Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng xử lý phế phụ phẩm nhãn sau thu hoạch

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -🕮 - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH DẠNG LỎNG XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NHÃN SAU THU HOẠCH Hà Nội - 02/2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -🕮 - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH DẠNG LỎNG XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NHÃN SAU THU HOẠCH Họ tên : Mạch Văn Hợp Mã sinh viên : 637227 Lớp : K63CNSHC Giáo viên hướng dẫn : Ths Trịnh Thị Thu Thủy Hà Nội - 02/2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu chế tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng sử lý phế phụ phẩm nhà ăn sau thu hoạch” cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn ThS Trịnh Thị Thu Thủy Các nội dung, kết nghiên cứu đề tài hoàn toàn trung thực khách quan Các phần tham khảo, trích dẫn ghi rõ phần tài liệu tham khảo Nếu có phát gian lận xin chịu hoàn toàn trách nghiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp, lời em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến ThS Trịnh Thị Thu Thủy, người cô dạy, hướng dẫn tận tình cho em suốt q trình nghiên cứu hồn thiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất Thầy Cô Bộ môn Công nghê sinh học phân tử CNSH ứng dụng– Khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo Khoa Công nghệ sinh học giảng viên Học viên Nông nghiệp Việt Nam tận tình dạy tạo mơi trường học tập tốt để em hồn thành tốt qng thời gian học tập Học viện Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân bên cạnh ủng hộ, động viên tin tưởng em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Dẫu cố gắng hồn thành khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp từ Thầy Cô Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VII TÓM TẮT VIII Chương I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan phế phụ phẩm nông nghiệp 2.1.1 Tổng quan phế phụ phẩm nông nghiệp 2.1.2 Sản lượng phụ phẩm sau thu hoạch nhãn 2.3 Thành phần có phế phụ phẩm nông nghiệp 2.5 Vai trò vi sinh vật sử dụng để xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 14 2.5.1 Vai trị nhóm vi sinh vật cố định đạm 14 2.5.2 Vai trị vi sinh vật phân giải lân khó tan 16 2.5.3 Nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 19 2.5.4 Nhóm vi sinh vật đối kháng 20 2.5.5 Nhóm vi sinh vật xử lý ao hồ 22 2.6 Chất mang xử lý chất mang 24 CHƯƠNG III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 27 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 iii 3.2 Phương pháp nghiên cứu 28 3.2.1 Phương pháp sàng lọc vi sinh vật 28 3.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng Cellulose 31 3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng Lignin 31 3.2.4 Phương pháp chọn lọc chất mang dạng lỏng 33 3.2.5 Phương pháp đánh giá khả phân hủy chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm nhãn 34 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Hoạt hóa chủng vi sinh vật 35 4.1.1 Đánh giá khả phân giải lignin 35 4.1.2 Đánh giá khả phân giải cellulose 36 4.1.3 Mối tương quan OD600 mật độ vi sinh vật (CFU/mL) 37 4.2 Kết khảo sát mật độ vi sinh vật chất mang 38 4.2.1 Kết phối trộn với chất mang Sucrose 38 4.2.2 Kết phối trộn chất mang Skimmilk 39 4.3 Kết xử lý phế phụ phẩm nhãn 41 4.3.1 pH, nhiệt độ 41 4.3.2 Hàm lượng lignin 42 4.3.3 HÀM LƯỢNG CELLULOSE 43 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 49 iv DANH MỤC BẢNG Bảng1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến (Tchobanoglous et al., 1993) Bảng Thành phần dinh dưỡng cám gạo 25 Bảng Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 27 Bảng Giá trị d theo Va 33 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.Cấu trúc lignocellulose Hình 2 Cơng thức cấu tạo Cellulose Hình Cấu trúc Lignin Hình Quy trình sản xuất chế phẩm VSV chức có bổ sung biochar 13 Hình Quy trình tạo chế phẩm PT (Pgs Ts Lê Đình Đơn, 2020) 13 Hình Sơ đồ công nghệ tạo chế phẩm vi sinh lactic 14 Hình Kết định tính lignin 35 Hình Kết định tính cellulase 36 Hình 4.3 Đường biểu diễn mối tương quan OD600 – CFU/ml chủng HN8 D504 37 Hình 4.5 Đường biểu diễn mật độ chủng D504 39 Hình 4.6 Đường biểu diễn mật độ chủng HN8 40 Hình 4.7 Đường biểu diễn mật độ chủng D504 41 Hình 4.8 Đường biểu diễn pH đống ủ 41 Hình 4.9 Đường biểu diễn nhiệt độ đống ủ 42 Hình 4.10 Đường biểu diễn thay đổi hàm lượng lignin 43 Hình 4.11 Đường biểu diễn thay đổi hàm lượng Cellulose 44 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LB Môi trường LB (Luria broth) CT Công thức NL Nguyên liệu vii TÓM TẮT Với vị nước phát triển với chủ đạo nơng nghiệp, Việt Nam có sản xuất nông nghiệp đa dạng, kèm với lượng lớn phế phụ phẩm tạo Lượng phụ phẩm nông nghiệp chứa nguồn sinh khối khổng lồ nên tận dụng cách hiệu quả, việc vừa có tác dụng bảo vệ môi trường lại vừa tận dụng lượng sinh khối để tạo sản phẩm có giá trị Trên thị trường lưu hành nhiều loại chế phẩm vi sinh phân giải phế phụ phẩm nông nghiệp Tuy nhiên chế phẩm có nhiều loại không rỏ nguồn gốc, xuất xứ tiềm ẩn rủi ro, nguy hiểm, khó kiểm sốt bào tử từ nguồn nấm gây độc Chính nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng để giải lượng phế phụ phẩm nhãn nói riêng phế phụ phẩm nơng nghiệp nói chung Kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm đề có khả phân giải nguồn phụ phẩm trộn lẫn tiềm đưa vào thực tế xử lí trực tiếp vườn Tuy nhiên lượng cellulose hemicellulose phân hủy đống ủ có tỉ lệ phân giải thấp vi khuẩn tạp nhiễm nhiều yếu tố khác mơi trường thực tế Chúng tiến hành đánh giá kết luận, giải thích tượng báo cáo Những kết nước đầu đạt sở để sử dụng chế phẩm xử lý phế phụ phẩm sau thu hoạch nhãn, sản xuất phân bón hữu vi sinh viii Hình 4.7 Đường biểu diễn mật độ chủng D504 Chất mang skimmilk cho thấy khả sống trì mật độ vi sinh vật Kết thu cho thấy chênh lệch mật độ lên xuống trình bảo quản song đảm bảo mật độ vi sinh vật có chế phẩm Ở nồng độ skimmilk 2% mật độ vi sinh vật trì mức ổn định 4.3 Kết xử lý phế phụ phẩm nhãn 4.3.1 pH, nhiệt độ Hình 4.8 Đường biểu diễn pH đống ủ 41 Hình 4.9 Đường biểu diễn nhiệt độ đống ủ Thông qua thay đổi pH, nhiệt độ thấy mức dộ hoạt động vi khuẩn, nắm sơ khả phân giải vi sinh vật tới đống ủ Đối với pH, 10 ngày đầu, nhìn chung pH có thay đổi nhẹ Các mức dộ thay đổi theo đống ủ khác nhau, pH khoảng thời gian có xu hướng tăng nhẹ, riêng có CT6 (Trichoderma+NL+nước) CT4 (D504 + 1% Succarose + NL+ nước) có xu hướng giảm pH so với ban đầu Trong 10 ngày pH có xu hướng giảm mạnh, đống ủ giảm tới 1.5- đơn vị pH chưa có xu hướng dừng lại Cụ thể, CT5 pH giảm mạnh từ pH xuống pH 3, CT2 giảm từ pH 5,5 xuống pH 3,1 Các đống ủ lại giảm từ đến đơn vị Ở nhiệt độ, 10 ngày đầu nhiệt độ có tăng khơng đáng kể, CT4 tăng nhiều tăng 50C so với ban đầu, CT7 nhỏ với tăng 20C so với ban đầu Ngược lại, với 10 ngày tiếp theo, nhiệt độ có thay đổi mạnh, CT7 cho thấy thay đổi nhiều với ngưỡng nhiệt 400C , đống ủ lại tăng giao động từ 16 – 210C so với mốc 10 ngày trước 4.3.2 Hàm lượng lignin 42 Các mẫu phế phụ phẩm sau ủ 20 ngày, tiến hành xác định hàm lượng lignin lại mẫu Kết xác định hàm lượng lignin mẫu phế phụ phẩm cho thấy hàm lượng lignin giảm sau 20 ngày ủ công thức khác cho kết khác Hình 4.10 Đường biểu diễn thay đổi hàm lượng lignin Dựa theo kết quan sát được, công thức ủ phân giải thành phần lignin có phế phụ phẩm nhãn Kết sau 20 ngày cho thấy hàm lượng lignin giảm mạnh, đống ủ vào thời điểm phân giải mạnh mẽ CT2 ( HN8 + 1% Sucrose + NL + nước) có % lignin phân giải mạnh với gần 28 %, công thức khác cho thấy kết phân giải tích cực với % phân giải lignin cao so với CT7 – đối chứng (nước) 4.3.3 Hàm lượng Cellulose 43 Sau 20 ngày, kết khảo sát % cellulose theo thời điểm khác cho thấy cơng thức ủ có thay đổi Hình 4.11 Đường biểu diễn thay đổi hàm lượng Cellulose Dựa theo kết thu tập từ đông ủ theo mốc thời gian khác cho thấy thành phần cellulose hemicellulose có thay đổi So với CT7 – đối chứng (nước) cơng thức ủ cho thấy % hàm lượng cellulose hemicellulose có giảm cao Tuy mước % giảm chưa cao kết đạt cho thấy vi sinh vật có chế phẩm cho thấy khả phân giải chúng 44 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian làm thí nghiêm, thu số kết sau: - Hoạt hóa đánh giá hoạt tính phân hủy lignin cellulose hai chủng vi khuẩn HN8 Đ504 Đã xây dựng đường chuẩn xác định môi tương quan OD600 mật độ CFU/mL hai chủng - Khảo sát, đánh giá mật độ vi sinh vật có chất mang Skinmilk Sucrose đảm bảo trì mật độ Xác định nồng độ skimmilk phù hợp khoảng 1.5 – % ; nồng độ sucrose phù hợp khoảng – 15% - Bước đầu đánh giá khả xử lý đống ủ chế phẩm vi sinh bao gồm chủng vi khuẩn D504 HN8 với chất mang sucrose Xác định thông số ban đầu đống ủ sau 20 ngày ủ như:  pH giảm mạnh, CT5 (Em5 + Nl + nước) giảm mạnh từ pH 5.5 pH 3.0  nhiệt độ, tất đống ủ có xu hướng tăng CT5 (Em5 + Nl + nước) 19oC so với nhiệt độ môi trường, tăng 24 oC so với ban đầu  hàm lượng lignin giảm mạnh, CT2 (HN8 +1% sucrose) giảm mạnh với 24 % so với đối chứng CT7 (nước), 29%với trước ủ  hàm lượng cellulose giảm mạnh, CT4 (D504+ 1% sucrose) giảm 34% so với ban đầu, 12 % với đối chứng CT7 (nước) 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu phối trộn hai nhiều chủng vi sinh vật để tăng hiệu xử lý đống ủ - Thơng qua q trình nghiên cứu chất mang, Skimmilk có khả bảo quản vi sinh vật loại chất mang có mùi nên kiến nghị không sử dụng 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Bảo Châu (2018) Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm chất nuôi trồng mộc nhĩ tái sử dụng bãi thải để trồng nấm sị, Viện Khoa học Nơng Nghiệp Việt Nam, trang Nguyễn Quốc Việt N V V L., Nguyễn Ngọc Kim Tuyến, Phạm Ngọc Sinh, Nguyễn Anh Thư (2019) Giải pháp hữu ích “quy trình xác định hàm lượng lignin sợi xơ dừa” Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lâm Đồn & Hồ Thị Thơm (2021) Tạo chế phẩm probioic Bacillus sp RGB7.1 ảnh hưởng chế phẩm đến tỷ lệ nuôi sống khối lượng gà Nông nghiệp Phát triển Nông thôn - kỳ Nguyễn Thị Thuý Nga P Q N., Lê Xuân Phúc, Phạm Quang Thu, Nguyễn Minh Chí (2015) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải xenlulo sản xuất phân hữu sinh học Tạp chí KHLN 2(2015): 3841-3850 Nhung H (2022) Khai thác "mỏ vàng' phế phụ phẩm nông nghiệp Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam Lê Đình Đơn (2020) Quy trình sản xuất chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) dùng kiểm soát sâu hại thuộc Lepidoptera rau Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường – Đại học Nơng Lâm TP.HCM Phí Hải Nam & Nhật Tiến (2021) Sản lượng nhãn nước ước tính đạt 637 000 Nông Nghiệp Việt Nam Trần Tiến Dũng, Võ Tuấn Tồn, Đào Văn Thơng & Võ Chí Hiếu (2017) Hồn thiện cơng nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chức có bổ sung Biochar Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam số 10 (83) Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 28-30 TIẾNG ANH 46 Britannica (T Editors of Encyclopaedia (2020, January 13)) Nitrogen-fixing bacteria, Encyclopedia Britannica Favilli F., Balloni W., Cappellini A., Granchi L & Savoini G (1987) Esperienze pluriennali di batterizzazione in campo Azospirillum spp di colture cerealicole Annali di microbiologia ed enzimologia 37: 169181 Liđan-Vidriales M A., Pa-Rodríguez A., Tovar-Ramírez D., ElizondoGonzález R., Barajas-Sandoval D R., Ponce-Gracía E I., RodríguezJaramillo C., Balcázar J L & Quiroz-Guzmán E (2021) Effect of rice bran fermented with Bacillus and Lysinibacillus species on dynamic microbial activity of Pacific white shrimp (Penaeus vannamei) Aquaculture 531: 735958 Linder M & Teeri T T (1997) The roles and function of cellulose-binding domains Journal of biotechnology 57(1-3): 15-28 Naz S., Devtare S., Satapathy S & Gupta S (2015) Study of ligninolytic bacteria isolation and characterization from Dhamdha agro field of BhilaiDurg region IJERT 4: 258262 Okon Y (1985) Azospirillum as a potential inoculant for agriculture Trends in Biotechnology 3(9): 223-228 Omar N., Heulin T., Weinhard P., El-Din A & Balandreau J (1989) Field inoculation of rice with in vitro selected plant-growth promotingrhizobacteria Agronomie (Print) 9(8): 803-808 Palonen H (2004) Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose VTT Technical Research Centre of Finland trang trang Patinvoh R J & Taherzadeh M J (2019) Fermentation processes for secondgeneration biofuels Trong: Second and third generation of feedstocks Elsevier: 241-272 trang Sigma Prod (No P-6782).Enzymatic Assay of PEROXIDASE (EC 1.11.1.7) 2,2’-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) as a Substrate 47 from Truy cập từ https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/docu ments/260/895/p6782enz.pdf Sintu Rongpipi, Dan Ye, Enrique D Gomez & Gomez E W (2018) Progress and Opportunities in the Characterization of Cellulose – An Important Regulator of Cell Wall Growth and Mechanics Plant Cell Biology Sruamsiri, Sompong, and Pirote Silman "Chemical composition and in vitro digestibility of by-products from longan production." Journal of Agricultural Research and Extension 32.2 (2015): 50-58 48 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bố trí thí nghiệm khảo sát chất mang - Chủng HN8 - Chủng D504 Phụ lục2: Kết hỉnh ảnh CFU chất mang 49 50 Phụ lục : Kết khảo sát chất mang Kết khảo sát chất mang Sucrose đoi với chủng HN8 HN8 TUẦN TUẦN2 TUẦN TUẦN 1,18x109 1,34x109 1,04x109 2,95x109 9,28x108 1,15x109 2,27x109 4,47x109 1,31x109 1,91x109 1,27x109 1,14x109 1,05x109 5,86x108 1,41x109 1,73x109 1,40x109 3,77x109 1,36x109 2,59x109 1% 5% 10% 15% 20% Kết khảo sát chất mang Sucrose đoi với chủng D504 D504 Tuần Tuần2 Tuần Tuần 1% 1,2x109 1,8x109 1,57x109 3,11x109 5% 8,11x108 1,59x109 1,93x109 2,18x109 10% 1,04x109 1,84x109 1,53x109 2,41x109 15% 1,05x109 1,31x109 1,96x109 1,86x109 20% 1,26x109 2,58x109 4,86x108 2,41x109 51 Kết khảo sát chất mang Skimmilk đói với chủng HN8 HN8 Tuần Tuần2 Tuần Tuần 1,0% 1,14x109 1,58x109 2,41x109 2,98x109 1,5% 1,23x109 1,90x109 8,38x108 2,41x109 2,0% 1,70x109 1,18x109 8,56x108 2,02x109 2,5% 8,92x108 7,48x108 1,84x109 5,32x108 Kết khảo sát chất mang Skimmilk đói với chủng D504 D504 Tuần Tuần2 Tuần Tuần 1% 1,67x109 1,86x109 1,34x109 2,33x109 1.5% 1,05x109 6,76x108 7,39x108 1,64x109 2% 1,45x109 1,91x109 9,73x108 1,5x109 2.5% 1,02x109 8,56x108 1,03x109 8,92x108 52 Phụ lục 4: xử lý nguyên liệu Phụ lục : bố trí ủ 53 Trước ủ Sau ủ Bảng thay đổi hàm lượng Cellulose Công thức ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày CT1 58,5% 45,5% 38,5% 31,0% CT2 58,5% 44,5% 31,5% 29,0% CT3 58,5% 52,0% 36,0% 30,5% CT4 58,5% 48,0% 34,0% 26,0% CT5 58,5% 41,0% 30,5% 28,0% CT6 58,5% 41,5% 33,0% 29,0% CT7 58,5% 53,0% 40,5% 36,3% 54 Bảng thay đổi hàm lượng lignin(%) ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày CT1 41,3 35,8 23,4 20,5 CT2 41,3 26,7 17,1 12,4 CT3 41,3 36,14 19 17,2 CT4 41,3 31,8 20,2 12,9 CT5 41,3 34,7 27,5 17,1 CT6 41,3 35,2 26 13,4 CT7 41,3 40,6 38,7 37 Công thức 55