng gene thị DNA barcode công cụ mới, ứng dụng rộng rãi giới, dựa tiến hóa khác biệt trình tự nucleotide cho phép phân loại xác định mối quan hệ di truyền giống/loài khác N nucifera lồi sen thuộc nhóm thực vật thủy sinh sống ao hồ, đầm lầy, trồng nhiều nơi giới Ở Thừa Thiên Huế, có nhiều giống sen màu sắc hoa khác trồng nhiều nơi khu vực ngoại thành nội thành Sen Trắng Trẹt Lõm giống sen Huế địa xưa, biết đến giống sen cung đình tiếng, trồng từ xa xưa hồ sen khu vực nội thành, hồ lăng tẩm hồ sen thuộc vùng di tích Cố Huế Giống sen có hương thơm dịu dàng, hoa trắng khiết, củ hạt sen có hương vị chất lượng đặt biệt, mang thương hiệu “sen Huế”, du khách ưa chuộng Trong năm gần đây, phong trào trồng sen Huế đầu tư phát triển mạnh Một số địa phương chuyển đổi diện tích trồng lúa hiệu sang trồng sen lấy hạt Do vậy, việc trồng giống sen trắng có nguồn gốc lâu năm Huế, người dân du nhập số giống sen hồng từ địa phương khác trồng Huế, đặc biệt giống Sen Hồng Cao Sản - giống sen chuyên cho hạt, mang nhiều đặc tính vượt trội điều kiện sống cho suất cao giống sen địa phương Việc trồng nhiều loại sen nội nhập Huế dẫn tới trạng gây lẫn giống, thối hóa giống có nguy làm giảm số lượng giống sen địa, quý Huế Cây sen sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực sống trang trí nghệ thuật, hoa cảnh, văn hóa tâm linh, ẩm thực y học…Nhiều nghiên cứu năm gần cho thấy phận khác sen sử dụng làm ăn vị thuốc có giá trị y học cổ truyền có chứa nhiều hợp chất có chất alkaloid flavonoid với nhiều hoạt tính dược lý chống viêm, chống trí nhớ, chống oxy hóa hoạt tính ức chế khối u, có tác dụng việc cải thiện sức khỏe người Vì thế, việc nghiên cứu sai khác di truyền mẫu sen trồng Huế dựa số vùng gene thị, tuyển chọn giống có khác biệt di truyền kiểu gene đặc trưng để đánh giá hoạt tính sinh học số hợp chất tách chiết từ hạt sen giống sen tuyển chọn việc làm cần thiết Xuất phát từ cở sở khoa học nêu trên, thực đề tài: “Nghiên cứu khác biệt trình tự nucleotide vùng gene thị mẫu sen trồng Huế khảo sát hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ hạt sen” Nghiên cứu cung cấp sở liệu cấp độ phân tử số vùng gene thị, thiết lập mối quan hệ di truyền mẫu sen khác trồng Huế, cung cấp liệu khoa học liên quan đến hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu khác biệt di truyền mẫu sen trồng Huế dựa số vùng gene thị khảo sát hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương 2.2 Mục tiêu cụ thể - Cung cấp liệu khoa học khác biệt trình tự nucleotide vùng gene thị thu từ mẫu sen trồng địa điểm khác Huế, ký gửi liệu cấp mã số GenBank 3 - Đánh giá việc ứng dụng số vùng gene thị hệ gene nhân hệ gene lục lạp nghiên cứu phát khác biệt trình tự nucleotide vùng gene thu từ mẫu sen trồng địa điểm khác Huế Khảo sát qui luật khác biệt, thiết lập mối quan hệ phát sinh dựa vùng gene thị có sai khác nucleotide số mẫu sen trồng Huế, làm sở khoa học cho việc tuyển chọn giống khác biệt đặc trưng để nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học - Nghiên cứu phân lập hợp chất tinh khiết thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất tách chiết từ hạt sen giống sen khác biệt đặc trưng tuyển chọn, tạo tiền đề cho việc khai thác sử dụng bền vững giống sen Huế Những đóng góp đề tài - Đề tài đóng góp số kết sau đây: Xây dựng liệu khác biệt trình tự nucleotide vùng gene thị từ hệ gene nhân vùng gene thị từ hệ gene lục lạp 33 mẫu sen trồng địa điểm khác Huế Từ ký gửi cấp mã số truy cập 330 trình tự nucleotide 10 vùng gene thị thu từ 33 mẫu sen Huế GenBank Bước đầu phát qui luật khác biệt trình tự nucleotide số vùng gene thị 33 mẫu sen trồng địa điểm khác Huế, xây dựng quan hệ phát sinh 33 mẫu sen dựa vùng gene thị có sai khác nucleotide, tuyển chọn giống Sen Trắng Trẹt Lõm có khác biệt đặc trưng trình tự nucleotide để nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học hạt sen Bước đầu phân lập ba hợp chất tinh khiết từ phân đoạn nButanol hạt Sen Trắng Trẹt Lõm có chất alkaloid: nuciferine (C19H21NO2), armepavine (C19H23O3N), anonaine (C 17H15NO2) Bước đầu ghi nhận ba hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh khơng thể hoạt tính gây độc lên ba dịng tế bào ung thư MKN7, SK-Mel-2 KB nồng độ nghiên cứu 4 Cấu trúc lận án Luận án gồm 139 trang Phần mở đầu 05 trang, kết luận kiến nghị 02 trang, cơng trình công bố 01 trang, tài liệu tham khảo 23 trang phụ lục Nội dung luận án chia làm 03 chương: Chương 1: Tổng quan gồm 44 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu gồm 18 trang Chương 3: Kết thảo luận 46 trang CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước vấn đề ứng dụng thị phân tử vào phân tích đa dạng di truyền, xác định lồi thực vật nói chung sen (N nucifera) nói riêng Các nghiên cứu chiết tách hợp chất từ phận khác sen thử hoạt tính sinh học chúng CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu sen Nguồn vật liệu sử dụng nghiên cứu di truyền: Lá 33 mẫu sen thu thập 33 địa điểm trồng sen khác Huế Các mẫu sen thu thập dựa kết công bố Nguyễn Thị Quỳnh Trang cs (2017) dựa đặc điểm hình thái tập đồn 66 mẫu sen thu Huế Nguyên liệu sử dụng chiết tách hợp chất: Hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) thu hồ Tịnh Tâm, phường Thuận Lộc, thành phố Huế 2.1.2 Nguồn vật liệu sử dụng sinh học phân tử: Mười cặp mồi barcode đặc hiệu cho 10 vùng gene thị DNA tham khảo từ Dong cs (2012), Cuenoud cs (2002), White cs (1990) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 2.2.1.1 Chiết tách lục lạp: Lá sen bảo quản 4°C bóng tối khoảng đến ngày để loại bỏ tinh bột tồn mô Lục lạp chiết tách tinh theo mô tả Lang cs (2011) 5 2.2.1.2 Chiết tách DNA từ hệ gene nhân cpDNA từ lục lạp: Lá sen lục lạp sử dụng làm nguyên liệu chiết tách tinh DNA cpDNA dựa phương pháp CTAB theo mô tả Doyle (1987) 2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh DNA cpDNA: Sử dụng phương pháp điện di agarose phương pháp quang phổ máy Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific) 2.2.1.4 Phản ứng PCR: Phản ứng PCR thực máy luân nhiệt (MJ - MiniTM Persanol Thermal Cycle, Bio - Rad) theo chu trình nhiệt sau: biến tính sợi đơi DNA/cpDNA 95oC/5 phút, tiếp đến 30 chu kỳ: 95oC/1 phút, 50 - 55oC/50 giây, 72oC/1 phút, 72oC/10 phút 2.2.1.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR tinh Kít Isolate II PCR and Gel (Bioline) 2.3.1.6 Phương pháp tạo dòng gene: Tạo dòng gene thực theo phương pháp TA cloning vào vector pGEM® -T Easy 2.2.1.7 Phương pháp tinh plasmid: DNA plasmid tái tổ hợp tinh từ dòng khuẩn lạc dương tính kít EZ-10 Spin Column Plasmid ADN Minipreps kit, BS6141 (BioBase) 2.2.1.8 Phương pháp giải trình tự gene: Các gene mục tiêu tiến hành giải trình tự dựa phương pháp Sanger hệ thống phân tích ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer 2.2.1.9 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền: Các trình tự nucleotide xếp dựa chương trình Clustals hiệu chỉnh phần mềm BioEdit 7.0.5 Cây phát sinh chủng loại xây dựng phần mềm MEGA X phương pháp Maximum Like hood (ML) Trình tự nucleotide vùng gene so sánh với trình tự nucleotide cơng bố GenBank chương trình BLAST Phân tích đa hình DNA dựa thơng số bao gồm số lượng vị trí đa hình (S), tổng số đột biến (Eta), số lượng kiểu đơn bội (h), đa dạng kiểu đơn bội (Hd), số lượng nucleotide khác biệt trung bình (k), đa dạng nucleotide (π), số lượng kiện tối thiểu để xảy q trình tái tổ hợp (Rm) Tính trung lập kiểm tra dựa phương pháp bao gồm Tajima’s D test, Fs, Fu’s statistic; S, Strobeck’s statistic; D * and F *, Fu and Li’s statistics dựa phần mềm DNASP 6.0 Thống kê phân hóa dân số FST ước tính cách sử dụng phương pháp Hudson cs (1992) 2.2.2 Phương pháp chiết tách hoạt chất thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.2.1 Phương pháp thu cao phân đoạn: Xử lý mẫu, chiết mẫu ethanol 70%, ngâm lạnh môi trường acid, chiết thu phân đoạn dung mơi có độ phân cực ethylacetate, n-Butanol Từ phân đoạn n-Bu hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) thực chiết tách phân lập hợp chất sắc ký cổ điển cột thường (CC) với pha tĩnh silica gel (Merck) 2.2.2.2 Phương pháp xác định độ tinh khiết cấu trúc hoạt chất a Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng hợp chất phân lập thực theo mô tả Bela Khale (2011) b Phương pháp phân tích phổ HPLC-MS/MS: Phân tích phổ khối lượng MS/MS hệ thống Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer Dữ liệu phổ MS/MS hoạt chất so sánh với liệu phổ chuẩn NIST2017 công bố liên quan 2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học a Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa cao chiết thơ hoạt chất tinh khiết thực phương pháp 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) theo mô tả Vuong cs (2013) b Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: Các dịng tế bào ung thư ni cấy mơi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS Tế bào cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) nuôi tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2 c Xác định tính độc tế bào ung thư tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp: Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB, Sigma, Mỹ) d Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào dịng tế bào nuôi cấy hỗn dịch (HL-60): Phương pháp sử dụng muối tetrazolium (MTT-(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) làm thuốc thử phép so màu, qua đánh giá sống sót khả phát triển tế bào 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm thực nghiệm lặp lại lần Các giá trị phân tích có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Tất phân tích thống kê thực phần mềm SPSS (Version 20) CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khuếch đại PCR phân tích trình tự nucleotide số vùng gene thị Kết sản phẩm khuếch đại PCR 10 vùng gene thị thể điện di đồ hình 3.1 cho thấy tất mẫu sen sử dụng nghiên cứu cho tỷ lệ khuếch đại PCR 100%, băng DNA rõ nét, có nồng độ cao đảm bảo chất lượng làm nguyên liệu thực thí nghiệm (hình 3.1) A B C D E F G H I K Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm PCR M1: Kích thước thang chuẩn DNA; Hình A-K kết PCR vùng gene thị DNA ITS4-5, rbcL, matK, trnH-psbA, accD-psaI, ndhA, psbE-petL, Rpl32-trnL, trnW-psaJ trnSGCU-trnGGCC; NC: Kết PCR đối chứng âm; Giếng 01 đến 11 kết PCR mẫu sen trắng; Giếng 12 đến 33 kết PCR mẫu sen hồng Kích thước 10 vùng gene thị thu 33 mẫu sen dao động từ 350 bp đến 1667 bp Trong vùng gene ITS4-5 trnH-psbA thu kích thước nucleotide có khác biệt mẫu sen, dao động từ 729 bp đến 744 bp (ITS4-5) từ 350 đến 410 bp (trnH-psbA) (bảng 3.1) 8 Trình tự nucleotide vùng gene thị DNA thu từ 33 mẫu sen so với trình tự nucleotide cơng bố GenBank cho kết tương đồng cao với loài sen N nucifera (Mã số: FJ599761.1 KF009944.1), mức độ tương đồng dao động từ 96,89-100% độ bao phủ vùng gene đạt 98-100% Trình tự nucleotide 10 vùng gene thị DNA thu từ 33 mẫu sen ký gửi GenBank với mã số tham chiếu ITS4-5 (MT903421-MT903453), rbcL (MN011708-MN068956), matK (MN011719-MN068978), trnH-psbA (MN011730-MN086252), accD-psaI (MN086253-MN086285), psbE-petL (MT901764-MT901796), Rpl32-trnL (MT901731-MT901763), trnW-psaJ (MT905225-MT905257), trnSGCUtrnGGCC (MT905258-MT905290) ndhA (MZ611976 -MZ612008) 3.2 Kết phân tích đặc tính di truyền số mẫu sen trồng Huế dựa 10 vùng gene thị 3.2.1 Kết phân tích đặc tính phân tử 10 vùng gene thị thu từ số mẫu sen trồng Huế Vùng gene ITS4-5 thu từ 33 mẫu sen khác cho thấy Cystein (C) chiếm tỷ lệ cao (trung bình = 30,538%) thấp Timin (Uracin) (trung bình = 20,521%), tỷ lệ % (G+C) mẫu sen đạt trung bình 55,111% Các vùng gene thị lục lạp, nucleotide loại A chiếm tỷ lệ cao vùng gene rbcL, trnH-psbA psbE-petL, trung bình 28,802%, 45,980% 33,413% Timin (Uracil) chiếm tỷ lệ cao vùng gene lại matK, accD-psaI, ndhA, Rpl32-trnL, trnW-psaJ, trnSGCU-trnGGCC, trung bình thu 34,612%, 34,724%, 34,922%, 35,072%, 33,396% 35,137% Tỷ lệ % (G+C) vùng gene thị lục lạp đạt trung bình dao động từ 24,121% (trnH-psbA) đến 43,476% (rbcL) tỷ lệ vùng gene accD-psaI, ndhA, psbE-petL Rpl32-trnL khơng có sai khác mẫu sen (bảng 3.1) 3.2.2 Kết phân tích đặc tính di truyền 10 vùng gene thị thu từ số mẫu sen trồng Huế Bảng 3.1 Kết phân tích đặc tính phân tử đặc tính di truyền 10 vùng gene thị thu đƣợc từ số mẫu sen trồng Huế Vùng gene ITS4-5 rbcL matK trnH-psbA accD-psaI ndhA psbE-petL Rpl32-trnL trnW-psaJ trnSGCUtrnGGCC Kích Số lƣợng vị thƣớc trí nucleotide (bp) đơn hình 729-744 724 743 742 936 861 350-410 375 887 887 1206 1206 1667 1667 1246 1239 729 728 1097 1095 76 0 0 Tỷ lệ % vị trí nucleotide đa hình 2,688 0,135 8,013 0 0 0,562 0,137 Trung bình % (G+C ) 55,111 43,476 36,000 24,121 30,800 33,900 33,700 30,000 34,200 0,182 31,400 S Eta 75 0 0 1 Ghi chú: S: Số lượng vị trí nucleotide biến đổi; Eta: tổng số đột biến nucleotide Kết phân tích trình tự nucleotide cho thấy có năm vị trí nucleotide đa hình (S) tìm thấy vùng gene ITS4-5 33 mẫu sen, chiếm tỷ lệ 2,688% trình tự nucleotide khuyết từ vị trí 133 đến 147 gồm có 15 nucleotide ACGTCCAGCATTCCA (hình 3.2 bảng 3.1) Số lượng nucleotide khác biệt trung k = 2,688, tương ứng với hệ số đa dạng nucleotide π = 3,140 x10-3 (bảng 3.1 bảng 3.2) Hình 3.2 Kết phân tích so sánh trình tự nucleotide vùng gene thị ITS4-5 số mẫu sen Vùng gene ITS4-5 có chứa vị trí đột biến (Eta) góp phần phân chia 33 mẫu sen thành kiểu đơn bội khác với hệ số đa dạng kiểu đơn bội Hd = 0,458 (bảng 3.1 bảng 3.2) Các vị trí nucleotide có sai khác 10 mẫu sen trắng mẫu sen hồng là: 404 (C-T), 625 (G-A) 626 (A-G), 408 (G-T) 576 (C-A) (hình 3.2) Các vùng gene thuộc hệ gene lục lạp có số lượng vị trí nucleotide biến đổi tổng chiều dài vùng gene thu 33 mẫu sen có khác nhau, dao động từ đến 75 vị trí, tương ứng với tỷ lệ % nucleotide đa hình xuất trình tự nucleotide vùng gene dao động từ đến 8,013% (bảng 3.1) Vùng gene matK có số lượng vị trí nucleotide biến đổi lớn (75 vị trí), có 74 vị trí nucleotide đa hình, chiếm 8,013% (bảng 3.1 hình 3.3) Kết phân tích đặc tính di truyền dựa thông số k, π, S, Eta 33 mẫu sen vùng gene lục lạp có khác nhau, dao động từ 0,061 đến 20,563 (k), 0,080 x10-³ đến 21,970 x10-³ (π), đến 75 (S) đến 76 (Eta) (bảng 3.1 bảng 3.2) Vùng gene rbcL cho thấy thông số thu giá trị thấp (k = 0,061 π = 0,080 x10-³, S = Eta = 1), tiếp đến vùng gene trnH-psbA (k = 0,117 π = 0,330 x10-³), Rpl32-trnL (k = 0,424 π = 0,340 x10-³), trnSGCU-trnGGCC (k = 0,504 π = 0,460 x10-³), trnW-psaJ (k = 0,511 π = 0,700 x10-³) vùng gene matK giá trị thu cao (k = 20,563 π = 21,970 x10-³) (bảng 3.1 bảng 3.2) Hình 3.3 Kết phân tích so sánh trình tự nucleotide vùng gene thị matK số mẫu sen trồng Huế 11 Các mẫu sen phân chia kiểu đơn bội vùng gene thị dao động từ đến kiểu đơn bội, tương ứng với Hd thu dao động từ đến 0,822 (bảng 3.2) Trong vùng gene matK giá trị thu đạt cao tương ứng h = 5, Hd = 0,822 (bảng 3.2) Các vùng gene thị lục lạp rbcL, trnW-psaJ trnSGCU-trnGGCC có chứa đến vị trí nucleotide biến đổi trình tự vùng gene Tỷ lệ % nucleotide đa hình vùng gene 0,135%, 0,137% 0,182% (bảng 3.1) Bảng 3.2 Kết phân tích đặc điểm di truyền 10 vùng gene tổ hợp vùng gene thị thu đƣợc từ số mẫu sen trồng Huế Vùng gene π (x10-3) k Rm h Hd ITS4-5 3,140 2,292 0,458 rbcL 0,080 0,061 0,061 matK 21,970 20,563 0,822 trnH-psbA 0,330 0,117 0,117 accD-psaI ndhA psbE-petL Rpl32-trnL 0,340 0,424 0,061 trnW-psaJ 0,700 0,511 0,511 GCU GCC trnS -trnG 0,460 0,504 0,504 ITS4-5 + rbcL 1,600 2,352 0,477 ITS4-5 + matK 13,730 22,854 0,845 ITS4-5 + Rpl32-trnL 1,380 2,716 0,498 ITS4-5 + trnW-psaJ 1,920 2,803 0,689 ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC 1,530 2,795 0,699 rbcL + matK + Rpl32-trnL + 4,640 22,063 0,869 trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC Ghi chú: π: Đa dạng nucleotide (cho vị trí); k: Số lượng nucleotide khác biệt trung mình; Rm: Số kiện tối thiểu xảy trình tái tổ hợp; h: số lượng kiểu đơn bội; Hd: hệ số đa dạng kiểu đơn bội (gene) Mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 có vị trí nucleotide sai khác trình tự vùng gene Rpl32-trnL so với mẫu sen lại Tỷ lệ % vị trí nucleotide đa hình chiếm 0,562% (hình 3.4B bảng 3.1) Vùng gene Rpl32-trnL có vị trí đột biến hình thành với phân bố mẫu sen kiểu đơn bội không giống nhau, xuất kiểu đơn bội chứa 12 mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 (bảng 3.1) Kết sai khác nucleotide trình tự vùng gene rbcL, trnW-psaJ trnSGCU-trnGGCC làm cho mẫu sen có màu sắc hoa khác phân chia kiểu đơn bội khơng rõ ràng Trong vùng gene rbcL xuất kiểu đơn bội có khác biệt chứa mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 (hình 3.4) A B C D Hình 3.4 Kết phân tích so sánh trình tự nucleotide vùng gene thị số mẫu sen trồng Huế A: vùng gene rbcL, B: vùng gene Rpl32-trnL, C: vùng gene trnW-psaJ D: vùng gene trnSGCU-trnGGCC Vùng gene trnH-psbA với trình tự lặp lại TAAAA có khác biệt mẫu giống sen từ vị trí 242 đến 300, dao động từ đến 19 lần Trong mẫu giống Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) có 13 lần lặp lại trình tự TAAAA vùng gene Số lần lặp lại không xuất mẫu giống sen khác sử dụng nghiên cứu (hình 3.5) Hình 3.5 Kết phân tích so sánh trình tự nucleotide vùng gene thị trnH-psbA số mẫu sen trồng Huế Sự sai khác số lượng trình tự lặp lại ATAAA vùng gene trnHpsbA góp phần phân chia 33 mẫu sen thành kiểu đơn bội khác nhau, 13 xuất kiểu đơn bội chứa hai mẫu sen thuộc nhóm sen hồng SH02 SH13 (bảng 3.2) Các vùng gene accD-psaI, ndhA psbE-petL cho thấy khơng có sai khác nucleotide vùng gene mẫu sen sử dụng nghiên cứu Kết phân tích đặc tính di truyền (k, π, S, Eta) 33 mẫu sen dựa phân tích kết hợp trình tự nucleotide vùng gene ITS4-5 trình tự nucleotide vùng gene thị lục lạp có sai khác nucleotide 33 mẫu sen cho thấy có thay đổi khác so với kết thu phân tích vùng gene chị thị riêng lẻ, dao động từ 2,352 đến 22,854 (k), 1,380 x10-3 đến 13,730 x10-3 (π), đến 85 (S), đến 86 (Eta) (bảng 3.1 bảng 3.2) Kết phân bố mẫu sen kiểu đơn bội có khác nhau, nhiều kiểu đơn bội xuất chiếm ưu số lượng mẫu sen nghiên cứu, dao động từ đến kiểu đơn bội hệ số đa dạng kiểu đơn bội dao động từ 0,477 đến 0,869 (bảng 3.2) Các tổ hợp vùng gene ITS4-5 + rbcL, ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, ITS4-5 + Rpl32-trnL rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC xuất kiểu đơn bội chứa mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 mẫu sen hồng SH06 SH09 Số kiện tối thiểu xảy q trình tái tổ hợp (Rm) khơng tìm thấy vùng gene thị riêng lẻ 33 mẫu sen Sự kiện xảy vài tổ hợp vùng gene ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC (bảng 3.2) Tóm lại Kết phân tích cho thấy vùng gene thị tổng số 10 vùng gene sử dụng nghiên cứu có sai khác nucleotide 33 mẫu sen trồng địa điểm khác Huế Vùng gene matK cho số lượng vị trí nucleotide sai khác 33 mẫu sen lớn nhất, tiếp đến vùng gene ITS4-5, vùng gene Rpl32-trnL thấp vùng gene rbcL Các vùng gene cho thấy khác biệt theo quy luật chung mẫu sen thể qua vị trí nucleotide tương ứng là: ITS4-5: 404 (C-T), 625 (G-A) 626 (A-G), 408 (GT) 576 (C-A); rbcL: 459 (G-T); trnW-psaJ: 504 (T-G); trnSGCU-trnGGCC: 369 (A-0) 545 (A-T); Rpl32-trnL: 885 (C-G), 895 (CATC-ATCA), 920 (A- 14 G) 927 (A-G); matK: 293 (G-A), 323 (G-A-T), 709 (G-T) 819 (T-G) số lượng trình tự lặp lại ATAAA vùng gene trnH-psbA Kết phân tích tính trung lập: Các vùng gene ITS4-5, matK, trnW-psaJ, trnSGCU-trnGGCC tổ hợp ITS4-5 + matK, ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC thu giá trị dương phân tích thống kê D, Fs D *, F * cho thấy mẫu sen xảy hai tượng tần số thấp tần số cao số lượng vị trí đa hình so với kỳ vọng mức trung lập, thiếu hụt allen trình tự nucleotide vùng gene thu từ 33 mẫu sen (bảng 3.3) Trong thời gian gần đây, mẫu sen nghiên cứu xảy trình chọn lọc theo hướng cân bằng, dẫn đến số lượng mẫu sen có xu hướng giảm xuống thời điểm thực nghiên cứu Bảng 3.3 Kết kiểm tra tính trung lập số mẫu sen trồng Huế dựa vùng gene tổ hợp vùng gene thị Vùng gene ITS4-5 rbcL matK trnH-psbA Rpl32-trnL trnW-psaJ trnSGCU-trnGGCC ITS4-5 + rbcL ITS4-5 + matK ITS4-5 + Rpl32-trnL ITS4-5 + trnW-psaJ ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC D 2,291* -1,1404* 0,3664* -0,7924* -2,1793* 1,6264* 1,5804* 1,6484* 0,5434* -0,2614* 2,498* 2,484* D* 1,1354* -1,7134* 1,916** 0,5844* -3,7212* 0,5844* 0,5844* 0,4154* 1,9242* -1,9074* 1,207 4* 1,2074* F* 1,724* -1,7904* 1,648* 0,2314* -3,7972* 1,0074* 0,9924* 0,9194* 1,724* -1,6294* 1,8632* 1,8582* Fs 7,078 -1,290 21,765 -0,521 1,375 1,743 1,712 4,867 20,616 5,628 4,049 4,036 S 0,009 0,977 0,927 0,549 0,458 0,465 0,037 0,020 0,061 0,062 0,1544* 1,2244* 1,0204* 13,157 Ghi chú: Có ý nghĩa thống kê: *, p < 0,05; Có ý nghĩa thống kê: 2*; p < 0,02, Có ý nghĩa thống kê: 3*, p < 0,01, khơng có ý nghĩa thống kê: 4*, p > 0,10; D, Tajima’s statistic; Fs, Fu’s statistic; S, Strobeck’s statistic; D * and F *, Fu and Li’s statistics 15 Trong đó, vùng gene rbcL, Rpl32-trnL, trnH-psbA tổ hợp vùng gene ITS4-5 + Rpl32-trnL cho thấy số lượng vị trí nucleotide đa hình so với kỳ vọng mức trung lập xảy với tần số thấp mẫu sen nghiên cứu Số lượng allen vượt trội làm cho cá thể sen hai nhóm sen có xu hướng chia nhỏ thay đổi sau kiện nút thắt cổ chai tác động trình quét chọn lọc từ trình giang di truyền làm cho số lượng quần thể sen có xu hướng tăng lên thời điểm thực nghiên cứu Những nhận định thể thông qua giá trị âm giá trị dương thu từ phân tích thống kê D, Fs D *, F * (bảng 3.3) Tuy nhiên, kết phân tích xác suất quan sát toàn phạm vi kiểu đơn bội chọn lọc ngẫu nhiên cho thấy đa số vùng gene tổ hợp vùng gene thị thu từ 33 mẫu sen cho giá trị S thấp (S < 0,5), dao động từ 0,000 đến 0,465 Kết cho thấy xuất số kiểu đơn bội chiếm ưu số lượng mẫu sen nghiên cứu xác suất nhận tất kiểu đơn bội thấp theo chọn lọc ngẫu nhiên Các vùng gene rbcL, trnH-psbA, Rpl32-trnL thu giá trị S cao, dao động từ 0,549 đến 0,977 cho thấy xuất số kiểu đơn bội chứa đến mẫu sen có khác biệt di truyền lớn so với mẫu sen lại (bảng 3.3) 3.3 Kết phân tích đặc tính di truyền nhóm sen trắng nhóm sen hồng dựa tổ hợp vùng gene thị lục lạp Tỷ lệ % (G+C) chứa tổ hợp vùng gene lục lạp khơng có khác biệt lớn hai nhóm sen, 33,4% (sen trắng) 33,5% (sen hồng) Kết phân tích thơng số di truyền k, π, S, Eta nhóm sen trắng thu kết giá trị thấp so với nhóm sen hồng Nhóm sen trắng phân chia thành kiểu đơn bội khác nhau, tương ứng Hd = 0,618 nhóm sen hồng phân chia thành kiểu đơn bội khác nhau, tương ứng Hd = 0,818 (bảng 3.4) Bảng 3.4 Kết phân tích đặc tính di truyền nhóm sen trắng nhóm sen hồng Nhóm Sen trắng Sen hồng n 11 22 % (G+C) 33,400 33,500 S 84 Eta 85 h Hd 0,618 0,818 k 1,564 29,082 π (x10-3) 0,180 3,280 16 Kết phân tích thống kê D, D * F * nhóm sen trắng cho thấy số lượng vị trí nucleotide đa hình so với kỳ vọng mức trung lập xảy với tần số thấp mẫu sen Trong thời gian gần đây, trình tự tổ hợp vùng gene có nhiều biến thể nucleotide xuất làm gia tăng số lượng kiểu đơn bội, số lượng quần thể có xu hướng tăng lên chia nhỏ số lượng mẫu sen nhóm sen nghiên cứu tác động chọn lọc Các nhận định thể thông qua giá trị âm thu phân tích thống kê D, D * F * giá trị dương thu Fs (bảng 3.5) Trong đó, nhóm sen hồng, mẫu sen xảy hai tượng tần số thấp tần số cao số lượng vị trí đa hình so với kỳ vọng mức trung lập, có thiếu hụt allen trình tự nucleotide tổ hợp vùng gene thị lục lạp 33 mẫu sen Trong thời gian gần đây, mẫu sen xảy trình chọn lọc khắc khe, dẫn đến số lượng mẫu sen có xu hướng giảm xuống thời điểm thực nghiên cứu Các nhận định thể thông qua giá trị dương thu từ thống kê D, D * F * (bảng 3.5) Bảng 3.5 Kết kiểm tra tính trung lập nhóm sen trắng nhóm sen hồng Nhóm Sen trắng Sen hồng Fs 1,545 14,465 D - 0,322* 0,993* D* - 0,764* 1,134* F* - 0,736* 1,277* S 0,446 Tuy nhiên, xác suất quan sát toàn phạm vi kiểu đơn bội chọn lọc ngẫu nhiên hai nhóm sen thu giá trị S thấp (S < 0,5), dao động từ đến 0,446 (bảng 3.5) Giá trị Fst với khoảng cách di truyền lớn quan sát hai nhóm sen 0,00233 (p < 0,05) (bảng 3.6) Giá trị cho thấy khác biệt di truyền khơng đáng kể hai nhóm sen nghiên cứu thu địa điểm khác Huế Bảng 3.6 Kết giá trị Fst nhóm sen trắng nhóm sen hồng Nhóm Sen trắng Sen hồng Sen trắng 0,00233* Sen hồng 0,00032 - Ghi chú: Giá trị Fst có ý nghĩa p < 0,05; -: khơng có liệu 17 3.4 Phân tích q trình tiến hóa số mẫu sen trồng Huế dựa 10 vùng gene thị 3.4.1 Chỉ thị vùng gene nhân Kết phát sinh chủng loại xây dựng dựa vùng gene thị ITS4-5 cho thấy, mẫu sen thuộc nhóm chúng có quan hệ di truyền gần gủi tách riêng thành nhánh tiến hố riêng biệt (hình 3.6) Hình 3.6 Cây quan hệ phát sinh dựa vùng gene thị ITS4-5 số mẫu sen trồng Huế 3.4.2 Chỉ thị vùng gene lục lạp Kết xây dựng phát sinh chủng loại dựa vùng gene thị lục lạp riêng lẽ cho thấy 33 mẫu sen có phân hố di truyền chưa thể rõ ràng chúng phân chia nhánh khác nhau, ngoại trừ mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 mẫu Sen Hồng Cao sản SH09 (phụ lục 5.1-5.8) Hình 3.7 Cây quan hệ phát sinh dựa tổ hợp vùng gene thị có sai khác nucleotide số mẫu sen trồng Huế Các mẫu sen nghiên cứu có phân chia nhánh tiến hoá thể rõ ràng hơn, xuất nhiều kiểu đơn bội chứa mẫu sen 18 nhóm sen nghiên cứu có phân tích kết hợp hay nhiều trình tự nucleotide vùng gene thị lại với ITS4-5 + trnW-psaJ, ITS4-5 + trnSGCU-trnGGCC, ITS4-5 + rbcL, ITS4-5 + Rpl32-trnL tổ hợp rbcL + matK + Rpl32-trnL + trnW-psaJ + trnSGCU-trnGGCC tổ hợp rbcL + matK + trnH-psbA + accD-psaI + ndhA + psbE-petL + Rpl32-trnL + trnWpsaJ + trnSGCU-trnGGCC (phụ lục 5.1 đến phụ lục 5.8, hình 3.7 hình 3.8) Hình 3.8 Cây quan hệ phát sinh dựa tổ hợp vùng gene thị lục lạp số mẫu sen trồng Huế Các mẫu Sen Hồng Cao Sản SH06 SH09 phân bố thành nhánh phụ riêng biệt có khoảng cách di truyền khác biệt lớn so với mẫu sen hồng phân bố nhánh với nhau, mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 có khoảng cách di truyền lớn Mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 tách thành nhóm phụ có khoảng cách di truyền lớn mẫu sen trắng lại phân bố nhánh Mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 thuộc nhóm sen địa phương thu hồ Tịnh Tâm, phường Thuận Lộc, thành phố Huế Đối với người dân trồng sen lợi ích kinh tế, sen trắng giống sen ưu tiên lựa chọn vừa khai thác hoa hạt với giá thành cao Hạt sen trắng tiếng với hương vị thơm ngon mà giống sen khác khơng có Mặt khác, Theo Nguyễn Thị Quỳnh Trang cs (2017), nhóm tác giả xác định giống Sen Trắng Trẹt Lõm giống sen địa phương có giá trị màu sắc hoa, suất, chất lượng có tiềm sản xuất để bảo tồn, khai thác phát triển Bên cạnh đó, theo nghiên cứu Lê Công Sơn (2008), giống Sen Trắng 19 Trẹt Lõm giống đặc trưng Huế, có màu hoa trắng, nụ hoa dài, chóp nhọn, gương phẳng, lõm, hạt nhỏ nhiều trọng trồng di tích Huế thuộc khu vực nội thành, thành phố Huế Chúng ví biểu tượng văn hóa ý nghĩa lịch sử mà mang lại Chính đặc điểm ưu việt đó, khác biệt đặc trưng khoảng cách di truyền dựa mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 dựa trình tự nucleotide 10 vùng gene thị so với mẫu sen khác nghiên cứu, chọn mẫu giống Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 để thu hoạch hạt sen làm nguyên liệu tiến hành thí nghiệm chiết tách, phân lập đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất tinh khiết cần thiết để phục vụ cho việc khai thác tiềm sen bảo tồn giống sen quý 3.5 Kết khảo sát dung môi chiết cao tổng số từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Trong 100 g nguyên liệu bột hạt Sen Trắng Trẹt Lõm, cao tổng số thu dung môi nước ethanol với nồng độ khác có khác nhau, dao động từ 0,604 đến 1,703 g Trong đó, dung mơi ethanol nồng độ 70% cho hiệu thu cao tổng số, nhóm hợp chất alkaloid flavonoid cao nhất, chiếm 1,703 g (bảng 3.7) Bảng 3.7 Kết chiết cao tổng số, định tính alkaloid flavonoid từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Dung môi Nước Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Ethanol 96% Hàm lƣợng cao tổng số (g) 0,865c ± 0,057 1,142d ± 0,061 1,161d ± 0,009 1,703e ± 0,068 0,783b ± 0,009 0,604a ± 0,011 Alkaloid + + ++ +++ ++ ++ Flavonoid + + ++ +++ ++ ++ Chi chú: + : biểu yếu; ++: biểu trung bình; +++: biểu mạnh; Các chữ khác hàng sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 3.6 Kết định tính định lƣợng alkaloid flavonoid số cao chiết thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Kết định lượng alkaloid flavonoid thể bảng 3.8 cho thấy phân đoạn n-Bu cho hàm lượng alkaloid cao chiếm 209,667 mg NU/g cao tinh 20 phân đoạn NE cho hàm lượng flavonoid cao chiếm 414,300 mg CE/g cao tinh (bảng 3.8) Từ kết tiếp tục chọn phân đoạn n-Bu để thực trình phân lập hợp chất tinh khiết Bảng 3.8 Kết định lƣợng alkaloid flavonoid cao tổng số cao phân đoạn tinh thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Phân đoạn Cao tổng số NE n-Bu NP P flavonoid toàn phần (mg CE/g) 19,790b ± 0,385 414,300d ± 1,500 118,000c ± 11,456 9,050a ± 0,250 6,550a ± 0,250 alkaloid toàn phần (mg NU/g) 0,718a ± 0,041 52,571d ± 0,025 209,667e ± 0,041 6,676b ± 0,004 6,771c ± 0,019 3.7 Kết phân lập hợp chất tinh khiết phân đoạn n-B thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Kết phân PĐ3, PĐ4 PĐ5 phân lập thu hợp chất có ký hiệu NH2 (136 mg), NH8 (150 mg) NH11 (217 mg) Giá trị Rf thu tương ứng 0,651, 0,724 0,651 Cả hợp chất cho mầu nâu đỏ đặc trưng alkaloid nhuộm với Bouchardat sấy 105oC (bảng 3.9) Bảng 3.9 Kết tính chất hợp chất phân lập từ phân đoạn nBu hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Ký Khối lƣợng hiệu (mg) NH2 136 NH8 150 NH11 217 Hệ dung môi CHCl3:Acetone:MeOH (50:50:0,5) CHCl3:MeOH:NH4OH (96:4:0,5) CHCl3:MeOH:NH4OH (96:4:0,5) Thuốc thử Rf Biều màu Bouchardat 0,651 Màu nâu đỏ Bouchardat 0,724 Màu nâu đỏ Bouchardat 0,651 Màu nâu đỏ Kết phân tích phổ khối lượng dựa phương pháp HPLC-MS/MS hợp chất tinh khiết thể bảng 3.10 phụ lục 6.2 đến 6.4 cho thấy sau: Khối phổ phân giải cao ghi nhận ion dương [M+H]+ hoạt chất NH2 : m/z = 318,9372 tương ứng [C19H21NO2 + H]+ ; NH8 : m/z = 314,1750 tương ứng [C19H23NO3 + H]+ NH11 : m/z = 266,1595 tương ứng [C17H15NO2 + H]+ phù hợp với công thức phân tử C19H21NO2 , C19H23NO3 C17H15NO2 tương ứng 21 Bảng 3.10 Kết phân tích phổ khối lƣợng hợp chất tinh khiết Ký Thời gian Công hiệu lƣu thức phân (TR, min) tử NH2 12,065 C19H21NO2 NH8 5,686 C19H23NO3 NH11 9,620 C17H15NO2 Chất dự đoán Nuciferine m/z Lỗi [M+H]+ [M+H]+ (ppm) 296,971 >5 Armepavine 314,175 1,9 Anonaine 266,160 >5 m/z MS/MS phân mãnh ion 233,9; 250,1; 265,2; 296,2 107; 145,2; 173,9; 189,3; 239,1; 251,1; 268,2; 314,1 178,3; 189; 190; 191; 219 Kết phân tích MS/MS phân mãnh ion chế độ đo ion dương liệt kê bảng 3.10 Khi so sánh đối chiếu phổ liệu NIST2017 hoạt chất thiên nhiên tài liệu tham khảo xác định hoạt chất NH2 chất Nuciferine; NH8 chất Armepavine NH11 chất Anonaine (bảng 3.10) Kết tương tự kết công bố Deng cs (2016); Xu cs (2011); Zou cs (2019); Tan cs (2021); Lima cs (2020) Gontijo cs (2018) 3.8 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học 3.8.1 Hoạt tính kháng oxy hóa Kết cho thấy nồng độ 100 mg/mL cao chiết tổng ethanol 70% thu từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm cho khả bắt gốc tự DPPH cao đạt giá trị 82,333%, tương ứng với giá trị IC50 = 6,931 mg/mL (bảng 3.11) Bảng 3.11 Kết hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao chiết tổng ethanol 70% thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm Nồng độ cao chiết (mg/mL) 100 50 25 12,5 IC50 Sen Trắng Trẹt Lõm 82,333d ± 0,577 65,000c ± 2,000 56,333b ± 1,527 51,667a ± 1,155 6,931 ± 2,614 Nồng độ chất chuẩn (µg/mL) 10 0,4 0,08 IC50 Acid ascorbic 99,333d ± 1,155 67,667c ± 1,528 51,333b ± 2,527 15,667a ± 3,512 1,734 ± 0,151 Kết thể hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn n-Bu từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm hệ DPPH cho thấy rằng: Ở nồng 22 độ 100 µg/mL, nuciferine chất cho hoạt tính bắt gốc tự DPPH lớn (trung bình 94,620%), tiếp đến armepavine (74,019%) anonaine (61,151%) Giá trị IC50 thu 30,031 µg/mL (nuciferine), 43,093 µg/mL (armepavine) 68,217 µg/mL (anonaine) (bảng 3.12) Bảng 3.12 Kết hoạt tính bắt gốc tự DPPH hợp chất tinh khiết Nồng độ (µg/mL) 100 20 0,8 IC50 Nuciferine 94,620d ± 0,657 46,894c ± 3,329 35,587b ± 2,725 25,916a ± 1,340 30,031 ± 1,506 Hợp chất Armepavine Anonaine 74,019c ± 2,400 61,151d ± 2,349 39,827b ± 3,324 37,368c ± 2,028 33,750b ± 6,236 27,928b ± 3,975 16,722a ± 3,133 15,003a ± 2,256 43,093 ± 14,215 68,217 ± 6,214 Acid ascorbic 99,483d ± 0,896 68,172c ± 1,561 51,822b ± 2,607 16,059a ± 3,414 1,734 ± 0,151 Ghi chú: acid ascorbic hoạt động dãi nồng độ 0,08; 0,4; 10 µg/mL 3.8.2 Hoạt tính gây độc số dịng tế bào ung thư Cao chiết tổng ethanol 70% điều kiện in vitro thể khả gây độc dòng tế bào ung thư khảo sát mức độ trung bình với giá trị IC50 giao động từ 37,330 µg/mL đến 61,06 µg/mL gây độc tế bào HEK-293A nồng độ khảo sát Cao chiết cho hiệu tác dụng ức chế tốt dòng tế bào ung thư tiền liệt người LNCaP (IC50 = 37,330 µg/mL) (bảng 3.13) Bảng 3.13 Kết giá trị IC50 cao chiết tổng ethanol 70% thu đƣợc từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm LNCaP HepG2 MCF7 Hela SK-LU-1 MKN7 SW480 KB SK-Mel2 Cao chiết tổng ethanol 70% IC50 (µg/mL) 37,330 ± 3,950 54,110 ± 5,580 47,550 ± 0,410 48,020 ± 3,660 52,410 ± 5,370 57,450 ± 5,020 50,490 ± 3,740 61,060 ± 6,530 56,450 ± 2,310 Chất chuẩn Ellipticine IC50 (µg/mL) 0,450 ± 0,010 0,490 ± 0,020 0,480 ± 0,040 0,410 ± 0,020 0,360 ± 0,020 0,400 ± 0,040 0,440 ± 0,050 0,450 ± 0,030 0,480 ± 0,050 HL-60 HEK-293A 45,990 ± 4,280 >100 0,410 ± 0,040 0,40 ± 0,020 Dòng tế bào 23 Ở bảng 3.14 cho thấy tất hợp chất chưa thể hoạt tính gây độc nồng độ nghiên cứu lên dòng tế bào khảo sát, giá trị IC50 chưa thể xác định dải nồng độ nghiên cứu Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm (bảng 3.14) Bảng 3.14 Kết giá trị IC50 hợp chất tinh khiết Hoạt chất (µg/mL) Nuciferine Armepavine Anonaine Ellipticine MKN7 >100 >100 >100 0,360 ± 0,030 Dòng tế bào KB SK-Mel-2 >100 >100 >100 >100 >100 >100 0,360 ± 0,030 0,300 ± 0,030 HEK-293A >100 >100 >100 0,40 ± 0,020 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đề tài luận án, rút số kết luận sau: - Xác định kích thước vùng gene thị thu từ 33 mẫu sen khác Huế dao động từ 350 đến 1667 bp Hai vùng gene ITS4-5 trnH-psbA có thay đổi kích thước mẫu sen nghiên cứu, dao động từ 729 đến 744 bp (ITS4-5) từ 351 đến 410 bp (trnH-psbA) Các mẫu sen có mức độ tương đồng cao với lồi N nucifera - Trình tự nucleotide vùng gene thị thu từ 33 mẫu sen ký gửi GenBank với mã số ITS4-5 (MT903421 đến MT903453), rbcL (MN011708 đến MN068956), matK (MN011719 đến MN068978), trnHpsbA (MN011730 đến MN086252), accD-psaI (MN086253 đến MN086285), psbE-petL (MT901764 đến MT901796), Rpl32-trnL (MT901731 đến MT901763), trnW-psaJ (MT905225 đến MT905257), trnSGCU-trnGGCC (MT905258 đến MT905290) ndhA (MZ611976 đến MZ612008) - Xác định vùng gene thị có sai khác nucleotide 33 mẫu sen thu địa điểm trồng sen khác Thừa Thiên Huế Các vùng gene có sai khác theo quy luật chung mẫu sen thể qua vị trí nucleotide tương ứng là: ITS4-5: 404 (C-T), 625 (G-A) 626 (A-G), 408 (G-T) 576 (C-A); rbcL: 459 (G-T); trnW-psaJ: 504 (T-G); trnSGCUtrnGGCC: 369 (A-0) 545 (A-T); Rpl32-trnL: 885 (C-G); 895 (CATC- 24 ATCA); 920 (A-G) 927 (A-G); matK: 293 (G-A) 323 (G-A-T) 709 (G-T) 819 (T-G) số lượng trình tự lặp lại ATAAA vùng gene trnH-psbA - Xác định quan hệ phát sinh dựa tổ hợp vùng gen thị hệ gen lục lạp có sai khác trình tự nucleotide 33 mẫu sen trồng Huế Từ đó, tuyển chọn mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) giống sen địa Huế, có mối quan hệ di truyền khác biệt đặc trưng, có khoảng cách di truyền lớn mẫu sen lại tách riêng thành nhánh tiến hóa riêng biệt Mẫu sen tuyển chọn để làm nguồn nguyên liệu nghiên cứu tách chiết hợp chất tinh khiết đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất tách chiết hạt sen - Kết cao chiết tổng ethanol 70% từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm cho hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao, giá trị IC 50 = 6,931 mg/mL Hoạt tính gây độc lên 10 dịng tế bào ung thư khảo sát cao chiết tổng ethanol 70% mức trung bình, IC50 dao động từ 37,330 µg/mL đến 61,06 µg/mL Cao chiết tổng ethanol 70% có hoạt tính gây độc tốt dịng tế bào ung thư tiền liệt người LNCaP, với giá trị IC50 37,330 µg/mL - Phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-Bu từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm có chất alkaloid: nuciferine (NH2:C19H21NO2), armepavine (NH8:C19H23O3N), anonaine (NH11:C17H15NO2) Hoạt tính bắt gốc tự DPPH thể cao hợp chất, tương ứng IC50 thu hợp chất 30,031 µg/mL (nuciferine), 43,093 µg/mL (armepavine) 68,217 µg/mL (anonaine) Hoạt tính gây độc hợp chất thử nghiệm dòng tế bào ung thư MKN7, SK-Mel-2 KB hiện, giá trị ức chế mức 50% (IC50) chưa thể xác định dải nồng độ từ 0,8; 4; 20 100 µg/mL 4.2 Kiến nghị Từ số kết thu được, đưa số kiến nghị sau: Tăng số lượng vùng gene, tăng số lượng mẫu sen mở rộng địa điểm thu mẫu để đánh giá khách quan xác mức độ khác biệt di truyền loài sen N nucifera trồng Huế Tiếp tục nghiên cứu phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất có hạt Sen Trắng Trẹt Lõm 25 [1] [2] [3] [4] [5] [6] DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Dang Thanh Long, Hoang Thi Kim Hong, Nguyen Thị Quynh Trang, Le Ly Thuy Tram, Nguyen Van Hiep, Nguyen Phan Thuy Tien (2019), “Genetic diversity analysis of Lotus species (Nelumbo nucifera gaertn.) in Thua Thien Hue based on ITS4-5 genetic region”, Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology, 20(23&24), pp 1160-1171 Dang Thanh Long, Hoang Thi Kim Hong, Nguyen Thị Quynh Trang, Le Ly Thuy Tram, Nguyen Phan Thuy Tien; Nguyen Thi Ngoc Hanh (2020), “Study of the procedure for bath ultrasound-assisted extraction of total flavonoid from Lotus seeds and testing some biological activities”, Indian Journal of Agricultural Research, 54(5), pp 563-570 Dang Thanh Long, Hoang Thi Kim Hong, Le Ly Thuy Tram, Nguyen Thi Quynh Trang (2021), “Evalution of genetic diversity by DNA barcoding of local Lotus populations from Thua Thien Hue province”, Indian Journal of Agricultural Research, 55(2), pp 121-128 Dang Thanh Long, Hoang Thi Kim Hong, Le Ly Thuy Tram (2022), “ Research on phylogenetic relationship of Lotus populations collected in Thua Thien Hue province, Vietnam based on the chloroplast genome by DNA barcode,” Indian Journal of Agricultural Research, 56(3), pp 249-254 Dang Thanh Long, Hoang Thi Kim Hong, Le Ly Thuy Tram (2022), “Analysis genetic variation and phylogenetic relationships of local Lotus collecred in Thua Thien Hue province, Vietnam by DNA barcoding”, Resaarch Journal of Biotechnology, 17(2), pp 48-56 Long Dang Thanh, Quang Hoang Tan, Trang Nguyen Thi Quynh and Hoang Thi Ngoc Han (2022), “Study on the isolation and bioactivity assay of some compounds from Nelumbo nucifera Gaertn seeds collected at Tinh Tam Lake, Thua Thien Hue, Vietnam”, Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology, 23(21&22), pp 42-53