Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm sau thu hoạch vải

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH VẢI” Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH VẢI” Sinh viên : Nguyễn Thị Lan MSV : 637036 Lớp : K63CNSHA Khoa : Công nghệ sinh học Giảng viên HD : Th.S Trịnh Thị Thu Thủy Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận hồn tồn đƣợc hồn thiện tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân dƣới hƣớng dẫn ThS Trịnh Thị Thu Thủy giảng viên khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết đƣợc trình bày khóa luận tốt nghiệp hồn tồn trung thực, khơng chép cơng trình nghiên cứu ngƣời khác mà không rõ nguồn tham khảo Các tài liệu tham khảo đƣợc sử dụng khoá luận đƣợc liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc Hội đồng chấm khố luận tốt nghiệp Học viện Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Lan i LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô Học viện Nông nghiệp Việt Nam đặc biệt thầy cô khoa Công nghệ sinh học Học viện tạo điều kiện cho em thực tập khoa để có nhiều thời gian cho khóa luận tốt nghiệp Và em xin chân thành cám ơn Trịnh Thị Thu Thủy nhiệt tình hƣớng dẫn hƣớng dẫn em hồn thành tốt khóa thực tập Trong trình thực tập làm báo cáo thực tập, kiến thức nhƣ kinh nghiệm thực tế cịn nhiều hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy, để em học hỏi đƣợc nhiều kĩ năng, kinh nghiệm hoàn thành tốt báo cáo tốt nghiệp tới Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Lan ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT ix I Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thực trạng phế phụ phẩm sau thu hoạch vải 2.1.1 Sản lƣợng thực trạng phế phụ phẩm nông nghiệp 2.1.2 Sản lƣợng phụ phẩm sau thu hoạch vải 2.2 Thành phân nguyên liệu có vải 2.2.1 Thành phần Cellulose 2.2.2.Thành phần Lignin 12 2.2.3.Thành phần Hemicellulose 18 2.3 Một số hƣớng tái sử dụng phụ phẩm nông nghiệp 20 2.4 Tình hình nghiên cứu chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp giới nƣớc 22 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 22 2.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 2.4.3 Các chế phẩm vi sinh có mặt thị trƣờng 25 III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 iii 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 30 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 30 3.2 Đối tƣợng nghiên cứu 30 3.3 Nội dung nghiên cứu 30 3.3.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất phịng thí nghiệm 30 3.3.3 Hóa chất 31 3.4 Môi trƣờng 31 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 3.5.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính Cellulose, Lignin 32 3.5.2 Xác định hoạt độ enzyme Cellulase 33 3.5.3 Xác định hoạt độ enzyme Lignin peroxidase 34 3.5.4 Đánh giá đặc điểm hình thái 35 3.5.5 Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn trình tự gene mã hóa vùng 16S rRNA 35 3.5.6 Phân lập chế phẩm Trichoderma Bacillus chế phẩm Sumitri 37 3.5.7 Xác định hàm lƣợng chất khơ có mẫu 38 3.5.9 Đánh giá ảnh hƣởng chủng vi khuẩn đến loại nguyên liệu vải 41 3.5.10 Xây dựng công thức đánh giá phân hủy phế phụ phẩm vải 41 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết sàng lọc đánh giá hoạt tính enzyme cellulase, lignin peroxidase chủng vi khuẩn 43 4.1.1 Đánh giá hoạt tính emzyme Cellulase 43 4.1.2 Xác định hoạt độ enzyme Cellulase 44 4.1.3 Đánh giá hoạt tính enzyme Lignin peroxidase 45 4.1.4 Xác định hoạt độ enzyme Lignin peroxidase 46 4.2 Định danh chủng có hoạt tính cellulase lignin peroxidase đƣợc lựa chọn 47 4.2.1 Đánh giá đặc điểm hình thái 47 iv 4.2.2 Định danh chủng vi khuẩn trình tự gen mã hóa 16S rRNA 49 Bacillus sp 50 Klebsiella pneumoniae 50 4.5 Đánh giá khả phân hủy cellulose, lignin chủng vi khuẩn 51 4.5.1 Xác định thành phần nguyên liệu có phụ phẩm sau thu hoạch vải 51 4.5.2 Đánh giá ảnh hƣởng chủng vi khuẩn tác động đến loại nguyên liệu vải 51 4.5.3 Xây dựng công thức đánh giá phân hủy phế phụ phẩm vải 53 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các hóa chất đƣợc sử dụng 31 Bảng 3.2 Các môi trƣờng cấy 31 Bảng 3.3 Đƣờng chuẩn Glucose 33 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 37 Bảng 3.5 Giá trị d theo Va 40 Bảng 4.1 Hoat tính enzyme cellulase chủng vi khuẩn 44 Bảng 4.2 Hoạt độ Cellulase chủng vi khuẩn 44 Bảng 4.3 Hoạt độ enzyme Lignin peroxidase 46 Bảng 4.4 Kết giải trình tự 50 Bảng 4.5 Thành phần nguyên liệu có vải 51 Bảng 4.6 Kết bổ sung vi khuẩn vào đống ủ 52 Bảng 4.8 Kết công thức ủ với phụ phẩm 53 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh cấu trúc cellulose (Duarte, 2015) Hình 1.2 Quá trình phân giải cellulose enzyme cellulase (Sang Uk Park cs, 2014) Hình 1.3 Cấu trúc phân tử Lignin (Jiang-Meng Yuan, 2002) 12 Hình 1.4 Cơ chế hoạt động Lignin peroxidase (Camerero cs, 1999) 14 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động Mangan peroxidase (Camerero cs, 1999) 15 Hình 1.6 Cấu trúc hoạt động Laccase (Kaczmarek MB, 2017) 16 Hình 1.7 Cấu trúc phân tử Hemicellulose 19 Hình 1.8 Chế phẩm EMIC 25 Hình 1.9 Chế phẩm EMUNIV 26 Hình 1.10 Chế phẩm Sumitri 27 Hình 1.11 Chế phẩm EM1 28 Hình 1.12 Chế phẩm Trichoderma 29 Hình 4.1 Hoạt tính enzyme cellulase chủng vi khuẩn 43 Hình 4.2 Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose 44 Hình 4.3 Hoạt tính Lignin peroxidase chủng vi khuẩn 45 Hình 4.4 Hình thái chủng DV2-1 47 Hình 4.5 Hình thái chủng EM1 48 Hình 4.6 Hình thái chủng D3-3 48 Hình 4.7 Hình thái chủng R4 49 Hình 4.8 Hình ảnh điện di DNA tổng số 49 Hình 4.9 Kết chạy điện di 50 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) CMC Carboxymethyl cellulose DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid LB Luria Bertani Broth LiP Lignin peroxidase MnP Mangan peroxidase PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SHPT Sinh học phân tử U Unit VP Versatile peroxidase (Peroxidase đa năng) VSV Vi sinh vật ĐC Đối chứng cs Cộng viii Hình 4.7 Hình thái chủng R4 Ghi chú: (A) - Hình thái khuẩn lạc sau 24h ni cấy; (B) - Hình thái tế bào Chủng vi khuẩn R4 có dạng khuẩn lạc màu trắng đục, trịn, mặt lồi, bên có nhân Kết nhuộm Gram bắt màu tím cho thấy vi khuẩn thuộc dạng Gram (+) có dạng hình que ngắn 4.2.2 Định danh chủng vi khuẩn trình tự gen mã hóa 16S rRNA  Kết tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết đƣợc kiểm tra cách chạy điện di agarose 1% có bổ sung redsafe Hình 4.8 Hình ảnh điện di DNA tổng số Kết điện DNA tổng số cho thấy băng vạch sáng, không bị gãy chứng tỏ DNA chủng vi khuẩn đảm bảo chất lƣợng để tiến hành phản ứng PCR 49  Kết chạy PCR Tiến hành chạy PCR với cặp mồi 27F 1492R, sau điện di sản phẩm sau PCR gel agarose 2% với hiệu điện 120V vịng 20 phút Hình 4.9 Kết chạy điện di 1400bp Ghi chú: Kích thƣớc sản phẩm 1400bp Sau trình điện di mẫu với ký hiệu mẫu cho băng vạch sáng rõ, thang chuẩn đƣợc sử dụng ladder 1kb, kích thƣớc sản phẩm dự đốn khoảng 1400bp Điều cho thấy đoạn gen đƣợc khuếch đại thành công với thành phần phản ứng chu trình nhiệt trình bày bảng 3.4 Các mẫu PCR đƣợc gửi giải trình tự vùng 16S rARN so sánh trình tự với trình tự gen khác ngân hàng GenBank qua cơng cụ Blast  Kết giải trình tự so sánh ngân hàng GenBank Bảng 4.4 Kết giải trình tự Name Gene bank Accession code Identily(%) DV2-1 Bacillus subtilis AB726089.1 99,57% EM1 Bacillus licheniformis EF601577.1 99,04% D3-3 Bacillus sp MK120028.1 99,26% R4 CP033901.1 99,10% Klebsiella pneumoniae Kết giải trình tự đƣợc Blast để định danh so sánh ngân hàng 50 GenBank, trình tự chủng vi khuẩn có độ tƣơng đồng cao Dựa vào bảng cho thấy chủng DV2-1, EM1, D3-3 thuộc chi Bacillus, R4 thuộc chi Klebsiella Các chủng có khả sinh enzyme cellulase phân hủy hiệu phụ phẩm sau thu hoạch vải Kết phù hợp với nghiên cứu Kim cs (2012) dòng Bacillus subtilis phân lập từ môi trƣờng đất nông nghiệp có khả phâ hủy cellulose mạnh 4.5 Đánh giá khả phân hủy cellulose, lignin chủng vi khuẩn 4.5.1 Xác định thành phần nguyên liệu có phụ phẩm sau thu hoạch vải Tiến hành xác định thành phần vải cellulose lignin Để đánh giá đƣợc hiệu phân hủy chủng vi sinh vật, cần xác định phần trăm trƣớc ủ tất mẫu phế phụ phẩm Bảng 4.5 Thành phần nguyên liệu có vải Mẫu phụ phẩm Lignin (%) Cellulose (%) Chất khô (%) Lá 21,48 35,00 90,00 Cành 21,94 35,50 91,50 Vỏ 29,44 33,00 89,50 T0 25,14 45,25 92,50 Cây vải có thành phần cellulose, lignin thành phần khác nhƣ hemicellulose Tổng chất có vải đƣợc xác định qua phƣơng pháp trọng lƣợng theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 1867:2010 Hàm lƣợng chất khơ có vải vào khoảng 89% đến 92%, cành vải cao chiếm tới 91,50%, sau đến vải chiếm 90% đến vỏ vải chiếm 89,50% hàm lƣợng chất khơ có vải Theo nghiên cứu Latika Bhatia cộng (2014) xác định thành phần vỏ vải bao gồm 40 ± 0.38% cellulose, 28 ± 0.18% hemicellulose 25 ± 0.31% lignin Hai kết khác sử dụng phƣơng pháp khác để xác định thành phần sai số trình thực thí nghiệm 4.5.2 Đánh giá ảnh hƣởng chủng vi khuẩn tác động đến loại nguyên liệu vải Để đánh giá ảnh hƣởng chủng vi khuẩn lên loại nguyên 51 liệu phụ phẩm vải tiến hành thí nghiệm ủ mẫu (10g/mẫu) cách ủ chủng vi khuẩn với mẫu phụ phẩm; ủ enzyme với phụ phẩm, đối chứng mẫu ủ với nƣớc cất ủ mẫu với chế phẩm Trichoderma Bacilus, chế phẩm Sumitri với mẫu phế phụ phẩm điều kiện bình thƣờng, thời gian ngày với độ ẩm 50% Sau kết thúc thí nghiệm, tiến hành xác định lại thành phần phần trăm nguyên liệu so sánh với phần trăm ban đầu Bảng 4.6 Kết bổ sung vi khuẩn vào đống ủ Lá Mẫu Cành Vỏ Cellulose Lignin Cellulose Lignin Cellulose Lignin phụ phẩm (%) (%) (%) (%) (%) (%) ĐC 0,50 0,09 0,20 0,55 0,25 0,34 Trichoderma 3,00 4,69 2,75 4,60 3,20 6,30 Sumitri 2,50 1,81 3,00 2,90 2,70 4,83 Chủng DV2.1 1,00 2,09 2,00 3,99 2,20 8,05 Chủng EM1 3,50 4,15 3,25 4,34 2,75 4,96 Chủng D3.3 1,50 1,27 1,20 2,55 1,50 4,55 Chủng R4 2,50 2,99 2,50 4,61 2,75 2,08 Bảng 4.7 Kết bổ sung enzyme vào đống ủ Mẫu phế phụ phẩm Lá Cành Vỏ Cellulose Lignin Cellulose Lignin Cellulose Lignin (%) (%) (%) (%) (%) (%) ĐC 0,50 0,09 0,20 0,55 0,25 0,34 Trichoderma 3,00 4,69 2,75 4,60 3,20 6,30 Sumitri 2,50 1,81 3,00 2,90 2,70 4,83 Chủng DV2.1 1,50 1,54 1,75 2,90 1,75 5,75 Chủng EM1 2,50 3,26 3,00 3,45 2,5 3,47 Chủng D3.3 1,00 1,00 1,50 2,41 1,25 3,89 Chủng R4 2,00 2,44 2,25 4,34 2,25 1,25 52 Từ kết thu đƣợc bảng ta thấy phụ phẩm vải đƣợc ủ với vi khuẩn cho kết phân giải hàm lƣợng cellulose hàm lƣợng lignin cao ủ phế phẩm với enzyme Hàm lƣợng cllulose, lignin giảm 2-5% so với trƣớc ủ với vi khuẩn, chủng EM1 cho kết giảm tốt lên đến 5% vỏ, chế phẩm Trichoderma Bacillus cho kết cao so với trƣớc ủ, có chủng D3-3 giảm so với trƣớc ủ Nhƣ chủng EM1, DV2-2, R4 đƣợc dùng để thực thí nghiệm 4.5.3 Xây dựng công thức đánh giá phân hủy phế phụ phẩm vải Các chủng đƣợc lựa chọn nuôi lỏng đƣợc bổ sung 10% vào phụ phẩm trộn với tỉ lệ 1:1 Theo dõi ngày sau ủ mang xác định hàm lƣợng cellulose, lignin trƣớc (T0) sau ủ Bảng 4.8 Kết công thức ủ với phụ phẩm Công thức ủ ĐC Trichoderma Sumitri CT1 CT2 CT3 CT4 Hàm lƣợng Hàm lƣợng Cellulose (%) Lignin (%) 0,90 0,47 2,80 5,42 2,30 2,28 1,59 1,48 2,45 3,47 4,45 4,38 3,45 3,83 Kết cho thấy sau ủ ngày hàm lƣợng lignin, cellulose mẫu phế phụ phẩm giảm từ 1-5% so với trƣớc ủ Trong CT3: EM1+DV2-1 có khả giảm nhiều hàm lƣợng cellulose, lignin lên đến 4,4% so với chế phẩm Trichoderma Bacillus CT3 đƣợc gọi tƣơng đối tốt Theo báo cáo nghiên cứu Đinh Thị Hồng Duyên năm 2017 sử dụng chế phẩm V19 V98 để ủ với phế phụ phẩm, độ chênh lệch độ hoai mục so với đối chứng không sử dụng chế phẩm vào khoảng 12-14% sau 35 ngày ủ Do tỉ lệ ủ thời gian nghiên cứu khác nên hai kết không giống Vậy cần tiếp tục đánh giá khả phân hủy lignin, cellulose ủ các chủng vi sinh vật với nguồn phế phụ phẩm sau thu hoạch vải với thời gian dài 53 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ sƣu tập (20 chủng) vi khuẩn đƣợc phân tập phế phụ phẩm sau thu hoạch vải qua số thí nghiệm đánh giá đƣợc chủng có khả phân hủy Cellulose tốt EM1 DV2-1; chủng có khả phân hủy Lignin tốt R4 D3-3 với hoạt độ lần lƣợt 66,27 (U/ml), 79,03 (U/ml), 36,1110-3 (U/ml) 35,99 10-3 (U/ml) Kết định danh cho thấy chủng DV2-1, EM1, D3-3 thuộc chi Bacilus, chủng R4 thuộc chi Klebsiella Đánh giá đƣợc phù hợp chủng cho thấy chủng DV2-1, EM1, R4 phù hợp với nguồn nguyên liệu sau thu hoạch vải Chủng D3-3 không phù hợp với nguồn nguyên liệu Xác định đƣợc thành phần nguyên liệu sau thu hoạch vải có cellulose, lignin hemicellulose Xây dựng đƣợc cơng thức tạo chế phẩm vi sinh để xử lý nguồn phế phụ phẩm sau thu hoạch vải với khả tốt EM1 + DV2-1 phối trộn 10% tƣơng ứng với tỉ lệ 1:1 cho khả phân hủy cellulose, lignin tƣơng ứng 4,45% 4,38% 5.2 Kiến nghị Do thời gian điều kiện nghiên cứu có hạn nên chƣa thể thực hết bƣớc đánh giá tạo đƣợc chế phẩm sinh học nhằm xử lý phế phụ phẩm sau thu hoạch vải Vì chúng tơi có số kiến nghị nhƣ sau: Tiếp tục nghiên cứu kéo dài thời gian ủ, nhiệt độ, độ ẩm công thức phối trộn vi sinh vật với chất mang khác để tạo chế phẩm sinh học có khả phân hủy phế phụ phẩm sau thu hoạch vải thành phân bón hữu Tiếp tục tiến hành nuôi cấy sinh khối với quy mô lớn ứng dụng thử nghiệm vào sản xuất chế phẩm vi sinh phân hủy phế phụ phẩm 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase cellulase Trichoderma harzianum ảnh hƣởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 321-324 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzymen NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đào Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thiên Trang cs (2006) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng xử lý vỏ cà phê làm phân bón cho trồng Viện khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên Đinh Hồng Duyên, Nguyễn Thế Bình Vũ Thanh Hải (2015) Tuyển chọn đánh giá khả sử dụng xạ khuẩn để xử lý phụ phẩm sau thu hoạch vải Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn,15: 42-48 Đinh Hồng Duyên, Nguyễn Xuân Thành (2010) Phân lập tuyển chọn vi sinh vật để xử lý phế thải đồng ruộng Tạp chí Khoa học, 34: 68-73 Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến (2007) Giáo trình Hóa học hữu Trƣờng ĐH Nơng Nghiệp Hà Nội Hồ Sỹ Tráng (2006) Cơ sở hóa gỗ cellulose tập NXB Khoa học Kỹ thuật: trang 7-14 Nguyễn Lân Dũng (2014) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Ngọc Hà (2014) Bƣớc đầu chế tạo đánh giá hoạt tính enzyme Laccase phức hệ Nano Chitosan Đại học Dƣợc Hà Nội 10 Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Vũ Việt Linh, Nguyễn Ngọc Kim Tuyến, Phạm Ngọc Sinh, Nguyễn Anh Thƣ (2019) Giải pháp hữu ích quy trình xác định hàm lƣợng lignin sợi xơ dừa Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Thị Minh, Lê Anh Tùng (2005) Nghiên cứu, phân lập tuyển chọn chủng giống vi sinh vật có khả phân giải chất thải hữu mạnh để làm chế phẩm vi sinh vật xử lý rác thải hữu sinh học phế thải nông nghiệp thành phân hữu sinh học Báo cáo kết nghiên cứu khoa học công nghệ, Trƣờng Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội 12 Nguyễn Thị Thuý Nga, Phạm Quang Nam, Lê Xuân Phúc, Phạm Quang Thu Chí, Nguyễn Minh (2015) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải xenlulose sản xuất phân hữu sinh học Tạp chí Khoa học Lâm Nghiệp, 2: 3841-3850 13 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hƣng, Phạm Văn Tồn (2003) Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trƣờng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 105 trang 14 Phan Thị Phẩm, Lê Thị Thu Hƣơng (2017) Sự chuyển đối sinh khối Lignocellulose: từ 55 phế thải đến nguyên liệu tiềm cho sản xuất ethanol sinh học hệ thứ hai Việt Nam Tạp chí Khoa học Lạc Hồng, 159-164 15 Tổng cục Thống kê, Cục Chăn nuôi (2020) Sử dụng hiệu tài nguyên phụ phẩm nông nghiệp Báo Quân đội Nhân dân 20/03/2022 https://www.qdnd.vn/kinh-te/cacvan-de/de-su-dung-hieu-qua-tai-nguyen-phu-pham-nong-nghiep-689187 16 Trần Anh Tuấn (2010) Nghiên cứu quy trình thu hồi Lignin nƣớc thải dịch đen công nghiệp sản xuất giấy Trƣờng Đại học Hàng Hải 17 Trần Thạnh Phong (2004) Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T reesei A niger môi trƣờng lên men bán rắn Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM 24-36 18 Trần Văn Lƣơng (2020) Nghiên cứu tổng hợp ứng dụng xác tác cacbon hóa từ nguồn lignin phế thải Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội 19 Triệu Quốc Dƣơng (2021) Hiện trạng nông, lâm, thủy sản đề xuất giải pháp cho vùng Nam Bộ Truy cập ngày 21/09/2021 20 Trịnh Thị Thu Thủy, Phan Thị Hiền, Phùng Thị Duyên (2021) Tổng quan enzyme phân hủy lignin từ vi sinh vật Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Truy cập ngày 27/12/2021 https://vnua.edu.vn/tin-tuc-su-kien/nghien-cuu-khoa-hoc/tong-quan-ve-enzyme-phan-huylignin-tu-vi-sinh-vat-52262 - 2021 21 Trung tâm thông tin thống kê KH&CN ThS Phạm Xuân Hƣng (2019) Xu hƣớng ứng dụng chế phẩm Vi sinh xử lý phụ phẩm Nông nghiệp Trung tâm thông tin thống kê KH&CN, Tp HCM Tài liệu tham Khảo tiếng anh AT., Martı´nez (2002) Molecular biology and structure-function of lignindegrading haem peroxidases Enzyme and Microbial Technology 30, 425-444 B, Henrissat (1994) Cellulase and their interaction with cellulose, in Cellulose Chapman Hall, London, 169-196 Bárcena, JM Bruno, and others (1998) Chemostat production of plantaricin C by Lactobacillus plantarum LL441 Applied and Environmental Microbiology, 3512-3514 Béguin, Pierre, Jacqueline Millet and Jean-Paul Aubert (1992) Cellulose degradation by Clostridium thermocellum: from manure to molecular biology FEMS microbiology letters, 523-528 Camarero, S.; Sarkar, S.; Ruiz-Duenas, F J.; Martinez, M J.; Martinez, A T (1999) Description of a Versatile Peroxidase Involved in the Natural Degradation of Lignin That Has Both Manganese Peroxidase and Lignin Peroxidase Substrate Interaction Sites Journal of Biological Chemistry, 274(15), 10324– 10330 doi:10.1074/jbc.274.15.10324 Dorota Walkowiak-Tomczak, Natalia I., Krzysztof B., Zuzanna S., (2020) The Effect 56 of Mechanical Actions Occurring during Transport on Physicochemical Changes in Agaricus bisporus Mushrooms Emerging Trends and Sustainable Production in Agricultural Engineering Duarte, E B., Bruna, S., Andrade, F K., Brígida, A I., Borges, M F., Muniz, C R., Filho, M M S., Morais, J P S., Feitosa, J P A., and Rosa, M F (2015).Production of hydroxyapatite–bacterial cellulose nanocomposites from agroindustrial wastes Cellulose 22, 3177-3187 DOI: 10.1007/s10570-015-0734-8 Francesca, GM., Lanzalunga, O., Lapi, A., Piparo, MGL., Mancinelli, S (2001) Isotope-effect profiles in the oxidative N-Demethylation of N,N-Dimethylanilines catalysed by lignin peroxidase and a chemical model Isotope-effect profiles in the oxidative N-Dem Eur J Org Chem 2001: 2305-10 Gold MH, Youngs HL, Gelpke MD.(2000) Manganese peroxidase Metal Ions in Biological Systems 37, 559-586 10 Hammel KE, Cullen D (2008) Role of fungal peroxidases in biological ligninolysis Current Opinion in Plant Biology 11: 349-355 11 Harkin J.M., John R (1973) Syringaldezine, an effective reagent for detecting Laccase and Peroxidase in fungi Experientia, 29(4): 381-387 12 Jayasinghe, PA., Hettiaratchi, JP., Mehrotra, AK., Kumar, S (2011) Effect of enzyme additions on methane production and lignin degradation of landfilled sample of municipal solid waste Bioresour Technol 102:4633-7 13 Jiang-Meng Yuan, Hang Li, Ling-Ping Xiao(2002) Valorization of lignin into phenolic compounds via fast pyrolysis: Impact of lignin structure 14 JP, Bguin P & Aubert (1994) The biological degradation of cellulose FEMS Microbiol Rev, 25-58 15 Kaczmarek MB, Kwiatos N, Szczęsna-Antczak M, Bielecki S (2017) Laccases– enzymes with an unlimited potential Biotechnol Food Sci.81: 41–70 16 Laurent P., L Buchon, J.F.G Michel, N Orange (2000) Production of pectate lyases and cellulases by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperatures App and Env Micro,66(4):1538-1543 17 Miller, G L (1959) Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar Analytical Chemistry, 31(3): 426-428 18 Muhammad A, Muhammad T, Arfan A, Qurba A, Anwar K, Bushra T, Idrees Ahmad Nasir, Tayyab H (2017) Isolation, characteriztion and inter-relationship of Phosphate Solubilizing Bacteria from the Rhizosphere of Sugarcane and Rice Author’s Accepted Manuscript 19 Naz, Sabiha (2016) Study of ligninolytic bacteria isolation and characterization from Kuthrel Agro Field of Bhilai-Durg Region Int J Curr Microbiol App Sci, 5(12): 141 20 Park, S U., Lee, B K., Kim, M S., Park, K K., Sung, W J., Kim, H Y., et al (2014) The possibility of microbial cellulose for dressing and scaffold materials Int Wound J 57 11, 35–43 doi: 10.1111/j.1742-481X.2012.01035.x 21 Prod, Sigma Sigma quality control test procedure No P-6782 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Enzyme_Assay/p 6782enz.pdf 22 Ruiz-Duas FJ, Morales M, García E, Miki Y, Martínez MJ, Martínez AT (2009) Substrate oxidation sites in versatile peroxidase and other basidiomycete peroxidases Journal of Experimental Botany, 60(2):441-452 23 Taherzadeh, Mohammad J Karimi, Keikhosro (2008) Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review International journal of molecular sciences, 9(9): 1621-1651 24 Uraisha Ramlucken, Santosh O Ramchuran, Ghaneshree M, Rajesh L, Mapitsi S Thantsha (2019) A novel Bacillus based multi-strain probiotic improves growth performance and intestinal properties of Clostridium perfringens challenged broilers Poultry Science,1-11 25 Williams, GJ, AS Nelson and A Berry (2004) Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences Cellular Molecular Life Sciences CMLS, 61(24): 3034-3046 26 Wilson, David B (2011) Microbial diversity of cellulose hydrolysis Current opinion in microbiology, 14(3): 259-263 27 Wilson, K (2001) Preparation of Genomic DNA from Bacteria Current Protocols in Molecular Biology, 56(1): 2.4.1-2.4.5 Tài liệu internet Ứng dụng ƣu điểm sợi cellulose sống Ngày truy câp: 25/08/2021 https://labvietchem.com.vn/tin-tuc/cellulose-la-gi.html Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 1867:2010 - ISO 287:2009 Truy cập ngày 31/01/2019 https://123docz.net/document/5992917-tieu-chuan-quoc-gia-tcvn-1867-2010-iso-2872009.htm 58 PHỤ LỤC Phụ lục Hoạt tính cellulose chủng vi khuẩn Phụ lục Hoạt tính lignin chủng vi khuẩn 59 Phụ lục Xây dựng đƣờng chuẩn Glucose Bố trí thí nghiệm Thành phần ĐC Dung dịch glucose 0,1% 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 (ml) Dung dịch DNS 1% (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Nƣớc cất (ml) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Lắc ống nghiệm, đun sôi 100C 10 phút, làm nguội đến t phòng Bổ sung nƣớc cất (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10 10 Nồng độ glucose ống 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 nghiệm (mg ml) Kết Ống nghiệm Nồng độ Glucose 0.1% 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 OD 540nm 0,0348 0,0571 0,0858 0,1173 0,1582 0,1898 Ta có phƣơng trình sau : y = 0,6342x – 0,0038 (R² = 0.9921) Trong đó: x: Nồng độ glucose 0.1%, y (OD540) Đƣờng chuẩn Glucose 0.2 y = 0.6342x - 0.0038 R² = 0.9921 0.18 0.16 Giá trị OD540 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Nồng độ Glucose (mM) 60 0.3 0.35 Phụ lục Xác định hàm lƣợng chất khô phụ phẩm sau thu hoạch vải Mẫu phụ phẩm Vỏ Lá Cành Lần 1,79 1,81 1,83 m0(g) Lần Lần 1,79 1,81 1,82 TB 1,80 1,79 1,83 1,79 1,80 1,83 m(g) Hàm lƣợng chất khô Sai số (%) 0,01 2,00 89,50 0,01 2,00 90,00 0,01 2,00 91,50 Phụ lục Đánh giá ảnh hƣởng chủng vi khuẩn tác động đến loại nguyên liệu vải Hình Phụ Bổ sung chế phẩm Trichodema Sumitri ống ủ (A) (B) Hình phụ (A)-Bổ sung vi khuẩn; (B)-Bổ sung enzyme 61 Phụ lục Hình ảnh ủ công thức đánh giá phân hủy phế phụ phẩm vải Hình phụ Khi ủ với chế phẩm ĐC Hình phụ Khi ủ với cơng thức Phụ lục Hình ảnh sau ủ công thức đánh giá phân hủy phế phụ phẩm vải Hình phụ Sau ủ với chế phẩm ĐC 62 Hình phụ Sau ủ với công thức 63